具溶胶-凝胶转变特性的温敏型三嵌段共聚物及制备方法

摘要

本发明涉及医药用高分子材料领域，具体涉及一种温度敏感的，具有溶胶凝胶转变特性且可生物降解的三嵌段共聚物及其制备方法和用途。该三嵌段共聚物为PEG-PCL-PEG共聚物，随温度升高而从Sol～Gel相转变，转变温度在25℃～35℃。实验结果表明，本发明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物具有多种优良特性，为需要使用温度敏感型共聚物的领域提供了一种新的选择。

权利要求

1.一种嵌段共聚物，其特征在于：为PEG-PCL-PEG共聚物E550-C2200-E550，其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的相对分子质量；所述PEG-PCL-PEG嵌段共聚物由以下方法制备得到：a、以辛酸亚锡为催化剂，采用MPEG在130-150℃加热反应3～12小时引发己内酯开环聚合，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物；

b、将步骤a制得的MPEG-PCL二嵌段共聚物用异佛尔酮二异氰酸酯作交联剂在真空状态下继续反应0.5～2小时，得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物；

c、将步骤b所得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物提纯后在氮气保护下冷却至室温，即得。

2.一种制备权利要求1所述的嵌段共聚物的方法，其特征在于包括下述步骤：a、以辛酸亚锡为催化剂，采用MPEG在130～150℃加热反应3～12小时引发己内酯开环聚合，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物；

b、将步骤a制得的MPEG-PCL二嵌段共聚物用异佛尔酮二异氰酸酯作交联剂在真空状态下继续反应0.5～2小时，得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物；

c、将步骤b所得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物提纯后在氮气保护下冷却至室温，即得。

3.权利要求1所述的嵌段共聚物在制备温度敏感型的药物释放控制体系、细胞包埋材料、组织修复材料、可降解水凝胶或组织工程材料中的用途。

4.一种药物组合物，是由权利要求1所述的嵌段共聚物装载药物活性成分制备而成的。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物由以下方法制备而成：首先配制PEG-PCL-PEG重量含量为30％wt的水溶液，然后在PEG-PCL-PEG水溶液中装载药物活性成分，混合均匀。

说明书

具溶胶-凝胶转变特性的温敏型三嵌段共聚物及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药用高分子材料领域，具体涉及一种温度敏感的，具有溶胶凝胶转变特性且可生物降解的三嵌段共聚物及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 近年来，可生物降解环境敏感性水凝胶由于其良好的敏感性、生物降解性和生物相容性受到了国内外学者的广泛关注。环境敏感性水凝胶又被称为智能水凝胶，是指自身能感知外界环境(如温度、pH值、光、电、压力等)的变化或刺激，并能产生相应的物理结构和化学性质变化的一类高分子水凝胶。其中，温度敏感性物理水凝胶由于其在药物控制释放系统、细胞包埋和组织修复等领域方面具有广阔的应用前景而备受关注。

[0003] 目前，文献和专利中报道的随着温度升高具有溶胶凝胶转变特征的生物医用高分子材料包括：壳聚糖/甘油磷酸、泊洛沙姆(Pluronic)、聚乙二醇聚乙丙交酯聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG)三嵌段共聚物，但目前这些材料由于自身分子结构的原因而存在各种的缺陷。如：泊洛沙姆不可降解且凝胶强度低；壳聚糖/甘油磷酸水凝胶降解速度难以控制；PEG-PLGA-PEG水凝胶强度低且价格昂贵。

[0004] 由于良好的生物相容性和环境变化敏感性，泊洛沙姆(Pluronic or Poloxamer，PEG-PPG-PEG)作为一种药物控制释放体系被广泛研究。但是，泊洛沙姆的临界凝胶浓度较高，凝胶强度较弱，并且不能生物降解，这些缺点限制了泊洛沙姆在生物医学领域的广泛应用。

[0005] 申请号为03100434.2的中国专利申请中公开了一类聚乙二醇(PEG)嵌段修饰的聚己内酯(PCL)共聚物，其中具体公开了由相对分子质量为2000、4000的PCL和相对分子质量为2000、4000的PEG合成的PEG(2000、4000)-PCL(8000、4000)-PEG(2000、4000)两亲性三嵌段共聚物，相对分子质量大，该发明中公开的聚乙二醇(PEG)嵌段修饰的聚己内酯(PCL)共聚物用有机溶剂配制成溶液，再在水中自组装成纳米粒子或胶束，该纳米粒能够在体内降解，降解产物无毒无害，其纳米粒能够在水中分散形成稳定分散液，“是开发疏水性药物长效缓释制剂的优良辅料”，缺点在于该PEG-PCL-PEG共聚物在水中不溶解。发明内容：

[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种嵌段共聚物。该嵌段共聚物是PCL修饰PEG的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物，其相对分子质量为1000～6000，其中PCL链段的总相对分子质量与PEG链段的总相对分子质量的比值为1.4～2.6。

[0007] 优选的，上述嵌段共聚物中PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值优选为1.75～2.25。更优选的，上述嵌段共聚物中PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值为2。

[0008] 优选的，上述嵌段共聚物的相对分子质量为1500～5000。

[0009] 上述嵌段共聚物能够溶解于水中，其水溶液随着温度升高而发生Sol相～Gel相的相转变，相转变温度在25℃～35℃。

[0010] 进一 步的，上述 嵌段 共聚 物为 E550-C2000-E550、E550-C2200-E550、E750-C2200E750、E750-C3000-E750；其中的E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应各链段的相对分子质量。

[0011] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种制备上述的PEG-PCL-PEG共聚物的方法。该方法包括下述步骤：

[0012] a、以辛酸亚锡为催化剂，采用MPEG在130-150℃加热反应3-12小时引发己内酯开环聚合，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物；

[0013] b、将步骤a所得MPEG-PCL二嵌段共聚物该共聚物用二异氰酸酯做交联剂在真空状态下继续反应0.5-2小时，得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物；

[0014] c、将步骤b所得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物材料在氮气保护下冷却至室温，提纯后在室温下冷冻干燥后保存备用。

[0015] 其中，上述的制备温度敏感型PEG-PCL-PEG共聚物的方法中所述的二异氰酸酯为甲苯二异氰酸酯、1，6-己二异氰酸酯、二苯基甲烷-4，4’-二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯中的至少一种。

[0016] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述嵌段共聚物在药物在制备药物释放控制体系、组织工程材料、可降解水凝胶中的用途。本发明嵌段共聚物特别适合用于制备局部释放控制药物体系、温度敏感性栓塞材料、可注射且可降解组织工程支架材料等领域。

[0017] 本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种药物组合物。该药物组合物是上述的嵌段共聚物装载药物活性成分制备而成的。

[0018] 本发明PEG-PCL-PEG(可表示为PECE)嵌段共聚物正常条件下是固体或粘稠液体，可溶于水，其水溶液具有25℃～35℃的临界凝胶温度(CGT)。也就是说在其水溶液中，当其浓度等于或大于临界凝胶浓度(CGC)的情况下，当温度升高到临界凝胶温度(CGT)以上时，会发生溶胶(Sol)相向凝胶(Gel)相的相转变。

[0019] 本发明嵌段共聚物所制备成的水凝胶的凝胶强度可以在满足上述对临界凝胶温度(CGT)的要求的情况下，通过调整PCL和PEG段的长度和相对比例进行调节。一般情况下，采取本领域的常规措施，可增加其凝胶强度，以满足在温度敏感性栓塞材料及组织工程支架材料等领域的应用需要。

[0020] 本发明三嵌段共聚物所制备成的水凝胶的降解速度可以在满足上述对临界凝胶温度(CGT)的要求的情况下，通过调整PCL和PEG段的长度和相对比例进行调节，以满足对降解速度有特殊要求的相关应用领域的需要。一般情况下，采取本领域的常规措施可以调节其降解速度，从而达到一定程度的定时缓控释要求。

[0021] 本发明创造性地提供了具有温度敏感型的PEG-PCL-PEG嵌段共聚物，其具有25℃～35℃的临界凝胶温度(CGT)、降解速度可调、凝胶强度可调、生物相容性好、可能以粉末形式保存、制备凝胶不需要使用有毒的溶剂等优异的特性，而这些特性决定了本发明温度敏感型三嵌段共聚物在药物释放控制体系、组织工程领域、可降解水凝胶及生物医用高分子材料等应用领域具有极好的应用前景，为需要使用温度敏感型共聚物的领域提供了一种新的选择。本发明方法操作简便，产物得率高、纯度高、性质可控，适合于大规模生产应用。
附图说明：

[0022] 图1为二嵌段PCL-PEG共聚物(A)与三嵌段PEG-PCL-PEG共聚物(B)的红外光谱对比图。

[0023] 图2为PEG-PCL-PEG共聚物的核磁测试图谱。

[0024] 图3为E550-C2200-E550水凝胶在30℃(a)与在37℃(b)时的示意图。

[0025] 图4为VB12从VB12/PECE(E550-C2200-E550)复合物中的药物释放行为。其中：A表示水凝胶的浓度对药物释放行为的影响，其VB12含量是0.8毫克；B表示VB12的含量对药物释放行为的影响，其凝胶浓度为30％。

[0026] 图5和厚朴酚从和厚朴酚/PECE(E550-C2200-E550)水凝胶复合物中的释放行为，其凝胶浓度为30％。

[0027] 图6为BSA从BSA/PECE(E550-C2200-E550)水凝胶复合物中的释放行为。其中A表示BSA初始含量对其释放行为的影响，其凝胶浓度为30％；B表示水凝胶浓度对药物释放行为的影响。其BSA含量是4毫克。

[0028] 图7表示将PEG-PCL-PEG共聚物(PECE)、F127分别注射入老鼠皮下后的水凝胶形成及降解。其中：A、B、C、D分别是PECE水凝胶注射入老鼠皮下后1天、3天、7天、14天；E、F分别是泊洛沙姆F127在注射入老鼠皮下2小时、4小时。

[0029] 图8表示PECE水凝胶的相转变曲线。其中A表示PCL链段分子量对相转变曲线的影响，B表示水凝胶总分子量对相转变曲线的影响。

[0030] 下面结合附图通过具体实施方式进一步描述但不限制本发明。具体实施方式：

[0031] 本发明实施例使用的主要试剂和仪器：

[0032] 己内酯(ε-CL，Alfa Aesar公司，分析纯)

[0033] 聚乙二醇单甲醚(MPEG，Mn＝550，750，1000，Aldrich公司，分析纯)

[0034] 辛酸亚锡(Stannous octoate，Sigma公司，分析纯)

[0035] 异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI，Aldrich公司，分析纯)

[0036] Varian 400型核磁共振仪(美国Varian公司)

[0037] 200SXV型傅里叶红外光谱仪(Nicolet公司)

[0038] 实施例一本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成和验证

[0039] 1)本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成

[0040] 本发明PEG-PCL-PEG共聚物的简要合成路线如下所示：

[0041]

[0042] 其中的X、Y均为正整数。

[0043] 根据上式的合成路线，在装有搅拌器的三口烧瓶中加入一定量的聚乙二醇单甲醚(MPEG)和己内酯(ε-CL)，以辛酸亚锡为催化剂，在130℃、氮气保护的条件下反应6小时，降温至80℃，加入交联剂异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)再继续反应6小时后得到产物，冷却至室温提纯，烘干。此外，适合的二异氰酸酯还包括：甲苯二异氰酸酯、1，6-己二异氰酸酯、二苯基甲烷-4，4’-二异氰酸酯等。

[0044] 根据上述方法，合成了E550-C2000-E550、E550-C2200-E550、E750-C2200-E750、E750-C3000-E750等具符合要求的共聚物(见表1)。

[0045]

[0046] 2、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的验证

[0047] (1)、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的表征方法

[0048] 用傅里叶红外光谱仪(FTIR)(200SXV，Nicolet)，采用KBr压片法对合成的共聚物进行红外光谱分析。1H-NMR用核磁共振仪(Varian 400，Varian)测量，在400MHZ下，溶剂为CDCl3，以四甲基硅烷为内标。

[0049] (2)、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的验证与表征

[0050] 在本试验中，PEG-PCL-PEG共聚物表示成EY-C2x-EY，其中2X和Y分别代表共聚物中PCL和PEG的分子量。傅里叶红外光谱(见图1)和核磁共振氢谱(见图2)用来检测共聚物的结构和分子量。结果表明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物成功合成。

[0051] 图1是对E750-C1500二嵌段共聚物和E750-C3000-E750三嵌段共聚物的红外光谱的分析比较。从图中可以看出，PEG的特征峰在两图中均出现，在1105cm-1处的吸收峰是PEG中C-OC的特征峰。在1734cm-1处的强吸收峰是反应后得到的二嵌段共聚物中酯键的特征峰，可见二嵌段共聚物成功合成。在B图中，在2250-2270cm-1处未出现吸收峰，说明交联剂异-1氟尔酮二异氰酸酯中的-NCO基团已经完全反应掉。而在1525cm 处的吸收峰，则是反应后产生的-NHCO-的特征吸收峰。所以，PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物成功合成。

[0052] 在图2的1H-NMR图谱中，在3.60和3.38ppm处的尖峰分别代表了MPEG中-CH2CH2O-和OCH3基团的氢原子。而在1.35、1.62、2.30和4.06ppm处的峰则分别代表了PCL中-(CH2)3，-OCCH2-和-CH2OOC-基团中的氢原子。在4.20和3.82ppm处两个较弱的峰分别代表了与PCL相连的PEG中-O-CH2-CH2-两个亚甲基上的氢原子。在0.96和1.11ppm
处的峰则分别代表了IPDI中-CH3和-CH2-基团的氢原子。

[0053] 3、本发明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的结构和分子量的进一步确定

[0054] 为了进一步确定PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的结构和分子量，对样品进行了核磁共振氢谱检测。实施例一中合成的各种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的分子量和PEG与PCL的嵌段比例根据核磁共振氢谱检测来确定。根据上述试验结果可以得出结论：本实施例已经成功地合成了理论值为E550-C2000-E550、E550-C2200-E550、E750-C2200-E750、E750-C3000E750等的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。

[0055] 实施例二本发明PEG-PCL-PEG共聚物的溶胶凝胶转变特性研究

[0056] 在本发明中，采用试管法测试凝胶溶胶转变温度。当体系处于流动液体状态时，称之为溶胶态(Sol)；当体系处于不流动固体状态时，称之为凝胶态(Gel)；当体系处于乳白色悬浊状态时，称之为悬浊态(Sus)；当体系中水相与聚合物相分离时，称之为沉淀态(Prep)

[0057] 1、本发明PEG-PCL-PEG共聚物水溶液的制备

[0058] 称取上述实施例一制备的不同分子量的PEG-PCL-PEG共聚物，按重量百分比分别是10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％的不同浓度加入到二次蒸馏水(即双蒸水)中充分均匀溶解，定容4ml。在4℃的条件下保存备用。

[0059] 2、本发明PEG-PCL-PEG凝胶温度响应特性

[0060] 图3为E550-C2200-E550三嵌段共聚物溶液分别在30℃和37℃时状态示意图。可以看到，当温度低于于体温时(30℃)，PEG-PCL-PEG水溶液显透明状态，具有流动性；在温度为37℃时，PEG-PCL-PEG水溶液显透明固体态，失去流动性。温度的变化造成了系统的溶胶凝胶转变。

[0061] 3、本发明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物凝胶溶胶转变温度的影响因素实验

[0062] 本发明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物是一种两亲性的聚合物，它的水溶液随着温度升高表现出特有的溶胶凝胶转变特性。这种转变主要受到聚合物分子结构中亲水链段和疏水链段比例和长度的影响(见图8)，同时也受到水凝胶的热历史，测试时的体积，冷藏储存时间以及共聚物溶于水形成凝胶时的温度等因素的影响。

[0063] 同时还考察了保持共聚物中亲水链段PEG和疏水链段PCL的比例不变，增加总分子量对凝胶溶胶转变相图的影响(见图8)。实验结果表明，PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的凝胶溶胶转变相图不仅受到分子内亲水疏水链段比例的影响，也部分受到亲水疏水链段长度的影响。

[0064] 实验结果表明，在试管法测试溶胶凝胶转变时，凝胶体系的体积和共聚物溶于水形成凝胶时的温度是比较重要的参数，不同参数可以得到有一定差异的测试结果。

[0065] 由上述实验可知，除了共聚物的分子组成外，许多其他因素都对本发明共聚物水凝胶体系的溶胶凝胶转变温度有着一定影响。通过对这些参数的微调，水凝胶系统的溶胶凝胶转变温度可以在一个比较确定范围内调节，这有助于本发明PEG-PCL-PEG共聚物的水凝胶作为可注射药物控制释放系统的应用。

[0066] 实施例三PEG-PCL-PEG共聚物-药物复合物的制备和释放实验

[0067] 在本实施例中，使用上述实施例制备的共聚物分别装载了3种药物制备成PEG-PCL-PEG共聚物-药物复合物，包括大分子蛋白药物(模型药物为牛血清蛋白BSA)、小分子亲水药物(模型药物为VB12)、小分子疏水药物(模型药物为和厚朴酚Honokiol)。

[0068] 1、小分子亲水药物(维生素B12)的PEG-PCL-PEG复合物制备和药物释放行为

[0069] 首先配制200微升的PEG-PCL-PEG(E550-C2200-E550)的水溶液(PEG-PCL-PEG重量含量为30％wt或20％wt)，然后在PEG-PCL-PEG水溶液中分别加入0.8毫克、2毫克的小分子亲水药物VB12，混合均匀。接着将所得溶液加入到5毫升的EP管中，在37℃保持12小时制成凝胶，然后将所得凝胶中加入2毫升的磷酸盐缓冲溶液PBS(pH＝7.4)，在空气浴摇床中进行药物释放实验，在时间T＝0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h和
168h时分别取样。采用紫外可见分光光度计测定VB12的浓度(波长为362nm)，从而研究其药物释放行为。

[0070] VB12的累计释放量根据下列公式计算得到：

[0071] Q＝CnVt+Vs∑Cn-1

[0072] 其中的Q为累计释放量，Cn为时间t时VB12的浓度，Vt溶剂体积(Vt＝2mL)，Vs为从上清液中移除的溶液体积(Vs＝1mL)。检测结果见图4。

[0073] 2、小分子疏水药物(和厚朴酚)的PEG-PCL-PEG复合物制备和药物释放行为

[0074] 使用和厚朴酚研究小分子疏水性药物和本发明PEG-PCL-PEG共聚物组成的复合体系在体外的释放行为。复合体系的制备方法和试验方法基本同上，只是复合物载药量改为用200μl共聚物分别装载1mg和2mg和厚朴酚，检测改为用HPLC系统(Waters Alliance2695)检测和厚朴酚的浓度。进样系统加装有加热恒温装置和自动进样器，使用Waters
2996检测器检测信号。色谱柱为反相C18柱(4.6×150mm-5um，Sunfire Analysis产品)，柱温保持在28℃，使用乙腈/水(60/40，v/v)系统洗脱，流速为1mL/min。标准曲线方程为：H＝105000*X+4680(H：峰面积；X：和厚朴酚的浓度)，相关系数为0.999994。检测结果见图5。

[0075] 3、大分子蛋白药物(牛血清蛋白BSA)的PEG-PCL-PEG复合物的制备和药物释放行为

[0076] 将牛血清蛋白BSA作为一种模式蛋白药物用来研究本发明PECE水凝胶装载的蛋白或多肽类药物在体外的释放行为。

[0077] 制备试验过程同上，初始的药物装载量分别为4mg和10mg.溶出的BSA总量用BCA蛋白分析试剂盒(PIERCE公司，USA)进行检测.然后用SDS-PAGE确定BSA的稳定性，结果见图6。

[0078] 上述试验结果表明，本发明PEG-PCL-PEG复合物能够分别装载大分子蛋白药物(牛血清蛋白BSA)、小分子亲水药物(VB12)、小分子疏水药物(和厚朴酚Honokiol)作为活性成分制成药物复合物，并在磷酸盐缓冲溶液PBS(pH＝7.4)中实现较长时间的缓释作用。

[0079] 实施例四本发明药物组合物体内相转变、降解及安全性试验

[0080] 将实施例一制备的E550-C2000-E550、E550-C2200-E5550、E750-C2200-E5750或E750C3000-E750溶解于生理盐水(或葡萄糖注射液)中，在低于20℃的温度下配制成一定浓度的水溶液，皮下注射入小鼠体内，约30秒钟后，在小鼠皮下形成凝胶块，14天后该凝胶块消失。同时用泊洛沙姆(泊洛沙姆F1F27，美国Fluka公司产品)作为对照，在注射入老鼠皮下4小时后，泊洛沙姆F127形成的凝胶块消失(见图7)。

[0081] 另外，按照注射用药的安全性试验要求，分别用本发明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物水凝胶进行了皮下、胸腔、腹腔注射实验，没有明显不良反应出现，然后检测实验组的心肌，肝，脾，肺肾，胃，肠等组织，与空白对照组相比没有明显差异，结果表明本发明试验结果表明PEG-PCL-PEG共聚物安全性良好，符合用药要求。

[0082] 上述实验结果表明，本发明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物能够在体内生物慢速降解，且降解产物无毒无害，是一种优良的药物释放载体，是药物缓释制剂和局部释放制剂的新载体。

[0083] 上述实例表明，本发明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物具有25℃～35℃的临界凝胶温度(CGT)、降解速度可调、凝胶强度可调、生物相容性好、能以粉末的形式保存、制备凝胶不需要用有毒的溶剂等优秀的特性，而这些特性决定了本发明温度敏感型三嵌段共聚物在药物释放控制体系、组织工程领域、可降解水凝胶及生物医用高分子材料等应用领域具有极好的应用前景，为需要使用温度敏感型共聚物的领域提供了一种新的选择。