一种以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法

摘要

本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法，以经过改性与浸润处理的蛭石为载体材料，高温高压蒸汽灭菌后，接种真菌与细菌的混合菌，然后增殖培养，便制得所需固定化混合菌颗粒。本发明对载体材料进行改性处理，使蛭石呈现多孔的特征，晶片破裂，并出现0.01～0.4μm大小不等微孔，比表面积提高，吸附性增强，为真菌和细菌提供了更多的吸附位点，提高了固定化效率；为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。

权利要求

1.一种以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法，其特征在于：以经过改性与浸润处理的蛭石为载体材料，高温高压蒸汽灭菌后，接种真菌与细菌的混合菌，然后增殖培养，便制得所需固定化混合菌颗粒；

所述蛭石浸润处理为，改性处理后的蛭石按0.5～1.5ml/g的固液比用无菌水或增殖培养基浸润培养12～24h；

所述真菌为毛霉Mucor sp.，细菌为Bacillussp.，培养温度为20～28℃；

所述蛭石改性处理过程为：

将蛭石过筛后，加0.5～1.5mol/L HCl，固液比1∶15～25，室温静泡24～36h，用水冲洗，然后60～83℃烘干，放干燥器中备用，便制得室温酸改性蛭石；

或者，将蛭石过筛后，加0.5～1.5mol/L HCl，固液比1∶15～25，80～83℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗，烘干后，便制得加热酸改性蛭石。

2.按照权利要求1所述以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法，其特征在于：所述加热酸改性后蛭石再于400～500℃焙烧4～8h，得到酸处理并焙烧的蛭石。

3.按照权利要求1所述以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法，其特征在于：所述混合菌进行种子培养时，其采用的种子斜面培养基为葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，KCl 0.02％，pH 6.5；或为马铃薯0.3％，蔗糖2％，牛肉膏0.2％，琼脂2％，NaCl 0.5％，pH自然；

混合菌进行增殖培养时，其采用的增殖培养基为蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，尿素

0.12％，KH2PO40.05％，MgSO4·H2O 0.025％，pH 5.0～7.0；或为蔗糖4.0％，尿素0.12％，蛋白胨0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·H2O 0.025％，NaCl 0.2％pH 5.0～7.0。

说明书

一种以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，是以蛭石为载体的吸附固定化混合菌工艺。

背景技术

[0002] 蛭石化学式为Mgx(H2O){Mg3～x〔AlSiO3O10〕(OH)2}，是一种层状结构的含镁的水铝硅酸盐次生变质矿物，外形似云母，通常由黑(金)云母经热液蚀变作用或风化而成。因其受热失水膨胀时呈挠曲状，形态酷似水蛭，故称蛭石。蛭石具有隔热、耐冻、吸水等优异性能，是一种优良的载体材料。

[0003] 多环芳烃(PAHs)是指2个或2个以上的苯环稠合在一起的一类化合物，它们在环境中普遍存在。人类活动特别是化石燃料的燃烧是环境中PAHs的主要来源。由于该类化合物的辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤就成为PAHs的主要载体。PAHs在土壤中比较稳定而且难于分解，即便采用处理土壤中易挥发、易降解有机污染物较成功的方法也很难去除土壤中的PAHs。多环芳烃在自然界中的积累会对人类以及整个自然界造成极大的危害，一些多环芳烃进入人体和动物体内后，会产生致癌、致畸、致突变的后果。因此，有关PAHs污染土壤的修复技术倍受关注。尽快开发出安全、高效、实用性强的多环芳烃污染土壤修复技术，是科研工作者面临的艰巨而紧迫的任务。

[0004] 近年来，发展起来的微生物修复技术为PAHs的降解提供了较好的途径，但也存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。因此，亟需开发更高效更适合于原位多环芳烃污染土壤修复的新型生物技术，而微生物固定化技术可以克服这些弊端。

[0005] 所谓固定化技术，是利用化学或物理的手段，将游离的细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种基本技术。其优点是可以大幅度提高参加反应的微生物浓度，固定化后的微生物耐环境冲击性增强，根据需要可选择适宜的微生物，可降低二次污染等优点，因而被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中。但将固定化微生物用于降解非流体介质(土壤)中有机污染物的研究，国内外尚未见报道。

[0006] 微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺条件。

发明内容

[0007] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化混合菌(细菌与真菌)颗粒的制备方法。本发明以蛭石为载体材料，采用吸附固定化方法，对高效降解多环芳烃的菌株进行固定化，将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明：按照该配方制得的固定化生物产品对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案(固定化混合菌的制备方法)为：

[0009] 一种以蛭石为载体的真菌和细菌联合固定化方法，以经过改性与浸润处理的蛭石为载体材料，高温高压蒸汽灭菌后，接种真菌与细菌的混合菌，然后增殖培养，便制得所需固定化混合菌颗粒。

[0010] 所述蛭石在作为载体以前需经过改性处理，包括3种改性方法，具体为：

[0011] 1.将蛭石过2mm筛后，加0.5～1.5mol/L HCl，固液比1∶15～25，室温静泡24～36h，用水冲洗，然后60～83℃烘干，放干燥器中备用，便制得室温酸改性蛭石；

[0012] 2.将蛭石过2mm筛后，加0.5～1.5mol/L HCl，固液比1∶15～25，80～83℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗，烘干后，便制得加热酸改性蛭石；

[0013] 3.加热酸改性后蛭石再于400～500℃焙烧4～8h，得到酸处理并焙烧的蛭石。

[0014] 所述蛭石浸润处理为，改性处理后的蛭石按0.5～1.5ml/g的固液比用无菌水或增殖培养基浸润培养12～24h。

[0015] 所述真菌为毛霉(Mucor sp.)，细菌为(Bacillus sp.)，其对多环芳烃，尤其是高分子量多环芳烃具有一定的降解能力，培养温度为20～28℃；种子斜面培养基为葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO3 0.1％，MgSO4·7H2O0.02％，KCl 0.02％，pH6.5，较佳的种子培养基为马铃薯0.3％，蔗糖2％，牛肉膏0.2％，琼脂2％，NaCl 0.5％，pH自然；增殖培养基可为蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，尿素0.12％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·H2O0.025％，pH5.0～7.0，也可为蔗糖4.0％，尿素0.12％，蛋白胨0.3％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·H2O0.025％，NaCl 0.2％pH5.0～7.0，较佳的为蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，(NH4)HPO4 0.2％，MgSO4·H2O 0.025％，pH6.0～6.5。

[0016] 本发明具有如下优点：

[0017] 1.本发明对载体材料进行三种不同的改性处理，使蛭石呈现多孔的特征，晶片破裂，并出现0.01～0.4μm大小不等微孔，比表面积提高，吸附性增强，为真菌和细菌提供了更多的吸附位点，提高了固定化效率；以改性后的蛭石为载体材料，制备的固定化混合菌颗粒为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。

[0018] 2.本发明所采用微生物为真菌和细菌的混合菌，很好的解决了单一菌株降解不彻底问题，真菌能够分泌胞外酶，使多环芳烃羟基化，对高分子量多环芳烃起开环作用，但生成的中间代谢产物毒性往往比原污染物的毒性更大，真菌不能降解这些中间产物，而细菌可以将这些毒性更大的中间产物降解成CO2和水，真菌和细菌的联合使得高分子量的多环芳烃降解更彻底；固定化混合菌(真菌和细菌)颗粒对受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多环芳烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比2％、修复时间60d的条件下，土壤中PYR去除率为81～96％，对BaP的去除率为52～65％，较游离菌提高20％以上。

[0019] 3.本发明所制得的固定化混合菌颗粒很好的解决了非流体介质传质困难的问题。“蛭石-细菌-真菌”三者间关系相互关联，不可分割，经SEM(扫描电子显微镜)观察到：细菌附着在真菌菌丝体表面，菌丝随着生长而移动，使得附着在其表面的细菌也跟着迁移，更易于与污染物接触，从而使固定化颗粒降解多环芳烃的有效范围更广，修复效果更明显，修复更彻底(见图7、8)；有的细菌附着在真菌孢子表面，有的细菌直接吸附在蛭石表面，或者蛭石的凹陷部位(见图4、5、6)；真菌繁茂的菌丝交错于蛭石空隙间，有的菌丝附着在蛭石表面(见图1、2、3、4)，“蛭石-细菌-真菌”这种固定化混合菌颗粒就如一个“源”向周围非流体介质输送能高效降解多环芳烃的微生物，发挥真菌与细菌协同降解作用，使受污染介质得到净化。

[0020] 4.本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染。

附图说明

[0021] 图1为蛭石改性后固定化颗粒×150扫描电子显微镜照片；

[0022] 图2为蛭石改性后固定化颗粒×2000扫描电子显微镜照片；真菌较细菌大的多，很难在一个视野里即看到真菌有看见细菌，所以图1与图2的固定化混合菌，主要看见的是真菌菌丝体与载体蛭石的关系；

[0023] 图3为蛭石载体固定化颗粒×500扫描电子显微镜照片；

[0024] 图4为蛭石载体固定化颗粒×200扫描电子显微镜照片；图3与图4是表示传质过程图。真菌孢子囊里面的孢子散落到邻近蛭石载体上，使得真菌在载体间传递，延伸，便于在非流体介质中传质；

[0025] 图5为蛭石载体固定化混合菌×1500扫描电子显微镜照片；图5表示真菌孢子与细菌关系，细菌吸附在孢子表面(右上角)；

[0026] 图6为蛭石载体固定化混合菌×10000扫描电子显微镜照片；图6表示真菌孢子吸附在蛭石表面，同时细菌也有吸附在蛭石表面；

[0027] 图7为蛭石改性后固定化颗粒×1000扫描电子显微镜照片；

[0028] 图8为蛭石改性后固定化颗粒×10000扫描电子显微镜照片；图8是图7的局部放大图。真菌菌丝体上面也吸附了细菌！细菌可以随着真菌菌丝体的生长而不断的移动，进一步解决了非流体介质中传质性的问题！

具体实施方式

[0029] 下面通过实例对本发明作进一步详细说明。

[0030] 实施例1

[0031] (1)固定化混合菌斜面培养

[0032] 在装有培养基(葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO3 0.1％，MgSO4·7H2O0.02％，KCl 0.02％，pH6.5)的试管中先后接种细菌和真菌，置于28～30℃培养箱中培养
2～3d。

[0033] (2)固定化载体改性处理

[0034] 所述蛭石在作为载体以前需经过改性处理，具体操作步骤为：将蛭石过2mm筛后，加1mol/L HCl，固液比1∶20，室温静泡24h，自来水洗至pH值为自来水的pH值(约为6.8)，然后60℃烘干，放干燥器中备用，便制得室温酸改性蛭石。

[0035] (3)固定化载体浸润培养

[0036] 将改性后的蛭石按1ml/g比例，用无菌水浸润培养12～24h。

[0037] (4)固定化颗粒制备

[0038] 将处理后的载体中间打孔，高温高压蒸汽灭菌90min，待温度降到20℃，从混合菌斜面培养基上取1环混合菌，接入无菌载体有孔的中心部位，密封后放入28℃恒温培养箱中避光培养，每天按0.2ml/g载体的量补加增殖培养基(蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，(NH4)HPO4 0.2％，MgSO4·H2O 0.025％，pH6.0～6.5)，3d后菌丝体穿透蛭石载体，布满培养瓶，便制得以蛭石为载体的混合菌固定化颗粒。

[0039] 经上述步骤制得的固定化混合菌颗粒周期短，单位体积细胞密度大，细菌7 5
3.07×10 个/g，真菌9.25×10 个孢子/g。

[0040] (5)固定化混合菌对受多环芳烃污染土壤的修复效果

[0041] 将制备好的固定化颗粒按2％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，60d后，土壤中PYR的去除率为87％；土壤中BaP的去除率为52％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，60d后固定化颗粒仍然具有90％以上的活性。

[0042] 实施例2

[0043] 与实施例1不同处在于：载体改性处理步骤为将2mm粒径的蛭石，加0.5mol/L HCl，固液比1∶15，80℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗至pH为6.8，烘干后，制得加热酸改性蛭石。

[0044] 经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度，7.21×108个/g，真菌孢6
子数为5.38×10 个/g。

[0045] 固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为81％，BaP的去除率为59％。

[0046] 实施例3

[0047] 不同处在于：载体改性处理步骤为将2mm粒径的蛭石，加1mol/L HCl，固液比1∶20，83℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗至pH为6.8，烘干后，制得加热酸改性蛭石。

[0048] 经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度较大，1.59×109个/g，真7
菌孢子数为2.42×10 个/g。

[0049] 固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为85％，BaP的去除率为59％。

[0050] 实施例4

[0051] 与实施例1不同处之一在于：混合菌培养基制备为在装有培养基(马铃薯0.3％，蔗糖2％，牛肉膏0.2％，琼脂2％，NaCl 0.5％，pH自然)的试管中先后接种细菌和真菌，置于28～30℃培养箱中培养2～3d。

[0052] 与实施例1不同处之二在于：载体改性处理步骤为将2mm粒径的蛭石，加1mol/L HCl，固液比1∶20，83℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗至pH为6.8，烘干后，便制得加热酸改性蛭石(ST83)，然后再焙烧至400℃(升温速度为90℃/h)，得到酸处理并焙烧至400℃的蛭石。

[0053] 经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度很大，6.17×1010个/g，8
真菌孢子数为4.38×10。

[0054] 固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为89％，BaP的去除率为64％。

[0055] 实施例5

[0056] 与实施例4不同处在于：载体改性处理步骤为将2mm粒径的蛭石，加1.5mol/L HCl，固液比1∶25，83℃恒温水浴搅动2～2.5h，蒸馏水冲洗至pH为6.8，烘干后，便制得加热酸改性蛭石(ST83)，然后再焙烧至500℃(升温速度为90℃/h)，得到酸处理并焙烧至500℃的蛭石。

[0057] 经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度，1.48×1010个/g，真菌8
孢子数为2.52×10。

[0058] 固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为86％，BaP的去除率为60％。

[0059] 实施例6

[0060] 与实施例4不同处之一在于：载体经改性处理后无浸润处理过程，而是直接将干燥后的泥炭土灭菌，然后接种。

[0061] 不同处之二在于：接种后的固定化颗粒，在增殖培养过程中不补加增殖营养液或无菌水。

[0062] 结果表明：固定化混合菌中真菌的孢子数无明显变化，而单位载体细菌数受到很7
大影响，仅为10，较实施例3下降了3个数量级。

[0063] 实施例7

[0064] 与实施例4不同处之一在于：载体浸润处理步骤为改性处理后的泥炭土(ST400)按1ml/g比例加增殖培养液(蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，(NH4)HPO4 0.2％，MgSO4·H2O 0.025％，pH6.0～6.5)后，再高温湿热灭菌90min。

[0065] 与实施例4不同处之二在于：接种后，每天按0.2ml/g载体的量补加增殖培养基(蔗糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO4 0.05％，(NH4)HPO4 0.2％，MgSO4·H2O 0.025％，pH6.0～6.5)，3d后菌丝体穿透蛭石载体，布满培养瓶，便制得以蛭石为载体的混合菌固定化颗粒。

[0066] 结果表明：经培养液浸润的载体较经无菌水或无浸润的载体对细菌吸附能力更强，细菌活力更持久，主要提高了固定化混合菌中细菌的数量，制得的固定化颗粒细菌密度11
可达3.24×10 个/g；固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为96％，BaP的去除率为65％。