适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法

摘要

本发明公开了一种适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，其特点是该固定化酶由从动植物体中提取的B-酯酶和从蔬菜中提取的酚氧化酶组成，制作方法步骤为：1)酶液的提取；2)酶的部分纯化；3)酶的固定化。由本方法制作的固定化酶利用酶联级反应大大提高了量热式农药检测的灵敏度，适用于量热式农药快速检测。

权利要求

1.一种适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，其特征在于，所述的固定化酶由从动植物体中提取的B-酯酶和从蔬菜中提取的酚氧化酶组成，制作方法步骤为：

1)酶液的提取

动物组织按1∶3的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎；或植物组织干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的缓冲液，进行搅拌提取；离心分离得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎、离心分离得酚氧化酶粗酶液；

2)酶的部分纯化

用30％和80％饱和度的硫酸铵溶液依次对B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液进行分级沉淀，之后用超滤除去小分子盐；

3)酶的固定化

将部分纯化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，与处理好的OH型阴离子交换树脂一起搅拌固定，4-5小时后，用蒸馏水洗去未固定上的酶液，将洗净的固定化酶存于中性缓冲液中待用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，属农药快速检测领域。

背景技术

目前，国内外研究的快速检测农药残留的方法主要有：酶联免疫吸附分析法、酶片法(速测卡法)、农药残留分光光度计法和生物传感器法等。这些方法大多是通过检测酶催化反应得到的电化学活性物质或有色物质的多少，来反映样品中的农药残留的高低。然而，由于食品样品的组分多样性，这种方法容易受样品中其他电化学活性物质或光学物质的干扰，造成结果的不准确性。
利用生化反应过程中普遍伴随的热量变化，采用量热的方式来进行分析，具有通用性强、适用于大多数生化样品、在测量时不受其他电化学活性物质或光学物质的干扰等优点。然而，由于生化反应产生的热量往往比较小，难以测量。因此，目前国内外在检测农药方面，很少采用量热式的方法。
本申请人曾基于量热原理，于2002年11月获得了一项名为“一种探测农药残留用的量热式生物传感器”的实用新型专利(CN2519909)。该专利装置主要由参考酶柱、检测酶柱、流动单元和检测单元组成，通过检测两酶柱出口液体的温度差和标定，获知样液中的农药残留高低。但也由于利用的胆碱酯酶催化的生化反应放出热量过小，增加了检测难度，降低了检测准确度。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有快速检测农药残留方法中，由于食品样品的组分多样性，容易受样品中其他电化学活性物质或光学物质的干扰，造成结果的不准确性的缺点，提供一种生化反应产生的热量大，易测量的适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法。
本发明的技术方案是：一种适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，其特点是，所述的固定化酶由从动植物体中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和从蔬菜中提取的酚氧化酶组成，制作方法步骤为：
1、酶液的提取
动物组织按1∶3的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎；或植物组织干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的缓冲液，进行搅拌提取；离心分离得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎、离心分离得酚氧化酶粗酶液；
2、酶的部分纯化
用30％和80％饱和度的硫酸铵溶液依次对B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液进行分级沉淀，之后用超滤除去小分子盐；
3、酶的固定化
将部分纯化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，与处理好的OH型阴离子交换树脂一起搅拌固定，4-5小时后，用蒸馏水洗去未固定上的酶液，将洗净的固定化酶存于中性缓冲液中待用。
本方法制作的固定化酶由从动植物体中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和从蔬菜中提取的酚氧化酶组成。前者能专一性地被有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制，后者能催化前者催化产生的水解产物——酚类物质的氧化。其原理示意图为：

其中Q1和Q2分别为反应(1)和(2)两个过程中放出的热量。利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对B-酯酶的抑制作用，采用与未受抑制的同种酶体系的反应放热对比的方法，测得热量之差(ΔQ)。通过标定，这个热量差就反映食品中农药残留的浓度。本发明的有益效果是：由于由本方法制作的固定化酶利用酶联级反应(反应1和2)将ΔQ由原来的ΔQ1提高到了Δ(Q1+Q2)，大大提高了量热式农药检测的灵敏度。

附图说明

图1为酶催化反应的热流曲线。
图中A：固定化B-酯酶，未经敌敌畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反应的热流曲线；
B：本发明制备的固定化酶(含B-酯酶和酚氧化酶)，未经敌敌畏(1mg/L)溶液抑制，催化的生化反应的热流曲线；
A’：固定化B-酯酶，经敌敌畏(1mg/L))溶液抑制后，催化的生化反应的热流曲线；
B’：本发明制备的固定化酶(含B-酯酶和酚氧化酶)，经敌敌畏(1mg/L))溶液抑制后，催化的生化反应的热流曲线。

具体实施方式

一种适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，其特点是该固定化酶由从动植物体中提取的B-酯酶(羧基酯酶)和从蔬菜中提取的酚氧化酶组成，制作方法步骤为：
1、酶液的提取
本实施例中动物组织采用动物的肝脏按1∶3的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎；或植物组织采用小麦干磨碎后按1∶5的比例加入pH中性的缓冲液，进行搅拌提取；离心分离得B-酯酶粗酶液；蔬菜原料按1∶1的比例加入pH中性的缓冲液，进行组织破碎、离心分离得酚氧化酶粗酶液；
2、酶的部分纯化
用30％和80％饱和度的硫酸铵溶液依次对B-酯酶粗酶液和酚氧化酶粗酶液进行分级沉淀，之后用超滤除去小分子盐；
3、酶的固定化
将部分纯化的B-酯酶酶液和酚氧化酶酶液按1∶4～1∶10的活力比例混合，与处理好的OH型阴离子交换树脂一起搅拌固定，4-5小时后，用蒸馏水洗去未固定上的酶液，将洗净的固定化酶存于中性缓冲液中待用。
具体试验实例：
以1mg/L(相当于1ppm)的敌敌畏标准溶液为样液，分别通过固定化B-酯酶和本发明制备的固定化酶；用micro-DSCIII微量量热仪，测量通过后的这两类酶体系催化反应的放热量，并与无样液通过的酶体系的反应放热比较，得到以下曲线。其具体操作条件如下：
反应温度：40℃；反应pH：6.4磷酸缓冲液；流速：0.3ml/min底物：80mmol/L α-乙酸萘酯溶液；
由图1所示曲线积分可知，1mg/L的敌敌畏引起B-酯酶催化反应的热量变化(即曲线A的积分面积-曲线A’的积分面积)仅为0.003mJ(mW*s)，而它引起本发明制备的固定化酶催化反应的热量变化(即曲线B的积分面积-曲线B’的积分面积)却为0.1mJ(mW*s)。与单独使用B-酯酶相比，由相同农药浓度引起的热量变化提高了33倍左右，这大大降低了测热的难度。这是因为，当样液中存在农药时，B-酯酶的活性受到抑制，酚的产量降低，放热量Q1减少；反应式(2)的反应放热量Q2也随着酚浓度的降低而减少，从而使得与使用单级B-酯酶相比，由相同农药浓度引起的热量变化大幅度升高。