长效胰岛素衍生物及其方法

摘要

本发明涉及胰岛素衍生物，其包括胰岛素分子和用于与血液成分共价结合的活性基团，其中优选胰岛素分子为人天然胰岛素分子，并且活性基团与胰岛素分子的氨基酸在选自位置Gly A1、Phe B1和LysB29的位置连接。

权利要求

1.胰岛素衍生物，包括胰岛素分子和用于与血液成分共价结合的活性基团，所述活性基团是含马来酰亚胺基的基团，并且其中所述活性基团与胰岛素分子可获得的氨基连接，所述可获得的氨基选自链A和B的N-末端氨基酸的α-氨基，或Lys B29的ε-氨基。

2.权利要求1的胰岛素衍生物，其中胰岛素分子为下式I：并且活性基团与胰岛素分子的氨基酸在选自位置Gly A1、Phe B1和Lys B29的位置连接。

3.权利要求1的胰岛素衍生物，其中活性基团为3-马来酰亚胺基丙酸(MPA)。

4.权利要求1的胰岛素衍生物，其中活性基团通过连接体与胰岛素分子的氨基酸连接。

5.权利要求4的胰岛素衍生物，其中所述连接体选自(2-氨基)乙氧基乙酸，乙二胺，氨基乙氧基乙氧基琥珀酸，(氨基乙氧基乙氧基琥珀酸)2，2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸，[2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸]2和-NH2-(CH2)n-COOH，其中n为1到20的整数，和C1-C10烷基链基元，及其任何组合的组中。

6.权利要求5的胰岛素衍生物，其中所述C1-C10烷基链基元为一种或多种任选包括氧、氮或硫原子的饱和或不饱和的C1-C10烷基链。

7.权利要求5的胰岛素衍生物，其中所述连接体选自甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)和4-氨基苯甲酸(APhA)的组中。

8.权利要求5的胰岛素衍生物，其中所述组合选自[2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸]-乙二胺、[2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸]2和[(2-氨基)乙氧基乙酸]-[2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸]的组中。

9.权利要求5的胰岛素衍生物，其中所述连接体为

10.权利要求1的胰岛素衍生物，其由下式表示：

11.权利要求1的胰岛素衍生物，其由下式表示：

12.权利要求1的胰岛素衍生物，其由下式表示：

13.权利要求1的胰岛素衍生物，其中所述血液成分为血液蛋白。

14.权利要求13的胰岛素衍生物，其中所述血液蛋白为白蛋白。

15.胰岛素结合物，包括权利要求1到14中任一项的胰岛素衍生物和血液成分，其中活性基团和血液成分通过在所述活性基团与所述血液成分之间形成的共价键结合。

16.权利要求15的胰岛素结合物，其中血液成分为血液蛋白。

17.权利要求16的胰岛素结合物，其中血液蛋白为白蛋白。

18.权利要求15的胰岛素结合物，其中所述结合物在体外形成。

19.权利要求18的胰岛素结合物，其中所述血液成分是重组白蛋白。

20.药学组合物，包括与可药用载体结合的权利要求1到14中任一项的胰岛素衍生物。

21.药学组合物，包括与可药用载体结合的权利要求15的胰岛素结合物。

22.权利要求20的药学组合物在制备用于治疗与血糖有关的疾病或病症的药物中的应用，其中所述与血糖有关的疾病或病症选自I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病的组中。

23.权利要求21的药学组合物在制备用于治疗与血糖有关的疾病或病症的药物中的应用，其中所述与血糖有关的疾病或病症选自I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病的组中。

24.权利要求1-14中任一项的胰岛素衍生物在制备用于治疗I型糖尿病或II型糖尿病的药物中的应用。

25.权利要求15的胰岛素结合物在制备用于治疗I型糖尿病或II型糖尿病的药物中的应用。

说明书

长效胰岛素衍生物及其方法

[0001] 发明背景

[0002] (a)技术领域

[0003] 本发明涉及长效胰岛素衍生物。更具体地，所述胰岛素衍生物包括胰岛素分子和与其连接的活性基团，活性基团用于与血液成分共价结合从而产生长效胰岛素衍生物。 [0004] (b)背景技术

[0005] 胰岛素为重要的内分泌激素，其结合于细胞表面受体，引起事件的级联，最终从血液吸收葡萄糖。胰岛素水平变差导致严重的病症如I型和II型糖尿病。I型糖尿病为危急生命的疾病，患者必须每天自我给药多剂量胰岛素以维持生存。II型糖尿病也是严重的医学疾病，由于患者形成的对胰岛素内源性水平的耐受性而使胰岛素的内源性水平不再能保持恰当的血糖水平。为了减少长期后果的发作，在生活方式改变失败之后或当常规的血糖控制药物无效时，用胰岛素治疗变得必要。国际专利申请WO 95/05187描述了胰岛素或将其与对结合蛋白具有亲和力的侧基分子基团共价连接的功能性衍生等价物。侧基分子基团与结合蛋白的结合不是共价的。这种结合力可为例如静电的(如相反电荷的吸引、氢键)或疏水的。因此，这种化合物不适合于提供持久作用。加拿大专利申请2,363,712涉及胰岛素释放的刺激物。具体地，该申请描述了长效促胰岛素分泌(insulinotropic)化合物，其刺激患者内源性胰岛素响应刺激而释放。因此，这种促胰岛素分泌化合物满足了在长时间过程中允许或增强胰腺细胞的内源性胰岛素相应刺激而释放的需要。然而，该文献没有教导长效胰岛素衍生物或长效外源性胰岛素。

[0006] 控制血糖病症的成功性与要治疗的患者的顺从性高度相关，并且期望降低所需的注射频率。为此，非常期望有新型的长效胰岛素衍生物。

[0007] 发明内容

[0008] 根据本发明，提供了胰岛素衍生物，其包括胰岛素分子和用于与血液成分共价结合的活性基团。

[0009] 在本发明的优选实施方案中，胰岛素分子为式I：

[0010]

[0011] 并且活性基团与胰岛素分子的氨基酸在选自位置Gly A1、Phe B1和Lys B29的位置连接。

[0012] 在本发明的优选实施方案中，活性基团选自麦克尔(Michael)受体(α，β不饱和羰基部分)含琥珀酰亚胺基的基团和含马来酰亚胺基的基团的组中，更优选MPA(3-马来酰亚胺基丙酸)。

[0013] 在本发明的优选实施方案中，活性基团通过连接体(linker)与胰岛素分子的氨基酸连接，所述连接体例如但不限于(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、氨基乙氧基乙氧基琥珀酸(AEES)、AEES-AEES、2-[2-(2-氨基)乙氧基]]乙氧基乙酸(AEEA)、AEEA-AEEA、-NH2-(CH2)n-COOH(其中n为1到20的整数)、和其中可以包括氧、氮、或硫原子的烷基链(C1-C10)饱和或不饱和基元(motif)，例如但不限于甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(OA)和4-氨基苯甲酸(APhA)、及其组合。

[0014] 在本发明的优选实施方案中，血液成分为血液蛋白，更优选为血清白蛋白。 [0015] 根据本发明，提供了胰岛素结合物(conjugate)，其包括本发明的胰岛素衍生物和血液成分，其中活性基团和血液成分通过在所述活性基团与所述血液成分之间形成的共价键结合。这种结合物在体内或体外形成。

[0016] 根据本发明，提供了药学组合物，其包括与可药用载体结合的本发明的胰岛素衍生物。

[0017] 根据本发明，提供了药学组合物，其包括与可药用载体结合的本发明的胰岛素结合物。

[0018] 根据本发明，提供治疗患有与血糖有关的疾病或病症的主体中的所述与血糖有关的疾病或病症的方法，其包括对主体给用本发明的胰岛素衍生物、本发明的结合物和本发明的药物组合物中的至少一种。

[0019] 本文中的所有参考文献都被并入本文作为参考。

附图说明

[0020] 图1说明来源于天然人胰岛素的实施例I到实施例VIII；

[0021] 图2说明胰岛素、胰岛素衍生物、和胰岛素衍生物的结合物对wistar大鼠的肝细胞膜(liver membrane)的竞争性结合；

[0022] 图3说明胰岛素、胰岛素衍生物、和胰岛素衍生物的结合物对wistar大鼠的肝细胞膜的竞争性结合；

[0023] 图4A、4B、4C、5A、5B、6A、6B表示3T3 L1脂肪细胞分化阶段的不同时期； [0024] 图7说明胰岛素、实施例III和IV及其相应的结合物在3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖转运；

[0025] 图8说明胰岛素、实施例III和VI及其相应结合物在附睾脂肪细胞中从wistar大鼠脂肪细胞的葡萄糖转运；

[0026] 图9说明用3.6mg/kg胰岛素处理的动物中Δ血糖随时间变化的 函数； [0027] 图10说明在用3.6mg/kg的实施例I、II和III的胰岛素衍生物处理的动物中Δ血糖随时间变化的函数；

[0028] 图11说明在用17.9mg/kg的实施例I、II和III的胰岛素衍生物处理的动物中Δ血糖随时间变化的函数；

[0029] 图12说明在用3.6mg/kg的胰岛素、3.6mg/kg的实施例I的胰岛素衍生物和17.9mg/kg的实施例I的胰岛素衍生物处理的动物中Δ血糖随时间变化的函数； [0030] 图13说明用3.6mg/kg的胰岛素、3.6mg/kg的实施例II的胰岛素衍生物和
17.9mg/kg的实施例II的胰岛素衍生物处理的动物中Δ血糖随时间变化的函数； [0031] 图14说明用3.6mg/kg的胰岛素、3.6mg/kg的实施例III的胰岛素衍生物和
17.9mg/kg的实施例III的胰岛素衍生物处理的动物中Δ血糖随时间变化的函数； [0032] 图15说明皮下注射和静脉内注射天然胰岛素的药代动力学曲线； [0033] 图16说明皮下注射和静脉内注射实施例III的结合物的药代动力学曲线； [0034] 图17说明皮下注射和静脉内注射实施例III的药代动力学曲线； [0035] 图18说明皮下注射胰岛素、实施例III和实施例III的结合物的药代动力学曲线比较；

[0036] 图19说明静脉内注射胰岛素、实施例III和实施例III的结合物的药代动力学曲线比较；

[0037] 图20说明在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠中皮下注射胰岛素、实施例I到IV和介质后的药效曲线比较；

[0038] 图21说明在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠中皮下注射胰岛素、实施例I到IV的结合物和介质后的药效曲线比较；

[0039] 图22说明重复皮下注射实施例III(第一天、第六天、第十二天、和对照)的药效曲线比较；和

[0040] 图23说明重复皮下注射实施例III的结合物(第一天、第六天、 第十二天、和对照)的药效曲线比较。

[0041] 发明详述

[0042] 本发明提供长效胰岛素衍生物。更具体地，胰岛素衍生物包括胰岛素分子和与其连接的活性基团，所述活性基团用于与血液成分共价结合。在本申请中，共价结合是指在给用本发明的胰岛素衍生物时在体内形成结合物胰岛素-活性基团-血液成分。还是指通过使本发明的胰岛素衍生物与白蛋白源接触在体外发生共价结合，白蛋白源可为重组白蛋白，或从主体血浆提取、或通过本领域技术人员已知的任何其它适当的来源提供。 [0043] 胰岛素分子可为天然人胰岛素(参见以下式I所示的天然人胰岛素的序列)或其类似物如具有氨基酸取代、氨基酸删除、或氨基酸加入的胰岛素分子。以下列举的是可用于本发明中的胰岛素类似物的例子，其不以任何方式限制本发明的类似物：得自Aventis Pharmaceuticals Inc.的称为Lantus 的胰岛素glargine，其在位置A21被甘氨酸取代和在链B的C末端加入两个精氨酸残基；得自Novo Nordisk A/S的称为Levemir 的胰岛素detemir，其为天然人胰岛素，其中位置B30的苏氨酸被删除，和在赖氨酸B29的侧链上加入十四烷酰基；得自EliLilly的称为Humalog 的胰岛素lispro，其为Lys B28、Pro B29的人胰岛素；得自Novo Nordisk A/S的称为NovoLog 的胰岛素aspart，其为Asp B28人胰岛素；和得自Aventis的称为Apidra 的胰岛素glulisine，其为Lys B3、Glu B29的人胰岛素。

[0044]

[0045] 活性基团可与胰岛素分子或其类似物上的不同官能度连接。优选地，活性基团与胰岛素分子可获得的氨基连接，如链A和B的N-末端氨基酸的α-氨基，或Lys B29的ε-氨基。根据本发明，包含取代的和/或加入的氨基酸的胰岛素类似物可包含另外的氨基用于连接活性基团；或包含其它适合于与活性基团连接的官能度。能够在体内或体外与血液成分共价结合的优选活性基团为麦克尔受体(α，β不饱和羰基部分)含琥珀酰亚胺基的基团和含马来酰亚胺基的基团。更优选的活性基团为含马来酰亚胺基的基团，更优选为MPA(3-马来酰亚胺基丙酸)。

[0046] 选择性地，活性基团选择性地通过连接体连接于胰岛素分子。优选连接体选自下组中：羟乙基基元，如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、氨基乙氧基乙氧基琥珀酸(AEES)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]]乙氧基乙酸(AEEA)、AEEA-AEEA、-NH2-(CH2)n-COOH(其中n为1到20的整数)；一种或多种其中可包括氧、氮、或硫原子的饱和或不饱和烷基链(C1-C10)基元，如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(OA)、4-氨基苯甲酸(APhA)。连接体的组合的例子包括但不限于AEEA-EDA、AEEA-AEEA、AEA-AEEA、AEES-AEES等。优选的连接体为8-氨基辛酸(AOA)或没有连接体而使用活性基团MPA连接。本领域技术人员应该容易地知道何种类型的连接体适合于本发明的目 的。

[0047] 本发明还涉及胰岛素结合物。该结合物包括胰岛素衍生物，其中胰岛素衍生物的活性基团已经在体内或体外与血液成分反应形成共价键。因此，可通过给用胰岛素衍生物在体内形成结合物，或通过使胰岛素衍生物与血液溶液或纯化的血液成分在允许形成共价键的条件下在体外形成结合物。可通过自血液样品提取和纯化提供、或通过重组技术生产纯化的血液成分。优选的血液成分为血液蛋白，更优选血清白蛋白。

[0048] 本发明另外涉及治疗与血糖相关的疾病或病症的方法，该方法包括给用胰岛素衍生物或胰岛素结合物。与血糖相关的疾病或病症包括I型和II型糖尿病、以及妊娠糖尿病。另外，还可以通过给用本发明的胰岛素衍生物或胰岛素结合物治疗囊性纤维化、多囊卵巢综合症、胰腺炎和其它与胰腺有关的疾病。胰岛素又已知为生长因子，因此本发明的胰岛素衍生物或胰岛素结合物可用于局部给药用于创伤愈合和其它相关的适应症。 [0049] 以下实施例只是用于进一步说明上述的本发明，其不是用于限制本发明的范围。 [0050] 实施例

[0051] 图1说明与以下实施例一起提到的胰岛素分子和Gly A1、Phe B1和Lys B29位置。

[0052] 实施例I

[0053] (Gly A1)-MPA-胰岛素的合成

[0054] 将胰岛素(100mg)溶解于DMF(二甲基甲酰胺)(2mL)和TFA(100μL)中。向该溶液中加入NMM(4-甲基吗啉，200μL)和MPA-OSu(N-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯，9.2mg，2.5当量)并搅 拌反应2小时。通过加入水猝灭反应并用AcOH(乙酸)调节到pH4。加入乙腈溶解沉淀物，并且水/乙腈(3∶1)的总体积为2mL。将溶液注射到半制备HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶剂A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶剂B)平衡。通过以9.5mL/min在120分钟内从27到31％B梯度洗脱。通过214和254nm的UV吸光度检测含肽级分。
以9.5mL等分收集级分。通过直接注射到LC/MS上后的质量检测鉴定含所需产物数据的级分。收集Rt＝36-46分钟的纯级分，合并并冻干，得到白色粉末(40mg)，以及23mg回收的胰岛素。

[0055] 计算的质量为5958.5g/mol，通过LC-MS测量的质量为5958.0g/mol。 [0056] 表1表示为了证实A-链N末端被封端和B链N末端(苯丙氨酸)仍然游离而进行的氨基酸序列分析(使用异硫氰酸苯酯的Edman降解法)。

[0057] 表1

[0058]

[0059] 表1表示通过实施例I到IV的Edman降解法进行结构说明

[0060] 实施例II

[0061] (Phe B1)-MPA-胰岛素的合成

[0062] 用超声处理将胰岛素(100mg)溶解于DMSO(二甲基亚砜)(4mL)和Et3N(三乙胺)(100μL)中。向该溶液中加入Boc2O(二碳酸二叔丁酯)(9.3mg，2.5当量)并在环境温度下搅拌30分钟。通过加入水(15mL)和乙腈(5mL)猝灭反应并用AcOH调节溶液到pH4。将溶液注射到半制备HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250 mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶剂A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶剂B)平衡。通过以9.5mL/min在120分钟内从27到40％B梯度洗脱。通过214和254nm的UV吸光度检测含肽级分。以9.5mL等分收集级分。通过直接注射到LC/MS上之后的质量检测鉴定含所需产物数据的级分。分离三个产物(Boc-胰岛素、Gly A1Lys B29-双Boc-胰岛素和三Boc-胰岛素)，将所需的(GIyA1 Lys B29)-双Boc-胰岛素的级分合并并冻干，得到白色粉末(72mg)。

[0063] 使DMF(3mL)中的(Gly A1 Lys B29)-双Boc-胰岛素(51mg)与MPA-OSu(36mg)在Et3N(30μL)的存在下反应。在环境温度下搅拌反应2小时。在真空下蒸发DMF。将残余物用TFA(2mL)处理10分钟，然后将TFA蒸发。将粗产物溶解于水/乙腈(3∶1)中并将溶液注射到半制备HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250 mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶剂A)和TFA的乙腈溶液(CH3CN中的0.1％TFA，溶剂B)平衡。通过以9.5mL/min在120分钟内从27到32％B梯度洗脱。通过214和254nm的UV吸光度检测含肽级分。以9.5mL等分收集级分。通过直接注射到LC/MS上之后的质量检测鉴定含所需产物数据的级分。将纯级分合并并冻干，得到白色粉末(29mg)。 [0064] 计算的质量为5958.5g/mol，通过LC-MS测量的质量为5958.4g/mol。 [0065] 使用氨基酸序列分析(使用异硫氰酸苯酯的Edman降解法)证实B-链N末端被封端和A链N末端(甘氨酸)仍然为游离的(参见表1)。

[0066] 实施例III

[0067] (B1)-MPA-OA-胰岛素的合成

[0068] 使DMF(3mL)和Et3N(30μL)中的(Gly A1 Lys B29)-双Boc-胰岛素(39mg)与MPA-OA-OSu([N-琥珀酰亚胺基8-N-(3-马来酰亚胺基丙酰基)氨基辛酸酯]25mg)反应4小时。蒸发DMF并用TFA处理残余物10分钟。在蒸发TFA之后，将残余物溶解于水/乙腈(1∶3)中。将溶液注射到半制备HPLC中。Phenomenex Luna 10 mphenyl-hexyl 21 mm X250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶剂A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶剂B)平衡。通过以9.5mL/min在120分钟内从27到36％B梯度洗脱通过214和254nm的UV吸光度检测含肽的级分。以9.5mL等分收集级分。通过直接注射到LC/MS上之后的质量检测鉴定含所需产物数据的级分。将纯级分合并并冻干，得到白色粉末(21mg)。 [0069] 计算的质量为6099.5g/mol，通过LC-MS测量的质量为6099.6g/mol。 [0070] 实施例IV

[0071] (Lys B29)-MPA-胰岛素的合成

[0072] 将胰岛素(74mg)溶解于DMSO(2mL)和乙酸(46μL)中。向该溶液中加入Boc2O(6.9mg，2.5当量)并在室温下搅拌反应5小时。加入水(15mL)和乙腈(5mL)并将溶液注射到半制备HPLC柱(C18phenyl-hexyl)中，在120分钟内以9.5mL/min的流速和27-40％的梯度洗脱。将43分钟的级分合并并冻干，得到(Gly A1 Phe B1)-Boc2-胰岛素(30mg)。

[0073] 使DMF(2mL)和NMM(4-甲基吗啉，100μL)中的(Gly A1 PheB1)-Boc2-胰岛素(30mg)与MPA-OSu(10mg)反应60分钟。蒸发DMF 并用TFA处理残余物10分钟。将残余物溶解于水/乙腈(3∶1)中并将溶液注射到半制备HPLC中。Phenomenex Luna 10 mphenyl-hexyl 21 mm X250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶剂A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶剂B)平衡。通过以9.5mL/min在120分钟内从27到32％B的梯度进行洗脱。通过214和254nm的UV吸光度检测含肽级分。以9.5mL等分收集级分。通过直接注射到LC/MS上之后的质量检测鉴定含所需产物数据的级分。将纯级分合并并冻干，得到白色粉末(22.2mg)。

[0074] 计算的质量为5958.5g/mol，通过LC-MS调整的质量为5958.0g/mol。 [0075] 使用氨基酸序列分析(使用异硫氰酸苯酯的Edman降解法)证实B-链(苯丙氨酸)和A链(甘氨酸)的N-末端都是游离的(参见表1)。

[0076] 实施例V

[0077] MPA-(AEES)2-COOH连接体的合成

[0078] 使用Biotage “40i急骤层析”模块化系统进行急骤柱色谱法。在Waters“Breeze”系统1500系列上进行半制备HPLC纯化，使用Phenomexluna(RP-18，10 u phenyl-hexyl 250×21.2mm)柱，流动相流速为9.5mL/min。使用Gilson 690系统进行制备级的纯化，使用Phenomexluna(RP-18，10 u phenyl-hexyl 250×50.0mm)柱，流动相流速为50mL/分钟。使用Gilson 690系统用于制备规模的纯化，使用Phenomexluna(RP-18，10 uphenyl-hexyl 250×50.0mm)柱，流动相流速为50mL/min。使用乙腈(CH3CN)(含0.1％TFA)在水(含0.1％TFA)中梯度洗脱，更多细节在每个化合物的合成过程中指出。使用具有ES1电喷射源的Agilent 1100系列LC-MSD单四极质谱仪进行LC-MS。

[0079] MPA-(AEES)2-COOH连接体的合成

[0080]

[0081] 实施例VI

[0082] (Phe B1)-MPA-(AEES)2-胰岛素的合成

[0083] 使甲醇(150mL)中的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(50.0g)与Boc2O(93.4g)反应30分钟。在真空中蒸发甲醇并将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水、盐水洗并用硫酸钠干燥。在蒸发溶剂之后，粗产物用于下一步。MS m/z 205。

[0084] 在Et3N(66mL)的存在下将保护的醇溶解于N，N-二甲基甲酰胺(500mL)中。在0下在30分钟内滴加MsCl(甲磺酰氯)(33.4mL)，然 后在环境温度下搅拌1小时。然后向反应混合物中加入NaN3(127.6g)，随后加入NMM(N-甲基吗啉，215mL)并在40-50搅拌反应16小时。将反应混合物倾入到乙酸乙酯(2L)中并用水洗。将水层用乙酸乙酯(2L)反萃取并将合并的乙酸乙酯层用水、盐水洗并干燥。在蒸发溶剂之后，粗产物用于下一步(101.4g，含一些DMF)。MS m/z 231。

[0085] 将粗产物(62.4g)溶解于甲醇(300mL)中，随后加入Pd(OAc)2(3.0g)和甲酸(96％，62g)。在反应完成之后，通过硅藻土过滤除去Pd物质。真空除去甲醇并在真空下进一步干燥。粗产物用于下一步。

[0086] 将粗产物溶解于二氯甲烷中并用Et3N中和，直到为碱性的。一次性加入琥珀酸酐(32.3g)。反应在环境温度下搅拌1小时。真空除去溶剂并通过1N的HCl将残余物酸化到pH3。用乙酸乙酯萃取产物。使乙酸乙酯层通过硅胶短柱(1kg)。然后硅胶用含2-4％甲醇的乙酸乙酯洗。将纯级分(通过薄层色谱法判断)合并并真空除去溶剂，得到Boc-AEES，为油状残余物(36g，44％)。MS m/z 305。

[0087] 将Boc-AEES(5.5g)用二氯甲烷(30mL)中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，4.57g)和乙基-(二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，7.62g)处理2小时。将NHS酯倾入到乙酸乙酯(500mL)中，用0.1N HCl洗并用硫酸钠干燥。真空除去溶剂并将残余物直接用于下一步。

[0088] 将Boc-AEES(6.05g)用三氟乙酸(TFA，10mL)处理10分钟。真空除去TFA并真空下进一步干燥。将(AEES)氨基酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中并用过量的NMM碱化。然后加入得自实施例V的粗产物并将反应在环境温度下搅拌1小时。减压蒸发溶剂并将残余物注射到制备HPLC中，在60分钟内使用5-40％的梯度洗脱。除去溶剂并将残余物在真空下干燥，得到Boc-(AEES)2-COOH，为油状物(5，64g，84％)。MS m/z 478。 [0089] 将Boc-(AEES)2-COOH(3.60g)用三氟乙酸(TFA，10mL)处理10分钟。真空除去TFA并在真空下进一步干燥。将(AEES)2氨基酸溶解于N，N-二甲基甲酰胺中并用NMM碱化。加入MPA-OSu(2.94g)并搅拌混合物30分钟。在真空下除去N，N-二甲基甲酰胺。将残余物溶解于水并注射到制备HPLC中，在60分钟内使用5-40％的梯度洗脱。将纯级分合并并除去溶剂，得到MPA-(AEES)2-COOH，为灰白色固体(3.8g，95％)。MS m/z 542.2。 [0090] 在NMM(1.13mL)的存在下将MPA-(AEES)2-COOH(3.04g)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中并用对硝基氯甲酸苯酯(1.13g)处理。反应混合物在环境温度下搅拌2小时。在真空下除去N，N-二甲基甲酰胺。使用Biotage 系统将残余物通过急骤色谱法纯化。
将柱用乙酸乙酯(500mL)冲洗，随后用10％甲醇的乙酸乙酯混合液(1L)冲洗。将纯级分合并并除去溶剂，得到MPA-(AEES)2-CO2PNP，为固体(1.39g，37％)。MS m/z 663。 [0091] 在环境温度下在NMM(200μL)的存在下使N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中的Gly A1、Lys B29-双Boc-胰岛素(200mg)与得自实施例VIII的MPA-(AEES)2-CO2PNP(200mg)偶联16小时。在真空下除去N，N-二甲基甲酰胺并将残余物用TFA处理10分钟。真空除去TFA，将残余物溶解于水中并注射到HPLC中，在120分钟内使用27-32％梯度洗脱。将纯级分合并并冻干溶剂，得到(Phe B1)-MPA-(AEES)2-胰岛素，为白色粉末(95.0mg，43.7％)。
MS m/z 6330.4。

[0092] 实施例VII

[0093] (B29)-MPA(AEES)2-胰岛素的合成

[0094] 在环境温度下在NMM(200μL)的存在下使N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中的Gly A1、Phe B1-双Boc-胰岛素(200mg)与实施例VI的MPA-(AEES)2-CO2PNP(200mg)偶联16小时。在真空下除去N，N-二甲基甲酰胺并将残余物用TFA处理10分钟。真空除去TFA之后，将残余物 溶解于水中并注射到HPLC中，在120分钟内使用27-32％梯度洗脱。将纯级分合并并冻干溶剂，得到(Lys B29)-MPA-(AEES)2-胰岛素，为白色粉末(56.3mg，25.9％)。MS m/z 6328.8。

[0095] 实施例VIII

[0096] (B29)-MPA(OA)-胰岛素的合成

[0097] 在环境温度下在NMM(20μL)的存在下使N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中的Gly A1、Phe B1-双Boc-胰岛素(205mg)与MPA-OA-CO2Su(139mg)偶联16小时。在真空下除去溶剂并将残余物用TFA处理10分钟。真空除去TFA之后，将残余物溶解于水中并注射到HPLC中，在120分钟内使用27-36％梯度洗脱。将纯级分合并并冻干溶剂，得到(LysB29)-MPA-(OA)-胰岛素，为白色粉末(64.2mg，31％)。MS m/z 6098.8。 [0098] 实施例IX

[0099] 体外结合试验

[0100] 将Wistar大鼠的肝细胞膜用[125I]胰岛素和高浓度的胰岛素、DAC：如图1中所述的胰岛素及其相应的结合物在4下培养16小时。将膜过滤并洗涤3次，将滤液计数以测定特异性结合的[125I]胰岛素。使用GraphPad Prism软件计算IC50。

[0101] IC50的结果在表2中说明。

[0102] 表2

[0103]

[0104] 图2和图3说明根据抑制率％作为本发明的胰岛素衍生物浓度的函数确定的结合到肝细胞膜中的胰岛素。

[0105] 实施例X

[0106] 体外生物活性

[0107] 使用脂肪细胞中的葡萄糖摄取评价体外活性。将鼠科成纤维细胞系3T3-L1细胞分化为脂肪细胞用于生物测定。将3T3-L1细胞涂板并在DMEM和10％FBS中生长到铺满，随后培养两天。通过加入地塞米松和胰岛素诱导分化(D0)。到第七天，超过90％的细胞表现出脂肪细胞表型，即，脂类小滴积聚。图4A-4C表示前成脂肪细胞，3天后的细胞和第七天的脂肪细胞。图5A和5B表示在第四天的脂肪细胞和第七天的脂肪细胞的油红o染色。图6A和6B表示在第四天的脂肪细胞和第七天的脂肪细胞的油红o和亚甲基蓝染色。 [0108] 将3T3-L1脂肪细胞在包含5mM葡萄糖和0.5％FBS的DMEM中饥饿(starved)过夜。将细胞在包含1％BSA的Kreb′s-Ringer-Hepes 缓冲液中漂洗并在37下在高浓
14
度的胰岛素、DAC：胰岛素衍生物及其相应的结合物下培养20分钟，并在加入[ C]-2-脱氧-D-葡萄糖(1μCi/孔)后再培养20分钟。将细胞溶解并测量放射性。根据胰岛素对TM
照计算葡萄糖摄取率(％)并使用GraphPad Prism 软件计算EC50。

[0109] 表3表示测试的化合物的EC50结果，图7说明葡萄糖相对于对照的摄取率％随化合物浓度(M)的变化的函数。

[0110] 表3

[0111]

[0112] 实施例XI

[0113] 另外，使用在其它脂肪细胞源中的葡萄糖摄取率评价体外活性。使用从Wistar雄性大鼠得到的称重为175±25g的附睾脂肪。在37下将组织(0.03g/ml)在pH7.4的改性HEPES溶液中用胶原酶降解。将受试化合物和/或介质以500μL等分在pH7.4的改性HEPES缓冲液中培养，然后加入D-[3-3H]葡萄糖(2.5μCi/ml)培养2小时。受试化合物诱导的相对于对照2 nM胰岛素应答的超过50％或更多(50％)的葡萄糖结合增加表明可能的胰岛素受体激动剂活性。受试化合物抑制胰岛素诱导的葡萄糖结合应答超过50％则表明了胰岛素受体拮抗剂活性。在10、1、0.1、0.01、和0.001μM筛选化合物。 [0114] 表4表示受试化合物的EC50结果，图8说明葡萄糖相对于对照的摄取率％随化合物浓度(M)改变的函数。

[0115] 表4

[0116]

[0117] 实施例XII

[0118] 体内实验

[0119] 比较了对糖尿病雌性db/db小鼠皮下给用重组人胰岛素和本发明的胰岛素衍生物的血糖降低效果的评价。

[0120] 通过单次皮下弹丸(bolus)注射，对重量为24.3到33.3g的5-6周大的雌性db/db小鼠给用受试化合物。剂量注射的溶液的平均体积为0.35mL/小鼠(12.5mL/kg)。 [0121] 通过ICNTM以28IU/mg的浓度提供重组(大肠杆菌)人胰岛素(以下在本文中称为“rH胰岛素”)。

[0122] 通过用酸化水(～pH2)将合成的胰岛素衍生物重组，制备14.29mg/mL(～400IU/mL)的胰岛素衍生物的储备液。随后用0.9％NaCl稀释储备液并通过0.22μm过滤(Millex GV)，得到表5中所示的剂量溶液。第一组接受0.9％NaCl USP作为对照溶液。 [0123] 表5

[0124]

[0125] 分组和治疗总结在表6中。

[0126] 表6

[0127]

[0128] *基于供应商的估测，rH胰岛素的效价为28IU/mg。

[0129] 通过尾部末端进行采血(一滴)并使用手持糖度计(型号：One TouchUltraTM，Lifescan Canada)测定葡萄糖水平。在给药之前(剂量给药前)，剂量给药后1、2、3、4、6、24、30、48和72小时对所有动物测定血糖水平。

[0130] 体内结果：

[0131] 所有动物在给用受试化合物之前表现为正常。剂量给药后约一小时，第2组用100IU/kg重组人胰岛素(rH胰岛素)处理的动物表现出轻微活动减少和步态不协调。其它经处理的动物在整个实验过程中表现为正常。在用17.9mg/kg

[0132] 的实施例III处理的动物中观察到轻微的摄食量减少。

[0133] 表7表示在单次给药rH胰岛素和胰岛素衍生物之后的摄食量(总重量/笼(g))。 [0134] 表7

[0135] 摄食量：总重量/笼(g)

[0136]

[0137] 表8表示在单次给药rH胰岛素和胰岛素衍生物之后相对于对照的摄食量(总重量/笼(g))。

[0138] 表8

[0139] 相对于对照组的摄食量％

[0140]

[0141] 从每只小鼠的剂量后葡萄糖水平的血糖水平相对于剂量前葡萄糖水平的血糖水平计算Δ血糖，并报告在图9、10、11、12、13、和14中。通常，胰岛素衍生物(实施例I、实施例II和实施例III)能够以剂量依赖的方式降低血糖浓度，而只试验了一个剂量水平(100IU/kg)的重组胰岛素活性持续2小时。在3.6mg/kg，实施例2在第一个2小时过程中同胰岛素一样具有活性，而实施例I和实施例III只观察到边缘效应。rH胰岛素的降低作用在17.9mg/kg时更明显，因为观察到其持续高达24小时。虽然总体上倾向于表明胰岛素衍生物的活性持续高达24小时(与对照组比较)，重要的是要指出的是，葡萄糖水平在剂量给药后1-2小时时降低，然后在3-4小时时升高，并在6小时时再次降低。这种“起伏的”应答可能表明小鼠的进食习惯和代谢是可影响药效的重要参数。

[0142] 重要的是要提及的是，db/db小鼠随年龄形成胰岛素耐受性，其 可以说明必须要注射非常高剂量的胰岛素以观察葡萄糖降低作用。

[0143] 实施例XIII

[0144] 在正常大鼠中的药代动力学曲线

[0145] 以36nmol/kg皮下(sc)或12nmol/kg静脉内(iV)对7-8周龄雄性CD大鼠给用Rh胰岛素、实施例III的胰岛素衍生物和实施例III的胰岛素衍生物的结合物。收集血样直到72小时(rh胰岛素处理的动物只收集到3小时)。使用人胰岛素ELISA试剂盒(Linco)测定药物水平。使用WinNonlin软件通过非区隔分析(non-compartmental analysis)计算药代动力学参数，对于每种给药途径的每个化合物，N＝4只大鼠。图15为其中以36nmol/kg sc和12nmol/kg iv给用胰岛素的正常SD大鼠中的胰岛素的药代动力学曲线。图16为其中以36nmol/kg sc和12nmol/kgiv给用实施例III的结合物的正常SD大鼠中的结合物的药代动力学曲线。图17为其中以36nmol/kg sc和12nmol/kg iv给用实施例III的胰岛素衍生物的正常SD大鼠中的胰岛素衍生物的药代动力学曲线。图18为皮下给用胰岛素、实施例III的胰岛素衍生物和实施例III的胰岛素衍生物的结合物的PK曲线。图19为静脉内给用胰岛素、实施例III的胰岛素衍生物和实施例III的胰岛素衍生物的结合物的PK曲线。

[0146] 实施例XIV

[0147] 糖尿病大鼠中的单剂量药效

[0148] 通过单次i.v.注射链脲佐菌素(60mg/kg)在雄性CD大鼠中诱导糖尿病。两天后，TM大鼠接受单次皮下注射120nmol/kg的DAC ：胰岛素衍生物、300nmol/kg的预形成的结合物、20U/kg(120nmol/kg)的rh胰岛素、或介质。用手持糖度计对每组5只大鼠(除了介质组为每组3只大鼠外)测量刚好注射前和剂量给药后1、2、3、4、6、8、10、11、24、30和48小时的血糖水平。正常大鼠的血糖为5.2到7.6mmol/L。

[0149] 图20表示给药120nmol/kg的实施例I到IV之后大鼠的血糖水平。图21表示以300nmol/kg给用本发明的实施例I到IV的相应的 结合物之后大鼠的血糖水平。 [0150] 实施例XV

[0151] 在重复皮下给用DAC：胰岛素衍生物及其相应的预形成的结合物后的效价的评价 [0152] 进行该试验是要评价在成年雄性CD 大鼠中重复皮下注射实施例III的胰岛素衍生物及其结合物相对于游离的人重组胰岛素的效价。

[0153] 在研究的第1天通过单次静脉内(i.v.)注射链脲佐菌素(60mg/kg，pH4.5)在雄性CD 大鼠中诱导I型糖尿病。监测受试血液的血糖确认为高血糖。在研究的第3-14天通过皮下注射(s.c.)以1mL/kg体重每天一次给用受试化合物。在每天即将剂量给药之前和给药后2、8和18小时检查血糖水平。每天监控进食量和饮水量。在研究的第1、3、6、9、12、15和17天收集体重数据。

[0154] 图22说明实施例III的胰岛素衍生物在第1、6和12天每天的血糖曲线，图23说明实施例III的胰岛素衍生物的结合物在第1、6和12天每天的血糖曲线。 [0155] 虽然已经参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，其能够被进一步改进，并且本申请包括通常根据本发明原理对本发明所作的任何变体、应用和改进，并且包括在本发明所述领域中已知的或惯例的实践范围内的和可能适用于在上文中所述基本特征的、和在权利要求范围内的从本发明的公开的这种偏离。