一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母工程菌及制备方法和应用转让专利
申请号 : CN200610125183.5
文献号 : CN1970570B
文献日 : 2010-04-14
发明人 : 徐进平 , 孟小林 , 王健 , 鲁伟 , 李静
申请人 : 武汉大学
摘要 :
本发明公开了一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母基因工程菌株的构建方法及应用，编码重组对虾蛋白Pen9的核苷酸和氨基酸序列，一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)，CCTCC No：M206002，利用工程菌株表达重组对虾蛋白Pen9。重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有明显的抗菌活性。Pen9对流感病毒(A型H3N2)在鸡胚中的增殖有抑制作用。Pen9在制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，并作为防腐剂在化妆品、食品和饲料中应用。
权利要求 :
1.一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白Pen9，其特征在于所述蛋白Pen9的氨基酸序列如序列表1所示。
2.根据权利要求1所述对虾蛋白Pen9，其特征在于所述蛋白Pen9的分子量为8.9千道尔顿。
3.一种编码权利要求1所述对虾蛋白Pen9的核酸，其特征在于所述核酸的核苷酸序列如序列表2所示。
4.一种表达权利要求1所述对虾蛋白Pen9的基因工程菌株，其特征在于所述菌株是重组基因工程酵母(Pichia pastoris)菌株，其特征在于所述菌株的保藏号为CCTCC No：M206002。
5.权利要求1或2所述的对虾蛋白Pen9在制备用于治疗或预防革兰氏阳性菌药物中的用途。
6.权利要求1或2所述的对虾蛋白Pen9在制备用于治疗或预防革兰氏阴性菌药物中的用途。
7.权利要求1或2所述的对虾蛋白Pen9在制备用于治疗或预防抗病毒感染药物中的用途。
说明书 :
一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母工程菌及制备方法和
应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，更属于一种表达重组对虾蛋白Pen9的基因工程菌株，更具体涉及一种含有对虾肽基因的酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)和对虾肽相关的重组对虾蛋白Pen9，重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和病毒均具有明显的抗生物活性。本发明还涉及基因工程菌株的制备方法。重组对虾蛋白Pen9作为一种制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，并可作为防腐剂应用于化妆品、食品和饲料等领域。
背景技术
[0002] 抗菌肽是生物体防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的一类小分子多肽，是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽具有抗细菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞、螺旋体等多种活性(Bals R，Wang X，Meegalla R L，etal.Infect Immun，1999，67：3542～3547.)。1975年，G.Boman等在惜古比天蚕蛹中发现和研究了抗菌多肽cecropins，该肽在昆虫天然免疫中发挥着重要的作用。
[0003] 抗菌肽广泛存在于生物界中，研究者在细菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物和人类中相继发现并获得了抗菌肽或具有类似抗菌肽性质的活性多肽。目前，在昆虫、鱼类、鸟类、被囊动物、两栖动物、哺乳动物、植物和人类等多种生物体中发现并分离了300多种内源性抗菌肽。目前报道的cecropins约有30多种。哺乳动物抗菌肽主要存在于中性粒细胞、黏膜和皮肤等。Lee等首先从猪小肠分离得到的cecropin P1。在绵羊中已发现约10种抗菌肽基因，在牛中已发现约30种抗菌肽，人体中的抗菌肽多以防御素为主。防御素包括α-防御素和β-防御素。已经在各种脊椎动物中发现了100余种防御素，哺乳动物防御素主要存在于吞噬细胞、白细胞或小肠的潘氏细胞中，特别是中性粒细胞中。
[0004] 抗菌肽抗菌广谱，对病毒、寄生虫、癌细胞均有抑制作用。抗菌肽具有杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌的功能。哺乳动物防御素具有十分广泛的抗菌谱，抗革兰氏阴性菌和阳性菌、真菌、病毒，同时对支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞(如肿瘤细胞)有杀灭作用。cecropin P1是一种哺乳动物抗菌肽，具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌及一些革兰氏阴性菌有抑制或杀灭作用。猪的抗菌肽Protegrins富含Cys，具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性。
[0005] 有些抗菌肽对真核微生物如霉菌、酵母也具有抑制作用。LfcinB及其衍生物能够通过抑制白色念球菌、毛癣菌等菌丝生长，而抑制真菌病原体的繁殖。
[0006] LfcinB和LfcinH具有抗寄生虫生物活性，能够抑制贾第鞭毛虫的生长，杀死培养基中的贾第鞭毛虫。另外，LfcinB对体外环境下的鼠弓形体具抑制作用。
[0007] 猪的抗菌肽Protegrins具有抗HIV病毒活性。LfcinB可降低细胞巨化病毒和HIV、疱疹1型和2型病毒、腺病毒、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒和猫嵌杯样病毒等对宿主细胞的感染力，抑制病毒颗粒复制。有些抗菌肽具有抗癌活性，LfcinB对转化细胞具有细胞毒作用。
[0008] 抗菌肽具有调节机体免疫与消炎的作用。Lfcin(25AA)能调节动物机体免疫分子水平、辅助杀死体内致病细菌、原虫或病毒。一般认为，LfcinB通过与机体消化道免疫系统作用，增强细胞免疫反应，从而间接提高机体的抵抗力。抗菌肽参与机体的多种其他的生理功能。一些抗菌肽具有抗氧化作用。
[0009] 抗菌肽是虾的防御系统的主要成分之一。Destoumieux等从南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，其中3种同时具有抗真菌和抗细菌活性，尤其是抗革兰氏阳性菌的活力。Pan等发现蓝蟹、白滨对虾和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的组织提取液具有抗DNA病毒和RNA病毒活性。
[0010] 对虾抗菌肽Penaeidins是从南美白对虾血液中分离出的一组抗菌肽，具有抗真菌活性。当Penaeidins的浓度较低时，抑制不同品系真菌的生长，并且导致其形态异常。当Penaeidins的浓度较高时，通过抑制抱子萌发而杀死真菌。尖袍镰刀菌能感染不同的对虾品种，Penaeidins具有抗尖袍镰刀菌活性。Pen-2和Pen-3a对于许多丝状真菌具有抗菌活性，其最小抑菌浓度(MIC)低于10μmoL/L。另外，许多致植物病的真菌对Penaeidins敏感，因此，Penaeidins可应用于农业真菌病害的防治。
[0011] 对虾抗菌肽Penaeidins具有抗细菌活性。Destoumieux等研究表明，Penaeidins可以通过多种抗菌模式发挥作用。Penaeidins对不同品系的菌类或者起到快速杀死的作用，或者表现为抑制剂的作用。用10倍于最小抑菌浓度(MIC＝2.5-5μmoL/L)的Pen-2或Pen-3a作用于巨大芽孢杆菌，会迅速杀死杆菌。Penaeidins对绿色气球菌有缓慢致死作用(在作用24h后，该菌的存活率仍达10％)，并且能够强烈抑制该菌的生长(Pen-3a的MIC＝0.3-0.6μmoL/L)。
[0012] 天蚕素(Cecropins)是由31～39个氨基酸组成的多肽，分子量约为4kDa，具有广谱抗菌作用。哺乳动物防御素具有保守的6个半胱氨酸，能形成3个稳定的二硫键。在猪小肠中已分离到的Cecropin P1含31个氨基酸残基，分子量是3339u，富含Pro-arg，不含半胱氨酸(Cys)，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，C端酰胺化。大多数抗菌肽具有α-螺旋或者β-折叠结构，有些同时包含这两种结构。Cecropin P1二级结构分子内含有两亲性α-螺旋，中间是形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列。该螺旋-卷曲-螺旋结构对保持高抗菌活性具有特殊重要性。
[0013] 对虾抗菌肽Penaeidins等电点为9.34-9.84。Penaeidin富含阳离子，其N端有一个富含脯氨酸的区域，推测Penaeidins N端参与靶细胞的相互作用，而不具有直接抗菌的活性。Penaeidins C端有3个分子内二硫键。推测是Penaeidins的C端使该肽具有抗菌活性。大多数有分子内二硫键的抗菌肽，如防御素，所具有的抗菌属性与Penaeidins的相同。Penaeidins进行翻译后修饰，Pen-3a的N端存在焦谷氨酸。
[0014] 致病性病原菌是影响畜牧业发展的一个重要因素，传统抗生素的应用导致了细菌耐药性、药物残留等问题，给人类的健康造成了巨大的威胁。在饲料中大量使用抗生素作为添加剂，不仅破坏养殖动物体内的正常菌群，而且易在动物体内残留，影响到产品的品质和出口创汇。目前，人们对食品安全日益关注，越来越多的国家开始呼吁禁用抗生素，国内外对抗菌肽新产品的研究与开发已成为世界前沿性课题。
[0015] 国内外学者在研究抗菌肽一级结构的基础上，采用分子生物学和基因工程技术方法来获得抗菌肽转基因的动植物或大批量的表达抗菌肽，以作为新一代的抗菌药来源。
[0016] 抗菌肽与传统的抗生素相比，具有抗菌谱广、分子量小、热稳定性好、抗菌机理独特等优点。具有抗细菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞、螺旋体等多种活性，尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用。抗菌肽不破坏生物体细胞，无免疫原性，且不易产生耐药性。因此，利用基因工程技术体外生产抗菌肽，以替代传统的抗生素，或作为环保型饲料添加剂，不仅可增强养殖生物的抗病能力，而且可提高养殖产品的质量。研究开发海洋生物抗菌肽，如对虾抗菌肽Penaeidins及其相关重组对虾蛋白具有广阔的应用前景。
发明内容
[0017] 本发明的目的是在于提供一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母基因工程菌株。重组对虾蛋白Pen9具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性；对病毒的感染具有明显的抗病毒活性。基因工程重组对虾蛋白Pen9可广泛应用于动物和植物的细菌、真菌和病毒病的预防和治疗，并应用于化妆品、食品和饲料等领域。
[0018] 本发明的一个目的在于提供一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母工程菌的制备方法，方法易行，操作方便。
[0019] 本发明的另一个目的在于提供一种表达重组对虾蛋白Pen9的制备方法，方法易行，操作方便。
[0020] 本发明涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗革兰氏阳性细菌活性药物中的应用。
[0021] 本发明涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗革兰氏阴性细菌活性药物中的应用。
[0022] 本发明涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗病毒感染活性药物中的应用。
[0023] 目前，国内外学者采用基因工程技术改造或合成稳定高效、特异且对宿主无害的抗菌肽基因，研究抗菌肽在原核细胞、真核细胞或某些藻类中的表达，以及抗菌肽转基因的动植物。经生物工程技术所批量生产的抗菌肽，将有希望替代抗生素，成为抑制或杀灭临床微生物病原体、危害水产养殖品种的主要病原体等，特别是耐药菌的新型药物。
[0024] 通过基因工程技术生产抗菌肽具有重要的意义。目前，在表达抗菌肽的基因工程技术中，采用大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达体系。大肠杆菌能被大规模培养。在昆虫细胞表达体系中，由于外源蛋白处在极晚期病毒启动与调控下，此时细胞已经开始死亡。因此，采用昆虫细胞表达体系大量表达抗菌肽尚存许多问题有待解决。
[0025] 本发明的目的是在于提供一种含有南美白对虾Penaeidin基因的重组基因工程酵母菌株，其特征在于：该菌株是一种高效表达重组对虾蛋白Pen9的重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)，该菌株于2006年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M206002。南美白对虾Penaeidin基因通过同源重组方式被稳定的整合在毕赤酵母基因组上。利用该基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)，可高效、稳定地表达基因工程重组对虾蛋白Pen9。
[0026] 本发明的目的之一是在于提供一种酵母宿主细胞的构建方法，方法简便，操作方便，该宿主细胞包含重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列。
[0027] 本发明的目的之一是在于提供一种表达重组对虾蛋白Pen9的方法。利用重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)表达重组对虾蛋白Pen9，表达量高、融合表达，安全性高，利于产业化生产。
[0028] 本发明的目的之一是在于提供一种具有生物活性的重组对虾蛋白Pen9，其分子量为约8.9kDa。该蛋白具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性：对病毒的感染具有明显的抗病毒活性。
[0029] 本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表1的氨基酸序列至少有70％的同源性。
[0030] 本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表1的氨基酸序列至少有80％的同源性。
[0031] 本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表1的氨基酸序列至少有90％的同源性。
[0032] 本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9对应的核苷酸序列，其核苷酸序列与序列表2的核苷酸序列至少有50％的同源性。
[0033] 本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9对应的核苷酸序列，其核苷酸序列与序列表2的核苷酸序列至少有80％的同源性。
[0034] 本发明的目的之一是提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的DNA片断。
[0035] 本发明的目的之一是提供一种酵母宿主细胞的构建方法，该宿主细胞包含本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸片断。
[0036] 本发明还涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗革兰氏阴性细菌感染药物中的应用。
[0037] 本发明还涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗革兰氏阳性细菌感染药物中的应用。
[0038] 本发明还涉及重组对虾蛋白Pen9作为在制备治疗或预防抗病毒感染药物中的应用。
[0039] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0040] 本发明提供一种DNA片断的制备方法，该片段包含所述的编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列。
[0041] 在本发明的一个实施方案中，本发明所提供的一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，其具有与序列表1所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量为8.9千道尔顿，该基因工程重组对虾蛋白Pen9具有抗细菌和病毒感染的生物活性。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，其具有与序列表1所示氨基酸至少80％同源性的序列。
[0043] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，其具有与序列表1所示氨基酸至少90％同源性的序列。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9具有的氨基酸序列为序列表1。
[0045] 本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的氨基酸序列可以在一定范围内进行修饰、改变，所获得的修饰后的蛋白质或蛋白质的片段与基因工程重组对虾蛋白Pen9有相同的生物学功能。重组对虾蛋白Pen9具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性；对病毒的感染均具有明显的抗病毒活性。
[0046] 对蛋白质进行修饰和改变的方法为常规的方法[Joe Sambrook，DavidRussell et al.，Molecular Cloning：A Laboratry Manual，Cold Spring HarborLab(CSHL)Press，2001]，为本专业技术人员所熟悉。其中包括：(1)缺失或插入个别氨基酸。(2)插入特殊的氨基酸残基。(3)对个别氨基酸进行突变。通过上述方法获得的与本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9有70％同源性的蛋白质或片段都具有与本发明所述基因工程重组对虾蛋白Pen9相同的生物学功能，即它们具有广谱抗细菌和病毒感染的生物活性，能够用于实现本发明的一个或多个目的。
[0047] 本发明以南美白对虾为材料，提取总RNA，设计特异引物，通过RT-PCR、PCR扩增，得到其Penaeidin成熟肽编码区序列，核苷酸序列为：
[0048] tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa
[0049] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列为序列表2。
[0050] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，该蛋白为基因工程融合蛋白，N端氨基酸是：MG
[0051] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，该蛋白为基因工程融合蛋白，C端氨基酸是：DDDDKALEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
[0052] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾蛋白Pen9，该蛋白为基因工程融合蛋白，其中含有Penaeidin成熟肽编码区所对应的氨基酸序列：YRGGYTGPIPRPPPIGRPPFRPVCNACYRLSVSDARNCCIKFGSCCHLVKG
[0053] 本发明提供一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列，其具有与序列表2所示核苷酸至少有50％同源性的序列。
[0054] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列，其核苷酸序列与序列表2的核苷酸序列至少有80％的同源性。
[0055] 本发明所述的编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列可以在一定范围内进行改变，所获得的核苷酸序列与编码基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列具有相同的生物学功能。
[0056] 在本发明的一个实施方案中，所用pPIC6B质粒为Invitrogen公司产品，在pPIC6B质粒多克隆位点下游带有His.Tag，表达的重组对虾蛋白Pen9为融合蛋白，其分子质量约8.9kDa。
[0057] 在本发明的一个实施方案中，通过PCR引物的设计，在对虾Penaeidin成熟肽编码区下游引入肠激酶位点。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞——Pichia pastorisX33，该宿主细胞基因组包含编码本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程重组对虾蛋白Pen9的DNA片断。
[0059] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种毕赤酵母重组基因工程菌株，该菌株分类命名为Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2006年1月10日，保藏编号：CCTCC No：M206002。
[0060] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种表达重组对虾蛋白Pen9酵母基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)的制备方法。
[0061] A、美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成：采集南美白对虾血淋巴，获得血细胞，提取总RNA，并按Promega公司Universal RiboclonecDNA Synthesis System试剂盒操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链；
[0062] B、PCR扩增Penaeidin基因：以反转录合成的cDNA第一条链为模板，上游引物P1：5′GAATTCGCCATGGGGTACAGGGGCGGTTACACA 3′(下划线处为EcoR I位点)；下游引物P2：
5′TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3′(下划线处为XbaI位点)。利用PCR仪扩增，获得191bp目的基因；
5′TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3′(下划线处为XbaI位点)。利用PCR仪扩增，获得191bp目的基因；
[0063] C、重组质粒pG EM-T/Pen的构建和鉴定
[0064] 回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化E.coli JM 109(购于美国Promega公司)感受态细胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T/Pen；
[0065] D、重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的构建和鉴定：用EcoRI和XbaI分别双酶切质粒pPIC6B和质粒pGEM-T/Pen DNA，将Penaeidin基因定向插入质粒pPIC6B，获得重组穿梭质粒pPIC6B/Pen。转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含300μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)的LB平板上筛选阳性克隆，用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序分析鉴定重组穿梭质粒pPIC6B/Pen；
[0066] E、重组穿梭质粒pPIC6B/pen转化Pichia pastoris X-33，获得毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)。
[0067] a.重组 穿梭质 粒pPIC6B/Pen DNA的线性 化：小量制 备质粒 pPIC6B/penDNA15-20μg，经RNaseA消化，然后用限制性内切酶Sac I进行酶切线性化，沉淀过夜。
[0068] b.Pichia pastoris X-33感受态细胞的制备：挑取Pichia pastoris X-33单菌落，接种子5ml YPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，离心收集菌体，经0.1M LiCl处理制备Pichia pastoris X-33感受态细胞。
[0069] c.转化：采用线性化的重组穿梭质粒pPIC6B/Pen DNA转化Pichiapastoris X-33感受态细胞，涂布于含300μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)的YPD平板上。30℃，培养2～3天，观察单菌落的形成。同时，按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6B，作为阴性对照。
[0070] F.毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)的筛选与鉴定：提取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)基因组，以Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)基因组DNA为模板，用酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1与p3′AOX1进行PCR鉴定，同时设Pichiapastoris X-33(pPIC6B)基因组DNA和Pichia pastoris X-33基因组DNA两个对照。
[0071] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)表达基因工程重组对虾蛋白Pen9的方法。
[0072] (1)用无菌牙签从平板上挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichiapastoris X-33(pPIC-pen)单菌落，接种于20ml YPD培养液中，30℃、260rpm振摇培养过夜，取此菌液按2％体积比转接于100ml BMGY培养基中，30℃、200rpm振摇培养20h。4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY重悬菌体，每隔24h按培养液的0.5％体积补充无水甲醇，
28℃、200rpm振摇培养120h，诱导表达重组对虾蛋白Pen9。
28℃、200rpm振摇培养120h，诱导表达重组对虾蛋白Pen9。
[0073] (2)每24小时取样一次，4℃、15000rpm离心10min，收集表达菌体，菌体采用玻璃珠破碎法制备蛋白质抽提物，加入适量的蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA和抑菌剂叠氮钠，贮存于-20℃。
[0074] (3)采用SDS-PAGE和Western Blot方法，取诱导表达48、72、96、120小时的样品和阴性对照Pichia pastoris X-33(pPIC6B)样品，检测重组对虾蛋白Pen9的表达。
[0075] 在本发明的一个实施方案中，提供了一种纯化基因工程重组对虾蛋白Pen9的方法。
[0076] (1)采用玻璃珠破碎法制备蛋白质抽提物，离心收集上清。
[0077] (2)采用His·Bind resin柱，按照操作手册纯化基因工程重组对虾蛋白Pen9。
[0078] (3)PBS缓冲液(pH7.3)透析处理纯化的基因工程重组对虾蛋白Pen9。
[0079] (4)采用Bradford assay法，测定重组对虾蛋白Pen9的含量。
[0080] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0081] 在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾蛋白Pen9的生物活性。重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性，对病毒的感染具有明显的抗病毒活性。
[0082] 在本发明的一个实施方案中，采用纸片扩散法，检测了重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌的生物活性，Pen9对革兰氏阳性菌有明显的抗菌活性
[0083] 在本发明的一个实施方案中，采用纸片扩散法，检测了重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阴性细菌的生物活性，Pen9对革兰氏阴性菌有明显的抗菌活性
[0084] 在本发明的一个实施方案中，检测了重组对虾蛋白Pen9对流感病毒(A型H3N2)增殖的影响，Pen9对流感病毒(A型H3N2)在鸡胚中的增殖具有明显的抑制作用。
[0085] 本发明的优越性在于：
[0086] 目前，对虾抗菌肽的天然产量有限，从对虾中获取对虾抗菌肽步骤复杂，产量极低。如果通过化学合成方法，步骤复杂、产量亦低、成本较高。本发明通过基因工程技术，采用酵母基因工程菌株生产抗菌肽，具有生产步骤简单、成本低、产量高的特征。
[0087] 对虾抗菌肽抗菌广谱，通过基因工程技术，宿主表达的抗菌肽可能会对宿主本身产生抑制作用，达不到理想的高效表达结果。因此，本发明在构建对虾抗菌肽基因工程菌株、表达对虾抗菌肽的同时，采取融合蛋白表达方式，选择毕赤酵母X-33宿主，胞内表达重组对虾蛋白Pen9。毕赤酵母体系具有外源基因整合稳定、发酵工艺成熟、宿主细胞能迅速生长进行高密度发酵的优点。本发明通过筛选获得高效表达重组蛋白Pen9的毕赤酵母基因工程菌株，通过优化毕酵母发酵条件提高重组蛋白Pen9的表达量。
[0088] 抗菌肽是由生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽，天然抗菌肽的极其有限，目前主要是通过基因工程技术和化学合成方法获得抗菌肽。但是，化学合成法步骤复杂、产量低、成本较高。Durvasula等[Durvasula RV，Gumbs A，Panackal A，et al.Prevention of insectbone disease：an approachusing transgenic symbiotic bacteria[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：3274-3278.]在昆虫细胞内表达了cecropin A和cecropin B。王志兴等[王志兴，贾士荣.抗菌肽分泌型载体的构建及转基因马铃薯中蛋白的胞外分泌.农业生物技术学报，1996，4(3)：277-286.]将抗菌肽cecropinB基因通过构建嵌合基因方式导入马铃薯，延迟了植株青枯病的发生，降低了病情指数。随着分子生物学和生物技术的发展，人们利用基因工程技术生产抗菌肽已经取得了一定的进展。
附图说明
[0089] 本发明的上述目的、特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图所示内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。
[0090] 图1为一种对虾基因Penaeidins PCR扩增鉴定图
[0091] Lane 1，2：Penaeidins PCR产物；Lane M：DL2000marker
[0092] 图2为一种重组质粒pGEM-T/Pen酶切和PCR鉴定图
[0093] Lane M1：MarkerIII；Lane1：pGEM-T/Pen/EcoRI；Lane 2：pGEM-T/Pen/XbaI；Lane3：pGEM-T/Pen/EcoRI+XbaI；Lane 4：PCR产物；Lane M2：DL2000Marker
[0094] 图3为一种重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的酶切和PCR鉴定图
[0095] Lane M1：MarkIII；Lane 1：质粒pPIC6B/Pen；Lane 2：载体pPIC6BEcoRI+XbaI双酶切；Lane 3，4：pPIC6B/Pen/EcoRI+XbaI双酶切；Lane M2：DL 2000Marker；Lane 5：Penaeidin PCR产物
[0096] 图4为一种Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)阳性重组子基因组DNA的PCR鉴定图
[0097] Lane 1，3，5：用引物P1、P2进行PCR鉴定；Lane 2，4，6：用引物p5′AOX1 Pichia primer与p3′AOX1 Pichia primer进行PCR鉴定；LaneM：Marker 2000
[0098] 图5为一种重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的构建过程图
[0099] 图6为一种18％SDS-PAGE检测重组对虾蛋白Pen9的表达图Lane M：Protein molecular marker；Lane 1：甲醇诱导Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)120h；Lane 2：甲醇诱导Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)96h；Lane 3：甲醇诱导Pichia pastoris X-33(pPIC6B)72h；Lane 4：甲醇诱导Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)72h；Lane 5：甲醇诱导Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)48h；Lane 6：未诱导酵母Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)
[0100] 图7为一种琼脂免疫扩散测定抗体效价图
[0101] 图8为一种重组对虾蛋白Pen9对大肠杆菌的抗菌活性试验结果图
[0102] 1.Amp阳性对照；2.空载体对照；3.15μl重组对虾蛋白Pen9；4.20μl重组对虾蛋白Pen9；5.30μl重组对虾蛋白Pen9；6.Break buffer溶液
[0103] 图9为一种重组对虾蛋白Pen9对金黄色葡萄球菌的抗菌活性试验结果图[0104] 1.先锋霉素VI阳性对照；2.Break buffer溶液；3.20μl重组对虾蛋白Pen9；4.空载体阴性对照；5.未诱导菌体
[0105] 图10为一种重组对虾蛋白Pen9对苏云金芽孢杆菌的抗菌活性试验结果图[0106] 1.先锋霉素VI阳性对照；2.空载体诱导；3.5μl重组对虾蛋白Pen9；4.15μl重组对虾蛋白Pen9；5.30μl重组对虾蛋白Pen9；6.Break buffer溶液
具体实施方式
[0107] 实施例1南美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成
[0108] 将南美白对虾饲养于通氧22℃的水箱中待用。选取蜕皮间期健康虾，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，用2.5mL一次性注射器从虾的腹窦处收集血淋巴750μL，加入等体积7
的抗凝剂(pH7.0)，镜检记数，取细胞含量为1×10 的血淋巴于4℃、800g离心15min，移去上清，收集血细胞。按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃，以备用。
的抗凝剂(pH7.0)，镜检记数，取细胞含量为1×10 的血淋巴于4℃、800g离心15min，移去上清，收集血细胞。按照Qiagen公司RNeasy Mini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃，以备用。
[0109] 以 Oligo(dT)15 为 引 物，采 用 Promega 公 司 的 Universal Riboclone cDNASynthesis System试剂盒，按照操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链。具体操作步骤如下：将以下试剂加入到经DEPC浸泡并灭菌处理过的PCR反应管中：25mM MgCl2，4μL；10×反转录缓冲液，2μL；10mM dNTP混合物，2μL；重组的 核糖核酸酶抑制剂，0.5μL；24U/μL AMV反转录酶，0.8μL；0.5μg/μL Oligo(dT)15引物1μL；总RNA，
3μL；无核酸酶的水，2.7μL。反应条件为：42℃，1小时；95℃，5分钟；3℃，5分钟。将合成的cDNA第一链存放于-80℃备用。
3μL；无核酸酶的水，2.7μL。反应条件为：42℃，1小时；95℃，5分钟；3℃，5分钟。将合成的cDNA第一链存放于-80℃备用。
[0110] 实施例2南美白对虾Penaeidin基因的扩增
[0111] 1.扩增引物的合成
[0112] 设计引物，上游引物P1：5′GAATTCGCCATGGGGTACAGGGGCGGTTACACA 3′(下划线处为EcoRI位点)；下游引物P2：5′TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA3′(下划线处为XbaI位点)。引物由美国Alpha公司合成。
[0113] 2.目的基因的PCR扩增
[0114] 按照Reverse Transcription Reaction试剂盒操作手册，以反转录合成的cDNA第一条链为模板，PCR扩增目的基因Penaeidin。PCR反应体系：10×reaction buffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加无菌水至终体积为50μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35个循环)；72℃，5min。
[0115] 琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示。PCR扩增目的基因Penaeidin产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，有一约为191bp DNA带，与预测结果相符。
[0116] 实施例3重组质粒pGEM-T/Pen的构建和鉴定
[0117] 1.PCR产物的回收
[0118] 采用DNA胶回收试剂盒(Omega公司产品)，按照Omega公司DNA胶同收试剂盒说明书回收PCR产物片段。具体操作步骤如下：
[0119] (1)上述PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。
[0120] (2)在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。
[0121] (3)将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。
[0122] (4)加300μL Binding Buffer，离心弃去液体。
[0123] (5)加750μL Washing Buffer，离心弃去液体。
[0124] (6)重复步骤(5)。
[0125] (7)空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。
[0126] (8)将柱子放于1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，收集离心液，贮存于-20℃。
[0127] 2.目的基因片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T/Pen
[0128] 将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为：2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T载体，0.5μL；PCR产物，4.0μL；T4DNA ligase，0.5μL；无加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液体，16℃连接15h。
[0129] 3.质粒的转化
[0130] (1)感受态细胞的制备：采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。挑取单个E.coli JM109菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mL LB培养液中，37℃，220rpm振荡，待菌液OD值为0.6时，取1.5mL菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，弃上清。加入800μL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min，弃上清。加入100μL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，4℃保存，7～10天内使用。
[0131] (2)质粒转化E.coli JM109感受态细胞：取上述连接产物10μL加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入390μL新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。取100μL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和Amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜，观察结果，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR和酶切鉴定。阳性重组质粒被命名为pGEM-T/Pen。
[0132] 4.重组质粒pGEM-T/Pen的鉴定
[0133] (1)采用碱裂解法提取质粒DNA
[0134] 随机挑取10个单克隆白斑，抽提质粒。
[0135] A.分别用无菌牙签挑取生长在氨苄青霉素平板上的单菌落，接种到3mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。
[0136] B.次日将培养的菌液4℃，12,000rpm离心30s，吸弃上清，收集菌体沉淀，加入100μL冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl，pH8.0，10mMEDTA，pH8.0)，剧烈振荡使沉淀完全悬浮。
[0137] C.加入200L溶液II(0.2M NaOH，1％SDS，临用前配制)，颠倒数次混匀，待整个溶液澄清，冰浴静置5min。
[0138] D.加入150μL冰预冷的溶液III(将5M KAc60mL、HAcl 1.5mL、ddH2O28.5mL混匀配制成100mL)，轻微振荡均匀，冰浴10min，澄清的溶液会出现絮状沉淀。
[0139] E.4℃，12,000rpm离心10-15min，转移上清至一个无菌Eppendorf管中。F.加入等体积的苯酚，充分混匀，4℃，12,000rpm，离心5min，取上清液转入另一支无菌的Eppendorf管中，再依次用等体积的苯酚/氯仿(1/1)、苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)同上抽提。
[0140] G.离心后取上清，加入800μL预冷的无水乙醇，-20℃沉淀2小时。
[0141] H.12,000rpm离心15min，去上清，吸弃液体，倒置于无菌滤纸上待其干燥。
[0142] I.加入室温(20-25℃)放置的70％乙醇1mL，4℃，12,000rpm离心10min，吸弃液体，倒置于无菌滤纸上37℃温箱内干燥。
[0143] J.DNA沉淀溶于50μL含RNaseA(10mg/mL)的TE溶液(10mMTris-Cl，1mMEDTA，pH8.0)中，-20℃存放。
[0144] (2)重组质粒pGEM-T/Pen的PCR鉴定
[0145] 重组质粒pGEM-T/Pen的PCR鉴定结果见附图2。以质粒DNA为模板，用引物P1、P2扩增，PCR产物为191bp，与预测结果相符，表明目的基因Penaeidin已克隆入pGEM-T载体中。
[0146] (3)重组质粒pGEM-T/Pen的酶切鉴定
[0147] 重组质粒pGEM-T/Pen的酶切鉴定结果见附图2。
[0148] 酶切反应体系：质粒15μl；10×M buffer 2μl；EcoRI 1μl；XbaI 1μl；H2O：1μl；总体积20μl。37℃水浴酶切4小时，然后进行1.2％琼脂糖凝胶鉴定。
[0149] 重组质粒pGEM-T/Pen经EcoRI+XbaI双酶切，得到约3000bp和191bp的预期DNA片断，pGEM-T/Pen经EcoRI单酶切，得到单一约3190bp的预期DNA片断。
[0150] 实施例4基因Penaeidin核苷酸序列测定
[0151] 将重组质粒pGEM-T/pen DNA送上海联众生物工程有限公司进行DNA测序分析。采用DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为T7p启动子引物，全自动测序分析。
[0152] 序列测定结果：Penaeidin DNA序列全长191个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：
[0153] A：50nucleotides T：42nucleotides
[0154] G：49nucleotides C：50nucleotides
[0155] 根据DNA序列，推测的蛋白质等电点(IP)为9.0。
[0156] 实施例5重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的构建和鉴定
[0157] 1.重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的构建
[0158] 提取重组质粒pGEM-T/Pen，用EcoRI和XbaI双酶切，得到目的片段penaeidin；同样酶切pPIC6B空载体。将双酶切后得到的penaeidin与空载体pPIC6B在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，得到重组质粒pPIC6B/Pen。连接反应体系如下：
[0159] pPIC6B载体：2μl；penaeidin片段：10μl；T4 DNA buffer：1.5μl；T4 DNA连接酶：1.5μl。
[0160] 用该重组质粒pPIC6B/Pen转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，在含300μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)的LB平板上筛选阳性克隆，获得大肠杆菌菌株E.coli JM109(pPIC6B/Pen)。采用裂解法，提取质粒pPIC6B/PenDNA(参见分子克隆实验指南(第三版))。
[0161] 2.重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的鉴定
[0162] 用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序分析鉴定重组穿梭质粒pPIC6B/Pen。
[0163] (1)重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的PCR鉴定
[0164] 重组质粒pPIC6B/Pen的PCR鉴定结果见附图3。以质粒pPIC6B/PenDNA为模板，用实施例2中的引物P1、P2扩增，PCR产物为约191bp，与预测结果相符，表明目的基因Penaeidin已克隆入pPIC6B载体中。
[0165] (2)重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的酶切鉴定
[0166] 重组质粒pPIC6B/Pen的酶切鉴定结果见附图3。
[0167] 酶切反应体系：质粒15μl；10×M buffer 2μl；EcoRI 1μl；XbaI 1μl；H2O：1μl；总体积20μl。37℃水浴酶切4小时，然后进行1.2％琼脂糖凝胶鉴定。
[0168] 重组质粒pPIC6B/Pen经EcoRI和XbaI双酶切，得到约3400bp和191bp的预期DNA片断。
[0169] (3)重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的测序结果
[0170] 将重组质粒pPIC6B/Pen DNA送上海联众生物工程有限公司进行DNA测序分析。采用DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为T7启动子引物，全自动测序分析。测序结果表明Penaeidin基因已正确定向插入穿梭载体pPIC6B中。
[0171] 实施例6重组穿梭质粒pPIC6B/Pen转化Pichia pastoris X-33
[0172] 1.重组穿梭质粒pPIC6B/Pen DNA的线性化
[0173] 小量制备重组质粒pPIC6B/Pen DNA 15-20μg，用RNaseA在37℃消化30min，然后在60μL体系中用限制性内切酶Sac I进行酶切线性化，37℃水浴锅中保温4h后，用苯酚∶氯仿(25∶24)抽提一次，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，加0.1体积的3M的乙酸钠(pH5.2)、2.5倍体积的无水乙醇，混匀置于-20℃沉淀过夜，4℃、12000rpm离心20min，弃上清，用超纯水配置的75％的乙醇洗2次，自然晾干后，用5-10μL TE溶液溶解沉淀，-20℃保存备用。用限制性内切酶SacI酶切线性化载体质粒pPIC6B，作为阴性对照。
[0174] 用超纯水分别配置1M LiCl和50％PEG，分别用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；用1.5mL Eppendorf管分装，密封，4℃保存备用。将Salmon sperm DNA用TE(pH8.0)配成
2mg/mL的溶液，沸水中水浴加热5min，然后立即插在冰上直接使用或-20℃保存备用。
2mg/mL的溶液，沸水中水浴加热5min，然后立即插在冰上直接使用或-20℃保存备用。
[0175] 2.Pichia pastoris X-33感受态细胞的制备
[0176] 用无菌牙签挑取一酵母Pichia pastoris X-33单菌落，接种于5mL YPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，第二天取200μL酵母菌液接种于20mLYPD，30℃、280rpm振摇培养到OD600为0.6～0.8时，转至无菌离心管，室温(20-25℃)、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，用25ml无菌ddH2O重悬，室温(20-25℃)、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，再用1ml无菌ddH2O重悬，转到1.5mL的Eppendorf管中，室温(20-25℃)、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，加1mL 0.1M LiCl重悬菌体，12,000g离心15sec，弃尽上清，用400μL 0.1M LiCl重悬菌体，用1.5mL的Eppendorf管，每管100L分装使用，该酵母感受态细胞即制即用。
[0177] 3.转化
[0178] 将以上制备的100μL酵母感受态细胞，12,000g离心15sec，弃尽上清，向该Eppendorf管中严格按以下顺序加入试剂：
[0179] 240μl 50％PEG
[0180] 36μl 1M LiCl
[0181] 25μl 2mg/ml single-stranded DNA
[0182] linearized pPIC6B/Pen DNA in 50μl steriled water[0183] 在漩涡振荡器上剧烈振动大约1min，使各试剂成分充分混合均匀，细胞充分悬浮后；将混合液在30℃条件下静置孵育30min，接着42℃热激20～25min，然后室温(20-25℃)下6,000-8,000rpm离心5min，弃上清，用1mL YPD重悬细胞，30℃、200rpm振摇培养，1h后取细胞培养液100μl涂布于含300μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)的YPD平板上。将平板正放于30℃培养箱，至平板表面液体吸干，倒置培养2～3天，观察单菌落的形成。将该经转化的菌株命名为毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)。
[0184] 同时，按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6B，获得毕赤酵母Pichiapastoris X-33(pPIC 6B)，作为阴性对照。
[0185] 实施例7毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)的筛选与鉴定
[0186] 1.酵母基因组的提取
[0187] 从YPDS平板上挑取10～20酵母单菌落，分别接种于3ml YPD培养液中，将1.5ml过夜培养液转到1.5ml的Eppendorf管中，室温、12000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬于50μL STES缓冲液中；向酵母悬液中加入50μL酸洗过的玻璃珠。每管加入20μL TE(pH7.6)，然后加入60μL苯酚∶氯仿(25∶24)，盖紧盖子。先振荡1min，使有机相和水相充分混合，然后每振荡30sec就将Eppendorf管插在冰上，重复振荡6次。室温、12000rpm离心8min，将上层的水相转移到1.5ml的Eppendorf管中，分别加1/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.3)、2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min，4℃、12000rpm下离心10min，去上清，沉淀用75％的乙醇洗涤1次，12000rpm离心2min，去上清，空气干燥沉淀后，将沉淀溶解于40μL TE Buffer(pH7.6)，-20℃冻存备用。取5μL该酵母基因组DNA样品作琼脂糖电泳检测。
[0188] 2.PCR鉴定
[0189] 合成酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer与p3′AOX1Pichia primer，分别为p5′AOX1 Pichia primer：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC 3′；p3′AOX1 Pichia primer：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′，由上海生工生物工程公司合成。
[0190] 取1～10μL毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)基因组DNA样品作为PCR鉴定的模板。采用酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer与p3′AOX1 Pichia primer为引物，进行PCR鉴定。同时，采用实施例2中引物P1、P2为引物，进行PCR鉴定。PCR反应条件为：95℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min 30s，30个循环后，72℃10min。
[0191] 实验结果见附图4，表明目的基因Penaeidin已被准确地整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
[0192] 重组穿梭质粒pPIC6B/Pen的构建过程见附图5。
[0193] 3.测序鉴定
[0194] 制备Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)基因组DNA，送上海联众生物工程有限公司进行DNA测序分析。采用DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer和p3′AOX1Pichia primer，全自动测序分析。测序结果表明Penaeidin基因已正确定向整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
[0195] 经 上 述 筛 选、鉴 定 正 确 的 毕 赤 酵 母 重 组 基 因 工 程 菌 株 Pichia pastorisX-33(pPIC-pen)保藏于中国典型培养物保藏中心，该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC No：M206002。
[0196] 实施例8基因工程重组对虾蛋白Pen9的诱导表达
[0197] 利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)表达基因工程重组对虾蛋白Pen9。
[0198] (1)用无菌牙签从平板上挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichiapastoris X-33(pPIC-pen)单菌落，接种于20ml YPD培养液中(酵母菌完全培养基YPD：10g Yeast Extract，20g Peptone完全溶解后定容至900ml，如果要倒平板，则另加20g琼脂粉，蒸汽高压15磅灭菌20min，然后加100ml过滤除菌的20％dextrose。)。30℃、260rpm振摇培养过夜，取此菌液按2％体积比转接于100ml BMGY培养基中。(BMGY配制：完全溶解10g YeastExtract，20g peptone后定容到700ml。蒸汽高压15磅[121℃]灭菌20min。冷却到室温，加入100ml 10×PBS，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×G。4℃可保存两个月。(10×PBS配制：将132ml 1M K2HPO4和868ml1M KH2PO4混合均匀，确证pH为6.0，如需要用KOH或H3PO4调整为pH 6.0。蒸汽高压121℃灭菌20min。10×YNB配制：用134g含(NH4)2SO4无氨基酸的酵母氮源[YNB]完全溶解在800ml双蒸水中[可适当加热到50℃左右使YNB完全溶解]，定容到1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。4℃保存备用。500×B配制：将20mg生物素[biotin]完全溶解在100ml双蒸水中，过滤除菌，4℃保存。10×G配制：将100ml甘油和900ml双蒸水混合均匀，蒸汽高压115℃灭菌15min或0.22μm微孔滤膜过滤除菌。4℃保存。)30℃、200rpm振摇培养20h。
[0199] 4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY重悬菌体(BMMY配制：完全溶解10g Yeast Extract，20g peptone后定容到700ml。蒸汽高压15磅[121℃]灭菌20min。
冷却到室温，加入100ml 10×PBS，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M。4℃可保存两个月。10×M配制：将50ml甲醇和950ml双蒸水混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4℃可保存两个月。)
冷却到室温，加入100ml 10×PBS，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×M。4℃可保存两个月。10×M配制：将50ml甲醇和950ml双蒸水混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4℃可保存两个月。)
[0200] (2)28℃、200rpm振摇培养120h，每隔24h按培养液的0.5％体积补充无水甲醇，诱导表达重组对虾蛋白Pen9。
[0201] (3)每24小时取样一次，4℃、15,000rpm离心10min，收集表达菌体，贮存于-20℃。
[0202] 实施例9基因工程重组对虾蛋白Pen9的检测
[0203] 采用18％SDS-PAGE和Western Blot方法，检测毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)经甲醇诱导表达48、72、96、120小时的样品中重组对虾蛋白Pen9的表达，并设经甲醇诱导表达48、72、96、120小时的Pichia pastoris X-33(pPIC6B)样品作为阴性对照。
[0204] 1.18％SDS-PAGE的检测
[0205] 18％SDS-PAGE实验操作参照《分子克隆》(Joe Sambrook，DavidRussell et al.，Molecular Cloning：A Laboratry Manual，Cold Spring HarborLab[CSHL]Press，2001)进行，样品中加入5×SDS-PAGE样品缓冲液，用银染染色，检测分析表达结果。18％SDS-PAGE实验结果如附图6所示。
[0206] 18％SDS-PAGE电泳结果表明在甲醇诱导后，毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)表达基因工程重组对虾蛋白Pen9。分别取诱导前、诱导后48、72、96、120小时样品检测，结果表明随着诱导时间延长，诱导48、72、96小时Pen9表达量逐渐增大，96小时表达量达到最大，诱导120h表达量开始减少。表达产物基因工程重组对虾蛋白Pen9分子量与预期相符，为约8.9kDa。
[0207] 2.Western Blot的检测
[0208] Western Blot实验操作参照《分子克隆》进行，具体操作如下：
[0209] (1)转膜
[0210] A.湿转使用常规电转液：
[0211] Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10％SDS 180μl。
[0212] B.浸泡NC膜：
[0213] 将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
[0214] C.取胶：
[0215] 将18％SDS-PAGE胶卸下，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张(于转每侧三张)滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分。
[0216] D.转膜：
[0217] 采用干转方法，用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以2 2
1.5mA/cm 凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm 胶面积。
1.5mA/cm 凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm 胶面积。
[0218] (2)兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清的制备
[0219] A.材料
[0220] 考马斯亮蓝G250，牛血清白蛋白(BSA)弗氏佐剂均为Sigma公司产品，其它药品均为华美公司产品。新西兰大白兔由中国科学院武汉分院动物房提供。
[0221] B.Bradford法测定蛋白质浓度
[0222] 配浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mg/mL牛血清白蛋白溶液各100μL。向每管中加入1mL Bradford试剂工作液(0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振荡混匀后室温放置2分钟。用1cm光径的比色皿测BSA蛋白各浓度的OD值(λ＝570nm)。以BSA蛋白质浓度为横坐标，以BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线。用同样方法测定南美白对虾penaeidin蛋白样品的OD570值，从标准曲线中确定样品的浓度。
[0223] C.兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清的制备
[0224] 将纯化的penaeidin蛋白200μg和等体积的完全弗氏佐剂用对接的注射器来回抽吸，使之充分混合，乳化。将乳化好的目的蛋白皮下注射新西兰大白兔，并在免疫前耳静脉取血1mL。间隔两周后加强免疫1次，共加强免疫2次。最后一次加强免疫后一周采静动脉取血法采全血。血样收集在40mL的无菌的离心管中，常温下静置30分钟左右使之凝聚，37℃温箱中放值1.5h，用无菌的枪头将凝块与管壁分离，4℃放置过夜。次日从离心管中吸出血清，4℃下8,500rpm离心10分钟，去除不溶物。离心后得到的上层血清加入0.02％的叠氮化钠，置于-70℃保存。
[0225] D.兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清效价测定
[0226] 本实验采用琼脂扩散反应进行测定。具体操作方法如下：
[0227] 称取一定量的琼脂粉，按1％左右(0.8％～1.5％)的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。根据要求(孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径)按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散
24h～48h。
24h～48h。
[0228] 结果判定：将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。本实验将抗血清倍比稀释1、2、4、8、16、32倍进行效价测定，结果见附图7所示。抗体原液和经稀释2倍和4倍时，均能看到很明显的沉淀线，稀释4倍沉淀线相对较弱。
[0229] (3)封闭及杂交
[0230] A.封闭：
[0231] 将膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，在30mlTBST中加入3g脱脂牛奶混匀，将NC膜置于封闭液中封闭过夜。
[0232] B.结合一抗：
[0233] 一抗为上述制备的兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清。
[0234] 将封闭过夜的NC膜用双蒸水漂洗几次后置于30ml TBST中，并加入15μl一抗，室温轻摇一小时。
[0235] C.洗涤：
[0236] 一抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
[0237] D.结合二抗：
[0238] 二抗为辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgGs。将NC膜置于30mlTBST中，并加入3μL二抗，室温轻摇一小时。
[0239] E.重复步骤C。
[0240] F.室温以PBS洗膜15min。
[0241] G.在10mL ddH2O中按顺序依次加入DAB显色液，后将膜浸泡于DAB显色液中10-30min，直至蛋白条带出现。
[0242] H.以PBS清洗以终止显色反应。
[0243] Western Blot的检测结果表明甲醇诱导毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33(pPIC-pen)表达基因工程重组对虾蛋白Pen9。该蛋白质带能和兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清发生特异性反应，所设对照Pichia pastoris X-33(pPIC6B)蛋白质带均不能与兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清反应。
[0244] 实施例10基因工程重组对虾蛋白Pen9的纯化
[0245] 用Ni2+柱亲和层析法纯化基因工程重组对虾蛋白Pen9，具体操作方法如下：
[0246] (1)用无菌牙签从平板上挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichiapastoris X-33(pPIC-pen)单菌落，接种于20ml YPD培养液中。30℃、260rpm振摇培养过夜，取此菌液按2％体积比转接于100ml BMGY培养基中。30℃、200rpm振摇培养20h。4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，用100ml BMMY重悬菌体。28℃、200rpm振摇培养96h，其中每隔24h按培养液的0.5％体积补充无水甲醇。
[0247] (2)4℃、15000rpm离心10min，收集表达菌体。
[0248] (3)采用玻璃珠破碎法破碎酵母细胞。用1体积的玻璃珠破菌缓冲液(20mmol/L Tris-Cl，pH7.9，10mmol/L MgCl2，1mmol/L EDTA，5％甘油，1mmol/L DTT，0.3mmol/L硫酸铵，1mmol/L PMSF)重悬细胞；用2体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠；将细胞悬液转移至合适大小的带螺口的离心管中，于4℃以最大速度下振荡30～60s，将管置于冰上放置1～2min，重复3～5次，在显微镜下检查破细胞的程度；沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2～4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5～10次，等玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液；合并的上清液于4℃，12,000g离心60min，收集上清，即为基因工程重组对虾蛋白Pen9的抽提液，-80℃贮存。
[0249] (4)Pen9的抽提液经1×Binding Buffer透析(8X Binding Buffer配制：4M NaCl，160mM Tris-HCl，40mM imidazole，pH 7.9)、0.45μm的滤膜过滤，用1×Binding ++Buffer定容至100ml Ni 柱层析样品。用10床1×BindingBuffer，20床无菌水清洗柱床；
++
用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，结合Ni ；再用10床1×Binding Buffer平衡柱++
床(1床即是柱内介质的体积)。样品经蠕动泵以循环方式通过Ni 柱，使带有6×His的蛋++ ++ ++
白样品流动相充分与Ni 柱中的Ni 相结合，过夜后从Ni 柱出口收集未与Ni++结合的样品(穿漏液)。分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑30++
床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni 柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(4X Elute Buffer配制：4M imidazole，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9)洗脱与++
Ni 柱结合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。
++
用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，结合Ni ；再用10床1×Binding Buffer平衡柱++
床(1床即是柱内介质的体积)。样品经蠕动泵以循环方式通过Ni 柱，使带有6×His的蛋++ ++ ++
白样品流动相充分与Ni 柱中的Ni 相结合，过夜后从Ni 柱出口收集未与Ni++结合的样品(穿漏液)。分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑30++
床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni 柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(4X Elute Buffer配制：4M imidazole，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9)洗脱与++
Ni 柱结合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。
[0250] (5)Ni++柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗脱柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(4X Strip Buffer配制：2M NaCl，400mM EDTA，80mMTris-HCl，pH 7.9)洗柱子。
[0251] (6)通过18％SDS-PAGE检测Pen9在洗脱液中的分布，参照《分子克隆》进行18％SDS-PAGE，用银染检测分析表达结果。
[0252] 实施例11基因工程重组对虾蛋白Pen9抗细菌的生物活性
[0253] 采用纸片扩散法，检测基因工程重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌的生物活性。
[0254] 1.实验菌种包括：大肠杆菌(Escherichia coli)JM109株、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923株、枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC6633株、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki de Barjac and lemille)。
[0255] 2.将培养至对数生长期的不同细菌(CFU＝1.5×106个/mL)以1∶200比例均匀涂布于LB琼脂平板上，待干燥后贴上无菌纸片，将待测基因工程重组对虾蛋白Pen9样品溶液5-20μL加到纸片上。同时，分别设Pichia pastorisX-33、Pichia pastoris X-33(pPIC6B)抽提液、破碎菌体的break buffer各20μL作阴性对照，设含氨苄青霉素、先锋霉素VI的药敏纸片作阳性对照，并设无药对照纸片对照。37℃孵育12h后，测量抑菌圈直径大小。
[0256] 3.重组对虾蛋白Pen9对大肠杆菌的抗菌活性试验结果见附图8。重组对虾蛋白Pen9对金黄色葡萄球菌的抗菌活性试验结果见附图9。重组对虾蛋白Pen9对苏云金芽孢杆菌的抗菌活性试验结果见附图10。
[0257] 4.重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌生物活性抑菌圈直径测定见表1
[0258] 表1重组对虾蛋白Pen9对细菌抑菌圈直径测定
[0259]
[0260] 上述试验结果表明重组对虾蛋白Pen9对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗菌活性，且随着Pen9含量的提高，抑菌圈逐渐加大，效果不断加强。
[0261] 实施例12基因工程重组对虾蛋白Pen9抗病毒的生物活性
[0262] 依据戴华生编著的《病毒学实验诊断技术》，测定基因工程重组对虾蛋白Pen9抗流感病毒的生物活性。
[0263] 1.毒种和样品
[0264] 流感病毒毒种：A型H3N2流感病毒毒种由中国典型培养物保藏中心提供。基因工程重组对虾蛋白Pen9样品和Pichia pastoris X-33(pPIC6B)抽提液样品经0.22μm微孔滤膜过滤、除菌。
[0265] 2.按下表2所示依次将样品接入鸡胚尿囊腔：(病毒效价为480)
[0266] 表2接入鸡胚尿囊腔样品
[0267]组别 样品 检测样品/μL 病毒/μL 无菌水/μL 总体积/μL
1 病毒对照 0 500 500 1000
2 Pen9对照 500 0 500 1000
3 Pen9+病毒 500 500 0 1000
组别 样品 检测样品/μL 病毒/μL 无菌水/μL 总体积/μL
4 PichiapastorisX-33
500 500 0 1000
(pPIC6B)+病毒
1 病毒对照 0 500 500 1000
2 Pen9对照 500 0 500 1000
3 Pen9+病毒 500 500 0 1000
组别 样品 检测样品/μL 病毒/μL 无菌水/μL 总体积/μL
4 PichiapastorisX-33
500 500 0 1000
(pPIC6B)+病毒
[0268] 注：以上各组中分别加入10,000U/ml的青霉素及链霉素各10μL。37℃静置3小时后，各组样品接种鸡胚，每组接5只鸡胚。
[0269] 表2中，病毒(流感病毒A型H3N2)与样品37℃混合，37℃静置3小时后，将各组样品按每只鸡胚0.15mL接入9-11日龄尿囊腔。
[0270] 3.鸡胚尿囊腔接种具体操作如下：
[0271] (1)取孵育9-11天的鸡胚，照视、划出气室及胚胎位置，在距气室底边0.5cm处的卵壳上表明开孔记号。以酒精消毒开孔处，然后钻一小孔，再用酒精消毒。
[0272] (2)注射针头由小孔刺入0.5-1cm，注射器向钝头方向倾斜45°，注射0.15mL上述各组样品后用封口膜封口。置35℃孵育48小时。自接种起每日检视一次，于24小时内死亡的多为非特异性因素致死，应及时剔出。
[0273] (3)解剖及收获
[0274] 在接种48小时后收获。收获前将鸡胚于4℃冰箱过夜，将鸡胚冻死，血液凝固，以免收获时红血球流出，影响收获的病毒滴度。
[0275] 经冰冻鸡胚消毒后，用无菌镊子轻轻揭去气室部的卵壳，揭去壳膜，然后用移液枪通过绒毛尿囊腔吸出尿囊液。将收取的尿囊液置无菌小瓶内于-20℃保存。
[0276] 4.鸡胚尿囊液效价的测定
[0277] 表2中各组样品分别接种9-11日龄鸡胚尿囊腔，48小时后收获鸡胚尿囊液并测定其血凝效价。
[0278] (1)取一干净的血凝板，标记所要测定的标本名称。
[0279] (2)于第2孔加入0.9m L 0.85％生理盐水，从第3孔至第10孔各加0.2mL0.85％生理盐水。第1孔中加入0.2m L尿囊液，第2孔中加入0.1mL尿囊液，反复吹打7至8次混匀。
[0280] (3)从混匀的第2孔中吸入0.2mL至第3孔，再从第3孔中吸0.2mL至第4孔，依次类推作倍比稀释，直至第9孔，第10孔为红血球对照，即不加尿囊液。各孔液体量均为0.2mL，多余的弃去。
[0281] (4)从第10孔开始，于每孔加入0.2mL 1％红细胞悬液。相混后置室温30-60min后观察结果。结果以++++、+++、++、+、±和-表示。具体判定如下：
[0282] A.一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++。
[0283] B.基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。
[0284] C.红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。
[0285] D.红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。
[0286] E.红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪滴样者为一。
[0287] F.结果以+为终点，亦即一个凝集单位。
[0288] 5.基因工程重组对虾蛋白Pen9抗流感病毒生物活性测定
[0289] 基因工程重组对虾蛋白Pen9抗流感病毒血凝效价测定结果见表3。
[0290] 表3尿囊液流感病毒血凝效价测定
[0291]样品 鸡胚发育状况 所取尿囊液病毒效价
病毒对照 良好 480
重组对虾蛋白Pen9对照 良好 /
重组对虾蛋白Pen9+病毒 良好 120
PichiapastorisX-33(pPIC6B)+病毒 良好 480
病毒对照 良好 480
重组对虾蛋白Pen9对照 良好 /
重组对虾蛋白Pen9+病毒 良好 120
PichiapastorisX-33(pPIC6B)+病毒 良好 480
[0292] 上述血凝试验结果表明，基因工程重组对虾蛋白Pen9与流感病毒混合后接种鸡胚，基因工程重组对虾蛋白Pen9对流感病毒(A型H3N2)在鸡胚中的增殖具有明显的抑制作用。
[0293] 序列表1
[0294] (SEQUENCE LISTING No.1)
[0295] <110>武汉大学
[0296] <120>一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母工程菌及制备方法和应用[0297] <130>重组对虾蛋白Pen9的氨基酸序列
[0298] <160>1
[0299] <170>PatentIn version 3.1
[0300] <210>1
[0301] <211>81
[0302] <212>PRT
[0303] <213>重组蛋白质
[0304] <400>1
[0305] Met Gly Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro[0306] 1 5 10 15[0307] Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu[0308] 20 25 30
[0309] Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys[0310] 35 40 45
[0311] His Leu Val Lys Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ala Leu Glu Gln Lys Leu[0312] 50 55 60
[0313] Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His[0314] 65 70 75 80[0315] His
[0316] 序列表2(SEQUENCE LISTING No.2)
[0317] <110>武汉大学
[0318] <120>一种表达重组对虾蛋白Pen9的酵母工程菌及制备方法和应用[0319] <130>重组对虾蛋白Pen9的核苷酸序列
[0320] <160>1
[0321] <170>PatentIn version 3.1
[0322] <210>1
[0323] <211>246
[0324] <212>DNA
[0325] <213>重组DNA
[0326] <400>1
[0327] atggggtaca ggggcggtta cacaggcccg atacccaggc caccacccat tggaagacca 60[0328] ccgttcagac ctgtttgcaa tgcatgctac agactttccg tctcagatgc tcgcaattgc 120[0329] tgcatcaagt tcggaagctg ttgtcactta gtaaaaggag atgacgatga caaggctcta 180[0330] gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 240[0331] cattga 246