使细胞治疗中使用的细胞长期生长和存活的卵泡液转让专利
申请号 : CN200480032499.9
文献号 : CN1981030B
文献日 : 2010-06-23
发明人 : M·A·霍里斯伯格
申请人 : 艾沃根股份公司
摘要 :
本发明提供了通过在存在血清和卵泡液或卵泡液的成分的条件下培养细胞而防止体细胞衰老和死亡的方法。在体外具有有限寿命的体细胞获得干细胞的特性，并且能够连续地传代，不过，只能在连续存在卵泡液或其成分的条件下传代。
权利要求 :
1.防止体细胞衰老和死亡的方法，包括在含有血清的培养基或含有适当浓度的无机盐、生长激素或其它生长支持生物化学因子和激素的培养基等同物中并且在还含有卵泡液或其根据分子量和/或极性分级分离而获得的成分的条件下培养细胞。
2.如权利要求1的方法，包括以下步骤
-在含有血清的培养基中培养所述细胞；
-将卵泡液或其成分导入所述培养基和
-让细胞在重复的传代培养物中无限地增殖。
3.如权利要求1或2的方法，其中，所述卵泡液是部分纯化的。
4.如权利要求3的方法，其中，所述卵泡液是活性炭过滤的。
5.如权利要求3的方法，其中，所述卵泡液是未过滤的卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的大约1∶1的混合物。
6.如权利要求1或2的方法，其中，所述卵泡液的成分是＞30kDa的分子大小级份。
7.如权利要求1或2的方法，其中，所述卵泡液的成分是＞50kDa和＜3kDa的组合分子大小级份。
8.如权利要求1或2的方法，其中，所述卵泡液的成分是肽，它相当于人α-2-巨球蛋白前体的氨基酸序列，并且相当于其他物种的同源物。
9.如权利要求1或2的方法，其中，所述卵泡液选自猪，牛，绵羊和马卵泡液。
10.如权利要求9的方法，其中，所述卵泡液是猪卵泡液。
11.如权利要求1或2的方法，其中，所述细胞是颗粒细胞，皮肤成纤维细胞，神经元，角化细胞或肝细胞。
12.如权利要求11的方法，其中，所述细胞是颗粒细胞，皮肤成纤维细胞，神经元或肝细胞。
13.卵泡液或其成分防止体细胞衰老和死亡中的用途，所述用途通过在含有血清的培养基或含有适当浓度的无机盐、生长激素或其它生长支持生物化学因子和激素的培养基等同物中并且在还含有卵泡液或其根据分子量和/或极性分级分离而获得的成分的条件下体外培养细胞，由此导致所述细胞的成功增殖，并且保持它们的分化潜能。
14.如权利要求13的用途，其中，所述卵泡液是猪卵泡液。
15.卵泡液或其成分在使体细胞去分化中的用途，所述用途通过在含有血清的培养基或含有适当浓度的无机盐、生长激素或其它生长支持生物化学因子和激素的培养基等同物中并且在还含有卵泡液或其根据分子量和/或极性分级分离而获得的成分的条件下体外培养细胞，由此导致所述细胞的成功增殖，并且保持它们的分化潜能。
说明书 :
技术领域
组织工程是恢复，保持或改善组织功能的生物学替代品的开发。具体地讲，组织工程是在实验室中制备新的活组织以便替换病变或创伤组织的方法.
发明背景
再生组织的一种方法是从组织中分离特定的细胞，在体外扩增所述分离的细胞，并且将扩增的细胞植入入病变或创伤组织中，以便所述植入的细胞在体内增殖，并最终替代或修复组织缺陷.业已将这种技术应用在多种细胞类型和组织缺陷上.分离的细胞可以是来自特定组织的分化细胞或未分化的祖细胞(干细胞).在这两者场合下，用于细胞扩增的合适培养条件的建立是极为重要的，以便保持或改善它们使结构和功能性组织等同物再生的潜力.
组织再生技术发展的一个特别关键的部分是校正软骨组织中的缺陷。与其他组织不同，在受到创伤，病变或者由于老年而退化后，软骨很少具有自我再生的能力。这是由于正常关节软骨的无血管性质.尽管对表面软骨板的损伤通常不能愈合，软骨下骨是血管化的，因此对该部位的损伤只能愈合有限的程度.替代受损的关节软骨的新的软骨被称为纤维软骨.纤维软骨缺少原有透明蛋白软骨所具有的耐用性和更理想的机械特性.受到关节损伤的人们随后容易发生关节退化。
业已采用了若干种不同的方法来修复软骨组织，包括软骨刮片，软骨下钻孔，和组织自体/同种异体植入物。用于关节软骨修复的其他实验方法包括从软骨细胞活检物中获得软骨细胞，并且将软骨细胞直接接种在三维移植材料上，然后将移植物植入受损部位.这种技术导致了一旦再生完成就能获得高质量的软骨.不过，它需要从患者体内收获的大量的原材料，导致了对患者的创伤增加.
在其他方法中，从活检物中分离软骨细胞，在单层培养物中扩增，直到获得足够数量的细胞，并且植入受损的组织部位。同样在上述场合下，所述植入首先需要将所述细胞包埋在凝胶中或者与生物可降解的聚合物支架缔合.所述基质的三维特性赋予了植入物的结构完整性，并且提供了对软骨细胞生长成软骨组织的刚性支持.尽管该系统具有需要较少的细胞作为原材料的优点，但是如果细胞是从骨骼成熟的供体(成年人)体内收获或获得，用这种方法获得的软骨通常质量较差.
组织工程中的另一种主要问题是保持活细胞在培养物中生长和增殖的适当技术.细胞衰老是防止正常的二倍体哺乳动物细胞在培养物中无限地生长(增殖)的过程.
当今大部分变性疾病是通过药物治疗或对症治疗的，因为缺少可利用的患者相容性细胞或再生的组织，例如，通过上述方法之一，以便所述组织能够替换受损的组织或者修复由特定病症诱导的损伤.
相关的其他现有基于细胞的治疗方法是来自人类胚胎干(ES)细胞的同种异体细胞或来自猪的异种细胞.用于帕金森氏病的上述方法的例子是分化的人神经原(Geron)和猪胎神经细胞(Diacrin/GenVec).尽管所述方法具有科学前景，但是它们存在着重大限制.首先，人ES细胞会产生显著的伦理问题，因为必须破坏人类胚胎，以便制备ES细胞。其次，使用猪细胞存在潜在的未知问题，包括将猪携带的病原体传播给人类.第三，这两种方法都需要使用免疫抑制作用.
目前，迫切需要从患者自身的体细胞得到具有多种潜能的干细胞样细胞的有效方法.
正通过将来自体细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中克隆越来越多的动物，特别是家畜.该方法的问题是效率低.
发明概述
本发明的目的是通过新的多能中间体将一种类型的高度特化的体细胞，例如颗粒细胞的细胞核功能改变成另一种类型的技术.本发明不采用胚或胎组织实现功能的改变，并且可以设计用于采用自身细胞的个体患者。
现在业已惊奇地发现，在存在含有卵泡液或卵泡液的成分的血清的条件下培养体细胞，能防止细胞衰老.另外，在存在所述成分或所述卵泡液的条件的在体外培养具有有限寿命的体细胞，获得了干细胞的某些特性，并且可以连续地传代，不过，只能在连续存在卵泡液或来自卵泡液的成分的条件下传代.
本发明涉及防止体细胞衰老和死亡的方法，包括在含有血清的培养基或其等同物中并且在还含有卵泡液或其成分的条件下培养细胞.另外，本发明涉及使细胞去分化的方法，其方式导致所述细胞成功的增殖，并且保持它们的分化潜能，包括在含有血清的培养基或其等同物中并且在还含有卵泡液或其成分的条件下培养所述细胞.
具体地讲，本发明涉及的方法包括以下步骤
-在含有血清的培养基培养所述细胞；
-将卵泡液或其成分导入所述培养基和
-让细胞在重复的传代培养物中无限地增殖.
含有血清的培养基在本领域被广泛地使用.通常，所述血清是胎牛血清.根据体细胞的类型，还可以使用不含血清的培养基，不过，它是完全等同的，以便避免尚未完全了解的胎牛血清的副作用。所述等同的不含血清的培养基同样为本领域所熟知，并且特别包含适当浓度的无机盐，通常含有生长激素，例如，牛生长激素，或其他生长支持生物化学因子和激素。
卵泡液是从卵巢中获得的，并且能够方便地大量获得.可以考虑的具体卵泡液是猪，牛，羊和马卵泡液。优选的是猪卵泡液。
卵泡液可以是使用标准方法纯化或部分纯化的，如离心和通过惰性滤器过滤.进一步的纯化可以通过用活性炭过滤实现，已知活性炭能够保持低分子量成分和杂质.成分可以通过根据分子量和/或极性分级分离而获得.
优选使用活性炭过滤的卵泡液延长正常人二倍体成纤维细胞的寿命，而优选将未处理过的卵泡液用于建立和保持颗粒细胞系。活性炭过滤的卵泡液能够与未处理过的卵泡液混含，优选以大约1∶1的比例混合，并且混合物的活性高于未处理过的卵泡液的活性，如原代颗粒细胞系的建立和原代颗粒细胞系的增殖所示.未过滤的卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的大约1∶1的混合物在本发明的方法中是特别有效的，因此是优选的.
本发明方法中的其他优选的卵泡液的成分是＞30kDa的分子大小级份，以及＞50kDa和＜3kDa的组合分子大小级份.优选的大分子大小级份包括相当于人α-2-巨球蛋白前体的氨基酸序列的肽，并且相当于其他物种的同源物，它们同样是本发明方法所优选的.该蛋白家族的成员是同四聚体形式的，它由两对二硫键连接的链组成.优选具有生长促进活性和基质特性的卵泡液的高分子量成分.同样优选具有细胞存活活性的卵泡液的低分子量成分。
可以以导致细胞的成功增殖，并且保持它们的分化潜能的方式从衰老和死亡中恢复并且去分化的哺乳动物体细胞包括，例如，颗粒细胞，皮肤成纤维细胞，神经元，角化细胞或肝细胞，特别是颗粒细胞，皮肤成纤维细胞和神经元.不过，本发明并不局限于上述特定体细胞，它可应用于任何类型的体细胞.根据本发明，可以制备祖细胞类型(或干细胞-样)细胞，它可用于制备新的组织.能够分离并且扩增的任何类型的细胞都可用于再生新的组织.非限定性例子还包括内皮细胞，肌细胞，软骨细胞和黑素细胞.
当所述细胞被冷冻，保存并且随后用于培养时，体细胞的衰老是一个特殊问题.多种类型的体细胞在冷冻和保存时，培养效率会显著降低。本发明方法的效率可以在所述解冻的细胞上方便地验证.
本发明还涉及卵泡液或其成分在防止体细胞的衰老和死亡并且使体细胞去分化中的用途，其方式导致所述细胞成功增殖，并且保持它们的分化潜能.
基于上述用途，本发明提供了用于保持成年体细胞无限增殖潜力的新方法.所述细胞可以用作分化细胞的来源，其具有用于通过“治疗性克隆”治疗变性疾病的医学用途.
本发明还可以通过提供无限数量的向多能性方向再程序化的细胞而提高核转移效率.
体细胞的永生化通常是通过用端粒酶的表达载体转染培养的细胞实现的.本发明避开了所述转染方法，这是通过给所述细胞提供适合无限生长的环境.该过程是可逆的，就是说，通过本发明的方法获得的具有无限生长能力的细胞不是肿瘤细胞.
本发明利用了以下事实，即个体的所有体细胞都包括成为任何类型的细胞所必须的遗传信息，并且当处在诱导环境中时，最终分化的细胞的命运可以重新朝向多能性.这一事实业已通过在非人哺乳动物中进行的体细胞核转移实验的成功得到了验证.随着正常发育的进行，细胞的基因表达谱受到限制，并且基因组的区域被稳定地灭活，以便在正常条件下，所述细胞不能够恢复活力.本发明提供了诱导细胞核功能改变，并因此改变细胞身份的方法.体细胞，如颗粒细胞，在用卵泡液或其成分处理时，能够无限扩增，不过，在去掉卵泡液之后它们会死亡，即使在存在含有血清的培养基中也是如此.
在实施本发明时，没有制备或者使用任何物种的胚或胎，并且没有发生人类和非人线粒体或基因组DNA的混合.本发明的所有方法都能够在体外进行.恢复活力的/改变程序的卵泡液能够方便地从当地的屠宰场大量获得。
正如通过体细胞的核转移的成功所证实的，抹去成年分化的体细胞的记忆，并且用它的被长期遗忘的胚胎记忆取代其的能力仅仅受到操作细胞内和细胞外环境的能力的限制。通过给成年细胞提供卵泡液或其成分，本发明改变了细胞核记忆，并且诱导了核改变，这种改变通常出现在多能干细胞中.本发明的效果和优点包括以下所列：
-消除了伦理问题(不需要人类胚或胎组织，没有必要使用，制备或者破坏胚).
-没有线粒体不相容性(不将细胞核转移到去核的卵母细胞中).
本发明的方法包括以下步骤：提供事先从成熟组织中分离的细胞群体，并且在扩增条件下使所述细胞去分化.在去分化之后，可以诱导所述细胞以便再分化成不同的体细胞类型.为此，按照本发明方法制备的细胞和/或组织可以在第二种细胞培养基中，在存在至少一种能诱导和/或加快和/或促进细胞再分化的因子的条件下再分化.
能够增加细胞分化的多种因子中的任意一种都可以在细胞再分化过程中使用.可用于再分化的因子的非限定性例子包括花生四烯酸，前列腺素A，前列腺素B，前列腺素E，前列腺素F，和组胺，有或没有其他激素/皮质激素，如地塞米松，和生长因子。
本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的细胞扩增和去分化方法可应用于多种细胞类型.业已将组织工程技术用于通过使用多种不同的细胞类型校正缺陷.组织工程可用于校正硬组织缺陷，如在软骨或骨骼上由于病变或创伤导致的缺陷.业已将组织工程用于校正软组织结构.举例来说，在本发明中所使用的细胞可用于再生代谢器官(肝脏或胰腺)，上皮组织(例如烧伤患者的组织)或重建或增加乳房组织(例如可以将肌肉细胞用于重建受乳腺癌，先天性缺陷，或由于创伤造成的损伤影响的女性的乳房；参见美国专利号5,512,600和WO 96/18424，这两份文献都被收作本文参考)。另外，诸如膀胱输尿管返流，或失禁的先天性缺陷可以通过植入接种了有效数量的肌肉细胞的凝胶或支架基质进行校正，以便产生能提供对尿液通道所需要的控制的肌肉部位，或者校正所述缺陷(美国专利号5,667,778，收作本文参考).
本发明的去分化的细胞和上文所述的再分化的细胞可以用合适的生物可降解的聚合物基质植入，以便形成新的组织.有不同类型的基质可以使用。非限定性例子包括聚合物凝胶，它是由诸如在其中悬浮了细胞的藻酸盐的材料，具有大约100-300μm的间隙的纤维基质，和3D泡沫的材料形成.基质可以是基于天然存在的聚合物(例如透明质酸、胶原等)或合成聚合物(例如聚-乙醇酸、聚乳酸等)，或这两者.有关水凝胶聚合物溶液和聚合物基质和植入的其他方法的详细说明可以参见美国专利5,716,404.对于使用生物可降解的聚合物再生代谢器官和其他组织的其他方法，参见Cima等，Biotech.Bioeng.，38，145-158，1991；Langer等，Biomaterials，11，738-745，1990；Vacanti等，J.Pediatr.Surg.，23，3-9，1988；和Vacanti等，Arch.Surg.，123，545-549，1988。
在某些实施方案中，所述细胞基质结构是与组织扩张装置联合植入的。随着所述细胞基质的植入，或细胞增殖并且形成新组织，扩张装置的尺寸减小，直到它可以取出，并且获得需要的重建或增大.
附图简述
将通过以下实施例对本发明作更详细的说明，这些实施例并不意味着限定本发明的范围。所述实施例是结合附图说明的.
图1表示在CO2培养箱中，在37℃下，在存在卵泡液分子大小级份(表12，实施例J，卵泡液的分级分离)的条件下培养八天之后颗粒细胞的显微镜检查结果.数字表示孔的数量.
1：＞50kDa；2：30-50kDa，3：10-30kDa；4：3-10kDa；5：＜3kDa；6：完整的卵泡液；7：无卵泡液；8：＞50并且＜3kDa；9：用＞50kDa包被的孔；10：用＞50并且＜3kDa包被的孔.
图2表示在280nm波长的光密度(OD)(垂直轴)与大小层析收集的级份数量(水平轴)的曲线图，所述级份是通过SephadexTM G200super fine从卵泡液中获得的＞50kDa的级份(实施例K，卵泡液的高分子量因子的纯化).
图3表示颗粒细胞的衰老细胞的图2所示的大小层析级份的生物测定结果(实施例K，卵泡液的高分子量因子的纯化).CO+：阳性对照。只有级份23，24和25包括活性材料.
图4表示作为在含有10％胎牛血清的培养基(A)或含有10％胎牛血清和4％卵泡液的培养基(B)中培养的NHDF细胞的培养物(d)中的天数的函数的群体加倍的数量(n).卵泡液能够将所述细胞的增殖寿命延长大约15-20个群体加倍(实施例G，卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命).
图5比较了作为在含有10％胎牛血清的培养基(A)、含有10％胎牛血清和4％卵泡液的培养基(B)和含有10％胎牛血清和4％活性炭过滤的卵泡液的培养基(C)中培养的NHDF细胞的培养物(d)中的天数的函数的群体加倍的数量(n).在延缓衰老方面，活性炭过滤的卵泡液优于未处理过的卵泡液(实施例G，卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命).
优选实施方案的说明
A卵泡液的制备
收集卵巢
卵巢是从当地屠宰场屠宰至少4月龄的猪获得的.从刚处死的动物体内收集卵巢，并且立即放入装在保温瓶(thermobottle)中的温度大约为39℃的无菌0.9％NaCl(w/v)中。在回收2小时之内将它们转移到实验室中.所述容器抵达时的温度大约为33℃.
收集卵泡液
在预热到39℃的70％乙醇中对卵巢进行消毒10-20秒，然后将脂肪与周围的组织切开，并且立即放入无菌的磷酸缓冲盐水(PBS：0.2g/lKCl，0.2g/l KH2PO4，8g/lNaCl，1.15g/l Na2HPO4)中，在39℃下在恒温板(thermoplate)上用磁力搅拌器平衡.
卵泡液是使用吸液泵，在低真空条件下，并且使用18-号针头从直径为3-8mm的外周卵泡腔中吸出放入50ml锥形离心管(OrangeScientific，Belgium)的.细胞聚集物，卵丘-卵母细胞-复合物(COC′s)和细胞碎片在39℃下沉淀，不施加离心力。收集上清液，并且在-20℃下冷冻保存，直到进一步加工.将沉淀物用作颗粒细胞来源用于细胞培养.
制备用于细胞培养的卵泡液
将在-20℃下保存的卵泡液解冻，并且在室温下以1600x g的速度离心20分钟.去掉澄清的上清液，并且通过0.2μm孔度的过滤器(Sartorius，Germany，Cat.No 16534)进行消毒过滤.消毒的卵泡液在4℃或-20℃下保存.
制备用于细胞培养的活性炭过滤的卵泡液
将1g活化的活性炭(30-50mesh ASTM，Merck Cat.No.1.09631)放入Poly-柱10ml(BioRad，Cat.No.731-1550)中.所述活性炭依次用10ml的0.2NHCl，10ml的无水乙醇，10ml的甲醇，和10ml的0.2N NaOH洗涤。在添加每一种新的溶液之前，用蒸馏水充分洗涤活化的活性炭。
通过以1600xg的速度离心20分钟而澄清的卵泡液在重力作用下从所述活性炭柱中通过四次.最后的流通是上述无菌过滤，并且在4℃或-20℃下保存。
B猪颗粒细胞的培养
通过抽吸至少一个月龄的屠宰的猪体内卵泡腔卵泡(直径3-8mm)而收集颗粒细胞，用它建立原代细胞系.在不施加离心力的条件下使收集的细胞沉淀。在底部的细胞沉淀物在通过手工去掉卵丘-卵母细胞复合物之后是颗粒细胞的来源.用PBS洗涤所述细胞聚集物一次，然后将它们重新悬浮在颗粒细胞培养基中.将所述细胞悬浮液分配到直径为15cm的组织培养皿中(Orange Scientific，Belgium).在39℃下，在5％CO2气氛中培养培养物.当所述培养物达到汇合时，按下文所述方法对细胞进行传代.
颗粒细胞培养基由以下成分组成：89％(v/v)DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基，低葡萄糖，BioConcept1-25F50-I)，10％(v/v)FCS(胎牛血清，BioConcept1-01F00-l)，0.1mM NEAA(非必需氨基酸，BioConcept5-13K00)，2.5ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，Sigma Product No.F 0291，25μg，用1ml缺少bFGF的颗粒细胞培养基重建，在-20℃下冷冻，直到使用)，和6μg/ml庆大霉素(BioConcept4-07F00-H)。
传代培养物
在室温下用无菌PBS洗涤培养皿两次。让细胞通过PBS中的含有0.05％w/v胰蛋白酶(BioConcept，Switzerland)和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物(SigmaE-611)的酶溶液。在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶促活性.在室温下以180xg的速度离心细胞5分钟.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出等份样品进行计数.
细胞计数
将细胞悬浮液的等分样品在PBS中的0.05％台盼蓝(BioConcept，Switzerland)溶液中稀释，并且使用Neubauer血细胞计数器计数.统计活细胞(排斥台盼蓝染料)数量.
来自细胞培养物的颗粒细胞的冷冻保存
对培养物中的颗粒细胞进行胰蛋白酶化，并且悬浮在含有72％DMEM低葡萄糖(BioConcept，Switzerland)，20％FCS和8％DMSO(二甲亚砜，Sigma)的培养基中.将细胞分配到低温管形瓶(1ml)中，浓度为0.5-3.0×106细胞/ml.将它们放在控制速度的冰箱(Nicool LM 10，France)中冷冻，调整到位置3持续25分钟(直到达到-18℃)，然后调整到位置10，保持10分钟(直到达到-60℃).然后立即转移所述低温管形瓶并且保存在液氮容器中。
C颗粒细胞的增殖性衰老以及用卵泡液挽救
颗粒细胞原代细胞系的建立
收集800个卵丘-卵母细胞复合物，并且悬浮在含有0.1％(w/v)透明质酸酶(Sigma product No.H-3884)的0.4ml基于Tyrode′s的溶液中.通过在室温下用吸液管(1ml尖端)柔和地吸入和排出破坏所述卵丘-卵母细胞复合物.通过离心(180xg，5分钟)使细胞沉淀，并且重新悬浮在2ml基于Tyrode′s的溶液中。在显微镜下用吸液管将卵母细胞从悬浮液中机械取出.其余的细胞悬浮液与10ml颗粒细胞培养基混合，放入直径10cm的板中，并且在39℃下在5％CO2培养箱中培养。对汇合的单层进行传代，在每一世代对细胞进行计数，并且在表1中记录累积的细胞数量.
表1：颗粒细胞原代细胞系
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 8 原代培养物 2.1×106 12 1 3.2×106 18 2 5.7×106 22 3 28.8×106 39 4 34.2×106 54 5 8.2×106 74 6 0
在该代表性实验中，颗粒细胞原代细胞系具有有限的寿命，在体外传代4-5次之后就进入了增殖性衰老.
用卵泡液从衰老中挽救
从第5代中取出0.0557×106颗粒细胞，并且在补充了卵泡液(5％v/v)的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养。在表2中示出了卵泡液对衰老的颗粒细胞的挽救效果.
表2：在存在卵泡液的条件下的颗粒细胞
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 0 5 0.0557×106 24 6 0.55×106 31 7 6.8×106 37 8 43.53×106
所述卵泡液挽救了增殖性衰老的细胞，然后，所述细胞能够增殖，群体加倍时间为大约1.5天.该颗粒细胞系在体外传代50代之后仍然能增殖(超过150次的群体加倍).
挽救效果的可逆性
从第7代中取出1.07×106颗粒细胞，并且在不含卵泡液的10ml颗粒细胞培养基或者在补充了卵泡液(5％v/v)的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.在表3中示出了卵泡液作用的可逆性。
表3：挽救效果的可逆性
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 (培养基中不补充卵泡液) 累计细胞数量 (培养基中补充5％卵泡液) 0 7 1.07×106 1.07×106 6 8 1.95×106 6.68×106 11 9 ＜0.2×106
卵泡液的挽救效果是可逆的，因为在除去卵泡液时所述细胞系停止增殖并且细胞死亡.这意味着颗粒细胞系既没有获得肿瘤细胞系的特性，也没有通过病毒感染等而永生化.
表征建立的颗粒细胞系，并且使用卵泡液保持
使用卵泡液的来自颗粒细胞的细胞系的若干特征表明，尽管它们能迅速分裂，所述细胞保持了颗粒细胞的某些特征.
形态学：在次级培养物中，在早期世代(培养少于10代)以及在晚期世代(培养超过70代以上)中观察到了富含各种大小的微绒毛或泡的细胞.这些特征是颗粒细胞所特有的(Motta P等，2003.Int.Rev.Cytology223：178-288).
类固醇合成活性：颗粒细胞分化的进展伴随着孕酮的产生(Motta P等，在上述引文中).由颗粒细胞系产生的孕酮是少量的(表4)。很可能所述细胞业已去分化，并且停滞在细胞分化的早期阶段.
表4：由颗粒细胞系生产的孕酮：
凋亡性细胞死亡：在剥夺血清之后24小时之内，固缩的细胞的快速积累和DNA断裂的自发开始是在颗粒细胞系中发生的凋亡性细胞死亡的特征。业已证实，除去血清能加快凋亡性细胞死亡的自发开始，它是在颗粒细胞的原代培养物中发生的(Hu C-L等，2001.Biol Reprod 64：518-526)。
接触抑制：与体内相似，来自建立的细胞系的颗粒细胞在不接触抑制作用的条件下能在体外分裂.它们形成了交叉的细胞多层.
D在冷冻保存之后用卵泡液挽救原代颗粒细胞系
可以使原代颗粒细胞系传代有限的次数，然后它们进入不可逆转的生长停滞阶段，并且死亡.通过对颗粒细胞系进行冷冻保存可以加速停滞的生长.下面的实验证实了在冷冻保存和解冻之后卵泡液能挽救颗粒细胞.
让猪颗粒细胞的原代培养物在直径为15cm的培养皿中生长到混合。通过胰蛋白酶/EDTA处理分离细胞，计数，并且以2.2×106细胞/ml培养基的浓度悬浮，用于冷冻保存(参见″B猪颗粒细胞的培养″).
然后对颗粒细胞进行解冻，并且将两等份0.6×106细胞分配到两个直径10cm的培养皿中，培养皿中装有10ml颗粒细胞的常规培养基.一个培养皿中补充了10％(v/v)的卵泡液.两个培养皿在37℃下在CO2培养箱中培养.在培养7天之后，对细胞进行计数，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在再培养8天之后，对细胞进行计数(表5).
表5：冷冻保存的颗粒细胞的挽救
解冻之后 培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 (培养基中不补充卵泡液) 累计细胞数量 (培养基中补充10％卵泡液) 0 0.7×106 0.7×106 7 2 0.7×106 1.3×106 15 3 0.15×106 12.2×106
将卵泡液作为补充物添加到细胞培养基中，使得解冻的颗粒细胞能够正常生长，并且防止在不添加卵泡液的颗粒细胞培养物中出现的生长停滞和死亡.
E卵泡液不是血清的替代品
将在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基保持了11代的原代颗粒细胞系传代培养到两个直径15cm的培养皿中.每一个培养皿以5×106细胞的密度接种在30ml颗粒细胞培养基中；一个培养基补充了4％(v/v)的卵泡液.在37℃下，在CO2培养箱中培养三天之后，对细胞进行胰蛋白酶化并且计数.
在培养基中不添加卵泡液补充物：总共7.4×106细胞相当于0.2群体加倍/天.所述细胞被称作″衰老的″细胞.在培养基中添加4％(v/v)的卵泡液补充物：总共14.5×106细胞相当于0.5群体加倍/天。这样的细胞被称作″挽救的″细胞.
将两种类型的细胞群体(″衰老的″和″挽救的″)以0.04×106细胞/ml的浓度悬浮在无血清的颗粒细胞培养基中，并且分配到24-孔板的孔中(0.75ml/孔，30′000细胞/孔)或分配到12-孔板的孔中(2ml/孔，80′000细胞/孔).在附着90分钟之后，除去不含血清的培养基，并且分别用0.75ml，和2ml具有表6所示组成的培养基替换.
在37℃下在CO2培养箱中培养板7天.将12-孔板用于计数细胞，并且在下表中提供了计数结果.将24-孔板用于用结晶紫染色，在下面的表6中示出了″挽救的″细胞的结果.
细胞培养物的结晶紫染色
将培养基吸出，用PBS洗涤细胞层一次，并且用0.5％(w/v)结晶紫(于30％(v/v)乙醇和0.5％(v/v)戊二醛中)染色大约10分钟。在倒掉结晶紫溶液之后，用自来水漂洗所述板，然后在空气中风干.
表6：在含有血清和/或卵泡液的培养基中生长的颗粒细胞
FCS，优选10％(v/v)是必要的，但不足以阻止原代颗粒细胞系的生长停滞和死亡.卵泡液是必要的，但不足以阻止原代颗粒细胞系的生长停滞和死亡。卵泡液包含原代颗粒细胞系存活所必需的因子，并且这些因子是FCS缺乏的.
F活性炭过滤的卵泡液对颗粒细胞生长和维持的作用
颗粒细胞系在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基中保持7代。将0.4×106细胞从第7代中取出，并且在补充了4％卵泡液，或4％活性炭过滤的卵泡液的10ml颗粒细胞培养基，或剥夺了卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.每周计数细胞，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在表7中示出了累积的细胞数量.
表7：培养物中的颗粒细胞
活性炭过滤的卵泡液不能够长时间维持颗粒细胞系的生长
含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的混合物在生物学活性方面由于 单独的卵泡液：冷冻保存的细胞
对来自猪颗粒细胞原代培养物的细胞进行冷冻.将所述细胞用于比较卵泡液的作用和由一体积的卵泡液和一体积的活性炭过滤的卵泡液组成的混合物的作用.1.3×106解冻的细胞在补充了4％卵泡液，或上述4％卵泡液的1∶1的混合物的10ml颗粒细胞培养基中，或者在不含卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.在每一代对细胞计数，并且接种到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在下面的表8中示出了累积的细胞数量.
表8：含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养物中的冷冻保存的颗粒细胞
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
＊＊在35天之后的传代次数为3.n.d.＝未测定。
在实验过的所有培养条件下，在解冻之后，大部分冷冻的颗粒细胞迅速死亡.在挽救培养物中的颗粒细胞方面，卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物优于单独的卵泡液，这些细胞在剥夺了卵泡液时会死亡。挽救衰老出现的更早一些.
含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的混合物在生物学活性方面优于 单独的卵泡液：颗粒细胞系的增殖和生长
所述颗粒细胞系在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基中维持8代。从第8代取出0.4×106细胞，并且在补充了4％卵泡液，或补充了4％的卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的10ml颗粒细胞培养基中，或者在剥夺了卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.当培养物汇合时，对细胞进行计数，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在表9中示出了累积的细胞数量：
表9：在含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养物中的颗粒细胞系
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
以上结果表明，与只含有卵泡液的培养基相比，颗粒细胞系在补充了卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养基中增殖更快.在本实验中，每一代细胞数量平均增加25％.
G卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命
正常的体细胞总是会进入不可逆转的生长停滞状态，并且在有限次数的分裂之后改变功能.这一过程被称作复制性衰老.成纤维细胞在体外具有有限的寿命，它的寿命是由群体加倍数(PDs)决定的，而不是由时间决定的.在外植之后，细胞经历了迅速分裂的起始阶段，随后是增殖活性的下降(衰老前状态).随后所述细胞达到衰老状态，其特征是形态学改变，如体积的增加和不规则的形状，并且，尽管处在不增殖的状态，它们能存活多个月(Cristofalo VJ and Pignolo RJ，1993.Physio.Reviews 73：617-638)。
补充了卵泡液的培养基表现出衰老的开始的延迟，并且允许细胞保持分裂15-20PDs，这意味着比正常情况增加了50％.
在添加或不添加卵泡液的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF)中， 与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色
β-半乳糖苷酶，在pH 6下是可以通过组织化学检测的，它是鉴定培养物中衰老的人成纤维细胞的生物标记(Dimri等，1995.Proc.Nat.Acad.Sci.92：9363-9367)。从包皮上获得的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，Cat.No.C-10351，PromoCell GmbH，Heidelberg，Germany)在PromoCell成纤维细胞生长培养基(Cat.No.C-23010)中生长。在添加PromoCell补充混合物/成纤维细胞生长培养基(Cat.No.C-39315)之后，在完全培养基中生长因子的浓度如下：胰岛素5μg/ml，碱性成纤维细胞因子1ng/ml，两性霉素B 50μg/ml，庆大霉素50μg/ml.PromoCell成纤维细胞生长培养基是用于培养成纤维细胞的无菌的液体培养基，并且是无血清的。饲养层，基质底物或其他物质是不必要的.在新的容器中培养和继代培养是按照生产商的说明进行的.
在使用PromoCell成纤维细胞生长培养基传代五次之后，将13′500NHDF细胞接种到24-孔板的一个孔中，孔中容纳有0.75ml的培养基。在用补充了4％(v/v)卵泡液的PromoCell成纤维细胞生长培养基传代六次之后，将13′500NHDF细胞接种到24-孔板的另一个孔中，孔中容纳有0.75ml补充了卵泡液的培养基.在CO2培养箱中在37℃下培养3天之后，对所述细胞进行固定和染色，以便确定与衰老相关的-β半乳糖苷酶。
细胞的与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色
将培养基吸出，并且用PBS洗涤细胞一次，然后通过PBS中的0.5％戊二醛(25％溶液，Sigma)在室温下处理.5分钟之后，用PBS中的1mMMgCl2，pH7.2洗涤所述细胞.在PBS pH 6.0(通过添加乙酸将PBS调节为pH 6.0的)中的含有1mg/ml X-gal(来自4％DMSO母液，Fermentas No.R04019)，0.12 mM K3Fe(CN)6 3H2O，0.12mMK4Fe(CN)6，1mM MgCl2的溶液中对细胞进行染色。在室温或者在37℃下培养细胞，用H2O洗涤一次，并且在H2O中在4℃下保存.
在缺少卵泡液的条件下保持的所有成纤维细胞都处在衰老前或衰老的状态.保持在补充了卵泡液的培养基中的成纤维细胞只有不到10％处于衰老前或衰老的状态。
培养正常的人皮肤成纤维细胞
来自包皮的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，Cat.-No.：C-10351，PromoCell GmbH，Heidelberg，Germany)在NHDF培养基中培养(89％(v/v)DMEM，10％(v/v)FCS，0.1mM NEAA，和6μg/ml庆大霉素)。在室温下用无菌PBS洗涤培养皿两次.用PBS中的含有0.05％w/v胰蛋白酶和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物的酶溶液让细胞传代.在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶活性.在室温下以180xg的速度离心5分钟使细胞沉淀.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出一等份样品用于计数.
对细胞进行计数，并且按颗粒细胞的处理方法进行冷冻(B猪颗粒细胞的培养).
卵泡液能延长NHDF的寿命
在每一世代通过培养获得的群体加倍数是用以下公式计算的
群体加倍＝(logNt-log N0)/log 2.0，
其中Nt＝在时间t在收获时回收的细胞数量，而N0＝最初铺板的细胞数量。
比较了在含有10％血清的培养基或含有10％血清和4％卵泡液的培养基中培养的NHDF细胞的群体加倍(PDs).结果如图4所示。与它们的对应物相比，所述细胞的增殖寿命延长了大约15-20次群体加倍(与正常情况相比群体加倍增加了50％).在用5％的血清浓度取代10％的浓度的培养基中获得了类似的结果.
卵泡液作用的可逆性
在第21代(35次群体加倍)将在含有4％卵泡液的NHDF培养基中连续生长的0.45×106NHDF细胞取出，并且在不含卵泡液的10mlNHDF培养基或在补充了卵泡液(4％v/v)的10ml NHDF培养基中，或在补充了活性炭过滤的卵泡液(4％v/v)的10ml培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.如表10所示，来卵泡液的作用是可逆的.
表10：在有或没有卵泡液的NHDF培养基中培养的NHDF细胞
从在存在卵泡液的条件下连续生长的NHDF中剥夺卵泡液，使得所述细胞衰老.活性炭过滤的卵泡液在阻止NHDF细胞衰老方面比未处理过的卵泡液好。
卵泡液对衰老前NHDF细胞的恢复活力的作用
在添加到达到衰老前状态的老化NHDF细胞培养物之后，卵泡液能够恢复它们的生长能力.
NHDF细胞在缺少卵泡液的条件下传代26PD′s，并且在含有4％卵泡液作为补充物的NHDF培养基中进一步传代.同样，NHDF细胞在缺少卵泡液的条件下传代28PD′s，并且在含有4％活性炭过滤的卵泡液的培养基中进一步传代.在每一世代对NHDF细胞计数.结果如图5所示.
通过添加卵泡液延迟了衰老。活性炭过滤的卵泡液在诱导这种作用方面优于未处理过的卵泡液.
H卵泡液能保护原代培养物中的脑神经元避免发生细胞死亡.
从大鼠胚胎脑皮层中制备原代神经元
解剖来自大鼠胚胎(18天)脑的皮层，并且用木瓜蛋白酶溶液处理总共30分钟.在添加胰蛋白酶抑制剂之后，通过用吸液管柔和研磨而分离皮层神经元.然后对所述原代神经元进行计数，并且铺板到用poly-D赖氨酸包被的标准组织培养板上。
原代神经元的培养
在原代神经元铺板2小时之后，铺板的培养基用有或没有4％卵泡液的，由5％FCS/DMEM(高葡萄糖4500mg/ml)的生长培养基替换.
在缺少卵泡液的条件下培养的原代神经原培养物出现了广泛的细胞死亡，少有或没有神经突延伸.在存在卵泡液的条件下维持的神经原培养物表现出神经元的存活，在培养24小时之后具有广泛的神经突长出.
卵泡液提供了对神经细胞死亡的保护作用：在体外条件下从变性中挽救了原代神经元，并且促进了神经突的长出，而且允许神经网络广泛形成.
I卵泡液成分保护原代培养物中肝细胞避免发生细胞死亡
用大鼠胚胎肝脏制备肝细胞
解剖来自大鼠胚胎(18天)的肝脏，并且通过用吸液管柔和研磨而分离肝细胞.将原代肝细胞铺板到标准组织培养板上.生长培养基由5％FCS/DMEM组成，其中有或没有4％活性炭过滤的卵泡液或4％卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物。
培养原代肝细胞
原代肝细胞培养物在37℃下在CO2培养箱中保持，并且使用光学显微镜检查.当单层汇合时，使用PBS中的包括0.05％w/v胰蛋白酶(BioConcept，Switzerland)和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物(SigmaE-611)的酶溶液对所述细胞进行传代.在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶活性.通过在室温下以180xg的速度离心5分钟使细胞沉淀.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出一等份样品用于计数.在表11中示出了卵泡液成分的作用.
表11：在含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物或含有活性炭过滤的卵泡液的培养物中的大鼠胚胎肝细胞
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
在缺少卵泡液成分的条件下培养的原代胚胎肝细胞培养物不能长时间存活.卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物提供了对肝细胞死亡的保护作用，并且能在体外条件下从变性中挽救原代肝细胞。
J卵泡液的分离
将Centrifugal Filter Devices YM-3(标称分子量极限3′000)，YM-10(MW 10′000)，YM-30(MW30′000)，和YM-50(MW50′000)(Millipore Corporation，Product nos.分别为4320，4321，4322，和4323)用作超滤装置，用于对生物学样品进行纯化，浓缩，和脱盐。过滤过程本身是柔和的，避免了潜在的问题，如样品变性和缓冲盐的浓度.32ml的澄清的卵泡液以1500xg的速度在摆斗式转子中在室温下离心.分子大小级份的浓缩和用PBS进行的透析是按照生产商的说明进行的.开始使用YM-50装置，然后依次对卵泡液进行分离和浓缩。
来自卵泡液的级份的生物活性
将存在于0.75ml颗粒细胞培养基中的0.03×106衰老的颗粒细胞(第11代)接种到24-孔板的每一个孔中.将计算出的能恢复原始的4％v/v卵泡液的体积添加到每一个孔中。一个孔不接受补充物(阴性对照)。一个孔接受30μl的纯卵泡液(阳性对照)。
在表12中提供了在CO2培养箱中在37℃下培养八天之后显微镜检查的结果：
表12：卵泡液分子量级份在挽救颗粒细胞方面的活性
级份 细胞生长
级份 细胞生长 ＞50kDa ++++ 30-50kDa - 10-30kDa - 3-10kDa - ＜3kDa ++ 卵泡液 +++++ 不添加 -
<3kDa的级份和>50kDa的级份包括活性因子，它在某种程度上模拟卵泡液的活性.
检验<3kDa和>50kDa的级份之间的协同作用，以及在包被之后＞50 kDa的级份的活性
将存在于0.75ml的颗粒细胞培养基中的0.03×106衰老的颗粒细胞(第16代，在第15代期间剥夺了卵泡液)接种到24-孔板的每一个孔中。将一体积(计算出该体积能恢复每一种级份的最初的4％v/v卵泡液)添加到每一个孔中.一个孔不接受补充物(阴性对照).一个孔接受30μl的纯的卵泡液(阳性对照).包被是按以下方法进行的：将350μl PBS中的＞50kD的浓缩级份的1％(v/v)溶液添加到要包被的空孔中，并且在37℃下培养一小时.在用水快速洗涤之后，干燥所述孔.
在下面的表13和图1中示出了在CO2培养箱中在37℃下培养八天之后显微镜检查的结果：
表13：卵泡液分子量级份在支持颗粒细胞生长方面的活性
孔编号 级份 细胞生长 1 ＞50kDa ++++ 2 30-50kDa ++ 3 10-30kDa ++ 4 3-10kDa +
孔编号 级份 细胞生长 5 ＜3kDa ++ 6 卵泡液 +++++ 7 不添加 - 8 ＞50kDa+＜3kDa ++++++ 9 用＞50kDa的级份包被的孔 + 10 用＞50kDa+＜3kDa的级份包被的孔 +++
K纯化卵泡液的高分子量级分
大小层析
通过SephadexTM G200 super fine柱凝胶过滤，以便对来自卵泡液(蛋白浓度为100mg/ml)的0.5ml的＞50kDa的级份进行层析，所述柱的长度为1m，直径为26mm，使用PBS缓冲液，洗脱速度为120滴/级份(相当于6-7ml)。
图2表示收集的级份(水平轴)在280nm波长下的光密度(垂直轴)的曲线。分离了三个主要的峰。测定所述级份的生物学活性，按以下方法测定所述级份的生物学活性和蛋白特性：
生物学测定
将存在于750μl颗粒细胞培养基中的0.02×106颗粒细胞的衰老细胞(第30代)接种到24-孔板的每一个孔中。在铺板六小时之后除去350μl的培养基，并且替换为由100μl要检测的级份和100μl含有20％FCS，0.2mM NEAA和12μg/ml庆大霉素的DMEM培养基组成的200μl混合物.阳性对照：在第一个孔中，除去350μl的培养基，并且替换为由100μlPBS，100μl含有20％FCS，0.2mM NEAA和12μl/ml庆大霉素的DMEM以及30μl卵泡液组成的230μl混合物.在37℃下在CO2培养箱中培养四天之后，用结晶紫对所述板进行染色.
结果如图3所示。在该附图中，左上侧的孔是阳性对照。右侧随后的孔是级份22-44。
检测了级份23，24和25的挽救颗粒细胞的活性.所述活性相当于在层析中的最大尺寸的峰。
通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋 白分析
分析是使用Novex Bis-Tris凝胶系统，按照生产商的说明在用于微型凝胶电泳的XCellSureLockTM Mini-Cell(Invitrogen Cat.Nos：E10001，E10020，E10002)上进行的，使用预先浇铸的聚丙烯酰胺凝胶4-12％Bis-Tris Gel，1.0mm×12孔(Invitrogen Cat No.NP0322)和MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen Cat.No.NP0002).
将5μlLDS样品缓冲液(4X)以及任选的2μl还原剂(10X)添加到15μl要分析的级份样品中，分别得到了20μl和22μl的总体积.在70℃下将样品加热10分钟。电泳之后，用0.125％(w/v)考马斯亮蓝(考马斯Brilliant Blue R250，Fluka Cat.No.27816)，50％甲醇和10％乙酸的溶液在摇床上对所述凝胶染色15分钟.用5％甲醇和7％乙酸对凝胶进行脱染色。
在变性，非还原条件下，级份23-25的主要蛋白成分的表观分子量＞＞220kDa，并且在变性和还原条件下，表观分子量大约为170kDa。它很可能是由通过二硫键连接的两个160kDa亚基的二聚体组成的，级份30-32和级份38-41中的蛋白分别相当于免疫球蛋白和白蛋白.
阳离子交换层析
在上对来自大小层析的级份23-25的合并物进行浓缩，并且用含有0.02％NaN3的pH 5.0的25mM乙酸缓冲液透析.层析是使用CM纤维素离子交换剂进行的，床体积为0.5ml，使用含有0.02％NaN3的pH 5.0的25mM乙酸盐的起始缓冲液，在表14中示出了收集的级份.
表14：阳离子交换层析级份
样品 OD280nm(1cm) 级份编号 活性 起始缓冲液 0.092 样品“流通”(1.05ml) 0.577 1 + 第一次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.142 2 未测定 第二次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.127 3 - 第三次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.109 4 未测定 用25mM乙酸缓冲液中的1.05ml500mM NaCl洗脱 0.113 5 - 25mM乙酸缓冲液中的500mMNaCl 0.095
生物测定：由于所述样品含有0.02％NaN3(对活的细胞有毒性)，活性是在用所述成分对孔进行包被之后测定的.将来自CM柱的100μl样品(级份编号1，3和5)与100μl的PBS混合，并且将总体积转移到24-孔板的孔中.所述板在37℃下培养二小时，然后在4℃下培养过夜.取出样品.用无菌水洗涤所述孔并且干燥.
将0.02×106衰老的颗粒细胞接种到每一个孔中的用于颗粒细胞的0.75ml的培养基中.阳性对照：无包被，向培养基中添加30μl的卵泡液。阴性对照：无包被，不添加.在37℃下在CO2培养箱中培养四天之后，用结晶紫对所述板进行染色.
所有蛋白以及活性成分都在阳离子交换层析的″流通″级份中.
通过肽质量指纹分析鉴定蛋白
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离″流通″级份的等份样品，一个样品是在还原条件下变性的，而一个样品是在非还原条件下变性的.
在室温下在摇床上，在高纯度水中的0.15％(w/v)的考马斯亮蓝G-250，0.5％(v/v)乙酸和10％甲醇中对凝胶进行染色三分钟.然后在室温下，在摇床上，在高纯度水中的0.5％(v/v)乙酸和10％(v/v)甲醇中对所述凝胶进行脱染色，直到可以看见蛋白带.
将在非还原条件下相对MW＞220kDa的带，和在还原条件下160kDa的带切除并且转移到独立的0.5ml安全锁试管中.添加200μl高纯度水，并且在-20℃冷冻样品，直到用于质谱分析.
检测到了八种肽，它们相当于人α-2-巨球蛋白前体的氨基酸序列[A2MG-人；P01023；质量(平均)163278]，并且相当于其他物种(豚鼠和小鼠)的同源物.所述豚鼠蛋白不存在于SwissProt/Trembl数据库中。所述样品包含新的豚鼠蛋白，它属于α-2-巨球蛋白前体家族。
检测到的肽包括：
1)TEVSSNHVLIYLDK
2)QQNAQGGFSSTQDTVVALHALSK
3)MVSGFIPLKPTVK
4)SSGSLLNNAIK
5)QTVSWAVTPK
6)GEAFTLK
7)YGAATFTR
8)DLKPAIVK
该蛋白家族的成员是同四倍体形式的，它由两对二硫键连接的链组成.这种特性与猪的蛋白的SDS-PAGE分析吻合.
L核型分析
制备有丝分裂涂片
将(Fluka Cat.No.27645，蒸馏水中的母液5μg/ml，在-20℃下保存)添加到生长细胞的6cm的板上，最终浓度为0.05μg/ml。所述细胞在37℃下培养2.5小时.对所述细胞进行胰蛋白酶化，并且重新悬浮到10ml的0.56％(w/v)KCl溶液中.让所述细胞在室温下放置总共20分钟(包括以下的离心时间).通过柔和离心(500rpm，5分钟)使细胞沉淀.将尽可能多的KCl溶液吸出。添加1ml的Carnoy′s固定剂(3∶1v/v无水甲醇/冰醋酸).在室温下放置5分钟之后，使细胞沉淀，并且替换固定剂.重复这一过程一次，并且将细胞悬浮在1ml Carnoy′s固定剂中.将一小滴细胞悬浮液添加到预先清洗过的玻璃显微镜载玻片上。用PBS中的300nM DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，Sigma-Aldrich)母液对所述载玻片染色30分钟，然后用PBS洗涤.用荧光显微镜获得图像，并且在图像上对染色体进行计数。
在卵泡液中长时间保持的细胞具有正常的染色体互补.在表15中示出了每一种制备物的若干有丝分裂涂片的计数结果.
表15：染色体计数
细胞 历史 计数 预期 颗粒细胞系A(猪) 在含有4％卵泡液的培养基中传代70次 (群体加倍超过200次) 38 2N＝38 颗粒细胞系B(猪) 在含有4％卵泡液的培养基中传代21次 (群体加倍超过60次) 38 2N＝38 NHDF细胞(人) 在含有4％卵泡液的培养基中群体加倍50 次 46 2N＝46
序列表
<110>OvaGen AG
<120>使细胞治疗中使用的细胞长期生长和存活的卵泡液
<130>Zb/20646
<150>EP03405628.3
<151>2003-09-01
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>1
Thr Glu Val Ser Ser Asn His Val Leu Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>2
Gln Gln Asn Ala Gln Gly Gly Phe Ser Ser Thr Gln Asp Thr Val Val
1 5 10 15
Ala Leu His Ala Leu Ser Lys
20
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>3
Met Val Ser Gly Phe Ile Pro Leu Lys Pro Thr Val Lys
1 5 10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>4
Ser Ser Gly Ser Leu Leu Asn Asn Ala Ile Lys
1 5 10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>5
Gln Thr Val Ser Trp Ala Val Thr Pro Lys
1 5 10
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>6
Gly Glu Ala Phe Thr Leu Lys
1 5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>7
Tyr Gly Ala Ala Thr Phe Thr Arg
1 5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>8
Asp Leu Lys Pro Ala Ile Val Lys
1 5
组织再生技术发展的一个特别关键的部分是校正软骨组织中的缺陷。与其他组织不同，在受到创伤，病变或者由于老年而退化后，软骨很少具有自我再生的能力。这是由于正常关节软骨的无血管性质.尽管对表面软骨板的损伤通常不能愈合，软骨下骨是血管化的，因此对该部位的损伤只能愈合有限的程度.替代受损的关节软骨的新的软骨被称为纤维软骨.纤维软骨缺少原有透明蛋白软骨所具有的耐用性和更理想的机械特性.受到关节损伤的人们随后容易发生关节退化。
业已采用了若干种不同的方法来修复软骨组织，包括软骨刮片，软骨下钻孔，和组织自体/同种异体植入物。用于关节软骨修复的其他实验方法包括从软骨细胞活检物中获得软骨细胞，并且将软骨细胞直接接种在三维移植材料上，然后将移植物植入受损部位.这种技术导致了一旦再生完成就能获得高质量的软骨.不过，它需要从患者体内收获的大量的原材料，导致了对患者的创伤增加.
在其他方法中，从活检物中分离软骨细胞，在单层培养物中扩增，直到获得足够数量的细胞，并且植入受损的组织部位。同样在上述场合下，所述植入首先需要将所述细胞包埋在凝胶中或者与生物可降解的聚合物支架缔合.所述基质的三维特性赋予了植入物的结构完整性，并且提供了对软骨细胞生长成软骨组织的刚性支持.尽管该系统具有需要较少的细胞作为原材料的优点，但是如果细胞是从骨骼成熟的供体(成年人)体内收获或获得，用这种方法获得的软骨通常质量较差.
组织工程中的另一种主要问题是保持活细胞在培养物中生长和增殖的适当技术.细胞衰老是防止正常的二倍体哺乳动物细胞在培养物中无限地生长(增殖)的过程.
当今大部分变性疾病是通过药物治疗或对症治疗的，因为缺少可利用的患者相容性细胞或再生的组织，例如，通过上述方法之一，以便所述组织能够替换受损的组织或者修复由特定病症诱导的损伤.
相关的其他现有基于细胞的治疗方法是来自人类胚胎干(ES)细胞的同种异体细胞或来自猪的异种细胞.用于帕金森氏病的上述方法的例子是分化的人神经原(Geron)和猪胎神经细胞(Diacrin/GenVec).尽管所述方法具有科学前景，但是它们存在着重大限制.首先，人ES细胞会产生显著的伦理问题，因为必须破坏人类胚胎，以便制备ES细胞。其次，使用猪细胞存在潜在的未知问题，包括将猪携带的病原体传播给人类.第三，这两种方法都需要使用免疫抑制作用.
目前，迫切需要从患者自身的体细胞得到具有多种潜能的干细胞样细胞的有效方法.
正通过将来自体细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中克隆越来越多的动物，特别是家畜.该方法的问题是效率低.
发明概述
本发明的目的是通过新的多能中间体将一种类型的高度特化的体细胞，例如颗粒细胞的细胞核功能改变成另一种类型的技术.本发明不采用胚或胎组织实现功能的改变，并且可以设计用于采用自身细胞的个体患者。
现在业已惊奇地发现，在存在含有卵泡液或卵泡液的成分的血清的条件下培养体细胞，能防止细胞衰老.另外，在存在所述成分或所述卵泡液的条件的在体外培养具有有限寿命的体细胞，获得了干细胞的某些特性，并且可以连续地传代，不过，只能在连续存在卵泡液或来自卵泡液的成分的条件下传代.
本发明涉及防止体细胞衰老和死亡的方法，包括在含有血清的培养基或其等同物中并且在还含有卵泡液或其成分的条件下培养细胞.另外，本发明涉及使细胞去分化的方法，其方式导致所述细胞成功的增殖，并且保持它们的分化潜能，包括在含有血清的培养基或其等同物中并且在还含有卵泡液或其成分的条件下培养所述细胞.
具体地讲，本发明涉及的方法包括以下步骤
-在含有血清的培养基培养所述细胞；
-将卵泡液或其成分导入所述培养基和
-让细胞在重复的传代培养物中无限地增殖.
含有血清的培养基在本领域被广泛地使用.通常，所述血清是胎牛血清.根据体细胞的类型，还可以使用不含血清的培养基，不过，它是完全等同的，以便避免尚未完全了解的胎牛血清的副作用。所述等同的不含血清的培养基同样为本领域所熟知，并且特别包含适当浓度的无机盐，通常含有生长激素，例如，牛生长激素，或其他生长支持生物化学因子和激素。
卵泡液是从卵巢中获得的，并且能够方便地大量获得.可以考虑的具体卵泡液是猪，牛，羊和马卵泡液。优选的是猪卵泡液。
卵泡液可以是使用标准方法纯化或部分纯化的，如离心和通过惰性滤器过滤.进一步的纯化可以通过用活性炭过滤实现，已知活性炭能够保持低分子量成分和杂质.成分可以通过根据分子量和/或极性分级分离而获得.
优选使用活性炭过滤的卵泡液延长正常人二倍体成纤维细胞的寿命，而优选将未处理过的卵泡液用于建立和保持颗粒细胞系。活性炭过滤的卵泡液能够与未处理过的卵泡液混含，优选以大约1∶1的比例混合，并且混合物的活性高于未处理过的卵泡液的活性，如原代颗粒细胞系的建立和原代颗粒细胞系的增殖所示.未过滤的卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的大约1∶1的混合物在本发明的方法中是特别有效的，因此是优选的.
本发明方法中的其他优选的卵泡液的成分是＞30kDa的分子大小级份，以及＞50kDa和＜3kDa的组合分子大小级份.优选的大分子大小级份包括相当于人α-2-巨球蛋白前体的氨基酸序列的肽，并且相当于其他物种的同源物，它们同样是本发明方法所优选的.该蛋白家族的成员是同四聚体形式的，它由两对二硫键连接的链组成.优选具有生长促进活性和基质特性的卵泡液的高分子量成分.同样优选具有细胞存活活性的卵泡液的低分子量成分。
可以以导致细胞的成功增殖，并且保持它们的分化潜能的方式从衰老和死亡中恢复并且去分化的哺乳动物体细胞包括，例如，颗粒细胞，皮肤成纤维细胞，神经元，角化细胞或肝细胞，特别是颗粒细胞，皮肤成纤维细胞和神经元.不过，本发明并不局限于上述特定体细胞，它可应用于任何类型的体细胞.根据本发明，可以制备祖细胞类型(或干细胞-样)细胞，它可用于制备新的组织.能够分离并且扩增的任何类型的细胞都可用于再生新的组织.非限定性例子还包括内皮细胞，肌细胞，软骨细胞和黑素细胞.
当所述细胞被冷冻，保存并且随后用于培养时，体细胞的衰老是一个特殊问题.多种类型的体细胞在冷冻和保存时，培养效率会显著降低。本发明方法的效率可以在所述解冻的细胞上方便地验证.
本发明还涉及卵泡液或其成分在防止体细胞的衰老和死亡并且使体细胞去分化中的用途，其方式导致所述细胞成功增殖，并且保持它们的分化潜能.
基于上述用途，本发明提供了用于保持成年体细胞无限增殖潜力的新方法.所述细胞可以用作分化细胞的来源，其具有用于通过“治疗性克隆”治疗变性疾病的医学用途.
本发明还可以通过提供无限数量的向多能性方向再程序化的细胞而提高核转移效率.
体细胞的永生化通常是通过用端粒酶的表达载体转染培养的细胞实现的.本发明避开了所述转染方法，这是通过给所述细胞提供适合无限生长的环境.该过程是可逆的，就是说，通过本发明的方法获得的具有无限生长能力的细胞不是肿瘤细胞.
本发明利用了以下事实，即个体的所有体细胞都包括成为任何类型的细胞所必须的遗传信息，并且当处在诱导环境中时，最终分化的细胞的命运可以重新朝向多能性.这一事实业已通过在非人哺乳动物中进行的体细胞核转移实验的成功得到了验证.随着正常发育的进行，细胞的基因表达谱受到限制，并且基因组的区域被稳定地灭活，以便在正常条件下，所述细胞不能够恢复活力.本发明提供了诱导细胞核功能改变，并因此改变细胞身份的方法.体细胞，如颗粒细胞，在用卵泡液或其成分处理时，能够无限扩增，不过，在去掉卵泡液之后它们会死亡，即使在存在含有血清的培养基中也是如此.
在实施本发明时，没有制备或者使用任何物种的胚或胎，并且没有发生人类和非人线粒体或基因组DNA的混合.本发明的所有方法都能够在体外进行.恢复活力的/改变程序的卵泡液能够方便地从当地的屠宰场大量获得。
正如通过体细胞的核转移的成功所证实的，抹去成年分化的体细胞的记忆，并且用它的被长期遗忘的胚胎记忆取代其的能力仅仅受到操作细胞内和细胞外环境的能力的限制。通过给成年细胞提供卵泡液或其成分，本发明改变了细胞核记忆，并且诱导了核改变，这种改变通常出现在多能干细胞中.本发明的效果和优点包括以下所列：
-消除了伦理问题(不需要人类胚或胎组织，没有必要使用，制备或者破坏胚).
-没有线粒体不相容性(不将细胞核转移到去核的卵母细胞中).
本发明的方法包括以下步骤：提供事先从成熟组织中分离的细胞群体，并且在扩增条件下使所述细胞去分化.在去分化之后，可以诱导所述细胞以便再分化成不同的体细胞类型.为此，按照本发明方法制备的细胞和/或组织可以在第二种细胞培养基中，在存在至少一种能诱导和/或加快和/或促进细胞再分化的因子的条件下再分化.
能够增加细胞分化的多种因子中的任意一种都可以在细胞再分化过程中使用.可用于再分化的因子的非限定性例子包括花生四烯酸，前列腺素A，前列腺素B，前列腺素E，前列腺素F，和组胺，有或没有其他激素/皮质激素，如地塞米松，和生长因子。
本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的细胞扩增和去分化方法可应用于多种细胞类型.业已将组织工程技术用于通过使用多种不同的细胞类型校正缺陷.组织工程可用于校正硬组织缺陷，如在软骨或骨骼上由于病变或创伤导致的缺陷.业已将组织工程用于校正软组织结构.举例来说，在本发明中所使用的细胞可用于再生代谢器官(肝脏或胰腺)，上皮组织(例如烧伤患者的组织)或重建或增加乳房组织(例如可以将肌肉细胞用于重建受乳腺癌，先天性缺陷，或由于创伤造成的损伤影响的女性的乳房；参见美国专利号5,512,600和WO 96/18424，这两份文献都被收作本文参考)。另外，诸如膀胱输尿管返流，或失禁的先天性缺陷可以通过植入接种了有效数量的肌肉细胞的凝胶或支架基质进行校正，以便产生能提供对尿液通道所需要的控制的肌肉部位，或者校正所述缺陷(美国专利号5,667,778，收作本文参考).
本发明的去分化的细胞和上文所述的再分化的细胞可以用合适的生物可降解的聚合物基质植入，以便形成新的组织.有不同类型的基质可以使用。非限定性例子包括聚合物凝胶，它是由诸如在其中悬浮了细胞的藻酸盐的材料，具有大约100-300μm的间隙的纤维基质，和3D泡沫的材料形成.基质可以是基于天然存在的聚合物(例如透明质酸、胶原等)或合成聚合物(例如聚-乙醇酸、聚乳酸等)，或这两者.有关水凝胶聚合物溶液和聚合物基质和植入的其他方法的详细说明可以参见美国专利5,716,404.对于使用生物可降解的聚合物再生代谢器官和其他组织的其他方法，参见Cima等，Biotech.Bioeng.，38，145-158，1991；Langer等，Biomaterials，11，738-745，1990；Vacanti等，J.Pediatr.Surg.，23，3-9，1988；和Vacanti等，Arch.Surg.，123，545-549，1988。
在某些实施方案中，所述细胞基质结构是与组织扩张装置联合植入的。随着所述细胞基质的植入，或细胞增殖并且形成新组织，扩张装置的尺寸减小，直到它可以取出，并且获得需要的重建或增大.
附图简述
将通过以下实施例对本发明作更详细的说明，这些实施例并不意味着限定本发明的范围。所述实施例是结合附图说明的.
图1表示在CO2培养箱中，在37℃下，在存在卵泡液分子大小级份(表12，实施例J，卵泡液的分级分离)的条件下培养八天之后颗粒细胞的显微镜检查结果.数字表示孔的数量.
1：＞50kDa；2：30-50kDa，3：10-30kDa；4：3-10kDa；5：＜3kDa；6：完整的卵泡液；7：无卵泡液；8：＞50并且＜3kDa；9：用＞50kDa包被的孔；10：用＞50并且＜3kDa包被的孔.
图2表示在280nm波长的光密度(OD)(垂直轴)与大小层析收集的级份数量(水平轴)的曲线图，所述级份是通过SephadexTM G200super fine从卵泡液中获得的＞50kDa的级份(实施例K，卵泡液的高分子量因子的纯化).
图3表示颗粒细胞的衰老细胞的图2所示的大小层析级份的生物测定结果(实施例K，卵泡液的高分子量因子的纯化).CO+：阳性对照。只有级份23，24和25包括活性材料.
图4表示作为在含有10％胎牛血清的培养基(A)或含有10％胎牛血清和4％卵泡液的培养基(B)中培养的NHDF细胞的培养物(d)中的天数的函数的群体加倍的数量(n).卵泡液能够将所述细胞的增殖寿命延长大约15-20个群体加倍(实施例G，卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命).
图5比较了作为在含有10％胎牛血清的培养基(A)、含有10％胎牛血清和4％卵泡液的培养基(B)和含有10％胎牛血清和4％活性炭过滤的卵泡液的培养基(C)中培养的NHDF细胞的培养物(d)中的天数的函数的群体加倍的数量(n).在延缓衰老方面，活性炭过滤的卵泡液优于未处理过的卵泡液(实施例G，卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命).
优选实施方案的说明
A卵泡液的制备
收集卵巢
卵巢是从当地屠宰场屠宰至少4月龄的猪获得的.从刚处死的动物体内收集卵巢，并且立即放入装在保温瓶(thermobottle)中的温度大约为39℃的无菌0.9％NaCl(w/v)中。在回收2小时之内将它们转移到实验室中.所述容器抵达时的温度大约为33℃.
收集卵泡液
在预热到39℃的70％乙醇中对卵巢进行消毒10-20秒，然后将脂肪与周围的组织切开，并且立即放入无菌的磷酸缓冲盐水(PBS：0.2g/lKCl，0.2g/l KH2PO4，8g/lNaCl，1.15g/l Na2HPO4)中，在39℃下在恒温板(thermoplate)上用磁力搅拌器平衡.
卵泡液是使用吸液泵，在低真空条件下，并且使用18-号针头从直径为3-8mm的外周卵泡腔中吸出放入50ml锥形离心管(OrangeScientific，Belgium)的.细胞聚集物，卵丘-卵母细胞-复合物(COC′s)和细胞碎片在39℃下沉淀，不施加离心力。收集上清液，并且在-20℃下冷冻保存，直到进一步加工.将沉淀物用作颗粒细胞来源用于细胞培养.
制备用于细胞培养的卵泡液
将在-20℃下保存的卵泡液解冻，并且在室温下以1600x g的速度离心20分钟.去掉澄清的上清液，并且通过0.2μm孔度的过滤器(Sartorius，Germany，Cat.No 16534)进行消毒过滤.消毒的卵泡液在4℃或-20℃下保存.
制备用于细胞培养的活性炭过滤的卵泡液
将1g活化的活性炭(30-50mesh ASTM，Merck Cat.No.1.09631)放入Poly-柱10ml(BioRad，Cat.No.731-1550)中.所述活性炭依次用10ml的0.2NHCl，10ml的无水乙醇，10ml的甲醇，和10ml的0.2N NaOH洗涤。在添加每一种新的溶液之前，用蒸馏水充分洗涤活化的活性炭。
通过以1600xg的速度离心20分钟而澄清的卵泡液在重力作用下从所述活性炭柱中通过四次.最后的流通是上述无菌过滤，并且在4℃或-20℃下保存。
B猪颗粒细胞的培养
通过抽吸至少一个月龄的屠宰的猪体内卵泡腔卵泡(直径3-8mm)而收集颗粒细胞，用它建立原代细胞系.在不施加离心力的条件下使收集的细胞沉淀。在底部的细胞沉淀物在通过手工去掉卵丘-卵母细胞复合物之后是颗粒细胞的来源.用PBS洗涤所述细胞聚集物一次，然后将它们重新悬浮在颗粒细胞培养基中.将所述细胞悬浮液分配到直径为15cm的组织培养皿中(Orange Scientific，Belgium).在39℃下，在5％CO2气氛中培养培养物.当所述培养物达到汇合时，按下文所述方法对细胞进行传代.
颗粒细胞培养基由以下成分组成：89％(v/v)DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基，低葡萄糖，BioConcept1-25F50-I)，10％(v/v)FCS(胎牛血清，BioConcept1-01F00-l)，0.1mM NEAA(非必需氨基酸，BioConcept5-13K00)，2.5ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，Sigma Product No.F 0291，25μg，用1ml缺少bFGF的颗粒细胞培养基重建，在-20℃下冷冻，直到使用)，和6μg/ml庆大霉素(BioConcept4-07F00-H)。
传代培养物
在室温下用无菌PBS洗涤培养皿两次。让细胞通过PBS中的含有0.05％w/v胰蛋白酶(BioConcept，Switzerland)和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物(SigmaE-611)的酶溶液。在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶促活性.在室温下以180xg的速度离心细胞5分钟.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出等份样品进行计数.
细胞计数
将细胞悬浮液的等分样品在PBS中的0.05％台盼蓝(BioConcept，Switzerland)溶液中稀释，并且使用Neubauer血细胞计数器计数.统计活细胞(排斥台盼蓝染料)数量.
来自细胞培养物的颗粒细胞的冷冻保存
对培养物中的颗粒细胞进行胰蛋白酶化，并且悬浮在含有72％DMEM低葡萄糖(BioConcept，Switzerland)，20％FCS和8％DMSO(二甲亚砜，Sigma)的培养基中.将细胞分配到低温管形瓶(1ml)中，浓度为0.5-3.0×106细胞/ml.将它们放在控制速度的冰箱(Nicool LM 10，France)中冷冻，调整到位置3持续25分钟(直到达到-18℃)，然后调整到位置10，保持10分钟(直到达到-60℃).然后立即转移所述低温管形瓶并且保存在液氮容器中。
C颗粒细胞的增殖性衰老以及用卵泡液挽救
颗粒细胞原代细胞系的建立
收集800个卵丘-卵母细胞复合物，并且悬浮在含有0.1％(w/v)透明质酸酶(Sigma product No.H-3884)的0.4ml基于Tyrode′s的溶液中.通过在室温下用吸液管(1ml尖端)柔和地吸入和排出破坏所述卵丘-卵母细胞复合物.通过离心(180xg，5分钟)使细胞沉淀，并且重新悬浮在2ml基于Tyrode′s的溶液中。在显微镜下用吸液管将卵母细胞从悬浮液中机械取出.其余的细胞悬浮液与10ml颗粒细胞培养基混合，放入直径10cm的板中，并且在39℃下在5％CO2培养箱中培养。对汇合的单层进行传代，在每一世代对细胞进行计数，并且在表1中记录累积的细胞数量.
表1：颗粒细胞原代细胞系
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 8 原代培养物 2.1×106 12 1 3.2×106 18 2 5.7×106 22 3 28.8×106 39 4 34.2×106 54 5 8.2×106 74 6 0
在该代表性实验中，颗粒细胞原代细胞系具有有限的寿命，在体外传代4-5次之后就进入了增殖性衰老.
用卵泡液从衰老中挽救
从第5代中取出0.0557×106颗粒细胞，并且在补充了卵泡液(5％v/v)的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养。在表2中示出了卵泡液对衰老的颗粒细胞的挽救效果.
表2：在存在卵泡液的条件下的颗粒细胞
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 0 5 0.0557×106 24 6 0.55×106 31 7 6.8×106 37 8 43.53×106
所述卵泡液挽救了增殖性衰老的细胞，然后，所述细胞能够增殖，群体加倍时间为大约1.5天.该颗粒细胞系在体外传代50代之后仍然能增殖(超过150次的群体加倍).
挽救效果的可逆性
从第7代中取出1.07×106颗粒细胞，并且在不含卵泡液的10ml颗粒细胞培养基或者在补充了卵泡液(5％v/v)的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.在表3中示出了卵泡液作用的可逆性。
表3：挽救效果的可逆性
培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 (培养基中不补充卵泡液) 累计细胞数量 (培养基中补充5％卵泡液) 0 7 1.07×106 1.07×106 6 8 1.95×106 6.68×106 11 9 ＜0.2×106
卵泡液的挽救效果是可逆的，因为在除去卵泡液时所述细胞系停止增殖并且细胞死亡.这意味着颗粒细胞系既没有获得肿瘤细胞系的特性，也没有通过病毒感染等而永生化.
表征建立的颗粒细胞系，并且使用卵泡液保持
使用卵泡液的来自颗粒细胞的细胞系的若干特征表明，尽管它们能迅速分裂，所述细胞保持了颗粒细胞的某些特征.
形态学：在次级培养物中，在早期世代(培养少于10代)以及在晚期世代(培养超过70代以上)中观察到了富含各种大小的微绒毛或泡的细胞.这些特征是颗粒细胞所特有的(Motta P等，2003.Int.Rev.Cytology223：178-288).
类固醇合成活性：颗粒细胞分化的进展伴随着孕酮的产生(Motta P等，在上述引文中).由颗粒细胞系产生的孕酮是少量的(表4)。很可能所述细胞业已去分化，并且停滞在细胞分化的早期阶段.
表4：由颗粒细胞系生产的孕酮：
凋亡性细胞死亡：在剥夺血清之后24小时之内，固缩的细胞的快速积累和DNA断裂的自发开始是在颗粒细胞系中发生的凋亡性细胞死亡的特征。业已证实，除去血清能加快凋亡性细胞死亡的自发开始，它是在颗粒细胞的原代培养物中发生的(Hu C-L等，2001.Biol Reprod 64：518-526)。
接触抑制：与体内相似，来自建立的细胞系的颗粒细胞在不接触抑制作用的条件下能在体外分裂.它们形成了交叉的细胞多层.
D在冷冻保存之后用卵泡液挽救原代颗粒细胞系
可以使原代颗粒细胞系传代有限的次数，然后它们进入不可逆转的生长停滞阶段，并且死亡.通过对颗粒细胞系进行冷冻保存可以加速停滞的生长.下面的实验证实了在冷冻保存和解冻之后卵泡液能挽救颗粒细胞.
让猪颗粒细胞的原代培养物在直径为15cm的培养皿中生长到混合。通过胰蛋白酶/EDTA处理分离细胞，计数，并且以2.2×106细胞/ml培养基的浓度悬浮，用于冷冻保存(参见″B猪颗粒细胞的培养″).
然后对颗粒细胞进行解冻，并且将两等份0.6×106细胞分配到两个直径10cm的培养皿中，培养皿中装有10ml颗粒细胞的常规培养基.一个培养皿中补充了10％(v/v)的卵泡液.两个培养皿在37℃下在CO2培养箱中培养.在培养7天之后，对细胞进行计数，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在再培养8天之后，对细胞进行计数(表5).
表5：冷冻保存的颗粒细胞的挽救
解冻之后 培养天数 传代次数 (传代培养物) 累计细胞数量 (培养基中不补充卵泡液) 累计细胞数量 (培养基中补充10％卵泡液) 0 0.7×106 0.7×106 7 2 0.7×106 1.3×106 15 3 0.15×106 12.2×106
将卵泡液作为补充物添加到细胞培养基中，使得解冻的颗粒细胞能够正常生长，并且防止在不添加卵泡液的颗粒细胞培养物中出现的生长停滞和死亡.
E卵泡液不是血清的替代品
将在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基保持了11代的原代颗粒细胞系传代培养到两个直径15cm的培养皿中.每一个培养皿以5×106细胞的密度接种在30ml颗粒细胞培养基中；一个培养基补充了4％(v/v)的卵泡液.在37℃下，在CO2培养箱中培养三天之后，对细胞进行胰蛋白酶化并且计数.
在培养基中不添加卵泡液补充物：总共7.4×106细胞相当于0.2群体加倍/天.所述细胞被称作″衰老的″细胞.在培养基中添加4％(v/v)的卵泡液补充物：总共14.5×106细胞相当于0.5群体加倍/天。这样的细胞被称作″挽救的″细胞.
将两种类型的细胞群体(″衰老的″和″挽救的″)以0.04×106细胞/ml的浓度悬浮在无血清的颗粒细胞培养基中，并且分配到24-孔板的孔中(0.75ml/孔，30′000细胞/孔)或分配到12-孔板的孔中(2ml/孔，80′000细胞/孔).在附着90分钟之后，除去不含血清的培养基，并且分别用0.75ml，和2ml具有表6所示组成的培养基替换.
在37℃下在CO2培养箱中培养板7天.将12-孔板用于计数细胞，并且在下表中提供了计数结果.将24-孔板用于用结晶紫染色，在下面的表6中示出了″挽救的″细胞的结果.
细胞培养物的结晶紫染色
将培养基吸出，用PBS洗涤细胞层一次，并且用0.5％(w/v)结晶紫(于30％(v/v)乙醇和0.5％(v/v)戊二醛中)染色大约10分钟。在倒掉结晶紫溶液之后，用自来水漂洗所述板，然后在空气中风干.
表6：在含有血清和/或卵泡液的培养基中生长的颗粒细胞
FCS，优选10％(v/v)是必要的，但不足以阻止原代颗粒细胞系的生长停滞和死亡.卵泡液是必要的，但不足以阻止原代颗粒细胞系的生长停滞和死亡。卵泡液包含原代颗粒细胞系存活所必需的因子，并且这些因子是FCS缺乏的.
F活性炭过滤的卵泡液对颗粒细胞生长和维持的作用
颗粒细胞系在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基中保持7代。将0.4×106细胞从第7代中取出，并且在补充了4％卵泡液，或4％活性炭过滤的卵泡液的10ml颗粒细胞培养基，或剥夺了卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.每周计数细胞，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在表7中示出了累积的细胞数量.
表7：培养物中的颗粒细胞
活性炭过滤的卵泡液不能够长时间维持颗粒细胞系的生长
含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的混合物在生物学活性方面由于 单独的卵泡液：冷冻保存的细胞
对来自猪颗粒细胞原代培养物的细胞进行冷冻.将所述细胞用于比较卵泡液的作用和由一体积的卵泡液和一体积的活性炭过滤的卵泡液组成的混合物的作用.1.3×106解冻的细胞在补充了4％卵泡液，或上述4％卵泡液的1∶1的混合物的10ml颗粒细胞培养基中，或者在不含卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.在每一代对细胞计数，并且接种到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在下面的表8中示出了累积的细胞数量.
表8：含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养物中的冷冻保存的颗粒细胞
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
＊＊在35天之后的传代次数为3.n.d.＝未测定。
在实验过的所有培养条件下，在解冻之后，大部分冷冻的颗粒细胞迅速死亡.在挽救培养物中的颗粒细胞方面，卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物优于单独的卵泡液，这些细胞在剥夺了卵泡液时会死亡。挽救衰老出现的更早一些.
含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的混合物在生物学活性方面优于 单独的卵泡液：颗粒细胞系的增殖和生长
所述颗粒细胞系在补充了4％卵泡液的颗粒细胞培养基中维持8代。从第8代取出0.4×106细胞，并且在补充了4％卵泡液，或补充了4％的卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的10ml颗粒细胞培养基中，或者在剥夺了卵泡液的10ml颗粒细胞培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.当培养物汇合时，对细胞进行计数，并且传代到新的培养皿中，保持相同的培养条件.在表9中示出了累积的细胞数量：
表9：在含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养物中的颗粒细胞系
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
以上结果表明，与只含有卵泡液的培养基相比，颗粒细胞系在补充了卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物的培养基中增殖更快.在本实验中，每一代细胞数量平均增加25％.
G卵泡液能延长培养物中原代人成纤维细胞的寿命
正常的体细胞总是会进入不可逆转的生长停滞状态，并且在有限次数的分裂之后改变功能.这一过程被称作复制性衰老.成纤维细胞在体外具有有限的寿命，它的寿命是由群体加倍数(PDs)决定的，而不是由时间决定的.在外植之后，细胞经历了迅速分裂的起始阶段，随后是增殖活性的下降(衰老前状态).随后所述细胞达到衰老状态，其特征是形态学改变，如体积的增加和不规则的形状，并且，尽管处在不增殖的状态，它们能存活多个月(Cristofalo VJ and Pignolo RJ，1993.Physio.Reviews 73：617-638)。
补充了卵泡液的培养基表现出衰老的开始的延迟，并且允许细胞保持分裂15-20PDs，这意味着比正常情况增加了50％.
在添加或不添加卵泡液的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF)中， 与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色
β-半乳糖苷酶，在pH 6下是可以通过组织化学检测的，它是鉴定培养物中衰老的人成纤维细胞的生物标记(Dimri等，1995.Proc.Nat.Acad.Sci.92：9363-9367)。从包皮上获得的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，Cat.No.C-10351，PromoCell GmbH，Heidelberg，Germany)在PromoCell成纤维细胞生长培养基(Cat.No.C-23010)中生长。在添加PromoCell补充混合物/成纤维细胞生长培养基(Cat.No.C-39315)之后，在完全培养基中生长因子的浓度如下：胰岛素5μg/ml，碱性成纤维细胞因子1ng/ml，两性霉素B 50μg/ml，庆大霉素50μg/ml.PromoCell成纤维细胞生长培养基是用于培养成纤维细胞的无菌的液体培养基，并且是无血清的。饲养层，基质底物或其他物质是不必要的.在新的容器中培养和继代培养是按照生产商的说明进行的.
在使用PromoCell成纤维细胞生长培养基传代五次之后，将13′500NHDF细胞接种到24-孔板的一个孔中，孔中容纳有0.75ml的培养基。在用补充了4％(v/v)卵泡液的PromoCell成纤维细胞生长培养基传代六次之后，将13′500NHDF细胞接种到24-孔板的另一个孔中，孔中容纳有0.75ml补充了卵泡液的培养基.在CO2培养箱中在37℃下培养3天之后，对所述细胞进行固定和染色，以便确定与衰老相关的-β半乳糖苷酶。
细胞的与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色
将培养基吸出，并且用PBS洗涤细胞一次，然后通过PBS中的0.5％戊二醛(25％溶液，Sigma)在室温下处理.5分钟之后，用PBS中的1mMMgCl2，pH7.2洗涤所述细胞.在PBS pH 6.0(通过添加乙酸将PBS调节为pH 6.0的)中的含有1mg/ml X-gal(来自4％DMSO母液，Fermentas No.R04019)，0.12 mM K3Fe(CN)6 3H2O，0.12mMK4Fe(CN)6，1mM MgCl2的溶液中对细胞进行染色。在室温或者在37℃下培养细胞，用H2O洗涤一次，并且在H2O中在4℃下保存.
在缺少卵泡液的条件下保持的所有成纤维细胞都处在衰老前或衰老的状态.保持在补充了卵泡液的培养基中的成纤维细胞只有不到10％处于衰老前或衰老的状态。
培养正常的人皮肤成纤维细胞
来自包皮的正常的人皮肤成纤维细胞(NHDF，Cat.-No.：C-10351，PromoCell GmbH，Heidelberg，Germany)在NHDF培养基中培养(89％(v/v)DMEM，10％(v/v)FCS，0.1mM NEAA，和6μg/ml庆大霉素)。在室温下用无菌PBS洗涤培养皿两次.用PBS中的含有0.05％w/v胰蛋白酶和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物的酶溶液让细胞传代.在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶活性.在室温下以180xg的速度离心5分钟使细胞沉淀.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出一等份样品用于计数.
对细胞进行计数，并且按颗粒细胞的处理方法进行冷冻(B猪颗粒细胞的培养).
卵泡液能延长NHDF的寿命
在每一世代通过培养获得的群体加倍数是用以下公式计算的
群体加倍＝(logNt-log N0)/log 2.0，
其中Nt＝在时间t在收获时回收的细胞数量，而N0＝最初铺板的细胞数量。
比较了在含有10％血清的培养基或含有10％血清和4％卵泡液的培养基中培养的NHDF细胞的群体加倍(PDs).结果如图4所示。与它们的对应物相比，所述细胞的增殖寿命延长了大约15-20次群体加倍(与正常情况相比群体加倍增加了50％).在用5％的血清浓度取代10％的浓度的培养基中获得了类似的结果.
卵泡液作用的可逆性
在第21代(35次群体加倍)将在含有4％卵泡液的NHDF培养基中连续生长的0.45×106NHDF细胞取出，并且在不含卵泡液的10mlNHDF培养基或在补充了卵泡液(4％v/v)的10ml NHDF培养基中，或在补充了活性炭过滤的卵泡液(4％v/v)的10ml培养基中，在直径10cm的培养皿中培养.如表10所示，来卵泡液的作用是可逆的.
表10：在有或没有卵泡液的NHDF培养基中培养的NHDF细胞
从在存在卵泡液的条件下连续生长的NHDF中剥夺卵泡液，使得所述细胞衰老.活性炭过滤的卵泡液在阻止NHDF细胞衰老方面比未处理过的卵泡液好。
卵泡液对衰老前NHDF细胞的恢复活力的作用
在添加到达到衰老前状态的老化NHDF细胞培养物之后，卵泡液能够恢复它们的生长能力.
NHDF细胞在缺少卵泡液的条件下传代26PD′s，并且在含有4％卵泡液作为补充物的NHDF培养基中进一步传代.同样，NHDF细胞在缺少卵泡液的条件下传代28PD′s，并且在含有4％活性炭过滤的卵泡液的培养基中进一步传代.在每一世代对NHDF细胞计数.结果如图5所示.
通过添加卵泡液延迟了衰老。活性炭过滤的卵泡液在诱导这种作用方面优于未处理过的卵泡液.
H卵泡液能保护原代培养物中的脑神经元避免发生细胞死亡.
从大鼠胚胎脑皮层中制备原代神经元
解剖来自大鼠胚胎(18天)脑的皮层，并且用木瓜蛋白酶溶液处理总共30分钟.在添加胰蛋白酶抑制剂之后，通过用吸液管柔和研磨而分离皮层神经元.然后对所述原代神经元进行计数，并且铺板到用poly-D赖氨酸包被的标准组织培养板上。
原代神经元的培养
在原代神经元铺板2小时之后，铺板的培养基用有或没有4％卵泡液的，由5％FCS/DMEM(高葡萄糖4500mg/ml)的生长培养基替换.
在缺少卵泡液的条件下培养的原代神经原培养物出现了广泛的细胞死亡，少有或没有神经突延伸.在存在卵泡液的条件下维持的神经原培养物表现出神经元的存活，在培养24小时之后具有广泛的神经突长出.
卵泡液提供了对神经细胞死亡的保护作用：在体外条件下从变性中挽救了原代神经元，并且促进了神经突的长出，而且允许神经网络广泛形成.
I卵泡液成分保护原代培养物中肝细胞避免发生细胞死亡
用大鼠胚胎肝脏制备肝细胞
解剖来自大鼠胚胎(18天)的肝脏，并且通过用吸液管柔和研磨而分离肝细胞.将原代肝细胞铺板到标准组织培养板上.生长培养基由5％FCS/DMEM组成，其中有或没有4％活性炭过滤的卵泡液或4％卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物。
培养原代肝细胞
原代肝细胞培养物在37℃下在CO2培养箱中保持，并且使用光学显微镜检查.当单层汇合时，使用PBS中的包括0.05％w/v胰蛋白酶(BioConcept，Switzerland)和0.02％w/v乙二次氮基四乙酸四钠盐二水合物(SigmaE-611)的酶溶液对所述细胞进行传代.在细胞分离之后，通过添加FCS(2％最终浓度)终止酶活性.通过在室温下以180xg的速度离心5分钟使细胞沉淀.将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的培养基中.取出一等份样品用于计数.在表11中示出了卵泡液成分的作用.
表11：在含有卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物或含有活性炭过滤的卵泡液的培养物中的大鼠胚胎肝细胞
＊卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物
在缺少卵泡液成分的条件下培养的原代胚胎肝细胞培养物不能长时间存活.卵泡液和活性炭过滤的卵泡液的1∶1混合物提供了对肝细胞死亡的保护作用，并且能在体外条件下从变性中挽救原代肝细胞。
J卵泡液的分离
将Centrifugal Filter Devices YM-3(标称分子量极限3′000)，YM-10(MW 10′000)，YM-30(MW30′000)，和YM-50(MW50′000)(Millipore Corporation，Product nos.分别为4320，4321，4322，和4323)用作超滤装置，用于对生物学样品进行纯化，浓缩，和脱盐。过滤过程本身是柔和的，避免了潜在的问题，如样品变性和缓冲盐的浓度.32ml的澄清的卵泡液以1500xg的速度在摆斗式转子中在室温下离心.分子大小级份的浓缩和用PBS进行的透析是按照生产商的说明进行的.开始使用YM-50装置，然后依次对卵泡液进行分离和浓缩。
来自卵泡液的级份的生物活性
将存在于0.75ml颗粒细胞培养基中的0.03×106衰老的颗粒细胞(第11代)接种到24-孔板的每一个孔中.将计算出的能恢复原始的4％v/v卵泡液的体积添加到每一个孔中。一个孔不接受补充物(阴性对照)。一个孔接受30μl的纯卵泡液(阳性对照)。
在表12中提供了在CO2培养箱中在37℃下培养八天之后显微镜检查的结果：
表12：卵泡液分子量级份在挽救颗粒细胞方面的活性
级份 细胞生长
级份 细胞生长 ＞50kDa ++++ 30-50kDa - 10-30kDa - 3-10kDa - ＜3kDa ++ 卵泡液 +++++ 不添加 -
<3kDa的级份和>50kDa的级份包括活性因子，它在某种程度上模拟卵泡液的活性.
检验<3kDa和>50kDa的级份之间的协同作用，以及在包被之后＞50 kDa的级份的活性
将存在于0.75ml的颗粒细胞培养基中的0.03×106衰老的颗粒细胞(第16代，在第15代期间剥夺了卵泡液)接种到24-孔板的每一个孔中。将一体积(计算出该体积能恢复每一种级份的最初的4％v/v卵泡液)添加到每一个孔中.一个孔不接受补充物(阴性对照).一个孔接受30μl的纯的卵泡液(阳性对照).包被是按以下方法进行的：将350μl PBS中的＞50kD的浓缩级份的1％(v/v)溶液添加到要包被的空孔中，并且在37℃下培养一小时.在用水快速洗涤之后，干燥所述孔.
在下面的表13和图1中示出了在CO2培养箱中在37℃下培养八天之后显微镜检查的结果：
表13：卵泡液分子量级份在支持颗粒细胞生长方面的活性
孔编号 级份 细胞生长 1 ＞50kDa ++++ 2 30-50kDa ++ 3 10-30kDa ++ 4 3-10kDa +
孔编号 级份 细胞生长 5 ＜3kDa ++ 6 卵泡液 +++++ 7 不添加 - 8 ＞50kDa+＜3kDa ++++++ 9 用＞50kDa的级份包被的孔 + 10 用＞50kDa+＜3kDa的级份包被的孔 +++
K纯化卵泡液的高分子量级分
大小层析
通过SephadexTM G200 super fine柱凝胶过滤，以便对来自卵泡液(蛋白浓度为100mg/ml)的0.5ml的＞50kDa的级份进行层析，所述柱的长度为1m，直径为26mm，使用PBS缓冲液，洗脱速度为120滴/级份(相当于6-7ml)。
图2表示收集的级份(水平轴)在280nm波长下的光密度(垂直轴)的曲线。分离了三个主要的峰。测定所述级份的生物学活性，按以下方法测定所述级份的生物学活性和蛋白特性：
生物学测定
将存在于750μl颗粒细胞培养基中的0.02×106颗粒细胞的衰老细胞(第30代)接种到24-孔板的每一个孔中。在铺板六小时之后除去350μl的培养基，并且替换为由100μl要检测的级份和100μl含有20％FCS，0.2mM NEAA和12μg/ml庆大霉素的DMEM培养基组成的200μl混合物.阳性对照：在第一个孔中，除去350μl的培养基，并且替换为由100μlPBS，100μl含有20％FCS，0.2mM NEAA和12μl/ml庆大霉素的DMEM以及30μl卵泡液组成的230μl混合物.在37℃下在CO2培养箱中培养四天之后，用结晶紫对所述板进行染色.
结果如图3所示。在该附图中，左上侧的孔是阳性对照。右侧随后的孔是级份22-44。
检测了级份23，24和25的挽救颗粒细胞的活性.所述活性相当于在层析中的最大尺寸的峰。
通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋 白分析
分析是使用Novex Bis-Tris凝胶系统，按照生产商的说明在用于微型凝胶电泳的XCellSureLockTM Mini-Cell(Invitrogen Cat.Nos：E10001，E10020，E10002)上进行的，使用预先浇铸的聚丙烯酰胺凝胶4-12％Bis-Tris Gel，1.0mm×12孔(Invitrogen Cat No.NP0322)和MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen Cat.No.NP0002).
将5μlLDS样品缓冲液(4X)以及任选的2μl还原剂(10X)添加到15μl要分析的级份样品中，分别得到了20μl和22μl的总体积.在70℃下将样品加热10分钟。电泳之后，用0.125％(w/v)考马斯亮蓝(考马斯Brilliant Blue R250，Fluka Cat.No.27816)，50％甲醇和10％乙酸的溶液在摇床上对所述凝胶染色15分钟.用5％甲醇和7％乙酸对凝胶进行脱染色。
在变性，非还原条件下，级份23-25的主要蛋白成分的表观分子量＞＞220kDa，并且在变性和还原条件下，表观分子量大约为170kDa。它很可能是由通过二硫键连接的两个160kDa亚基的二聚体组成的，级份30-32和级份38-41中的蛋白分别相当于免疫球蛋白和白蛋白.
阳离子交换层析
在上对来自大小层析的级份23-25的合并物进行浓缩，并且用含有0.02％NaN3的pH 5.0的25mM乙酸缓冲液透析.层析是使用CM纤维素离子交换剂进行的，床体积为0.5ml，使用含有0.02％NaN3的pH 5.0的25mM乙酸盐的起始缓冲液，在表14中示出了收集的级份.
表14：阳离子交换层析级份
样品 OD280nm(1cm) 级份编号 活性 起始缓冲液 0.092 样品“流通”(1.05ml) 0.577 1 + 第一次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.142 2 未测定 第二次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.127 3 - 第三次用1.05ml起始缓冲液洗涤 0.109 4 未测定 用25mM乙酸缓冲液中的1.05ml500mM NaCl洗脱 0.113 5 - 25mM乙酸缓冲液中的500mMNaCl 0.095
生物测定：由于所述样品含有0.02％NaN3(对活的细胞有毒性)，活性是在用所述成分对孔进行包被之后测定的.将来自CM柱的100μl样品(级份编号1，3和5)与100μl的PBS混合，并且将总体积转移到24-孔板的孔中.所述板在37℃下培养二小时，然后在4℃下培养过夜.取出样品.用无菌水洗涤所述孔并且干燥.
将0.02×106衰老的颗粒细胞接种到每一个孔中的用于颗粒细胞的0.75ml的培养基中.阳性对照：无包被，向培养基中添加30μl的卵泡液。阴性对照：无包被，不添加.在37℃下在CO2培养箱中培养四天之后，用结晶紫对所述板进行染色.
所有蛋白以及活性成分都在阳离子交换层析的″流通″级份中.
通过肽质量指纹分析鉴定蛋白
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离″流通″级份的等份样品，一个样品是在还原条件下变性的，而一个样品是在非还原条件下变性的.
在室温下在摇床上，在高纯度水中的0.15％(w/v)的考马斯亮蓝G-250，0.5％(v/v)乙酸和10％甲醇中对凝胶进行染色三分钟.然后在室温下，在摇床上，在高纯度水中的0.5％(v/v)乙酸和10％(v/v)甲醇中对所述凝胶进行脱染色，直到可以看见蛋白带.
将在非还原条件下相对MW＞220kDa的带，和在还原条件下160kDa的带切除并且转移到独立的0.5ml安全锁试管中.添加200μl高纯度水，并且在-20℃冷冻样品，直到用于质谱分析.
检测到了八种肽，它们相当于人α-2-巨球蛋白前体的氨基酸序列[A2MG-人；P01023；质量(平均)163278]，并且相当于其他物种(豚鼠和小鼠)的同源物.所述豚鼠蛋白不存在于SwissProt/Trembl数据库中。所述样品包含新的豚鼠蛋白，它属于α-2-巨球蛋白前体家族。
检测到的肽包括：
1)TEVSSNHVLIYLDK
2)QQNAQGGFSSTQDTVVALHALSK
3)MVSGFIPLKPTVK
4)SSGSLLNNAIK
5)QTVSWAVTPK
6)GEAFTLK
7)YGAATFTR
8)DLKPAIVK
该蛋白家族的成员是同四倍体形式的，它由两对二硫键连接的链组成.这种特性与猪的蛋白的SDS-PAGE分析吻合.
L核型分析
制备有丝分裂涂片
将(Fluka Cat.No.27645，蒸馏水中的母液5μg/ml，在-20℃下保存)添加到生长细胞的6cm的板上，最终浓度为0.05μg/ml。所述细胞在37℃下培养2.5小时.对所述细胞进行胰蛋白酶化，并且重新悬浮到10ml的0.56％(w/v)KCl溶液中.让所述细胞在室温下放置总共20分钟(包括以下的离心时间).通过柔和离心(500rpm，5分钟)使细胞沉淀.将尽可能多的KCl溶液吸出。添加1ml的Carnoy′s固定剂(3∶1v/v无水甲醇/冰醋酸).在室温下放置5分钟之后，使细胞沉淀，并且替换固定剂.重复这一过程一次，并且将细胞悬浮在1ml Carnoy′s固定剂中.将一小滴细胞悬浮液添加到预先清洗过的玻璃显微镜载玻片上。用PBS中的300nM DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，Sigma-Aldrich)母液对所述载玻片染色30分钟，然后用PBS洗涤.用荧光显微镜获得图像，并且在图像上对染色体进行计数。
在卵泡液中长时间保持的细胞具有正常的染色体互补.在表15中示出了每一种制备物的若干有丝分裂涂片的计数结果.
表15：染色体计数
细胞 历史 计数 预期 颗粒细胞系A(猪) 在含有4％卵泡液的培养基中传代70次 (群体加倍超过200次) 38 2N＝38 颗粒细胞系B(猪) 在含有4％卵泡液的培养基中传代21次 (群体加倍超过60次) 38 2N＝38 NHDF细胞(人) 在含有4％卵泡液的培养基中群体加倍50 次 46 2N＝46
序列表
<110>OvaGen AG
<120>使细胞治疗中使用的细胞长期生长和存活的卵泡液
<130>Zb/20646
<150>EP03405628.3
<151>2003-09-01
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>1
Thr Glu Val Ser Ser Asn His Val Leu Ile Tyr Leu Asp Lys
1 5 10
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>2
Gln Gln Asn Ala Gln Gly Gly Phe Ser Ser Thr Gln Asp Thr Val Val
1 5 10 15
Ala Leu His Ala Leu Ser Lys
20
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>3
Met Val Ser Gly Phe Ile Pro Leu Lys Pro Thr Val Lys
1 5 10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>4
Ser Ser Gly Ser Leu Leu Asn Asn Ala Ile Lys
1 5 10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>5
Gln Thr Val Ser Trp Ala Val Thr Pro Lys
1 5 10
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>6
Gly Glu Ala Phe Thr Leu Lys
1 5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>7
Tyr Gly Ala Ala Thr Phe Thr Arg
1 5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>Sus sp.
<400>8
Asp Leu Lys Pro Ala Ile Val Lys
1 5