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一种固定化硝化细菌及其固定化方法
申请号	CN202011621210.4	申请日	2020-12-31	公开(公告)号	CN114686472A	公开(公告)日	2022-07-01
申请人	中国石油化工股份有限公司; 中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院;			发明人	高会杰; 陈明翔; 孙丹凤; 王刚;
摘要	本发明涉及一种固定化硝化细菌及其固定化方法，采用腐殖酸改性气凝胶，再负载金属离子，然后与活性炭混匀，制得固定化载体；将载体与硝化细菌悬液混合，吸附后离心，得到固形物；制备聚乙烯醇和海藻酸钠凝胶，将凝胶加入到固形物中混匀，滴入CaCl2饱和硼酸溶液中，滴定结束后交联固定一定时间，洗涤后制得固定化硝化细菌。本发明的固定化方法采用特定固定化材料，对硝化细菌吸附性好，可以增强材料与菌体间的结合力，长期使用过程中可以避免硝化细菌脱落。
权利要求	1.一种硝化细菌的固定化方法，其特征在于包括如下步骤：（1）制备固定化载体：采用腐殖酸改性气凝胶，再负载金属离子，然后与活性炭混匀，制得固定化载体；（2）硝化细菌的吸附：将固定化载体与硝化细菌悬液混合，吸附后离心，得到吸附硝化细菌的固形物；（3）吸附后包埋交联：制备聚乙烯醇和海藻酸钠凝胶，将凝胶加入到步骤（2）固形物中混匀，滴入CaCl2饱和硼酸溶液中，滴定结束后交联固定一定时间，洗涤后制得固定化硝化细菌。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述气凝胶为碳气凝胶、硅气凝胶、纤维素气凝胶等中的至少一种，优选碳气凝胶。 2 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：气凝胶的比表面积为600～1100m/g，孔隙率为80%～98%。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）采用腐殖酸改性气凝胶的过程为：（a）将气凝胶置于醋酸溶液中水浴震荡，取出后洗涤至中性；（b）将腐殖酸溶于Fe(OH)3溶液中，再与步骤（a）气凝胶混合，在50～70℃水浴反应，反应后洗涤至中性，得到腐殖酸改性气凝胶。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（a）所述的醋酸溶液浓度为1.0～ 2.0mol/L；将气凝胶浸没于醋酸溶液中进行水浴反应，反应温度为30～50℃，反应时间为 1.0～2.0h；将气凝胶取出，洗涤至pH6.5～7.5。 6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（b）所述的Fe(OH)3溶液的浓度为0.5～ 0.8mol/L，Fe(OH)3溶液与腐殖酸的质量比为1:1～3:1。 7.根据权利要求4、5或6所述的方法，其特征在于：将步骤（a）气凝胶浸没于腐殖酸和Fe(OH)3溶液的混合体系中，在50～70℃下水浴反应3～5h，反应后洗涤至pH值6.5～7.5。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）在腐殖酸改性气凝胶上负载金属 2+ 2+ 2+ 2+ 离子，所述的金属离子为Cu 、Fe 、Mg 中的至少一种，优选含有Fe 。 9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，以总质量为基准，金属离子负载量以金属氧化物计为1%‑5%。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）在腐殖酸改性气凝胶上负载金属离子采用如下方法：将腐殖酸改性气凝胶加入到金属离子溶液中浸渍，搅拌浸渍时间后，取出进行热处理，干燥得到负载金属的改性气凝胶。 11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：金属离子溶液采用金属离子的可溶性盐溶液，金属离子溶液的浓度为4‑10mol/L；加入腐殖酸改性气凝胶后在60‑70℃下搅拌浸渍 6‑10h。 12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：热处理是先在90‑120℃下处理1‑5h，然后在150‑300℃下处理1‑5h。 13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：在金属离子溶液中加入甜菜碱，甜菜碱的加入量与金属离子的质量比为1:1‑1:5。 14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述活性炭与负载金属的改性气凝胶的质量比为1:1‑1:10。 15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）将培养获得的硝化细菌培养液沉降后，去除上清液至沉降比为80%‑90%，即为硝化细菌悬液，按照液固比为10‑20mL:1g与步骤（1）固定化载体混合。 16.根据权利要求1或15所述的方法，其特征在于：步骤（2）混匀后于28‑30℃，100‑ 200r/min条件下，吸附60‑180min，在400‑600r/min条件下离心2‑10min。 17.根据权利要求1或15所述的方法，其特征在于：步骤（2）混合后体系中加入聚乙烯亚胺，加入量为硝化细菌悬液体积的1%‑5%。 18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的包埋交联是在90‑95℃的水浴温度下，以溶解于蒸馏水中聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶，其中聚乙烯醇的含量为70‑ 80g/L，海藻酸钠的含量为20‑30g/L。 19.根据权利要求1或18所述的方法，其特征在于：步骤（3）将凝胶按体积比2‑3:1 加入到步骤（2）固形物中，搅拌混匀。 20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的CaCl2饱和硼酸溶液的质量分数为3%‑5%，滴定结束后在4‑5℃交联固定24‑48h，最后用质量分数0.9%的生理盐水冲洗。 21.一种固定化硝化细菌，其特征在于是采用上述本发明方法制备的。
说明书全文	一种固定化硝化细菌及其固定化方法技术领域 [0001] 本发明属于废水处理技术领域，具体涉及一种固定化硝化细菌及其固定化方法。背景技术 [0002] 硝化细菌属于自养微生物，自身生长繁殖慢，在应用过程中菌种易流失，对不良环境耐受性差、活性易受抑制，活性污泥中的菌体浓度小，在短时间内很难取得较好的脱氮效果。利用固定化微生物技术强化生物脱氮过程是近年来生物脱氮领域研究的热点之一。 [0003] 微生物固定化技术是采用合适的载体将纯种分离或者功能确定的微生物固定在一定的空间内，使之不被流水稀释或冲走，保证生物催化反应能高效持续进行。目前的固定化方法包括吸附法、载体结合法、包埋法和交联法等，每种方法都各有优点和不足。包埋法存在机械强度低等不足，吸附法因表面积小、生物膜易脱离，使大规模应用受到限制。目前，研究者大都从材料的选择、配比、载体改性及固定化方法相结合等方面开展大量的工作。 [0004] CN201510557050.4公开了一种处理氨氮废水的氨氮降解菌固定化方法，首先将海藻酸钠、聚乙烯醇和斜发沸石加入水中，70～100℃搅拌，得混合浆液；将混合浆液降至30～45℃，向其中加入氨氮降解菌，搅拌制成含有氨氮降解菌的混合浆液；将含有氨氮降解菌的混合浆液逐滴加入到质量分数为1%～10%的CaCl2溶液中，0～10℃静止2～24h，再用生理盐水或水冲洗。该发明提供的方法氨氮降解菌不会随水体流失，提高了系统稳定性和氨氮去除效率，所获得的固定化氨氮降解菌颗粒应用时在60小时内将氨氮浓度为256.9mg/L的废水处理至15.11mg/L以上。该方法将氨氮降解菌包埋于固定化颗粒内，虽然菌体不会流失，但是会影响氨氮脱除速率，处理时间长达60h。 [0005] CN201610595544.6公开了一种利用多孔纤维素气凝胶固定化微生物菌处理氨氮废水的方法，主要是制备多孔纤维素气凝胶，采用载体结合法将硝化菌和反硝化菌吸附固定在多孔纤维素气凝胶上，将微生物固定在多孔纤维素气凝胶上处理氨氮废水，有利于同步硝化反硝化反应的进行。该方法所获得固定化微生物菌按20‑30g/L加入50‑100L的100‑500mg/L氨氮废水中，水力停留时间为30‑40h，经过处理后氨氮去除率为68‑89%。但该方法利用纤维素气凝胶吸附菌体，属于表面吸附，由于菌体与吸附材料结合力不强，长期处理中还是会出现脱落现象。发明内容 [0006] 针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种固定化硝化细菌及其固定化方法。本发明所述固定化方法是通过所制备固定化材料实现，所述固定化材料对硝化细菌吸附性好，可以增强材料与菌体间的结合力，长期使用过程中可以避免硝化细菌脱落。 [0007] 本发明提供的一种硝化细菌的固定化方法，包括如下步骤：（1）制备固定化载体：采用腐殖酸改性气凝胶，再负载金属离子，然后与活性炭混匀，制得固定化载体；（2）硝化细菌的吸附：将固定化载体与硝化细菌悬液混合，吸附后离心，得到吸附硝化细菌的固形物；（3）吸附后包埋交联：制备聚乙烯醇和海藻酸钠凝胶，将凝胶加入到步骤（2）固形物中混匀，滴入CaCl2饱和硼酸溶液中，滴定结束后交联固定一定时间，洗涤后制得固定化硝化细菌。 [0008] 本发明步骤（1）所述气凝胶为碳气凝胶、硅气凝胶、纤维素气凝胶等中的至少一2 种，优选碳气凝胶。通常采用自制或者商业购买获得，气凝胶的比表面积为600～1100m/g，孔隙率为80%～98%。 [0009] 本发明步骤（1）采用腐殖酸改性气凝胶的过程为：（a）将气凝胶置于醋酸溶液中水浴震荡，取出后洗涤至中性；（b）将腐殖酸溶于Fe(OH)3溶液中，再与步骤（a）气凝胶混合，在50～70℃水浴反应，反应后洗涤至中性，得到腐殖酸改性气凝胶。 [0010] 步骤（a）所述的醋酸溶液浓度为1.0～2.0mol/L。将气凝胶浸没于醋酸溶液中进行水浴反应，反应温度为30～50℃，反应时间为1.0～2.0h。将气凝胶取出，洗涤至pH值中性，一般为6.5～7.5。 [0011] 步骤（b）所述的Fe(OH)3溶液的浓度为0.5～0.8mol/L，Fe(OH)3溶液与腐殖酸的质量比为1:1～3:1。将步骤（a）气凝胶浸没于腐殖酸和Fe(OH)3溶液的混合体系中，在50～70℃下水浴反应3～5h，反应后洗涤至pH值中性，一般为6.5～7.5。 [0012] 本发明步骤（1）在腐殖酸改性气凝胶上负载金属离子，可以采用本领域常规负载2+ 2+ 2+ 2+ 方法。所述的金属离子为Cu 、Fe 、Mg 等中的至少一种，优选含有Fe 。其中，以总质量为基准，金属离子负载量以金属氧化物计为1%‑5%。 [0013] 本发明步骤（1）在腐殖酸改性气凝胶上负载金属离子具体可以采用如下方法：将腐殖酸改性气凝胶加入到金属离子溶液中浸渍，搅拌一定时间后，取出进行热处理，干燥得到负载金属的改性气凝胶。金属离子溶液一般采用金属离子的可溶性盐溶液，金属离子溶液的浓度为4‑10mol/L。所述的浸渍可以采用等体积浸渍或者过量浸渍，可以采用一次或者多次浸渍，在60‑70℃搅拌条件下浸渍6‑10h。热处理是先在90‑120℃下处理1‑5h，然后在150‑300℃下处理1‑5h。所述的干燥是在100～120℃恒温干燥1～2h，得到负载金属的改性气凝胶。进一步的，在金属离子溶液中加入甜菜碱，甜菜碱的加入量与金属离子的质量比为 1:1‑1:5。 [0014] 本发明步骤（1）活性炭与负载金属的改性气凝胶的质量比为1:1‑1:10。所述的活性炭的目数为100‑500目。 [0015] 本发明步骤（2）将培养获得的硝化细菌培养液沉降后，去除上清液至沉降比为80%‑90%，即为硝化细菌悬液，按照液固比为10‑20mL:1g与步骤（1）固定化载体混合。混匀后于28‑30℃，100‑200r/min条件下，吸附60‑180min，在400‑600r/min条件下离心2‑10min。 [0016] 进一步的，步骤（2）加入聚乙烯亚胺，加入量为硝化细菌悬液体积的1%‑5%。 [0017] 本发明步骤（3）采用本领域熟知的方法进行包埋交联。具体可以是在90‑95℃的水浴温度下，以溶解于蒸馏水中聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶，其中聚乙烯醇的含量为70‑80g/L，海藻酸钠的含量为20‑30g/L；然后将凝胶按体积比2‑3:1 加入到步骤（2）固形物中，搅拌混匀。所述的CaCl2饱和硼酸溶液的质量分数为3%‑5%，并不断搅拌，滴定结束后在4‑5℃交联固定24‑48h，最后用质量分数0.9%的生理盐水冲洗三次，完成硝化细菌的固定化，0‑ 5℃保存。 [0018] 本发明所述的固定化硝化细菌是由上述本发明方法制备的。所述的固定化硝化细菌是在腐殖酸改性的气凝胶上负载金属离子，然后与活性碳混合制得固定化载体，再将硝化细菌吸附到该固定化载体上，最后进行包埋和交联制备得到。 [0019] 与现有技术相比，本发明有益效果为：（1）本发明采用腐殖酸改性气凝胶，并负载金属离子，再和活性炭混合作为固定化载体，然后用于吸附硝化细菌，最后经包埋和交联制得固定化硝化细菌，可以缓解高浓度氨氮对硝化细菌的冲击影响，确保高效稳定的处理效果，而且硝化细菌和载体结合牢固，避免了菌体脱落。 [0020] （2）采用腐殖酸改性气凝胶和金属离子负载制备固定化载体材料，通过协同作用，使各物质之间紧密结合，最终便于微生物附着吸附，且具有较强结合力。 [0021] （3）在金属离子浸渍溶液中加入甜菜碱，提高了金属离子与气凝胶的结合强度，同时增强金属离子与微生物的结合力，有助于长期处理过程中进一步避免微生物脱落。 [0022] （4）在载体吸附微生物过程中加入聚乙烯亚胺，提高了微生物与载体的亲和力，单位容积的载体固载微生物的数量多，缩短吸附时间，提高固定化效率。 [0023] （5）本发明硝化细菌的固定化方法对微生物损害小，获得的微生物颗粒传质性能好，不易破损，使用寿命长。具体实施方式 [0024] 下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 [0025] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。 [0026] 本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478‑87《水质铵的测定‑蒸镏和滴定法》测定；悬浮物浓度采用GB11901‑89《水质悬浮物的测定‑重量法》测定。 [0027] 实施例1（1）制备固定化载体： 2 采用腐殖酸改性碳气凝胶：（a）将比表面积为800m /g、孔隙率为80%的碳气凝胶浸没于1.5mol/L醋酸溶液中进行水浴反应，温度为40℃，震荡1.5h，取出后用去离子水洗涤至pH7.0；（b）配制0.6mol/L的Fe(OH)3溶液，按照Fe(OH)3溶液与腐殖酸的质量比为2:1，将腐殖酸溶于Fe(OH)3溶液中，与步骤（a）处理后碳气凝胶混合，在60℃水浴反应4h，取出后用去离子水洗至pH7.0，得到腐殖酸改性气凝胶。 [0028] 负载金属离子：配制4mol/L的硫酸亚铁溶液，将腐殖酸改性气凝胶加入该溶液中，在65℃搅拌条件下浸渍8h。取出后先在100℃下处理3h，然后在200℃下处理3h。热处理后在110℃干燥1.5h，得到负载金属的改性气凝胶。 [0029] 与活性碳混合：将100‑200目的活性碳与负载金属的改性气凝胶按照质量比为1:5混合，制得固定化载体。 [0030] （2）硝化细菌的吸附：将新鲜培养的硝化细菌培养液进行沉降，去除上清液至沉降比为90%，即为硝化细菌悬液，与固定化载体按照液固比10mL:1g混匀，于28℃、100r/min 条件下，吸附60min，在 400r/min条件下离心3min，得到固形物。 [0031] （3）吸附后包埋交联：在90℃的水浴温度下，以溶解于蒸馏水中聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶，其中聚乙烯醇的含量为75g/L，海藻酸钠的含量为25g/L；然后将凝胶按体积比2:1加入到步骤（2）的固形物中，搅拌混匀。所述的CaCl2饱和硼酸溶液的质量分数为4%，并不断搅拌，滴定结束后在4℃交联固定24h，最后用质量分数0.9%的生理盐水冲洗三次，完成硝化细菌的固定化，4℃保存。 [0032] 实施例2（1）制备固定化载体： 2 采用腐殖酸改性碳气凝胶：（a）将比表面积为800m /g、孔隙率为80%的碳气凝胶浸没于1.0mol/L醋酸溶液中进行水浴反应，温度为30℃，震荡1h，取出用去离子水洗涤至pH6.5；（b）配制0.5mol/LFe(OH)3溶液，按照Fe(OH)3溶液与腐殖酸的质量比为1:1，将腐殖酸溶于Fe(OH)3溶液中，与步骤（a）处理后碳气凝胶混合，在50℃水浴震荡3h，然后用去离子水洗涤至pH6.5，得到腐殖酸改性气凝胶。 [0033] 负载金属离子：配制4mol/L的硫酸亚铁溶液，将腐殖酸改性气凝胶加入该溶液中，在60℃搅拌条件下浸渍10h。取出后先在90℃下处理5h，然后在150℃下处理5h。再在100℃恒温干燥2h，得到负载金属的改性气凝胶。 [0034] 与活性碳混合：将200‑300目的活性碳与负载金属的改性气凝胶按照质量比为1:8混合，制得固定化载体。 [0035] （2）硝化细菌的吸附：将新鲜培养的硝化细菌培养液进行沉降，去除上清液至沉降比为90%，即为硝化细菌悬液，与固定化载体按照液固比为20mL:1g混匀，于29℃、150r/min 条件下，吸附120min，在500r/min条件下离心5min，得到固形物。 [0036] （3）吸附后包埋交联：在90℃的水浴温度下，以溶解于蒸馏水中聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶，其中聚乙烯醇的含量为70g/L，海藻酸钠的含量为20g/L；然后将凝胶按体积比3:1加入到步骤（2）的固形物中，搅拌混匀。所述的CaCl2饱和硼酸溶液的质量分数为3%，并不断搅拌，滴定结束后在4℃交联固定36h，最后用质量分数0.9%的生理盐水冲洗三次，完成硝化细菌的固定化，4℃保存。 [0037] 实施例3（1）制备固定化载体： 2 采用腐殖酸改性碳气凝胶：（a）将比表面积为1000m /g、孔隙率为98%的碳气凝胶浸没于2.0mol/L醋酸溶液中进行水浴反应，温度为50℃，震荡2h，取出用去离子水洗涤至pH7.5；（b）配制0.8mol/LFe(OH)3溶液，按照Fe(OH)3溶液与腐殖酸的质量比为3:1，将腐殖酸溶于Fe(OH)3溶液中，与步骤（a）处理后碳气凝胶混合，在70℃水浴震荡5h，然后用去离子水洗涤至pH7.5，得到腐殖酸改性气凝胶。 [0038] 负载金属离子：配制4mol/L的硫酸亚铁溶液，将腐殖酸改性气凝胶加入该溶液中，在70℃搅拌条件下浸渍6h。取出后先在120℃下处理1h，然后在300℃下处理1h。再在120℃恒温干燥1h，得到负载金属的改性气凝胶。 [0039] 与活性碳混合：将400‑500目的活性碳与负载金属的改性气凝胶按照质量比为1:10混合，制得固定化载体。 [0040] （2）硝化细菌的吸附：将新鲜培养的硝化细菌培养液进行沉降，去除上清液至沉降比为90%，即为硝化细菌悬液，与固定化载体按照液固比为15mL:1g混匀，于30℃，200r/min 条件下，吸附180min， 600r/min条件下离心10min，得到固形物。 [0041] （3）吸附后包埋交联：在90℃的水浴温度下，以溶解于蒸馏水中聚乙烯醇和海藻酸钠制备凝胶，其中聚乙烯醇的含量为80g/L，海藻酸钠的含量为30g/L；然后将凝胶按体积比3:1加入到步骤（2）的固形物中，搅拌混匀。所述的CaCl2饱和硼酸溶液的质量分数为5%，并不断搅拌，滴定结束后在4℃交联固定48h，最后用质量分数0.9%的生理盐水冲洗三次，完成硝化细菌的固定化，4℃保存。 [0042] 实施例4同实施例1，不同在于：采用硅气凝胶代替碳气凝胶，硅气凝胶的比表面积为 2 1000m/g，孔隙率为85%。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0043] 实施例5同实施例1，不同在于：采用纤维素气凝胶代替碳气凝胶，纤维素气凝胶的比表面 2 积为900m/g，孔隙率为95%。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0044] 实施例62+ 同实施例1，不同在于：金属离子采用Cu ，配制4mol/L的氯化铜溶液代替硫酸铁溶液。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0045] 实施例72+ 同实施例1，不同在于：金属离子采用Mg ，配制4mol/L的硫酸镁溶液代替硫酸铁溶液。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0046] 实施例8同实施例1，不同在于：在金属盐溶液中加入甜菜碱，甜菜碱的加入量与金属离子质量比为1:3。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0047] 实施例9同实施例1，不同在于：步骤（2）在硝化细菌悬液中加入聚乙烯亚胺，加入量为硝化细菌悬液体积的5%。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0048] 实施例10同实施例8，不同在于：步骤（2）在硝化细菌悬液中加入聚乙烯亚胺，加入量为硝化细菌悬液体积的3%。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0049] 比较例1同实施例1，不同在于：气凝胶改性步骤（b）未采用腐殖酸，仅负载金属离子。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0050] 比较例2同实施例1，不同在于：气凝胶经腐殖酸改性后将腐殖酸溶于水中，未负载金属离子，即未采用Fe(OH)3溶液。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0051] 比较例3同实施例1，不同在于：气凝胶腐殖酸改性时省略步骤（a），仅采用步骤（b）。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0052] 比较例4同实施例1，不同在于：负载金属离子过程中未采用热处理。最终制得固定化硝化细菌，4℃保存。 [0053] 测试例将实施例1‑10和比较例1‑4制备的固定化硝化细菌进行污水处理，按固液比1:5与待处理污水混合，污水中氨氮浓度为300mg/L。处理48h，考察出水氨氮去除情况和悬浮物情况，效果如表1所示。 [0054] 表1由表1可知，本发明方法制备的固定化硝化细菌的处理效果较好，且菌体结合牢固，经过长期处理后，出水悬浮物少。