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一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法
申请号	CN202110055550.3	申请日	2021-01-15	公开(公告)号	CN112900126B	公开(公告)日	2022-06-24
申请人	长江大学;			发明人	梁大成; 吴辉艳; 邓竹英; 李冬怡;
摘要	本发明公开了一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，所述方法包括：植株培养、固定、维管束剥离、纤维素酶和果胶酶消化以及用Triton X‑100剔除杂质污染。本发明通过在固定步骤中利用茶皂素协助维管束与邻近组织分离，然后用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，有效去除了维管及邻近组织中的细胞壁、胞间残留物、纤维组织及膜样物质残留等，进一步利用Triton X‑100洗脱维管束周围组织，有效剔除膜样软组织的粘连污染，从而将维管束从根及下胚轴中分离出来，采用该方法分离得到的维管束，在显微镜下可观察到清晰的形态结构，无杂质影响，该方法简单快速易实施，分离效果好，可用于维管束形成和发育的研究。
权利要求	1.一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： P1：选取植物种子，经表面消毒后播种至培养基并培养； P2：选取P1中生长健壮的完整植株，去除叶片，留取根和下胚轴，置于离心管中； P3：向P2的离心管中加入含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30‑40分钟，然后用PEM缓冲液润洗，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中固定30‑40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗； P4：在解剖显微镜下，用解剖针将维管束与其相邻组织分开，并将维管束取出，放入装有PEM缓冲液的离心管中； P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纤维素酶和果胶酶的酶液中，于28℃消化处理； P6：将P5中消化完全的材料放入Triton X‑100中清洗15‑20分钟，然后用PEM缓冲液冲洗，冲洗完毕后即完成对植物根及下胚轴中维管束的分离。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P5中，所述酶液的组分包括：5mM MES缓冲液，0.5％(w/v)纤维素酶，0.2％(w/v)果胶酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl2，并调节pH为 5.5。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEM缓冲液包括：50mM PIPES、5mM EGTA、2.5mM MgSO4，并调节pH为6.9。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P1中，在通风橱内用氯气对植物种子进行表面消毒。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P1中，将表面消毒后的种子播种至MS培养基上，在16h光照/8h黑暗，22‑23℃条件下培养7‑30天。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P3具体为：向P2的离心管中加入20mL含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30‑40分钟，然后用PEM缓冲液润洗3次，每次 20分钟，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中，于‑20℃真空干燥条件下固定30‑40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重复步骤P4，以获得多个解剖后的材料，且解剖后的材料数量不超过6个。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P5的消化处理过程中，随时镜检，直至观察到维管束上残留的组织消化完全。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P6中所述Triton X‑100的浓度为5％。
说明书全文	一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法技术领域 [0001] 本发明属于维管束分离技术领域，具体涉及一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法。背景技术 [0002] 维管束是维管植物的输导系统，在植物体内常呈束状结构，贯穿在植物体的各种器官内。主要分为韧皮部和木质部,韧皮部包括筛管和伴胞，主要负责同化物的运输；木质部以导管为主，负责输送水分和无机盐类。维管束除了具有运输作用外，还对植物器官起着机械支撑作用。 [0003] 一直以来，对于维管束的形成和发育研究受到学界的广泛重视，现有技术中一般借助显微与超显微技术就植物某些部位的发生、发育和结构进行多维度探索，然而目前已知的可观察到高清晰维管束形态结构的显微技术一直没有出现，其主要原因是现有技术中缺乏维管束完全分离技术，进而限制了对维管束形态发育的深入研究。发明内容 [0004] 本发明的目的在于提供一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，具体为：将植物的根及下胚轴浸泡润洗固定后，在显微镜下将维管束与相邻组织分开，并将解剖后的材料用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，并进一步利用Triton X‑100洗脱维管束周围的膜样软组织，从而实现维管束的分离，采用该方法分离得到的维管束，在显微镜下可观察到清晰的形态结构。 [0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是： [0006] 一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，包括以下步骤： [0007] P1：选取植物种子，经表面消毒后播种至培养基并培养； [0008] P2：选取P1中生长健壮的完整植株，去除叶片，留取根和下胚轴，置于离心管中； [0009] P3：向P2的离心管中加入含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30‑40分钟，然后用PEM缓冲液润洗，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中固定30‑40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗；该步骤在PEM缓冲液中加有茶皂素，茶皂素能快速浸润到根及下胚轴组织，以降低维管束与邻近组织间的连接，因此便于维管束的剥离。 [0010] P4：在解剖显微镜下，用解剖针将维管束与其相邻组织分开，并将维管束取出，放入装有PEM缓冲液的离心管中；利用解剖针进行分离得到的解剖材料，其中不仅含有维管束，还含有维管束鞘细胞残留壁、纤维组织、膜样物质等多种细胞或胞间残留物，因此无法直接用于观察维管束的形态结构。 [0011] P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纤维素酶和果胶酶的酶液中，于28℃消化处理；该步骤中利用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，可有效去除解剖材料中的残留细胞壁、胞间残留物、纤维组织及部分膜样物质等。 [0012] P6：将P5中消化完全的材料放入Triton X‑100中清洗15‑20分钟，然后用PEM缓冲液冲洗，冲洗完毕后即完成对植物根及下胚轴中维管束的分离。该步骤中进一步采用Triton X‑100对维管束进行清洗，以去除维管束周围的组织，有效剔除膜样软组织的粘连污染。 [0013] 进一步的，在步骤P5中，所述酶液的组分包括：5mM MES缓冲液，0.5％(w/v)纤维素酶，0.2％(w/v)果胶酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl2，并调节pH为5.5。 [0014] 进一步的，所述PEM缓冲液包括：50mM PIPES(哌嗪‑1,4‑二乙磺酸)、5mM EGTA(乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸)、2.5mM MgSO4，并调节pH为6.9。 [0015] 进一步的，在步骤P1中，在通风橱内用氯气对植物种子进行表面消毒。 [0016] 进一步的，在步骤P1中，将表面消毒后的种子播种至MS培养基上，在16h光照/8h黑暗，22‑23℃条件下培养7‑30天。 [0017] 进一步的，步骤P3具体为：向P2的离心管中加入20mL含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30‑40分钟，然后用PEM缓冲液润洗3次，每次20分钟，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中，于‑20℃真空干燥条件下固定30‑40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗3次，每次5分钟。 [0018] 进一步的，重复步骤P4，以获得多个解剖后的材料，且解剖后的材料数量不超过6个。其中数量过多会导致材料之间缠绕在一起，影响后续处理，导致材料损坏，无法用于观察。 [0019] 进一步的，步骤P5的消化处理过程中，随时镜检，直至观察到维管束上残留的组织消化完全。用酶进行消化处理的过程中随时镜检，避免消化不完全导致物质残留影响维管束观察，同时也可避免因消化时间过程对维管束的损伤。 [0020] 进一步的，步骤P6中所述Triton X‑100的浓度为5％。 [0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，在固定步骤中利用茶皂素能快速浸润到根及下胚轴组织中的特点以降低维管束与邻近组织间的连接，从而便于剥离，然后用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，有效去除了维管及邻近组织中的细胞壁、胞间残留物、纤维组织及膜样物质残留等，进一步利用Triton X‑100洗脱维管束周围组织，有效剔除膜样软组织的粘连污染，从而将维管束从根及下胚轴中分离出来，采用该方法分离得到的维管束，在显微镜下可观察到清晰的形态结构，无杂质影响，该方法简单快速易实施，分离效果好，可用于维管束形成和发育的研究。附图说明 [0022] 图1为本发明实施例1中分离得到的拟南芥维管束的SEM图片； [0023] 图2为本发明实施例1中分离得到的烟草维管束的SEM图片； [0024] 图3为本发明对比例1中分离得到的拟南芥维管束的SEM图片； [0025] 图4为本发明对比例1中分离得到的烟草维管束的SEM图片。具体实施方式 [0026] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。 [0027] 实施例1 [0028] 本实施例提供了一种从双子叶植物的根及下胚轴中分离维管束的方法，以拟南芥和烟草为例，具体的步骤为： [0029] P1：选取适量拟南芥以及烟草种子，分别置于1.5mL离心管中，用铅笔在管壁标明拟南芥和烟草种子名称，在通风橱内用氯气对种子进行表面消毒40分钟，并在1×MS培养基上分别播种表面消毒后的拟南芥和烟草种子。将培养基放置培养室，在长日照(16h光照/8h黑暗)，22‑23℃条件下垂直生长15天； [0030] P2：分别选取P1中生长健壮，完整的拟南芥植株和烟草植株，去除其叶片，取下胚轴和根部部位，分别置于50mL离心管中，在离心管壁用铅笔标明拟南芥以及烟草名称。 [0031] P3:材料的固定，具体步骤如下： [0032] A、向P2的离心管中加入20mL含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30分钟，其中PEM缓冲液的配方为：50mM PIPES(哌嗪‑1,4‑二乙磺酸)、5mM EGTA(乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸)、2.5mM MgSO4，并调节pH为6.9。其中茶皂素能快速浸润到根及下胚轴组织中，降低维管束与邻近组织间的连接，从而便于维管束的剥离。 [0033] B、然后用PEM缓冲液润洗3次，每次20分钟； [0034] C、将润洗后的材料在含有4％多聚甲醛的1×PBS缓冲液中固定，固定时需放入‑20℃，低真空干燥机(来源于CHRIST)真空渗透处理30分钟； [0035] D、将固定后的材料用PEM缓冲液冲洗3次，每次5分钟； [0036] P4：在解剖显微镜下，用解剖针的针尖将维管束与其相邻组织分开，用镊子将维管束取出，分别放进装有1mL PEM溶液的2mL离心管中，离心管壁用铅笔标明拟南芥和烟草名称。且每个离心管内的解剖材料不得超过6个，以防其缠绕在一起影响后续处理，致使材料损坏。利用解剖针进行分离得到的解剖材料，其中不仅含有维管束，还含有细胞残留壁、膜样物质等多种细胞或胞间残留物，无法直接用于观察维管束的形态结构，需进行后续处理。 [0037] P5:解剖后材料的酶消化处理，具体步骤如下： [0038] A、准备2mL的离心管2个，管壁用铅笔标明拟南芥及烟草名称，离心管内放置有1mL预先配制好的酶液，所述酶液具体为：5mM MES缓冲液，0.5％(w/v)纤维素酶，0.2％(w/v)果胶酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl2，并调节pH为5.5。利用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，可有效消化并去除附着在维管束上残留的细胞壁、胞间残留物、纤维组织及部分膜样物质等； [0039] B、用镊子取出步骤P4中解剖后的材料，对应放入装有酶液的2mL离心管中，进行消化处理，消化处理过程将离心管放于摇床上，摇床温度维持在28℃，转速维持120rpm。消化处理过程中，应随时镜检，直至观察到维管束上残留的组织消化完全，避免残留组织消化不完全，同时还应避免消化时间过程损坏维管束的完整结构。 [0040] P6:取出消化完成的材料，于5％的Triton X‑100中进一步浸泡润洗15分钟，之后再用PEM溶液冲洗2次，每次5分钟，冲洗完毕后即完成对拟南芥及烟草根及下胚轴的维管束分离。 [0041] 接着对维管束进行梯度脱水处理，在15％，30％，50％，75％乙醇中依次脱水15分钟，再利用无水乙醇脱水3次，每次15分钟。将脱水完成的材料在‑20℃，低真空干燥机(CHRIST)中干燥1小时。干燥完成后分别将其固定在两个样平台的导电胶上进行喷金处理后，再使用TESCAN的MIRA3场发射扫描电子显微镜对样品进行观察。观察结果如图1和图2所示，其中图1为拟南芥维管束的SEM图片，图2为烟草维管束的SEM图片，根据SEM图可知，采用本发明所述的方法可有效分离得到维管束组织，分离效果优异，无杂质残留。 [0042] 对比例1 [0043] 本对比例与实施例1的不同之处在于：无步骤P5和P6，即直接在解剖显微镜下，用解剖针将维管束与其相邻组织分开，而不使用纤维素酶和果胶酶进行消化处理以及用Triton X‑100去除杂质。 [0044] 将得到的维管束采用与实施例1相同的处理方式进行电镜观察，结果如图3和图4所示，其中图3为拟南芥维管束的SEM图片，图4为烟草维管束的SEM图片，根据该SEM图可知，不使用纤维素酶、果胶酶以及Triton X‑100处理会导致得到的维管柱上粘连有很多杂质，无法清晰观察到维管束的结构。 [0045] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。