使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)基因表达的抑制

摘要

本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达和/或活性调节的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法。本发明还指向涉及性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法，所述性状、疾病和状况响应前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达途径或其他细胞过程中涉及的基因表达和/或活性的调节，所述基因介导此种性状、疾病和状况的维持或发展。具体而言，本发明涉及能够介导针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达的RNA干扰(RNAi)的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子，包括此种小核酸分子的混合物和此种小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。本发明还涉及小核酸分子，例如siNA，siRNA，和可以抑制内源RNA分子功能，例如内源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)(例如siRNA抑制剂)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制剂)的其他分子，以通过干扰此种内源RNAs或与此种内源RNAs相关的蛋白质(例如，RISC)的调节功能来调节基因表达，包括此种小核酸分子的混合物和此种小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。此种小核酸分子在例如提供预防、抑制或减少代谢疾病、性状和状况的组合物中是有用的，包括但不限于高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗、肥胖和/或与受试者或生物中的基因表达或活性相关的其他疾病状态、状况或性状。

权利要求

1.一种具有结构SIX的双链核酸分子，其包含有义链和反义链：B——NX3——(N)X2B-3′

B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SIX

其中上部链是所述双链核酸分子的所述有义链，且下部链是所述反义链；所述反义链包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)RNA互补的序列；每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为约17-36；X5是约1-约6的整数；且(a)所述反义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的所述反义链中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；

(b)所述有义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；所述有义链中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

2.一种具有结构SX的双链核酸分子，其包含有义链和反义链：B——NX3——(N)X2B-3′

B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SX

其中上部链是所述双链核酸分子的所述有义链，且下部链是所述反义链；所述反义链包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)RNA互补的序列；每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为约17-36；X5是约1-约6的整数；且(a)所述反义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的所述反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)所述有义链中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；所述有义链中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

3.一种具有结构SXI的双链核酸分子，其包含有义链和反义链：B——NX3——(N)X2B-3′

B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SXI

其中上部链是所述双链核酸分子的所述有义链，且下部链是所述反义链；所述反义链包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)RNA互补的序列；每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为约17-36；X5是约1-约6的整数；且(a)所述反义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的所述反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)所述有义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；所述有义链中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

4.一种具有结构SXII的双链核酸分子，其包含有义链和反义链：B——NX3——(N)X2B-3′

B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SXII

其中上部链是所述双链核酸分子的所述有义链，且下部链是所述反义链；所述反义链包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)RNA互补的序列；每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为约17-36；X5是约1-约6的整数；且(a)所述反义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的所述反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

(b)所述有义链中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；所述有义链中存在的任何嘌呤核苷酸是脱氧糖核苷酸；和(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

5.一种具有结构SXIII的双链核酸分子，其包含有义链和反义链：B——NX3——(N)X2B-3′

B(N)X1——NX4——[N]X5-5′SXIII

其中上部链是所述双链核酸分子的所述有义链，且下部链是所述反义链；所述反义链包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)RNA互补的序列；每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为约17-36；X5是约1-约6的整数；且(a)所述反义链中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A型螺旋构型的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的所述反义链中存在的任何嘌呤核苷酸是

2′-O-甲基核苷酸；

(b)所述有义链中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样、Northern或A型螺旋构型的核苷酸；所述有义链中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；和(c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

6.权利要求1的双链核酸分子，其中X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、

13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且X4＝15、16、17、18、19、

20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

7.权利要求2的双链核酸分子，其中X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、

13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且X4＝15、16、17、18、19、

20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

8.权利要求3的双链核酸分子，其中X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、

13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且X4＝15、16、17、18、19、

20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

9.权利要求4的双链核酸分子，其中X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、

13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且X4＝15、16、17、18、19、

20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

10.权利要求5的双链核酸分子，其中X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、

13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，且X4＝15、16、17、18、19、

20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

11.权利要求1的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3′和5′末端处和所述反义链的3′末端处。

12.权利要求2的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3′和5′末端处和所述反义链的3′末端处。

13.权利要求3的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3′和5′末端处和所述反义链的3′末端处。

14.权利要求4的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3′和5′末端处和所述反义链的3′末端处。

15.权利要求5的双链核酸分子，其中B存在于所述有义链的3′和5′末端处和所述反义链的3′末端处。

16.权利要求1的双链核酸分子，其包含在所述siNA分子的所述有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

17.权利要求2的双链核酸分子，其包含在所述siNA分子的所述有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

18.权利要求3的双链核酸分子，其包含在所述siNA分子的所述有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

19.权利要求4的双链核酸分子，其包含在所述siNA分子的所述有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

20.权利要求5的双链核酸分子，其包含在所述siNA分子的所述有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

21.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求1的双链核酸分子。

22.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求2的双链核酸分子。

23.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求3的双链核酸分子。

24.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求4的双链核酸分子。

25.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求5的双链核酸分子。

26.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求1的2种或更多双链核酸分子。

27.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求2的2种或更多双链核酸分子。

28.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求3的2种或更多双链核酸分子。

29.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求4的2种或更多双链核酸分子。

30.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求5的2种或更多双链核酸分子。

31.权利要求1的组合物，其中所述组合物的一种或多种双链核酸分子包含与第一种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列，且其中所述组合物的一种或多种一种或多种双链核酸分子包含与第二种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列。

32.权利要求2的组合物，其中所述组合物的一种或多种双链核酸分子包含与第一种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列，且其中所述组合物的一种或多种一种或多种双链核酸分子包含与第二种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列。

33.权利要求3的组合物，其中所述组合物的一种或多种双链核酸分子包含与第一种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列，且其中所述组合物的一种或多种一种或多种双链核酸分子包含与第二种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列。

34.权利要求4的组合物，其中所述组合物的一种或多种双链核酸分子包含与第一种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列，且其中所述组合物的或多种一种或多种双链核酸分子包含与第二种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列。

35.权利要求5的组合物，其中所述组合物的一种或多种双链核酸分子包含与第一种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列，且其中所述组合物的一种或多种一种或多种双链核酸分子包含与第二种PCSK9靶互补的具有15个-30个核苷酸的序列。

36.一种具有式I的多功能双链核酸分子：

5′-p-XZX′-3′

3′-Y′ZY-p-5′

其中5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’各自独立地包含长度约24个-约38个核苷酸的寡核苷酸，XZ包含与第一种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列，YZ包含含有与第二种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸，Z包含区域XZ和YZ之间互补的长度约

1个-约24个核苷酸的核苷酸序列，X包含与区域Y’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，Y包含与区域X’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，p包含可以独立地存在或不存在的末端磷酸基，且其中所述XZ和所述YZ各自独立地具有足以分别与所述第一种和所述第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用的长度。

37.一种具有式II的多功能双链核酸分子：

5′-p-XX′-3′

3′-Y′Y-p-5′

其中5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’各自独立地包含长度约24个-约38个核苷酸的寡核苷酸，X包含与第一种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列，Y包含含有与第二种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸，所述X进一步包含与区域Y’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，所述Y进一步包含与区域X’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，p包含可以独立地存在或不存在的末端磷酸基；且其中所述X和所述Y各自独立地具有足以分别与所述第一种和所述第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用的长度。

38.一种具有式I的多功能双链核酸分子：

5′-p-XZX′-3′

3′-Y′ZY-p-5′

其中5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’各自独立地包含长度约24个-约38个核苷酸的寡核苷酸，XZ包含与第一种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列，YZ包含含有与PCSK9途径靶核酸序列的第二种核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸，Z包含区域XZ和YZ之间互补的长度约1个-约24个核苷酸的核苷酸序列，X包含与区域Y’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，Y包含与区域X’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，p包含可以独立地存在或不存在的末端磷酸基，且其中所述XZ和所述YZ各自独立地具有足以分别与所述第一种和所述第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用的长度。

39.一种具有式II的多功能双链核酸分子：

5′-p-XX′-3′

3′-Y′Y-p-5′

其中5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’各自独立地包含长度约24个-约38个核苷酸的寡核苷酸，X包含与第一种PCSK9靶核酸序列互补的核酸序列，Y包含含有与PCSK9途径靶核酸序列的第二种核酸序列互补的核酸序列的寡核苷酸，所述X进一步包含与区域Y’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，所述Y进一步包含与区域X’中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约21个核苷酸的核苷酸序列，p包含可以独立地存在或不存在的末端磷酸基；且其中所述X和所述Y各自独立地具有足以分别与所述第一种和所述第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用的长度。

40.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求36的多功能双链核酸分子。

41.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求37的多功能双链核酸分子。

42.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求38的多功能双链核酸分子。

43.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求39的多功能双链核酸分子。

44.一种包含权利要求1的双链核酸分子的组合物，其配制为LNP-051、052、053、054、

060、061、069、073、077、080、082、083、086、097、098、099、100、101、102、103、104、105、106、

107、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117中的任何一种。

45.一种包含权利要求2的双链核酸分子的组合物，其配制为脂质纳米颗粒(LNP)。

46.一种包含权利要求3的双链核酸分子的组合物，其配制为脂质纳米颗粒(LNP)。

47.一种包含权利要求4的双链核酸分子的组合物，其配制为脂质纳米颗粒(LNP)。

48.一种包含权利要求5的双链核酸分子的组合物，其配制为脂质纳米颗粒(LNP)。

说明书

使用短干扰核酸(siNA)的RNA干扰介导的前蛋白转化酶枯

草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达的抑制

[0001] 本申请是于2006年7月17日提交的美国专利申请号11/487,788的部分继续申请，所述美国专利申请号11/487,788是于2006年3月6日提交的部分继续申请
11/369,108。本申请还是于2005年12月8日提交的美国专利申请号11/299,254的部分
继续申请，所述美国专利申请号11/299,254是于2005年9月23日提交的美国专利申请
号11/234,730的部分继续申请，所述美国专利申请号11/234,730是于2005年8月17日
提交的美国专利申请号11/205,646的部分继续申请，所述美国专利申请号11/205,646是
于2005年4月4日提交的美国专利申请号11/098,303的部分继续申请，所述美国专利
申请号11/098,303是于2004年8月20日提交的美国专利申请号10/923,536的部分继
续申请，所述美国专利申请号10/923,536是于2004年7月14日提交的国际专利申请号
PCT/US04/22658的部分继续申请，所述国际专利申请号PCT/US04/22658要求于2003年7
月14日提交的临时申请号60/487,214的利益。本申请还是于2004年5月24日提交的
国际专利申请号PCT/US04/16390的部分继续申请，所述国际专利申请号PCT/US04/16390
是于2004年4月16日提交的美国专利申请号10/826,966的部分继续申请，所述美国专
利申请号10/826,966是于2004年1月14日提交的美国专利申请号10/757,803的部分
继续申请，所述美国专利申请号10/757,803是于2003年11月24日提交的美国专利申请
号10/720,448的部分继续申请，所述美国专利申请号10/720,448是于2003年10月23
日提交的美国专利申请号10/693,059的部分继续申请，所述美国专利申请号10/693,059
是于2003年5月23日提交的美国专利申请号10/444,853的部分继续申请，所述美国专
利申请号10/444,853是于2003年2月20日提交的国际专利申请号PCT/US03/05346的
部分继续申请和于2003年2月20日提交的国际专利申请号PCT/US03/05028的部分继续
申请，所述2个国际专利申请要求下述美国临时申请的利益：于2002年2月20日提交的
美国临时申请号60/358,580、于2002年3月11日提交的美国临时申请号60/363,124、于
2002年6月6日提交的美国临时申请号60/386,782、于2002年8月29日提交的美国临时
申请号60/406,784、于2002年9月5日提交的美国临时申请号60/408,378、于2002年9
月9日提交的美国临时申请号60/409,293、和于2003年1月15日提交的美国临时申请号
60/440,129。本申请还是于2004年4月30日提交的国际专利申请号PCT/US04/13456的部
分继续申请，所述国际专利申请号PCT/US04/13456是于2004年2月13日提交的美国专利
申请号10/780,447的部分继续申请，所述美国专利申请号10/780,447是于2003年4月30
日提交的美国专利申请号10/427,160的部分继续申请，所述美国专利申请号10/427,160
是于2002年5月17日提交的国际专利申请号PCT/US02/15876的部分继续申请，所述国际
专利申请号PCT/US02/15876要求下述美国临时申请的利益：于2001年5月18日提交的美
国临时申请号60/292,217、于2002年3月6日提交的美国临时申请号60/362,016、于2001
年7月20日提交的美国临时申请号60/306,883、和于2001年8月13日提交的美国临时
申请号60/311,865。本申请还是于2003年12月3日提交的美国专利申请号10/727,780
的部分继续申请。本申请还是于2005年2月9日提交的国际专利申请号PCT/US05/04270
的部分继续申请，所述国际专利申请号PCT/US05/04270要求于2004年2月10日提交的美
国临时申请号60/543,480的利益。本申请还是于2006年2月14日提交的美国专利申请
号11/353,630的部分继续申请，所述美国专利申请号11/353,630要求下述美国临时专利
申请的利益：于2005年2月14日提交的美国临时专利申请号60/652,787、于2005年5月
6日提交的美国临时专利申请号60/678,531、于2005年7月29日提交的美国临时专利申
请号60/703,946、和于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号60/737,024。本申
请要求所有列出的申请的利益，所述所有列出的申请包括附图整体引入本文作为参考。
发明领域

[0002] 本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)基因表达和/或活性调节的性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法。本发明
还指向涉及性状、疾病和状况的化合物、组合物和方法，所述性状、疾病和状况响应前蛋白
转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达途径或其他细胞过程中涉及的基因表达
和/或活性的调节，所述基因介导此种性状、疾病和状况的维持或发展。具体而言，本发明
涉及能够介导或介导针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达的RNA
干扰(RNAi)的核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双
链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子，包括此种小核酸分子的混合
物和此种小核酸分子的脂质纳米颗粒(nanoparticle)(LNP)制剂。本发明还涉及小核酸
分子，例如siNA，siRNA，和可以抑制内源RNA分子功能，例如内源微小RNA(miRNA)(例如，
miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)(例如siRNA抑制剂)，或可以抑制RISC功能(例
如，RISC抑制剂)的其他分子，以通过干扰此种内源RNAs或与此种内源RNAs相关的蛋白
质(例如，RISC)的调节功能来调节PCSK9基因表达，包括此种小核酸分子的混合物和此
种小核酸分子的脂质纳米颗粒(LNP)制剂。此种小核酸分子在例如提供预防、抑制或减少
代谢疾病性状和状况的组合物中是有用的，所述代谢疾病性状和状况包括但不限于高脂血
症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖
尿病)、胰岛素抵抗、肥胖和/或与受试者或生物中的PCSK9基因表达或活性相关的其他疾
病状态、状况或性状。

[0003] 发明背景

[0004] 下文是关于RNAi的相关技术的讨论。该讨论仅为了理解下述本发明而提供。该概述并非下文描述的任何工作是请求保护的本发明的现有技术的承认。

[0005] RNA干扰指动物中由短干扰RNAs(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Fire等人，1998，Nature，391，806；Hamilton等 人，1999，Science，286，950-951；Lin 等 人，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，Genes&Dev.，13：139-141；和Strauss，1999，Science，286，886)。植物中的相应过程
(Heifetz等人，国际PCT公开号WO 99/61631)通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，
并且在真菌中也称为压抑。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基因表达的
进化上保守的细胞防御机制，并且通常由不同的植物区系和门共享(Fire等人，1999，
TrendsGenet.，15，358)。使免于外来基因表达的此种保护可能响应双链RNAs(dsRNAs)的
产生而经由细胞应答发展出来，所述双链RNAs衍生自病毒感染或转座子元件随机整合到
宿主基因组内，所述细胞应答特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。细胞中dsRNA的
存在通过仍需充分表征的机制触发RNAi应答。这种机制似乎不同于涉及双链RNA特异性
核糖核酸酶的其他已知机制，例如起因于dsRNA介导的蛋白激酶PKR激活和通过核糖核酸
酶L导致mRNA的非特异性切割的2′，5′-寡腺苷酸合成酶的干扰素应答(参见例如美
国专利号6,107,094；5,898,031；Clemens等人，1997，J.Interferon&Cytokine Res.，17，
503-524；Adah等人，2001，Curr.Med.Chem.，8，1189)。

[0006] 细胞中长dsRNAs的存在刺激称为切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore 等 人，2000，Cell，101，25-33；Hammond等 人，2000，Nature，404，293)。切酶涉及dsRNA加工成称为短干扰RNAs(siRNAs)的dsRNA短片段
(Zamore等 人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein等 人，2001，Nature，409，363)。衍生自切酶活性的短干扰RNAs一般为长度约21个-约23个核苷酸并
且包含约19个碱基对双链体(Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Elbashir等人，2001，GenesDev.，15，188)。切酶已牵涉于来自保守结构的前体RNA的21-和22-核苷酸小时序
RNAs(stRNAs)的切割，所述小时序RNAs牵涉于翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science，
293，834)。RNAi应答还以通常称为RNA诱导性沉默复合物(RISC)的内切核酸酶复合物为
特征，所述复合物介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA切割。靶RNA的
切割发生于与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，
15，188)。

[0007] RNAi已在多种系统中进行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Bahramian和Zarbl，1999，Molecular and Cellular
Biology，19，274-283以及Wianny和Goetz，1999，Nature Cell Biol，2，70描述了在哺乳动物系统中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA转
染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人，2001，Nature，411，494和Tuschl等
人，国际PCT公开号WO 01/75164描述了通过在培养的哺乳动物细胞中引入合成的21-核
苷酸RNAs的双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人胚肾和HeLa细胞。果蝇胚胎溶
解产物中的近期工作(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，国际PCT公
开号WO 01/75164)已揭示了关于siRNA长度、结构、化学组成、和介导有效RNAi活性所必
需的序列的某些要求。这些研究已显示21-核苷酸siRNA双链体在包含3′-末端二核苷
酸突出端时是最有活性的。此外，用2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全置换1
条或2条siRNA链取消了RNAi活性，而用2′-脱氧核苷酸(2′-H)置换3′-末端siRNA
突出端核苷酸显示是耐受的。siRNA双链体中心处的单个错配序列也显示取消了RNAi活
性。此外，这些研究还指出靶RNA中切割位点的位置由siRNA引导序列的5′-末端而不
是引导序列的3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877)。其他研究已指出
siRNA双链体的靶互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于维持siRNA上
的5′-磷酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)。

[0008] 研究已显示用脱氧核糖核苷酸替换具有2-核苷酸的3′-突出端的21-聚体siRNA双链体的3′末端核苷酸突出端区段对RNAi活性没有不利作用。用脱氧核糖核苷酸
替换siRNA每个末端上的最高达4个核苷酸已报道是良好耐受的，而使用脱氧核糖核苷酸
的完全置换导致无RNAi活性(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877和Tuschl等人，国
际PCT公开号WO 01/75164)。此外，Elbashir等人，同上，同样报道使用2’-O-甲基核苷
酸的siRNA置换完全取消了RNAi活性。Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914和Beach等
人，国际PCT公开号WO01/68836预先提出siRNA可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，
以包括至少一个氮或硫杂原子，然而，无一申请假定此种修饰到何种程度在siRNA分子中
将是耐受的，也没有提供此种经修饰的siRNA的任何进一步指导或例子。Kreutzer等人，
加拿大专利申请号2,359,180也描述了用于在dsRNA构建体中使用的某些化学修饰，以抵
抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR的激活，特别是2′-氨基或2′-O-甲基核苷酸，和包含
2′-O或4′-C亚甲桥的核苷酸。然而，Kreutzer等人类似地未能提供关于这些修饰至何
种程度在dsRNA分子中将是耐受的例子或指导。

[0009] Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087使用长(＞25nt)siRNA转录物测试了靶向秀丽隐杆线虫中的unc-22基因的某些化学修饰。该作者描述了通过用T7和
T3RNA聚合酶掺入硫代硫酸核苷酸类似物将硫代磷酸残基引入这些siRNA转录物内，并且
观察到具有2个硫代磷酸酯修饰的碱基的RNAs作为RNAi也具有有效性中的相当大减少。
此外，Parrish等人报道超过2个残基的硫代磷酸酯修饰使RNAs在体外非常不稳定，从而
使得干扰活性无法被测定。同前在1081处。该作者还测试了在长siRNA转录物中的核苷
酸糖的2′-位置处的某些修饰，并且发现用脱氧核苷酸置换核糖核苷酸产生干扰活性中
的相当大减少，特别是在尿苷至胸苷和/或胞苷至脱氧胞苷置换的情况下。同前。此外，该
作者测试了某些碱基修饰，包括在siRNA的有义和反义链中，用4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、
5-碘尿嘧啶、和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶置换尿嘧啶，和用肌苷置换鸟苷。尽管4-硫尿嘧
啶和5-溴尿嘧啶置换似乎是耐受的，Parrish报道肌苷当掺入任一链中时产生干扰活性中
的相当大减少。Parrish还报道在反义链中5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶的掺入
同样导致RNAi活性中的相当大减少。

[0010] 较长dsRNA的使用已得到描述。例如，Beach等人，国际PCT公开号WO 01/68836描述了使用内源衍生的dsRNA用于减弱基因表达的具体方法。Tuschl等人，国际PCT公
开号WO 01/75164描述了果蝇体外RNAi系统和特定siRNA分子用于某些功能基因组和
某些治疗应用的用途；尽管由于激活干扰素应答的危险，Tuschl，2001，Chem.Biochem.，
2，239-245不确定RNAi可以用于治愈遗传疾病或病毒感染。Li等人，国际PCT公开号WO
00/44914描述了特定长度(141bp-488bp)的酶促合成或载体表达的dsRNAs用于减弱某些
靶基因表达的用途。Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646描述了使用某一
长(550bp-714bp)、酶促合成或载体表达的dsRNA分子用于抑制哺乳动物细胞中的特定基
因表达的某些方法。Fire等人，国际PCT公开号WO 99/32619描述了用于将某一长dsRNA
分子引入细胞内用于抑制线虫中的基因表达的具体方法。Plaetinck等人，国际PCT公开号
WO 00/01846描述了关于使用特定长度的dsRNA分子鉴定细胞中负责赋予特定表型的特定
基因的某些方法。Mello等人，国际PCT公开号WO 01/29058描述了涉及dsRNA介导的RNAi
的特定基因的鉴定。Pachuck等人，国际PCT公开号WO 00/63364描述了某一长(至少200
个核苷酸)dsRNA构建体。Deschamps Depaillette等人，国际PCT公开号WO 99/07409描
述了由与某些抗病毒剂组合的特定dsRNA分子组成的具体组合物。Waterhouse等人，国际
PCT公开号99/53050和1998，PNAS，95，13959-13964描述了使用某些dsRNAs用于减少核
酸在植物细胞中的表型表达的某些方法。Driscoll等人，国际PCT公开号WO01/49844描述
了用于促进靶向的生物中的基因沉默的特定DNA表达构建体。

[0011] 其他人已报道了各种RNAi和基因沉默系统。例如，Parrish等人，2000，Molecular Cell，6，1077-1087描述了靶向秀丽隐杆线虫的unc-22基因的特定化学修饰的dsRNA构建体。Grossniklaus，国际PCT公开号WO 01/38551描述了使用某些dsRNAs用于调节植物中
的polycomb基因表达的某些方法。Churikov等人，国际PCT公开号WO 01/42443描述了
使用某些dsRNAs用于修饰生物的遗传特征的某些方法。Cogoni等人，国际PCT公开号WO
01/53475描述了用于分离链孢霉属(Neurospora)沉默基因的某些方法及其用途。Reed等
人，国际PCT公开号WO 01/68836描述了用于植物中的基因沉默的某些方法。Honer等人，
国际PCT公开号WO 01/70944描述了使用某些dsRNAs使用转基因线虫作为帕金森氏病模
型的药物筛选的某些方法。Deak等人，国际PCT公开号WO 01/72774描述了可能涉及果蝇
中的RNAi的某些果蝇衍生的基因产物。Arndt等人，国际PCT公开号WO 01/92513描述了
通过使用增强RNAi的因子用于介导基因抑制的某些方法。Tuschl等人，国际PCT公开号
WO 02/44321描述了某些合成的siRNA构建体。Pachuk等人，国际PCT公开号WO 00/63364
和Satishchandran等人，国际PCT公开号WO 01/04313描述了使用某一长(超过250bp)、
载体表达的dsRNAs用于抑制某些多核苷酸序列功能的某些方法和组合物。Echeverri
等人，国际PCT公开号WO 02/38805描述了经由RNAi鉴定的某些秀丽隐杆线虫基因。
Kreutzer等人，国际PCT公开号WO02/055692、WO 02/055693和EP 1144623B1描述了使
用dsRNA用于抑制基因表达的某些方法。Graham等人，国际PCT公开号WO 99/49029和WO
01/70949以及AU 4037501描述了某些载体表达的siRNA分子。Fire等人，US 6,506,559
描述了使用介导RNAi的某一长dsRNA(299bp-1033bp)构建体用于抑制体外基因表达的
某些方法。Martinez等人，2002，Cell，110，563-574描述了介导HeLa细胞中的RNA干扰
的某些单链siRNA构建体，包括某些5′-磷酸化的单链siRNAs。Harborth等人，2003，
Antisense&Nucleic Acid Drug Development，13，83-105描述了某些化学上和结构上修饰
的siRNA分子。Chiu和Rana，2003，RNA，9，1034-1048描述了某些化学上和结构上修饰的
siRNA分子。Woolf等人，国际PCT公开号WO 03/064626和WO 03/064625描述了某些化学
修饰的dsRNA构建体。Hornung等人，2005，Nature Medicine，11，263-270描述了通过短干
扰RNA在浆细胞样树突细胞中经由TLR7的IFN-α的序列特异性有效诱导。Judge等人，
2005，NatureBiotechnology，在线公开：2005年3月20日描述了通过合成的siRNA的哺乳
动物先天性免疫应答的序列依赖性刺激。Yuki等人，国际PCT公开号WO 05/049821和WO
04/048566描述了用于设计具有最优化活性的短干扰RNA序列和某些短干扰RNA序列的某
些方法。Saigo等人，美国专利申请公开号US20040539332描述了设计寡或多核苷酸序列包
括短干扰RNA序列用于达到RNA干扰的某些方法。Tei等人，国际PCT公开号WO 03/044188
描述了用于抑制靶基因表达的某些方法，所述方法包括用包含DNA和RNA的双链多核苷酸
转染细胞、组织或个别生物，所述双链多核苷酸具有与靶基因的至少部分核苷酸序列基本
上等同的核苷酸序列。

[0012] Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，309，1529-1530；Sethupathy 等 人，2006，RNA，12，192-197；和 Czech，2006 NEJM，354，11：
1194-1195；Hutvagner等人，US 20050227256，和Tuschl等人，US 20050182005全都描述
了可以经由空间封闭抑制miRNA功能的反义分子并且全部整体引入本文作为参考。

[0013] Lalanne等人，2005，Journal of Lipid Research，46，1312-1319描述了靶向PCSK9的某些siRNA分子。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明涉及使用短干扰核酸(siNA)分子通过RNA干扰(RNAi)用于调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达的化合物、组合物和方法，所述基因例如与
代谢疾病性状和状况的发展或维持相关的那些PCSK9基因，所述代谢疾病性状和状况包括
但不限于高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗、肥胖和/或与PCSK9基因表达或活性相关的任何其他疾
病、性状和状况。本发明还涉及使用小核酸分子通过RNA干扰(RNAi)用于调节PCSK9基因
表达途径和/或活性中涉及的其他基因的表达和活性的化合物、组合物和方法。特别地，本
发明的特征在于用于调节PCSK9基因表达和/或活性途径中涉及的PCSK9基因和/或其他
基因表达的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微
小RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子和方法。

[0016] 本发明还涉及小核酸分子，例如siNA、siRNA和可以抑制内源RNA分子功能，例如内源微小RNA(miRNA)(例如，miRNA抑制剂)或内源短干扰RNA(siRNA)(例如siRNA抑制
剂)，或可以抑制RISC功能(例如，RISC抑制剂)的其他分子，以通过干扰此种内源RNAs
或与此种内源RNAs相关的蛋白质(例如，RISC)的调节功能来调节PCSK9基因表达。此种
分子在本文中统称为RNAi抑制剂。

[0017] 本发明的siNA或RNAi抑制剂可以是未修饰或化学修饰的。本发明的siNA或RNAi抑制剂可以是化学合成的、由载体表达的或酶促合成的。本发明的特征还在于通过RNA干
扰(RNAi)能够调节细胞中的靶基因表达或活性的各种化学修饰的合成短干扰核酸(siNA)
分子。本发明的特征还在于各种化学修饰的合成短核酸(siNA)分子，其能够通过与miRNA、
siRNA或RISC相互作用且因此下调或抑制细胞或生物中的RNA干扰(RNAi)、翻译抑制、或
转录沉默调节细胞中的RNAi活性。化学修饰的siNA和/或RNAi抑制剂的使用通过增加的
对于体内核酸酶降解的抗性和/或通过改善的细胞摄取改善天然siNA分子和/或RNAi抑
制剂的各种性质。此外，与早期公开的研究相反，具有多重化学修饰的本发明的siNA分子，
包括完全修饰的siRNA保留其RNAi活性。因此，申请人在本文中教导了在天然siRNA活性
上保留或改善的化学修饰的siRNA。本发明的siNA分子提供了用于多种治疗、预防、兽医、
诊断、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学(pharmacogenomic)应用的有用试剂
和方法。

[0018] 在一个实施方案中，本发明的特征在于一种或多种siNA分子和/或RNAi抑制剂，和方法，其独立或组合调节编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)的基因和/
或PCSK9途径基因的表达，所述基因例如编码包含通过表I、以及USSN 10/923,536和PCT/
US03/05028中显示的GenBank登记号提及的那些序列的序列的基因，所述2个专利都引入
本文作为参考，所述基因在本文中一般称为“PCSK9”。本发明的各种方面和实施方案的下
述描述关于示例性前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因而提供，所述基因
在本文中一般称为PCSK9，但也称为神经凋亡调节转化酶1或NARC1。本发明还涉及与性
状、疾病和状况相关的化合物、组合物和方法，所述性状、疾病和状况响应涉及前蛋白转化
酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9(PCSK9)基因表达途径或其他细胞过程的基因的表达和/或活
性的调节，所述其他细胞过程介导此种性状、疾病和状况的维持或发展。然而，此种提及仅
意欲是示例性的，并且本发明的各种方面和实施方案也涉及表达可替代的PCSK9基因的其
他基因，例如突变PCSK9基因、PCSK9基因的剪接变体、物种间或受试者间的PCSK9变体，以
及其他PCSK9途径基因，包括PCT/US03/05028和USSN 10/923,536中描述的某些基因，所
述2个专利都引入本文作为参考。此种另外的基因可以使用本文描述的用于本文的示例性
PCSK9基因和序列的方法就靶位点进行分析。因此，其他基因的调节和其他基因的此种调
节的作用可以如本文所描述的进行、测定和测量。换言之，如本文在下文中定义和在所述实
施方案中描述的，术语“PCSK9”意欲包含与本文的疾病、性状和状况的发展和/或维持相关
的基因，例如编码PCSK9多肽的基因、PCSK9调节多核苷酸(例如PCSK9miRNAs和siRNAs)、
突变PCSK9基因、和PCSK9基因的剪接变体、以及基因表达和/或活性的PCSK9途径中涉及
的其他基因。因此，本文关于术语“PCSK9”描述的实施方案中的每一个都可应用于由术语
“PCSK9”包含的所有蛋白质、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如那个术语在本文中定义的。总之，此种基因靶在本文中一般也称为“靶”序列。

[0019] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含靶向不同多核苷酸靶的本发明的2种或更多不同siNA分子和/或RNAi抑制剂的组合物(例如，siNA、双链体形成siNA、或多功
能siNA或其任何组合)，例如PCSK9 RNA或DNA的不同区域(例如，如本文提供的2种不同
靶位点或PCSK9靶或PCSK9途径靶的任何组合)或编码和非编码靶。此种siNA分子库可
以提供增加的疗效。

[0020] 在一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的2种或更多不同siNA分子的库(例如，siNA、双链体形成siNA、或多功能siNA或其任何组合)，所述siNA分子对不同的多
核苷酸靶具有特异性，例如PCSK9 RNA或DNA的不同区域(例如，本文的2个不同靶位点或
PCSK9靶或PCSK9途径靶的任何组合)或编码和非编码靶，其中所述库包含靶向约2个、3
个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多不同PCSK9靶的siNA分子。

[0021] 由于关于PCSK9基因组在不同生物或不同受试者中的序列变异性的可能性，用于广泛治疗应用的siNA分子的选择可能涉及PCSK9基因的保守区。在一个实施方案中，本
发明涉及靶向PCSK9基因组的保守区或在不同PCSK9靶中保守的区域的siNA分子和/或
RNAi抑制剂。被设计为靶向各种PCSK9靶的保守区的siNA分子和/或RNAi抑制剂使得能
够有效抑制不同患者群体中的PCSK9靶基因表达。

[0022] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链核酸分子，例如siNA分子，其中一条链包含与靶核酸分子中的预定核苷酸序列或其部分具有互补性的核苷酸序列。在一个实施
方案中，预定核苷酸序列是本文描述的核苷酸靶序列。在另一个实施方案中，预定核苷酸序
列是本领域已知的靶序列。

[0023] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约28个碱基对。例如，在一个
实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因的表达或指导靶RNA的切割的双链短干扰核酸
(siNA)分子，其中所述siRA分子包含约18-约27个碱基对。

[0024] 在一个实施方案中，本发明的特征在于指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约28个碱基对。

[0025] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子包含第一条链和第二条链，
siNA分子的每条链长度为约18个-约28个(例如，约18个、19个、20个、21个、22个、23
个、24个、25个、26个、27个或28个)核苷酸，siNA分子的第一条链包含与靶RNA具有足
够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA的切割，且所述siNA分
子的第二条链包含与第一条链互补的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，例如，siNA分
子的每条链长度为约18个-约27个核苷酸。

[0026] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子包含第一条链和第二条链，
siNA分子的每条链长度为约18个-约23个(例如，约18个、19个、20个、21个、22个或23
个)核苷酸，siNA分子的第一条链包含与靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA
分子经由RNA干扰指导靶RNA的切割，且所述siNA分子的第二条链包含与第一条链互补的
核苷酸序列。

[0027] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸或多核苷酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每条链长度为约
18个-约28个核苷酸；且siNA分子的一条链包含与靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列
以用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA的切割。

[0028] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸或多核苷酸(siNA)分子，其中所述siNA分子的每条链长度为约
18个-约23个核苷酸；且siNA分子的一条链包含与靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列
以用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA的切割。

[0029] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述靶基因或RNA包含蛋白质编码序列。在一个实施方案中，本发明的特
征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的siNA分子，例如，其中所述靶基因或RNA包含
非编码序列或涉及靶基因表达的调节元件(例如，非编码RNA、miRNA、stRNA、shRNA等)。

[0030] 在本发明的另一个实施方案中，dsRNA的一条或两条链是100个碱基(或碱基对)或更少。在其他实施方案中，dsRNA的一条或两条链长度小于70个碱基。关于其他实施方
案，dsRNA的一条或两条链各自长度可以为5-70、10-65、20-60、30-55、40-50个碱基或碱基对。在某些方面，链各自长度为15-30个碱基对，而在其他方面，链各自长度为19-23个碱
基对。具有等于或小于30个碱基对的互补区的dsRNA，例如其中链各自长度为30个碱基
或更少的dsRNA，或其中茎或互补部分小于或等于30个碱基对的单链发夹RNA是特别优选
的，因为此种链能够逃避哺乳动物的细胞抗病毒应答。因此，发夹dsRNA(一条链)长度可
以是70个或更少的碱基，具有30个碱基对或更少的互补区。

[0031] 发夹干扰RNA：发夹干扰RNA是包含茎-环或发夹结构(例如，shRNA)的干扰RNA的有义和反义链的单个分子(例如，单条寡核苷酸链)。例如，shRNAs可以由DNA载体进行
表达，其中编码有义干扰RNA链的DNA寡核苷酸通过短间隔物与编码反向互补的反义干扰
RNA链的DNA寡核苷酸进行连接。如果对于所选择的表达载体所需，那么可以添加3′末端
T′s和核苷酸形成限制位点。所得到的RNA转录物在其自身上往回折叠以形成茎-环结
构。

[0032] 在一个实施方案中，本发明的RNAi构建体用于下调或抑制起于PCSK9单元型多态性的PCSK9蛋白质的表达，所述PCSK9单元型多态性与疾病或状况(例如，高胆固醇血症、
高脂血症和心血管疾病)相关。PCSK9基因或PCSK9蛋白质或RNA水平的分析可以用于鉴
定具有此种多态性的受试者，或处于发展本文描述的性状、状况或疾病的危险中的那些受
试者。这些受试者顺应治疗，例如用本发明的RNAi构建体或在治疗与PCSK9基因表达相关
的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。照这样，PCSK9蛋白质或RNA水平的分析可以用
于测定治疗受试者中的治疗类型和治疗过程。PCSK9蛋白质或RNA水平的监控可以用于预
测治疗结果且测定化合物和组合物的功效，所述化合物和组合物调节与性状、状况或疾病
相关的某些PCSK9蛋白质的水平和/或活性。

[0033] 此外，上文和本申请的其他地方详述的本发明的RNAi构建体的反义链在生理条件下与PCSK9mRNA的部分杂交。此种组合物的施用减弱调节受试者的靶mRNA的胆固醇的
表达。

[0034] 在一个实施方案中，本发明的siNA用于抑制靶基因或靶基因家族(例如，不同PCSK9基因)的表达，其中所述基因或基因家族序列共享序列同源性。此种同源序列可以如
本领域已知的进行鉴定，例如使用序列比对。siNA分子可以被设计为靶向此种同源序列，
例如使用完全互补的序列或通过掺入非规范碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，这可以
提供另外的靶序列。在其中错配被鉴定的情况下，非规范碱基对(例如，错配和/或摆动碱
基)可以用于产生靶向超过一种基因序列的siNA分子。在非限制性例子中，非规范碱基对
例如UU和CC碱基对用于产生siNA分子，其能够靶向共享序列同源性的不同多核苷酸靶的
序列。照这样，使用本发明的siNA的一个优点是单一siNA可以被设计为包括与核苷酸序列
互补的核酸或多核苷酸序列，所述核苷酸序列在同源基因之间是保守的。在这种方法中，单
一siNA可以用于抑制超过一种基因的表达而不是使用超过一种siNA分子靶向不同基因。

[0035] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有针对靶RNA(例如，编码或非编码RNA)的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含与任何RNA序列互补的序列，例如具
有如表I、PCT/US03/05028、美国临时专利申请号60/363,124或USSN 10/923536中所示
GenBank登记号的那些序列，所述所有专利都引入本文作为参考。在另一个实施方案中，本
发明的特征在于具有针对靶RNA的RNAi活性的siNA分子，其中所述siNA分子包含与具有
变体编码序列的RNA互补的序列，例如与本文描述的或本领域以其他方式已知的疾病、性
状、病症和/或状况的维持和/或发展相关的本领域已知的其他突变基因。如表III和IV
中所示或本文其他地方描述的化学修饰可以应用于本发明的任何siNA构建体。在另一个
实施方案中，本发明的siNA分子包括这样的核苷酸序列，其可以与PCSK9基因的核苷酸序
列相互作用且从而介导PCSK9基因表达的沉默，例如，其中siNA通过细胞过程介导PCSK9
基因表达的调节，所述细胞过程介导染色质结构或PCSK9基因的甲基化模式且阻止PCSK9
基因的转录。

[0036] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调或抑制起于单元型多态性的蛋白质的表达，所述单元型多态性与受试者或生物中的性状、疾病或状况相关。基因或蛋白质
或RNA水平的分析可以用于鉴定具有此种多态性的受试者或处于发展本文描述的性状、状
况或疾病的危险中的那些受试者。这些受试者顺应这样的治疗，例如用本发明的siNA分子
和在治疗与靶基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。照这样，靶蛋白或RNA
水平的分析可以用于确定受试者治疗中的治疗类型和疗程。靶蛋白或RNA水平的监控可以
用于预测治疗结果和测定化合物和组合物的效力，所述化合物和组合物调节与性状、病症、
状况或疾病相关的某些靶蛋白的水平和/或活性。

[0037] 在本发明的一个实施方案中，siNA分子包含反义链，所述反义链包含与编码靶蛋白的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列。siNA进一步包含有义链，其中所述有义链包
含靶基因的核苷酸序列或其部分。

[0038] 在另一个实施方案中，siNA分子包含反义区，所述反义区包含与编码靶蛋白的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列。siNA分子进一步包含有义区，其中所述有义区包含
靶基因的核苷酸序列或其部分。

[0039] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含核苷酸序列的siNA分子，例如在siNA分子的反义区中与靶基因的核苷酸序列或序列的部分互补的核苷酸序列。在另一个实
施方案中，本发明的特征在于包含区域的siNA分子，例如与包含靶基因序列的序列或其部
分互补的siNA构建体的反义区。

[0040] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子的有义区或有义链与siNA分子的反义区或反义链的那个部分互补，所述部分与靶多核苷酸序列互补。

[0041] 在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含序列的siNA分子，例如siNA构建体的反义序列，与包含由PCT/US03/05028、美国临时专利申请号60/363,124和/或USSN
10/923,536中所示Genbank登记号表示的序列的序列或序列部分互补，所述所有专利都引
入本文作为参考。表III和IV以及本文其他地方描述的化学修饰可以应用于本发明的任
何siNA构建体。表IV中描述的LNP制剂可以应用于本文的任何siNA分子或siNA分子组
合。

[0042] 在本发明的一个实施方案中，siNA分子包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义链，其中所述反义链与PCSK9靶RNA序列或其部分互补，并且其
中所述siNA进一步包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、
20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义链，并且其中所述有义链和所述反义链是其中每条链中的至少约15个核苷酸与另一条链互补
的不同核苷酸序列。

[0043] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子(例如，双链核酸或多核苷酸分子)包含与靶RNA序列或其部分互补的具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的
反义(引导)链。在一个实施方案中，靶RNA序列的至少15个核苷酸(例如，15个、16个、
17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)与本发明的siNA分子的反义(引导)链互补。在一个实施方案中，本发明的siNA
分子(例如，双链核酸或多核苷酸分子)包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16
个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义(过客)链，其包含靶RNA的序列或其部分。在一个实施方案中，靶RNA
序列的至少15个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23
个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸包含本发明的siNA分子的有义
(过客)链。

[0044] 在本发明的另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义区，其中所述反义区与靶DNA序列互补，并且其中所
述siNA进一步包含包含具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、
20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义区，其中所述有义区和所述反义区包含在其中有义区包含与反义区互补的至少约15个核苷酸
的线性分子中。

[0045] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子具有调节由PCSK9基因编码的RNA表达的RNAi活性。因为PCSK9基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，所以通过选择在不同的
PCSK9靶中共享或可替代地对特定PCSK9靶独特的序列，siNA分子可以被设计为靶向一类
PCSK9基因。因此，在一个实施方案中，siNA分子可以被设计为靶向在几种PCSK9基因变体
中具有同源性的PCSK9 RNA序列的保守区，以便用一种siNA分子靶向一类PCSK9基因。因
此，在一个实施方案中，本发明的siNA分子调节受试者或生物中的一种或多种PCSK9同工
型或变体的表达。在另一个实施方案中，由于siNA分子介导RNAi活性所需的高度特异性，
siNA分子可以被设计为靶向对特定PCSK9多核苷酸序列(例如，单个PCSK9同工型或PCSK9
单核苷酸多态性(SNP))独特的序列。

[0046] 在一个实施方案中，充当RNA干扰基因沉默应答介质的本发明的核酸或多核苷酸分子是双链核酸或多核苷酸分子。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子由包含寡核苷
酸之间的约15个-约30个碱基对的双链体核酸或多核苷酸分子组成，所述寡核苷酸包含
约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24
个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有约1个-约3个(例如，约1个、2个或3个)核苷酸的突出端的双链体或多
核苷酸核酸分子，例如具有约19个碱基对和3′-末端单核苷酸、二核苷酸、或三核苷酸突
出端的约21-核苷酸双链体。在另外一个实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端的
双链体核酸或多核苷酸分子，其中2个末端是平头的，或可替代地其中末端之一是平头的。

[0047] 在一个实施方案中，双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含核苷酸或非核苷酸突出端。“突出端”意指在双链分子的2条链之间不是碱基配对的核苷酸序列的末端部分
(参见例如图6)。在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸分子在双链核酸或多
核苷酸分子的1条或2条链的3′-末端处可以包含核苷酸或非核苷酸突出端。例如，本发
明的双链核酸或多核苷酸分子在双链分子的引导链或反义链/区的3′-末端、过客链或有
义链/区的3′-末端、或引导链或反义链/区和过客链或有义链/区处可以包含核苷酸或
非核苷酸突出端。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(siNA)分子的核苷
酸突出端部分包含2′-O-甲基、2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧-2′-氟阿拉
伯糖(2′-deoxy-2′-fluoroarabino)(FANA)、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、无环或5-C-甲基核苷酸。在另
一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(siNA)分子的非核苷酸突出端部分包含
甘油基、脱碱基或反向的脱氧脱碱基非核苷酸。

[0048] 在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的突出端部分的核苷酸对应于包含siNA分子的靶多核苷酸序列的核苷酸。因此，在此种实施方案
中，包含本发明的siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于靶多核苷酸序列的序列，其中
包含本发明的siNA分子的引导链或反义链/区的突出端部分的核苷酸可以与靶多核苷酸
序列中的核苷酸互补，且包含本发明的siNA分子的过客链或有义链/区的突出端部分的核
苷酸可以包含靶多核苷酸序列中的核苷酸。此种核苷酸突出端包含可起因于天然dsRNA切
酶加工成siRNA的序列。

[0049] 在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的突出端部分的核苷酸与靶多核苷酸序列互补，并且任选如本文所描述的进行化学修饰。照这样，
在一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的引导链或反义链/区的突出端部分的核苷
酸可以与靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，即与siNA分子的引导链或反义链/区中的突
出端核苷酸的核苷酸位置互补的靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在另一个实施方
案中，包含本发明的siNA分子的过客链或有义链/区的突出端部分的核苷酸可以包含靶
多核苷酸序列中的核苷酸，即对应于siNA分子的过客链或有义链/区中的突出端核苷酸
的相同核苷酸位置的靶多核苷酸序列中的那些核苷酸位置。在一个实施方案中，突出端包
含与靶多核苷酸序列的部分互补的2个核苷酸(例如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；
3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；
3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)
突出端。在一个实施方案中，突出端包含不与靶多核苷酸序列的部分互补的2个核苷酸(例
如，3′-GA；3′-GU；3′-GG；3′GC；3′-CA；3′-CU；3′-CG；3′CC；3′-UA；3′-UU；
3′-UG；3′UC；3′-AA；3′-AU；3′-AG；3′-AC；3′-TA；3′-TU；3′-TG；3′-TC；
3′-AT；3′-UT；3′-GT；3′-CT)突出端。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突
出端核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脱氧-2′-氟
核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的突出端核苷酸在突出端核苷酸是嘌呤
核苷酸的情况下是2′-O-甲基核苷酸，和/或在突出端核苷酸是嘧啶核苷酸的情况下是
2′-脱氧-2′-氟核苷酸或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在另一个实施方案中，
本发明的siNA分子的突出端中的嘌呤核苷酸(存在时)是2′-O-甲基核苷酸。在另一个
实施方案中，本发明的siNA分子的突出端中的嘧啶核苷酸(存在时)是2′-脱氧-2′-氟
或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。

[0050] 在一个实施方案中，包含本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的突出端部分的核苷酸不与靶多核苷酸序列互补并且任选如本文所描述的进行化学修饰。在一个
实施方案中，突出端包含不与靶多核苷酸序列的部分互补的3′-UU突出端。在另一个实
施方案中，包含本发明的siNA分子的突出端部分的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱
氧-2′-氟阿拉伯糖和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸。

[0051] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子
(例如siNA)包含2或3核苷酸突出端，其中突出端中的核苷酸是相同或不同的，且其中突
出端中的一个或多个核苷酸在碱基、糖和/或磷酸主链处进行化学修饰。

[0052] 在一个实施方案中，本发明的特征在于对PCSK9靶核酸分子具有特异性的一个或多个化学修饰的siNA构建体，例如编码蛋白质的RNA或与PCSK9靶基因表达相关的非编
码RNA。在一个实施方案中，本发明的特征在于对核酸分子具有特异性的基于RNA的siNA
分子(例如，包含2′-OH核苷酸的siNA)，其包括本文描述的一个或多个化学修饰。此种
化学修饰的非限制性例子包括但不限于，硫代磷酸酯核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、
2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4’-硫代核糖核苷酸、2′-O-三
氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参
见例如于2004年11月5日提交的USSN 10/981,966，引入本文作为参考)、“通用碱基”核苷
酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖(FANA，参见例如Dowler
等人，2006，Nucleic Acids Research，34，1669-1675)和末端甘油基和/或反向的脱氧脱
碱基残基掺入。当在各种siNA构建体(例如，基于RNA的siNA构建体)中使用时，这些化
学修饰显示保持细胞中的RNAi活性，而同时急剧增加这些化合物的血清稳定性。

[0053] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的内部位置处包含本文描述的化学修饰(例如，2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、4′-硫代
核糖核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲
氧基-乙氧基核苷酸，LNA)。“内部位置”意指siNA双链体的碱基配对位置。在一个实施
方案中，本发明的siNA分子包含经修饰的核苷酸，同时维持介导RNAi的能力。经修饰的
核苷酸可以用于改善体外或体内特征，例如稳定性、活性、毒性、免疫应答和/或生物利用
率。例如，本发明的siNA分子可以包含作为siNA分子中存在的核苷酸总数目的百分比的
经修饰的核苷酸。照这样，本发明的siNA分子一般可以包含约5％-约100％经修饰的核
苷酸(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)。例如，在一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖修饰，例如2′-糖修饰，例如2′-O-甲基核苷酸、2′-脱
氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、2′-O-三
氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或
2′-脱氧核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约100％(例如，
约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、
80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸碱基修饰，例如
肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮(pyridin-4-one)、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基
尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-卤尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶
(例如6-甲基尿苷)或丙炔修饰。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中约5％-约
100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、
65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸主链修饰，例如具有本文的式I的主链修饰。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子中
约5％-约100％(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸)的核苷酸位置包含核酸糖、碱基、或主链修饰或其任何组合(例如，核酸糖、碱基、主链或本文的非核苷酸修饰的任何组合)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包含至少约20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％经修饰的核苷酸。给定siNA分子中存在的经修饰的核苷酸的实际百分比将依赖siNA中存在的核
苷酸总数目。如果siNA分子是单链的，那么百分比修饰可以基于单链siNA分子中存在的核
苷酸总数目。同样地，如果siNA分子是双链的，那么修饰百分比可以基于有义链、反义链、
或有义和反义链中存在的核苷酸总数目。

[0054] 本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以包含在核酸或多核苷酸分子内的各种位置处经修饰的核苷酸。在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如
siNA)分子包含在siNA双链体内的内部碱基配对位置处经修饰的核苷酸。例如，内部位置
可以包含来自21核苷酸siNA双链体的有义或反义链或区的5′-末端的约3个-约19个
核苷酸的位置，所述21核苷酸siNA双链体具有19个碱基对和2核苷酸的3′-突出端。
在另一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸分子包含在siNA分子的非碱基配对
或突出端区域处经修饰的核苷酸。“非碱基配对”意指核苷酸在核酸或多核苷酸分子的有义
链或有义区和反义链或反义区之间不是碱基配对的。突出端核苷酸可以与相应的靶多核苷
酸序列互补或碱基配对(参见例如图6C)。例如，突出端位置可以包含来自21核苷酸siNA
双链体的有义或反义链或区的5′-末端的约20个-约21个核苷酸的位置，所述21核苷
酸siNA双链体具有19个碱基对和2核苷酸3′-突出端。在另一个实施方案中，本发明
的双链核酸或多核苷酸分子包含在核酸或多核苷酸分子的末端位置处经修饰的核苷酸。例
如，此种末端区域包括核酸或多核苷酸分子的有义和/或反义链或区的3′-位置、5′-位
置、或3′和5′-位置。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸分子包含在
碱基配对或内部位置、非碱基配对或突出端区域、和/或末端区域、或其任何组合处经修饰
的核苷酸。

[0055] 本发明的一个方面的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子。在一个实施方案中，双链核酸或多核苷酸分子包含一
个或多个化学修饰且双链核酸或多核苷酸的每条链长度为约21个核苷酸。在一个实施方
案中，双链核酸或多核苷酸分子不包含任何核糖核苷酸。在另一个实施方案中，双链核酸或
多核苷酸分子包含一个或多个核糖核苷酸。在一个实施方案中，双链核酸或多核苷酸分子
的每条链独立地包含约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21
个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20
个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在一个实施方案中，双链核酸或多核苷酸分子的一条链包含与靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核
苷酸序列，且双链核酸或多核苷酸(例如，分子的第二条链包含基本上类似于靶基因的核
苷酸序列或其部分的核苷酸序列。

[0056] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含反义区，其中所述反义区包含与靶基
因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，和有义区，其中所述有义区包含基本上类似
于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，反义区和有义区独立
地包含约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23
个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述反义区包含与有义区
的核苷酸互补的约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、
22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。

[0057] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区包含
与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反
义区互补的核苷酸序列。

[0058] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含平端，即不包括任何突出端核苷酸的末端。例如，包含本文描述的修饰(例如，包含具有式I-VII的核
苷酸或包含“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab 36F”(表IV)或其任何组合的
siNA构建体)和/或本文描述的任何长度的siNA分子可以包含平端或无突出端核苷酸的
末端。

[0059] 在一个实施方案中，本发明的任何核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以包含一个或多个平端，即当平端不具有任何突出端核苷酸时。在一个实施方案中，平端的siNA分
子具有等于siNA分子的每条链中存在的核苷酸数目的许多碱基对。在另一个实施方案中，
siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的5′-末端和有义链的3′-末端不具有任何
突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的3′-末端
和有义链的5′-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含2个平
端，例如其中反义链的3′-末端和有义链的5′-末端以及反义链的5′-末端和有义链
的3′-末端不具有任何突出端核苷酸。平端的siNA分子可以包含例如约15个-约30个
核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)。平端的siNA分子中存在的其他核苷酸可以包含例
如，错配、凸起、环或摆动碱基对，以调节siNA分子介导RNA干扰的活性。

[0060] “平端”意指无突出端核苷酸的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的对称末端或末端。双链siNA分子的2条链在末端处不含突出端核苷酸彼此比对。例如，平端的siNA
构建体包含在siNA分子的有义和反义区之间互补的末端核苷酸。

[0061] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段
进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区。有义区可以经
由接头分子例如多核苷酸接头或非核苷酸接头与反义区进行连接。

[0062] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在维持或增强RNAi活性的位置处的核糖核苷酸。在一个实施方案中，核糖核苷酸存在于siNA分
子的有义链或有义区中，其通过允许经由RISC内的酶切割有义链或有义区可以提供RNAi
活性(例如，存在于过客链、有义链、或有义区切割位置处的核糖核苷酸，例如19碱基对双
链体的过客链的位置9，其通过AGO2酶在RISC中进行切割，参见例如Matranga等人，2005，
Cell，123：1-114和Rand等人，2005，Cell，123：621-629)。在另一个实施方案中，siNA分子的引导链或引导区(也称为反义链或反义区)的5′-末端处的一个或多个(例如1个、
2个、3个、4个或5个)核苷酸是核糖核苷酸。

[0063] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在过客链或过客区(也称为有义链或有义区)内的位置处的一个或多个核糖核苷酸，其允许通过
RISC复合物中的酶切割过客链或过客区(例如存在于过客链的位置例如19碱基对双链体
的过客链的位置9处的核糖核苷酸通过AGO2酶在RISC中进行切割，参见例如Matranga等
人，2005，Cell，123：1-114和Rand等人，2005，Cell，123：621-629)。

[0064] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含可以相同或不同的至少2个、3个、4个、5个或更多化学修饰。在另一个实施方案中，本发明的siNA分
子包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同的化学修饰。

[0065] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子是双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)，其中所述双链核酸分子包含约15个-约30个(例如约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA分子的每条链中的一个或多个(例如，至少1个、2个、
3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸位置包含化学修饰。在另一个实施方案中，siNA包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同
的化学修饰。

[0066] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA分子包含约15个-约30个(例
如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA分子的每条链包含一个或多个化学修饰。在一
个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)
不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。在另一个实施方案中，双链siNA
分子的一条链包含与靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且双链siNA分子
的第二条链包含基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序列。在另一个实施
方案中，双链siNA分子的一条链包含与靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，
且双链siNA分子的第二条链包含基本上类似于靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序
列。在另一个实施方案中，siNA分子的每条链包含约15个-约30个(例如约15个、16个、
17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，且每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约15个-约30个(例如约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或
30个)核苷酸。靶基因可以包含例如，在本文中提及或引入本文作为参考的序列。靶基因
可以包含例如在本文中通过Genbank登记号提及的序列。

[0067] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的每条链包含不同模式的化学修饰，例如本文的任何“Stab 00”-“Stab 36”或“Stab 3F”-“Stab
36F”(表IV)修饰模式或其任何组合(参见表IV)。具有各种修饰模式的此种siNA分子的
有义和反义链的非限制性例子显示于表III以及图4和5中。

[0068] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子不包含核糖核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含一个或多个核糖核苷酸(例如，1个、2
个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核糖核苷酸)。

[0069] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含反义区，所述反义区包含与PCSK9靶基因的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且siNA进一步包
含有义区，所述有义区包含基本上类似于PCSK9靶基因的核苷酸序列或其部分的核苷酸序
列。在另一个实施方案中，反义区和有义区各自包含约15个-约30个(例如约15个、16
个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，且反义区包含与有义区的核苷酸互补的至少约15个-约30个(例如约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或
30个)核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3
个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。PCSK9靶基
因可以包含例如在本文中提及或引入本文作为参考的序列。在另一个实施方案中，siNA是
双链核酸分子，其中siNA分子的2条链各自独立地包含约15个-约40个(例如约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸，且其中siNA分子的一条链包含与PCSK9靶基因的核苷酸序列或其部分互补的至少约15个(例如约15
个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个或更多)核苷酸。

[0070] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与由PCSK9靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核
苷酸序列，且所述有义区包含与反义区互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，siNA分子
由2个分开的寡核苷酸片段进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分
子的反义区。在另一个实施方案中，有义区可以经由接头分子与反义区进行连接。在另一
个实施方案中，有义区经由接头分子例如核苷酸或非核苷酸接头与反义区进行连接。在一
个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)
不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。PCSK9靶基因可以包含例如在本
文中提及或引入本文作为参考的序列。

[0071] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰(例如，其中siNA
的一个或多个或所有嘧啶(例如，U或C)位置被2′-脱氧-2′-氟核苷酸修饰)。在一
个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-脱
氧-2′-氟嘧啶修饰存在于反义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟嘧啶修饰
存在于siNA分子的有义链和反义链中。

[0072] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-O-甲基嘌呤修饰(例如，其中siNA的一个
或多个或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-O-甲基核苷酸修饰)。在一个实施方案中，
2′-O-甲基嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-O-甲基嘌呤修饰存在于
反义链中。在一个实施方案中，2′-O-甲基嘌呤修饰存在于siNA分子的有义链和反义链
中。

[0073] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、
16个、17个、18个、19个、20个或更多)2′-脱氧嘌呤修饰(例如，其中siNA的一个或多
个或所有嘌呤(例如，A或G)位置被2′-脱氧核苷酸修饰)。在一个实施方案中，2′-脱
氧嘌呤修饰存在于有义链中。在一个实施方案中，2′-脱氧嘌呤修饰存在于反义链中。在
一个实施方案中，2′-脱氧嘌呤修饰存在于siNA分子的有义链和反义链中。

[0074] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导PCSK9靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区
包含与由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含
与反义区互补的核苷酸序列，且其中所述siNA分子具有一个或多个经修饰的嘧啶和/或嘌
呤核苷酸。在一个实施方案中，双链siNA分子的每条链包含至少2个(例如，2个、3个、4
个、5个或更多)不同的化学修饰，例如不同的核苷酸糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案
中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸或2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，
且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义区中的
嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲
基嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶
核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，反
义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义区中存在的嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基或2′-脱氧嘌呤核苷酸。在上述siNA分子中的任何一种的另一个实施方案
中，有义链的非互补区(例如，突出端区域)中存在的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0075] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段
进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区，且其中包含有
义区的片段包括在片段的5′-末端、3′-末端或5′-末端和3′-末端处的末端帽部
分。在一个实施方案中，末端帽部分是反向的脱氧脱碱基部分或甘油基部分。在一个实施
方案中，siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约30个(例如约15个、16个、17
个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在另一个实施方案中，siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约40个(例
如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸。
在非限制性例子中，siNA分子的2个片段各自包含约21个核苷酸。

[0076] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含至少一个经修饰的核苷酸的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸、
2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷
酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN 10/981,966中描述的任何其他
经修饰的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11月5日提交，引入本文作为
参考。在一个实施方案中，本发明的特征在于包含至少2个(例如，2个、3个、4个、5个、6
个、7个、8个、9个、10个或更多)经修饰的核苷酸的siNA分子，其中所述经修饰的核苷酸
选自2′-脱氧-2′-氟核苷酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基核苷酸、
2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或本文和USSN
10/981,966中描述的任何其他经修饰的核苷/核苷酸，所述USSN 10/981,966于2004年11
月5日提交，引入本文作为参考。经修饰的核苷酸/核苷可以是相同或不同的。siNA可以是
例如长度约15个-约40个核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是
2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，siNA
中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷或2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷
酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷
和至少一个2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷
核苷酸是2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核
苷酸是2′-脱氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷
酸是2′-脱氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸
是2′-脱氧-2′-氟鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，
例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特异性
选择的对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0077] 在一个实施方案中，本发明的特征在于增加核酸或多核苷酸(例如siNA)分子针对经由核糖核酸酶的切割的稳定性的方法，所述方法包括将至少一种经修饰的核苷酸引入
siNA分子内，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，
siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，siNA
中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷或2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷
酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟胞苷
和至少一个2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷
核苷酸是2′-脱氧-2′-氟尿苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核
苷酸是2′-脱氧-2′-氟胞苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷
酸是2′-脱氧-2′-氟腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸
是2′-脱氧-2′-氟鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，
例如硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟核苷酸存在于siNA中特异性
选择的对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0078] 在一个实施方案中，本发明的特征在于增加核酸或多核苷酸(例如siNA)分子针对经由核糖核酸酶的切割的稳定性的方法，所述方法包括将至少一种经修饰的核苷酸引入
siNA分子内，其中所述经修饰的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸。在一个实
施方案中，siNA中存在的所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖嘧啶核苷酸。在
一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷酸包括至少一个2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷
或2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在另一个实施方案中，siNA中经修饰的核苷
酸包括至少一个2′-氟胞苷和至少一个2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。在一
个实施方案中，siNA中存在的所有尿苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖尿苷核苷酸。
在一个实施方案中，siNA中存在的所有胞苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖胞苷核
苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有腺苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖
腺苷核苷酸。在一个实施方案中，siNA中存在的所有鸟苷核苷酸是2′-脱氧-2′-氟阿
拉伯糖鸟苷核苷酸。siNA可以进一步包含至少一个经修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯
键。在一个实施方案中，2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖核苷酸存在于siNA中特异性选择的
对经由核糖核酸酶的切割敏感的位置处，例如具有嘧啶核苷酸的位置。

[0079] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含有义区和反义区，其中所述反义区包含与
由靶基因编码的RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且所述有义区包含与反义
区互补的核苷酸序列，且其中所述反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧-嘌呤核苷
酸。在一个可替代的实施方案中，反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-O-甲基嘌呤核苷
酸。在上述实施方案的任何一个中，反义区可以包含在反义区的3′末端处的硫代磷酸酯核
苷酸间键。可替代地，在上述实施方案的任何一个中，反义区可以包含在反义区的3′末端
处的甘油基修饰。在上述siNA分子中的任何一种的另一个实施方案中，反义链的非互补区
(例如，突出端区域)中存在的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0080] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的反义区包含与内源性转录物的部分互补的序列，所述内源性转录物具有对受试者或生物中的特定疾病或
性状相关的等位基因独特的序列，例如包含与疾病或性状特异性等位基因相关的单核苷酸
多态性(SNP)的序列。照这样，本发明的siNA分子的反义区可以包含与对特定等位基因独
特的序列互补的序列，以提供介导针对疾病、状况或性状相关的等位基因的选择性RNAi中
的特异性。

[0081] 在一个实施方案中，本发明的特征在于下调靶基因表达或指导靶RNA切割的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA分子由2个分开的寡核苷酸片段
进行装配，其中一个片段包含有义区且第二个片段包含siNA分子的反义区。在一个实施方
案中，双链siNA分子的每条链长度为约21个核苷酸，其中siNA分子的每个片段的约19个
核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，其中siNA分子的每个片段的至
少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一个片段的核苷酸不是碱基配对的。在另一个实施
方案中，siNA分子是双链核酸分子，其中每条链长度为约19个核苷酸，且其中siNA分子的
每个片段的核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，以形成至少约15个
(例如，15个、16个、17个、18个或19个)碱基对，其中所述siNA分子的1个或2个末端
是平端。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱
氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脱氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个
3′末端核苷酸各自是2′-O-甲基嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另
一个实施方案中，siNA分子的每个片段的所有核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核
苷酸碱基配对。在另一个实施方案中，siNA分子是具有有义区和反义区的约19个-约25
个碱基对的双链核酸分子，其中所述反义区的约19个核苷酸与由靶基因编码的RNA的核苷
酸序列或其部分碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约21个核苷酸与由靶基因编码
的RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在上述实施方案的任何一个中，包含所述反义区
的片段的5′-末端可以任选包括磷酸基。

[0082] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制靶RNA序列表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA分子不包含任何核糖核苷酸，且其中所述双链
siNA分子的每条链为约15个-约30个核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子长度为21
个核苷酸。包含非核糖核苷酸的siNA构建体的例子是有义/反义化学的任何组合的表IV
中所示的稳定化学的组合，例如Stab 7/8、Stab 7/11、Stab 8/8、Stab 18/8、Stab 18/11、Stab 12/13、Stab 7/13、Stab 18/13、Stab 7/19、Stab 8/19、Stab 18/19、Stab 7/20、Stab
8/20、Stab 18/20、Stab 7/32、Stab 8/32或Stab 18/32(例如，具有Stab 7、8、11、12、13、
14、15、17、18、19、20或32有义或反义链或其任何组合的任何siNA)。在本文中，数字Stab化学可以包括如表IV中所示化学的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab
7/8和Stab 7F/8F等。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰指导靶RNA切割
的化学合成的双链RNA分子，其中所述RNA分子的每条链长度为约15个-约30个核苷酸；
RNA分子的一条链包含与靶RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于RNA分子经由RNA干
扰指导靶RNA切割；且其中所述RNA分子的至少一条链任选包含本文描述的一个或多个化
学修饰的核苷酸，例如但不限于，脱氧核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷
酸、2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖、2′-O-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三
氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸等或
其任何组合。

[0083] 在一个实施方案中，本发明的靶RNA包含编码蛋白质的序列。

[0084] 在一个实施方案中，本发明的靶RNA包含非编码RNA序列(例如，miRNA、snRNA、siRNA等)，参见例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528；Claverie，2005，Science，
309，1529-1530；Sethupathy等人，2006，RNA，12，192-197；和Czech，2006 NEJM，354，11：
1194-1195。

[0085] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的药物。

[0086] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的siNA分子的活性成分。

[0087] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子抑制、下调或减少靶基因表达的用途，其中所述siNA分子包含一个或多个化学修饰，
且双链siNA的每条链的长度独立地为约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17
个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siNA分子是包含一个或多个化学修饰的双链核
酸分子，其中所述siNA分子的2个片段各自独立地包含约15个-约40个(例如约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、
30个、31个、23个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)核苷酸，且其中一条链包含与由靶编码RNA的核苷酸序列或其部分互补的至少15个核苷酸。在一个非限制
性的例子中，siNA分子的2个片段各自包含约21个核苷酸。在另一个实施方案中，siNA分
子是包含一个或多个化学修饰的双链核酸分子，其中每条链长度为约21个核苷酸，且其中
siNA分子的每个片段的约19个核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，
其中siNA分子的每个片段的至少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一个片段的核苷酸
不是碱基配对的。在另一个实施方案中，siNA分子是包含一个或多个化学修饰的双链核酸
分子，其中每条链长度为约19个核苷酸，且其中siNA分子的每个片段的核苷酸与siNA分
子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对，以形成至少约15个(例如，15个、16个、17个、18
个或19个)碱基对，其中所述siNA分子的1个或2个末端是平端。在一个实施方案中，
siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱氧-嘧啶核苷酸，例如2′-脱
氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸是2′-O-甲基
嘧啶核苷酸，例如2′-O-甲基尿苷、胞苷或胸苷。在另一个实施方案中，siNA分子的每个
片段的所有核苷酸与siNA分子的另一个片段的互补核苷酸碱基配对。在另一个实施方案
中，siNA分子是具有有义区和反义区且包含一个或多个化学修饰的约19个-约25个碱基
对的双链核酸分子，其中所述反义区的约19个核苷酸与由靶编码的RNA的核苷酸序列或其
部分碱基配对。在另一个实施方案中，反义区的约21个核苷酸与由靶编码的RNA的核苷酸
序列或其部分碱基配对。在上述实施方案的任何一个中，包含所述反义区的片段的5′-末
端可以任选包括磷酸基。

[0088] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制、下调或减少靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的用途，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，
所述反义链包含与靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，
所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具
有至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰，所述化学修饰可以是相同或不
同的，例如核苷酸、糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多
数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸
包含糖修饰。

[0089] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制、下调或减少靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反
义链包含与靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，其中另一条链是有义链，所
述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有
至少2个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰，所述化学修饰可以是相同或不同
的，例如核苷酸、糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数
嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包
含糖修饰。

[0090] 在一个实施方案中，本发明的特征在于在于抑制、下调或减少靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所
述反义链包含与编码蛋白质的靶RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链
是有义链，所述有义链包含与反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且其中双链siNA分
子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，siNA分子的每条链包含约
15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸，其中每条链包含与另一条
链的核苷酸互补的至少约15个核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子由2个寡核苷酸片
段进行装配，其中一个片段包含siNA分子的反义链的核苷酸序列，且第二个片段包含siNA
分子的有义区的核苷酸序列。在一个实施方案中，有义链经由接头分子例如多核苷酸接头
或非核苷酸接头与反义链进行连接。在进一步的实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸
是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-脱氧-嘌呤核
苷酸。在另一个实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷
酸，且有义区中存在的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另外一个实施方案中，反
义链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的任何嘌呤
核苷酸是2′-脱氧-嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，反义链包含一个或多个2′-脱
氧-2′-氟嘧啶核苷酸和一个或多个2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，反义
链中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的任何嘌呤核
苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在进一步的实施方案中，有义链包含3′-末端和5′-末
端，其中末端帽部分(例如，反向的脱氧脱碱基部分或反向的脱氧核苷酸部分例如反向的
胸苷)存在于有义链的5′-末端、3′-末端、或5′和3′末端处。在另一个实施方案中，
反义链在反义链的3′末端处包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方案中，反义链
包含在3′末端处的甘油基修饰。在另一个实施方案中，反义链的5′-末端任选包含磷酸
基。

[0091] 在抑制、下调或减少靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的上述实施方案的任何一个中，其中所述双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含
糖修饰，siNA分子的2条链各自可以包含约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、
17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，siNA分子的每条链的约15个-约30个或更多(例
如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对。在另一
个实施方案中，siNA分子的每条链的约15个-约30个或更多(例如约15个、16个、17个、
18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更
多)核苷酸与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱基配对，其中siNA分子的每条链的至
少2个3′末端核苷酸与siNA分子的另一条链的核苷酸不是碱基配对的。在另一个实施方
案中，siNA分子的每个片段的2个3′末端核苷酸各自是2′-脱氧-嘧啶，例如2′-脱
氧-胸苷。在一个实施方案中，siNA分子的每条链与siNA分子的另一条链的互补核苷酸碱
基配对。在一个实施方案中，反义链的15个-约30个(例如约15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸与靶RNA的核苷酸序列或其部分碱基配对。在一个实施方案中，反义链的约18个-约25个(例
如约18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸与靶RNA的核苷酸序列
或其部分碱基配对。

[0092] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与靶
RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义
链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，每条链具有至少2个(例如，2个、
3个、4个、5个或更多)不同的化学修饰，例如核苷酸糖、碱基或主链修饰。在一个实施方案
中，双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，双链siNA
分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包含糖修饰。在一个实施方案中，反义链的5′-末端任选
包括磷酸基。

[0093] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与靶
RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，另一条链是有义链，所述有义链包含与反义
链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且其中双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包
含糖修饰，且其中反义链的核苷酸序列或其部分与靶RNA的非翻译区的核苷酸序列或其部
分互补。

[0094] 在一个实施方案中，本发明的特征在于抑制靶基因表达的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述双链siNA分子的一条链是反义链，所述反义链包含与靶
RNA的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，其中另一条链是有义链，所述有义链包含与
反义链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸
包含糖修饰，且其中反义链的核苷酸序列与靶RNA的核苷酸序列或存在于靶RNA中的其部
分互补。

[0095] 在一个实施方案中，本发明的特征在于在药学上可接受的载体或稀释剂中包含本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的组合物。在另一个实施方案中，本发明的特征
在于在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明的2种或更多不同的siNA分子(例如，靶
向靶RNA的不同区域的siNA分子或靶向RNA和细胞靶的siNA分子)。

[0096] 在非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸引入核酸或多核苷酸(例如siNA)分子内提供了克服外源递送的天然RNA分子固有的体内稳定性和生物利用率的潜在局限性中
的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可以使得对于给定疗效较低剂量的特定核
酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中倾向于具有较长的半衰期。此外，通过
靶向特定细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核酸分子的
生物利用率。因此，即使与天然核酸分子相比较，例如，当与全RNA核酸分子相比较时，化学修饰的核酸分子的活性减少，由于分子改善的稳定性和/或递送，经修饰的核酸分子的总
体活性也可以大于天然分子的那种。与天然未修饰的siNA不同，化学修饰的siNA也可以使
在人中激活干扰素活性或免疫刺激的可能性降到最低。这些性质因此对天然siRNA或最低
限度修饰的siRNA在各种体外和体内背景中介导RNAi的能力，包括研究和治疗应用中的用
途加以改进。申请人在本文中描述了与相应的未修饰或最低限度修饰的siNA分子相比较，
具有改善的RNAi活性的化学修饰的siNA分子。本文公开的化学修饰的siNA基序提供了
维持基本上类似于未修饰的或最低限度修饰的活性siNA的RNAi活性(参见例如Elbashir
等人，2001，EMBO J.，20：6877-6888)，同时提供适合于在治疗应用中使用的核酸酶抗性和药物代谢动力学(pharmacoketic)性质的能力。

[0097] 在本文描述的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的任何一个实施方案中，本发明的siNA分子的反义区可以包含在所述反义区3′-末端处的硫代磷酸酯核苷酸间键。在本
文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，反义区可以包含在所述反义区的5′-末端处
的约1个-约5个硫代磷酸酯核苷酸间键。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案
中，本发明的siNA分子的3′-末端核苷酸突出端可以包含在核酸糖、碱基或主链处进行化
学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在本文描述的siNA分子的任何一个实施方案中，
3′-末端核苷酸突出端可以包含一个或多个通用碱基核糖核苷酸。在本文描述的siNA分
子的任何一个实施方案中，3′-末端核苷酸突出端可以包含一个或多个无环核苷酸。

[0098] 本发明的一个实施方案提供了以允许核酸分子表达的方式包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码本发明的至少一种多核苷酸(例如siNA)分子。本发明的另一个
实施方案提供了包含此种表达载体的哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是人细胞。表达载
体的siNA分子可以包含有义区和反义区。反义区可以包含与编码靶的RNA或DNA序列互
补的序列，且有义区可以包含与反义区互补的序列。siNA分子可以包含具有互补的有义和
反义区的2条不同的链。siNA分子可以包含具有互补的有义和反义区的单链。

[0099] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述化学修饰包
含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)核苷酸，所述核苷酸包含具有式I的主链修饰的核苷酸间键：

[0100]

[0101] 其中每个R1和R2独立地是任何核苷酸、非核苷酸、或多核苷酸，其可以是天然存在的或化学修饰的，并且其可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点，每
个X和Y独立地是O、S、N、烷基或取代烷基，每个Z和W独立地是O、S、N、烷基、取代烷基、
O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基或乙酰基，且其中W、X、Y和Z任选地不全是O。在另一个
实施方案中，本发明的主链修饰包含膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸间键(参见
例如Sheehan等人，2003，Nucleic Acids Research，31，4109-4118)。

[0102] 具有式I，例如其中任何Z、W、X和/或Y独立地包含硫原子的化学修饰的核苷酸间键，可以存在于核酸或多核苷酸(例如siNA)双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义
链、反义链或2条链中。本发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末
端、5′-末端、或3′和5′-末端处具有式I的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4
个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)化学修饰的核苷酸间键。例如，本发明的示例
性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处具有式I的约1个-约5
个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸间键。在另一个
非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中含有具
有式I的化学修饰的核苷酸间键的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、
7个、8个、9个、10个或更多)嘧啶核苷酸。在另外一个非限制性例子中，本发明的示例性
siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中含有具有式I的化学修饰的核苷酸间键的
一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘌呤核苷酸。在另一个实施方案中，具有式I的一个或多个核苷酸间键的本发明的siNA分子也包
含具有式I-VII中任何一个的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。

[0103] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述化学修饰包
含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)具有式II的核苷酸或非核苷酸：

[0104]

[0105] 其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基(polyalklylamino)、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何
一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9
是O、S、CH2、S＝O、CHF或CF2，且B是核苷(nucleosidic)碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧
啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的碱基，或非核苷碱基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲
哚、水粉蕈素、羟基吡啶、吡啶酮、或可以与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的
通用碱基。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述
或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于
细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP
编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，
例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。在一个实施方案中，本发明的具有式II的核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，
本发明的具有式II的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的具有式
II的核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0106] 式II的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可
以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处的式II
的一个或多个化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可以包含在
有义链、反义链或2条链的5′-末端处的式II的约1个-约5个或更多(例如，约1个、
2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。在另一个非限制性例子中，本
发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端处的式II的约1
个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核
苷酸。

[0107] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述化学修饰包
含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)具有式III的核苷酸或非核苷酸：

[0108]

[0109] 其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、
S＝O、CHF或CF2，且B是核苷碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、2-氨基腺苷、5-甲基胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、或可以利用的与靶RNA互补或非互补的任何其他非
天然存在的碱基，或非核苷碱基例如苯基、萘基、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、水粉蕈素、羟基吡啶、吡啶酮、或可以与靶RNA互补或非互补的任何其他非天然存在的通用碱基。在一个实
施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已
知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例
如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核
酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；
磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

[0110] 式III的化学修饰的核苷酸或非核苷酸可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子
可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处的式
III的一个或多个化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，本发明的示例性siNA分子可以包
含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处的式III的约1个-约5个或更多(例如，约
1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸或非核苷酸。在另一个非限制性例子
中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端处的式III
的约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)化学修饰的核苷酸
或非核苷酸。

[0111] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有式II或III的核苷酸，其中具有式II或III的核苷酸是反向构型。例如，具有式II或III的核
苷酸以3′-3′、3′-2′、2′-3′或5′-5′的构型例如在1条或2条siNA链的3′-末
端、5′-末端、或3′和5′-末端处与siNA构建体进行连接。

[0112] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述化学修饰包
含具有式IV的5′-末端磷酸基：

[0113]

[0114] 其中每个X和Y独立地是O、S、N、烷基、取代烷基或烷基卤；其中每个Z和W独立地是O、S、N、烷基、取代烷基、O-烷基、S-烷基、烷芳基、芳烷基、烷基卤或乙酰基；且其中W、X、Y和Z任选地不全是O且Y充当与siNA分子附着的点。

[0115] 在一个实施方案中，本发明的特征在于在靶互补链上带有具有式IV的5′-末端磷酸基的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，例如与靶RNA互补的链，其中所述siNA分子
包含全RNA siNA分子。在另一个实施方案中，本发明的特征在于在靶互补链上带有具有式
IV的5′-末端磷酸基的siNA分子，其中所述siNA分子还包含在1条或2条链的3′-末
端上具有约1个-约4个(例如，约1个、2个、3个或4个)脱氧核糖核苷酸的约1个-约
3个(例如，约1个、2个或3个)核苷酸3′-末端核苷酸突出端。在另一个实施方案中，
具有式IV的5′-末端磷酸基存在于本发明的siNA分子的靶互补链上，例如带有具有式
I-VII中任何一个的化学修饰的siNA分子。

[0116] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述化学修饰包
含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，在非限制性例子中，本发明的特征在于在1条
siNA链中具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键的
化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)。在另外一个实施方案中，本发明的特征在
于在2条siNA链中独立地具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多硫代磷酸
酯核苷酸间键的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)。硫代磷酸酯核苷酸间键
可以存在于siNA双链体的1条或2条寡核苷酸链中，例如有义链、反义链或2条链中。本
发明的siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′-和
5′-末端处的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，本发明的示例性siNA分子可以包
含在有义链、反义链或2条链的5′-末端处约1个-约5个或更多(例如，约1个、2个、
3个、4个、5个或更多)连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个非限制性例子中，本发明
的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中的一个或多个(例如，约1个、2
个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间键。在另
外一个非限制性例子中，本发明的示例性siNA分子可以包含在有义链、反义链或2条链中
的一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间键。

[0117] 双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的每条链可以具有一个或多个化学修饰，从而使得每条链包含不同模式的化学修饰。本文提供了可以产生不同修饰模式的修饰方案
的几个非限制性例子。

[0118] 在一个实施方案中，本发明的特征在于核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中有义链包含一个或多个，例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、
8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、
2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或约一个或多个(例如，约1
个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链
包含约1个-约10个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10
个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6
个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或
多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修
饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端
帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、
3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/
或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的一个
或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

[0119] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中有义链包含约1个-约5个，具体地约1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键，
和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、
2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙
氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个或更多)通用碱基
修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端
帽分子；且其中反义链包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更
多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7
个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲
基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个
(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。
在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、
5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟
甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱
氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的约1个-约5个
或更多，例如约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、
5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

[0120] 在一个实施方案中，本发明的特征在于核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中反义链包含一个或多个，例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或约一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、
7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟
甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基和/或一个或多个(例如，
约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中
反义链包含约1个-约10个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、
9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4
个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和
/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通
用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处
的末端帽分子。在另一个实施方案中，有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲
基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代
和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的
一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。

[0121] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中反义链包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯
核苷酸间键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、
10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1
个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子；且其中反义链
包含约1个-约5个或更多，具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间
键，和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或一个或多个(例如，约1个、2个、3
个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)通用碱基修饰的核苷酸，和任选地在反义链的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处的末端帽分子。在另一个实施方案中，
有义和/或反义siNA链的一个或多个，例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9
个、10个或更多嘧啶核苷酸由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三
氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、4′-硫代和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行
化学修饰，包括或不包括存在于相同或不同链中的约1个-约5个，例如约1个、2个、3个、
4个、5个或更多硫代磷酸酯核苷酸间键和/或3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末
端处的末端帽分子。

[0122] 在一个实施方案中，本发明的特征在于在siNA分子的每条链中具有约1个-约5个或更多(具体地约1个、2个、3个、4个、5个或更多)硫代磷酸酯核苷酸间键的化学修饰
的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子。

[0123] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含2′-5′核苷酸间键的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子。一个或多个2′-5′核苷酸间键可以在1条或2条siNA序列链
的3′-末端、5′-末端、或3′-和5′-末端处。此外，一个或多个2′-5′核苷酸间键
可以存在于1条或2条siNA序列链的各种其他位置处，例如，包括siNA分子的1条或2条
链中的嘧啶核苷酸的每个核苷酸间键的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、
10个或更多可以包括2′-5′核苷酸间键，或包括siNA分子的1条或2条链中的嘌呤核苷
酸的每个核苷酸间键的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多可以包括2′-5′核苷酸间键。

[0124] 在另一个实施方案中，本发明的化学修饰的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有2条链的双链体，其中的1条或2条链可以是化学修饰的，其中每条链的长度单独地
是约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24
个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述双链体具有约15个-约30
个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、
27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个的
结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有2条链的双链体，其中的1条
或2条链可以是由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中
每条链由约21个核苷酸组成，各自具有2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端，且其中所述双
链体具有约19个碱基对。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子包含单链发夹结构，其
中所述siNA长度为约36个-约70个(例如，约36个、40个、45个、50个、55个、60个、65
个或70个)核苷酸，具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20
个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA可以包括包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构的化学修饰。例如，本发
明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约42个-约50个(例如，约42个、43个、44个、
45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何
一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中所述线性寡核苷酸形成具有约19个-约
21个(例如，19个、20个或21个)碱基对和2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端的发夹结
构。在另一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子包含茎环基序，其中所述siNA分子
的环部分是生物可降解的。例如，本发明的线性发夹siNA分子被这样设计，从而使得siNA
分子的环部分在体内降解可以产生具有3′-末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2
个核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。

[0125] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含发夹结构，其中所述siNA长度为约25个-约50个(例如，约25个、26个、27个、28个、29个、30个、
31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸，具有约3个-约25个(例如，约3个、4个、5
个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学
修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示
例性化学修饰的siNA分子包含具有约25个-约35个(例如，约25个、26个、27个、28个、
29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII
中任何一个或其任何组合的一个或多个化学修饰进行化学修饰，其中所述线性寡核苷酸形
成具有约3个-约25个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13
个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对和可以如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸基(例如具有式IV的5′-末端磷
酸基)的发夹结构。在另一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA分子包含茎环基序，其
中所述siNA分子的环部分是生物可降解的。在一个实施方案中，本发明的线性发夹siNA
分子包含含有非核苷酸接头的环部分。

[0126] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含不对称的发夹结构，其中所述siNA长度为约25个-约50个(例如，约25个、26个、27个、28个、29
个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸，具有约3个-约25个(例如，
约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、
18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对，且其中所述siNA可以包括一
个或多个化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例
如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约25个-约35个(例如，约25个、26
个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或35个)核苷酸的线性寡核苷酸，其由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的一个或多个化学修饰进行化学修饰，其中所述
线性寡核苷酸形成具有约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10
个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对和可以如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸基(例如具有式
IV的5′-末端磷酸基)的不对称的发夹结构。在一个实施方案中，本发明的不对称的发
夹siNA分子包含茎环基序，其中所述siNA分子的环部分是生物可降解的。在另一个实施
方案中，本发明的不对称的发夹siNA分子包含含有非核苷酸接头的环部分。

[0127] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有分开的多核苷酸链的不对称的双链结构，所述多核苷酸链包含有义和反义区，其中所述反义区
长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸，其中所述有义区长度为约3
个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14
个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸，其中所述有义区和反义区具有至少3个互补核苷酸，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学
修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。例如，本发明的示
例性化学修饰的siNA分子包含具有分开的多核苷酸链的不对称的双链结构，所述多核苷
酸链包含有义和反义区，其中所述反义区长度为约18个-约23个(例如，约18个、19个、
20个、21个、22个或23个)核苷酸，且其中所述有义区长度为约3个-约15个(例如，约
3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)核苷酸，其中所述有义区反义区具有至少3个互补核苷酸，且其中所述siNA可以包括一个或多个化学修
饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组合的结构。在另一个实施方案
中，不对称的双链siNA分子还可以具有可如本文所描述的进行化学修饰的5′-末端磷酸
基(例如具有式IV的5′-末端磷酸基)。

[0128] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含环状核酸分子，其中所述siNA长度为约38个-约70个(例如，约38个、40个、45个、50个、55个、
60个、65个或70个)核苷酸，具有约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)碱基对，且其中所述siNA可以包括化学修饰，所述化学修饰包含具有式I-VII中任何一个或其任何组
合的结构。例如，本发明的示例性化学修饰的siNA分子包含具有约42个-约50个(例如，
约42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸的环状寡核苷酸，其
由具有式I-VII中任何一个或其任何组合的化学修饰进行化学修饰，其中所述环状寡核苷
酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃形结构。

[0129] 在另一个实施方案中，本发明的环状核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含2个环基序，其中所述siNA分子的1个或2个环部分是生物可降解的。例如，本发明的环状siNA
分子被这样设计，从而使得siNA分子的环部分在体内降解可以产生具有3′-末端突出端
的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3′-末端核苷酸突出端。

[0130] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)脱碱基部分，例如具有式V的化合物：

[0131]

[0132] 其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R13各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S
＝O、CHF或CF2。在一个实施方案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文
所描述或本领域其他方面已知的核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包
括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细
胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚
合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

[0133] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)反向的脱碱基部分，例如具有式VI的化合物：

[0134]

[0135] 其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12和R13各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点；R9是O、S、CH2、S
＝O、CHF或CF2，且R2、R3、R8或R13充当与本发明的siNA分子附着的点。在一个实施方
案中，R3和/或R7包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的
核苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生
自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；
维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；
胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

[0136] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含至少一个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)取代的聚烷基部分，例如具有式VII的化合物：

[0137]

[0138] 其中每个n独立地是1-12的整数，R1、R2和R3各自独立地是H、OH、烷基、取代烷基、烷芳基或芳烷基、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCH3、OCN、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-链烯基、S-链烯基、N-链烯基、SO-烷基、烷基-OSH、烷基-OH、O-烷基-OH、O-烷基-SH、S-烷
基-OH、S-烷基-SH、烷基-S-烷基、烷基-O-烷基、ONO2、NO2、N3、NH2、氨烷基、氨基酸、氨酰基、ONH2、O-氨烷基、O-氨基酸、O-氨酰基、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基，或具有式I、II、III、IV、V、VI和/或VII中的任何一个的基团，其中任何一个可以包括在siNA分子的结构中或充当与siNA分子附着的点。在一个实施方案
中，R3和/或R1包含缀合物部分和接头(例如，如本文所描述或本领域其他方面已知的核
苷酸或非核苷酸接头)。缀合物部分的非限制性例子包括关于细胞受体的配体，例如衍生
自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；
维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；
胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。

[0139] “ZIP编码”序列意指涉及细胞拓扑(topogenic)信号传导介导的转运的任何肽或蛋白质序列(参见例如Ray等人，2004，Science，306(1501)：1505)。

[0140] 双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子内的每个核苷酸可以独立地具有包含式I-VII中任何一个的结构的化学修饰。因此，在一个实施方案中，本发明的siNA分子的一个
或多个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修
饰。在一个实施方案中，本发明的siNA分子的每个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一
个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。

[0141] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的1条或2条链的一个或多个核苷酸位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的
任何其他修饰。在一个实施方案中，本发明的双链siNA分子的1条或2条链的每个核苷酸
位置包含具有式I-VII中任何一个的结构的化学修饰或本文的任何其他修饰。

[0142] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于具有式VII的化合物，其中R1和R2是羟基(OH)，n＝1，且R3包含O且是与本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的1条
或2条链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端或者与本发明的单链siNA分子附着
的点。这种修饰在本文中称为“甘油基”(例如，图10中的修饰6)。

[0143] 在另一个实施方案中，本发明的化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII中任何一个的部分)在本发明的siNA分子的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末
端处。例如，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI或VII的部分)可以存在于核
酸或多核苷酸(例如siNA)分子的反义链、有义链、或反义和有义链的3′-末端、5′-末
端、或3′和5′-末端处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、
VI或VII的部分)存在于本发明的双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及
反义链的3′-末端处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有式V、VI
或VII的部分)存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端以及反义
链的3′-末端的末端位置处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷(例如，具有
式V、VI或VII的部分)存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和3′-末端
以及反义链的3′-末端的2个末端位置处。在一个实施方案中，化学修饰的核苷或非核苷
(例如，具有式V、VI或VII的部分)存在于本发明双链siNA分子的有义链的5′-末端和
3′-末端以及反义链的3′-末端的倒数第二位置处。此外，具有式VII的部分可以存在
于如本文所描述的发夹siNA分子的3′-末端或5′-末端处。

[0144] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有式V或VI的脱碱基残基，其中具有式VI或VI的所述脱碱基残基以3′-3′、3′-2′、2′-3′
或5′-5′的构型例如在1条或2条siNA链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端
处与siNA构建体进行连接。

[0145] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例如，约
1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)锁定核酸(LNA)核苷酸。

[0146] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例如，约
1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)4′-硫代核苷酸。

[0147] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含例如在siNA分子的5′-末端、3′-末端、5′和3′-末端、或其任何组合处的一个或多个(例
如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)无环核苷酸。

[0148] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含有义链或有义区，其具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲
基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任何组合。

[0149] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含反义链或反义区，其具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲
基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任何组合。

[0150] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含有义链或有义区和反义链或反义区，其各自具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、
4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、FANA、或脱碱基化学修饰或其任
何组合。

[0151] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟
嘧啶核苷酸)。

[0152] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸，或可
替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是FANA嘧啶核苷酸)。

[0153] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟
嘧啶核苷酸)。

[0154] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区和反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区和反义区中存在的任何(例
如，一个或多个或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧
啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸
是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸)。

[0155] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核
苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0156] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌
呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸)。

[0157] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个
或所有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是
2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟嘧啶核苷酸)，且所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核
苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可
替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0158] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多
个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)，其中包含存在于所述有义区中的
3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0159] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地
多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

[0160] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含有义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述有义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地
多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述有
义区中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0161] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地
多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

[0162] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地
多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，且其中包含存在于所述反
义区中的3′-末端核苷酸突出端的任何核苷酸是2′-脱氧核苷酸。

[0163] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，或可替代地多
个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。

[0164] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含反义区的本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所
有)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘧啶核苷酸)，且其中所述反义区中存在的任何(例如，一个或多个或所有)嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地
多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。

[0165] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的本发明化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含有义
区，其中所述有义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸
(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一
个)嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述有义区中存在的一个或多个
嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸，
或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)，和反义区，其中所
述反义区中存在的一个或多个嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟
甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中
所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟
甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘧啶
核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、
或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且所述反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷
酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二
氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，
或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、
2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。有义区和/或
反义区可以具有末端帽修饰，例如本文描述或图10中显示的任何修饰，其任选存在于有义
和/或反义序列的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处。有义和/或反义区可以
任选进一步包含具有约1个-约4个(例如，约1个、2个、3个或4个)2′-脱氧核苷酸的
3′-末端核苷酸突出端。突出端核苷酸可以进一步包含一个或多个(例如，约1个、2个、3
个、4个或更多)硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸间键。这些化学修
饰的siNAs的非限制性例子显示于本文的图4和5以及表III中。在这些描述的实施方案
的任何一个中，有义区中存在的嘌呤核苷酸可替代地是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其
中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧
基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲
基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙
氧基嘌呤核苷酸)，且反义区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷
酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一
个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、
或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)。同样地，在这些实施方案的任何一个中，有义
区中存在的一个或多个嘌呤核苷酸可替代地是嘌呤核糖核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷
酸是嘌呤核糖核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸)，且
反义区中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸
是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟
甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、
4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基
嘌呤核苷酸)。此外，在这些实施方案的任何一个中，有义区中存在和/或反义区中存在的
一个或多个嘌呤核苷酸可替代地选自2′-脱氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧
基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷
酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷
酸选自2′-脱氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷
酸、2′-O-三氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧
基核苷酸、和2′-O-甲基核苷酸，或可替代地多个(即超过一个)嘌呤核苷酸选自2′-脱
氧核苷酸、锁定核酸(LNA)核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、4′-硫代核苷酸、2′-O-三
氟甲基核苷酸、2′-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、和
2′-O-甲基核苷酸)。

[0166] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子中，优选地在本发明的siNA分子的反义链中，但也任选在有义和/或反义和有义链中存在的任何经修饰的
核苷酸，包含具有与天然存在的核糖核苷酸类似的性质或特征的经修饰的核苷酸。例如，
本发明的特征在于包括具有Northern构型(例如，Northern假旋转环(pseudorotation
cycle)，参见例如Saenger，Principles of Nucleic AcidStructure，Springer-Verlag
编辑，1984)的经修饰的核苷酸的siNA分子，所述Northern构型也称为“核糖样
(ribo-like)”或“A型螺旋”构型。照这样，本发明的siNA分子中，优选地在本发明的siNA
分子的反义链中，但也任选在有义和/或反义和有义链中存在的化学修饰的核苷酸，对核
酸酶降解有抗性同时维持介导RNAi的能力。具有northern构型的核苷酸的非限制性例子
包括锁定核酸(LNA)核苷酸(例如，2′-O-，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；
2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2′-甲基-硫代-乙基，2′-脱氧-2′-氟核苷酸，
2′-脱氧-2′-氯核苷酸，2′-叠氮核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙基-三
氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，4′-硫代核苷酸、和2′-O-甲基核
苷酸。

[0167] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的有义链包含末端帽部分，(参见例如图10)例如在有义链的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末
端处的反向脱氧脱碱基部分。

[0168] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸分子(例如siNA)，其中所述化学修饰包
含与化学修饰的siNA分子共价附着的缀合物。由本发明预期的缀合物的非限制性例子包
括在Vargeese等人，USSN 10/427,160中描述的缀合物和配体，所述USSN10/427,160于
2003年4月30日提交，包括附图整体引入本文作为参考。在另一个实施方案中，缀合物经
由生物可降解的接头与化学修饰的siNA分子共价附着。在一个实施方案中，缀合物分子在
化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、或2条链的3′-末端处进行附着。在另一个实
施方案中，缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、或2条链的5′-末端处
进行附着。在另外一个实施方案中，缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链、
或2条链的3′-末端和5′-末端或其任何组合处进行附着。在一个实施方案中，本发
明的缀合物分子包含促进化学修饰的siNA分子递送到生物系统例如细胞内的分子。在另
一个实施方案中，与化学修饰的siNA分子附着的缀合物分子是胆固醇、聚乙二醇、人血清
清蛋白或关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；蛋白质定位序列，
包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖
胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；类固醇，和聚胺，例如PEI、精胺或亚精胺。
由本发明预期的可以与化学修饰的siNA分子附着的具体缀合物分子的例子在Vargeese等
人，美国系列号10/201,394中得到描述，所述美国系列号10/201,394于2002年7月22日
提交，引入本文作为参考。本发明的siNA分子使用的缀合物类型和缀合程度可以就改善的
药物代谢动力学概况、生物利用率和/或siNA构建体的稳定性同时维持siNA介导RNAi活
性的能力进行评估。照这样，本领域技术人员可以筛选用各种缀合物进行修饰的siNA构建
体，以确定siNA缀合物复合物是否具有改善的性质同时维持介导RNAi的能力，例如在如本
领域一般已知的动物模型中。

[0169] 在一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中所述siNA进一步包含使siNA的有义区与siNA的反义区连接的核苷酸、
非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一个实施方案中，核苷酸、非核苷酸、或混
合的核苷酸/非核苷酸接头用于例如使缀合物部分与siNA附着。在一个实施方案中，本发
明的核苷酸接头可以是长度≥2个核苷酸的接头，例如长度约3个、4个、5个、6个、7个、8
个、9个或10个核苷酸。在另一个实施方案中，核苷酸接头可以是核酸适体。如本文所使
用的，“适体”或“核酸适体”意指与靶分子特异性结合的核酸分子，其中所述核酸分子具有包含在其天然背景中由靶分子识别的序列的序列。可替代地，适体可以是与靶分子结合的
核酸分子，其中所述靶分子不与核酸天然结合。靶分子可以是任何目的分子。例如，适体可
以用于与蛋白质的配体结合结构域结合，从而阻止天然存在的配体与蛋白质的相互作用。
这是非限制性例子，并且本领域技术人员将认识到使用本领域一般已知的技术可以容易地
产生其他实施方案。(参见，例如，Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，64，763；Brody和Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann 和 Patel，2000，Science，287，820；和 Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628.)

[0170] 在另外一个实施方案中，本发明的非核苷酸接头包含脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃、或其他聚合化合物(例如聚乙二醇，例如具有
2个-100个乙二醇单位的那些)。具体例子包括由下述参考文献描述的那些：Seela
和 Kaiser，NucleicAcids Res.1990，18：6353 和 Nucleic Acids Res.1987，15：3113；
Cload 和 Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：6324；Richardson 和 Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1991，113：5109；Ma等 人，Nucleic AcidsRes.1993，21：2585和 Biochemistry
1993，32：1751；Durand 等 人，Nucleic Acids Res.1990，18：6353；McCurdy 等 人，
Nucleosides&Nucleotides 1991，10：287；Jschke等人，Tetrahedron Lett.1993，34：301；
Ono等人，Biochemistry 1991，30：9914；Arnold等人，国际公开号WO 89/02439；Usman
等人，国际公开号WO 95/06731；Dudycz等人，国际公开号WO 95/11910以及Ferentz和
Verdine，J.Am.Chem.Soc.1991，113：4000，全部引入本文作为参考。“非核苷酸”进一步意指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，包括糖和/或磷
酸置换，且允许siNA分子保留RNAi活性或RNAi抑制以保留其抑制活性。基团或化合物可
以是脱碱基的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，例如在糖的C1位置处。

[0171] 靶向部分

[0172] 在本发明的一个实施方案中，核酸或多核苷酸(例如siNA)试剂的性质，包括它的药理性质，可以通过引入配体例如束缚配体进行影响和适应。广泛多样的实体例如配体可
以束缚至siNA试剂，例如束缚至配体缀合的单体亚单位的载体。例子在下文配体缀合的单
体亚单位的背景中中进行描述，但那仅是优选的，实体可以在其他点上与siNA试剂偶联。

[0173] 在优选实施方案中，其为配体的部分优选共价地、直接或经由间插系链(tether)间接与载体偶联。在某些实施方案中，配体经由间插系链与载体附着。当配体缀合的单体
掺入生长中的链内时，配体或束缚配体可以呈现在配体缀合的单体上。在一些实施方案中，
在“前体”配体缀合的单体亚单位已掺入生长中的链内后，配体可以掺入“前体”配体缀合
的单体亚单位内。例如具有例如氨基末端系链例如TAP-(CH2)nNH2的单体可以掺入生长中
的有义或反义链内。在后续操作中，即，在前体单体亚单位掺入链内后，通过使配体的亲电
子基团与前体配体缀合的单体亚单位系链的末端亲核基团偶联，随后可以使具有亲电子基
团例如五氟苯酯或醛基团的配体与前体配体缀合的单体附着。

[0174] 在另一个实施方案中，配体改变它掺入其内的核酸或多核苷酸(例如siNA)试剂的分布、靶向或寿命。在某些实施方案中，与例如缺乏此种配体的种类比较，配体提供了关
于所选择的靶增强的亲和力，所述靶例如分子、细胞或细胞类型，区室例如细胞或器官区
室，身体的组织、器官或区域。

[0175] 在优选实施方案中，配体可以改善转运、杂交和特异性性质，且还可以改善所得到的天然或经修饰的寡核糖核苷酸，或包含本文描述的单体和/或天然或经修饰的核糖核苷
酸的任何组合的聚合分子的核酸酶抗性。

[0176] 一般而言配体可以包括治疗改性剂，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基团，例如用于监控分布；交联剂；核酸酶抗性赋予部分；和天然或罕见核碱基。一般的例子包括
亲脂体，脂质，类固醇(例如，山楂醇、核柯配基(hecigenin)、薯蓣皂苷配基)，萜(例如三
萜，例如萨洒皂苷配基、软木三萜酮、无羁萜-3β-醇衍生的石胆酸)，维生素(例如叶酸、维生素A、生物素、吡哆醛)，碳水化合物，蛋白质，蛋白质结合剂，整联蛋白靶向分子，聚阳离子，肽，聚胺和肽模拟物。

[0177] 在另一个实施方案中，配体可以包括天然存在的物质(例如，人血清清蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰、壳多糖、壳聚
糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；氨基酸或脂质。配体还可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的例子包括聚氨基酸是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨
酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯共乙交酯(glycolied))共聚物、
二乙烯醚马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙
烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)(poly(2-ethylacryllic acid))、N-异丙
基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的例子包括：聚氮丙啶、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、拟肽(peptidomimetic)聚胺、树状聚体聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子部分例如阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺季盐或α螺旋肽。

[0178] 在另外一个实施方案中，配体可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向试剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型例如肝细胞或空肠的细胞结合的抗
体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺(gulucosamine)多价甘露
糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋白、二膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。抗体无需是完整抗体但还可以包括其片段。参见于2004年11月15日提交的2005/0250722，
FcgammaRIIA-specific nucleic acid interference；于2004年11月15日提交的US
20050267059，其教导了涉及靶向Syk mRNA序列的RNAi构建体的使用的方法。还参见
Song E，Zhu P，Lee S-K，Chowdhury D，Kussman S，Dykxhoorn DM，Feng Y，Palliser D，WeinerDB，Shankar P，Marasco WA，Lieberman J.Antibody-mediated deliveryof small
interfering RNAs via cell surface receptors.Nature Biotech 2005；9：347-351；
Ted C.Chu，Karen Y.Twu，Andrew D.Ellington和MatthewLevy，Aptamer mediated siRNA
delivery，Nucleic Acid Research，34：e73，于2006年6月1日在线公开。

[0179] 在一个实施方案中，配体的例子包括染料，嵌入剂(例如吖啶)，交联剂(例如补骨脂内酯、丝裂霉素C)，卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉、Sapphyrin)，多环芳族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)，人工内切核酸酶(例如EDTA)，亲脂分子例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘
丁酸、双氢睾酮、甘油(例如，其酯和醚，例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基；例如1，3-二-O(十六基)甘油、1，3-二-O(十八基(octaadecyl)甘油)、牻牛儿氧
基己基(geranyloxyhexyl)，十六基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸，O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合
物(例如触角足肽、Tat肽)，烷化剂，磷酸，氨基，巯基，PEG(例如PEG-40K)，MPEG，[MPEG]2，聚氨基，烷基，取代烷基，放射性标记的标记，酶，半抗原(例如生物素)，转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)，合成核糖核酸酶(例如咪唑、二咪唑、组胺、咪唑簇、吖
啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)，二硝基苯基，HRP或AP。

[0180] 在另一个实施方案中，配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对于共配体(co-ligand)具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如与特定细胞类型例如癌细胞、内皮细
胞或骨细胞结合的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽种类，例
如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺(gulucosamine)多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38MAP
激酶激活剂或NF-κB激活剂。

[0181] 在本发明的其他实施方案中，配体可以是物质，例如可以增加核酸或多核苷酸(例如siNA)试剂摄取到细胞内的药物，例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞
的微管、微丝和/或中间丝。药物可以是例如紫杉醇(taxon)、长春花新碱、长春花碱、松
胞菌素、洛可达唑、japlakinolide、红海海绵素A、鬼笔环肽(phalloidin)、swinholideA、indanocine或myoservin。能够增加siRNA试剂摄取到细胞内的配体也在本发明的范围内。

[0182] 脂质或基于脂质的分子也视为配体。此种脂质或基于脂质的分子可以结合血清蛋白质，例如人血清清蛋白(HSA)。例如，HSA结合配体允许缀合物分布至靶组织，例如
肝组织，包括肝的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用
neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对于缀合物降解的抗性，(b)
增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜内，和/或(c)可以用于调整与血清蛋白质例如HSA的
结合。参见例如，于2004年7月16日提交的US 2005/0064595以及其中引用的参考文献，
所述专利提供了基于脂质的分子用于递送RNAi试剂。这个出版物的内容整体引入本文作
为参考。

[0183] 基于脂质的配体可以用于调节，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能靶向肾且因此较不可能从体内清除。与HSA
较不强烈结合的脂质或基于脂质可以用于使缀合物靶向肾。

[0184] 在本发明的另一个实施方案中，配体是经由靶细胞例如增殖细胞摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗特征在于不需要的细胞增殖的病症是特别有用的，所述细胞例如
恶性或非恶性类型的，例如癌细胞。示例性维生素包括维生素A、E和K。包括的其他示例
性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或者由癌细胞摄取的其他
维生素或营养物。还包括的是HSA和低密度脂蛋白(LDL)。

[0185] 在本发明的另一个实施方案中，配体是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。在一个实施方案中，试剂是两亲的。示例性试剂是肽例如tat或触角足。如果试剂是肽，那么它可
以进行修饰，包括肽基模拟物(peptidylmimetic)、反转异构体(invertomers)、非肽或假
肽键和D-氨基酸的使用。螺旋试剂是α螺旋试剂，其优选具有亲脂和疏脂相。

[0186] 还可以使用靶向增殖细胞中富含的标记的肽。例如，包含RGD的肽和拟肽(petomimetics)可以靶向癌细胞，特别是显示αvβ3整联蛋白的细胞。因此，人们可以使用
RGD肽、包含RGD的环肽、包括D-氨基酸的RGD肽以及合成RGD模拟物。此外，关于RGD，人
们可以使用靶向αvβ3整联蛋白配体的其他部分。一般地，此种配体可以用于控制增殖细
胞和血管发生(angiogeneis)。这种类型的优选缀合物包括靶向PECAM-1、PCSK9或其他癌
基因，例如本文描述的癌基因的核酸或多核苷酸(例如，siNA)试剂。

[0187] 掺入糖例如半乳糖和/或其类似物的靶向试剂是特别有用的。这些试剂特别靶向肝的实质细胞。例如，靶向部分可以包括超过一个或优选2个或3个半乳糖部分，彼此间隔
约15埃。靶向部分可以可替代地是乳糖(例如，3个乳糖部分)，这是与半乳糖偶联的葡萄
糖。靶向部分还可以是N-乙酰半乳糖胺、N-Ac-葡萄糖胺。甘露糖或甘露糖-6-磷酸靶向
部分可以用于巨噬细胞靶向。

[0188] 配体可以是肽或拟肽。拟肽(在本文中也称为寡拟肽(oligopeptidomimetic)是能够折叠成类似于天然肽的限定三维结构的分子。肽和拟肽与iRNA试剂的附着可以影响
iRNA的药物代谢动力学分布，例如通过增强细胞识别和吸收。肽或拟肽部分长度可以为约
5-50个氨基酸，例如长度为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。

[0189] 5′-磷酸修饰

[0190] 在本发明的某些实施方案中，siRNA试剂是5′磷酸化的或包括在5′(prime)末端处的磷酰基类似物。反义链的5′-磷酸修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。
合适的修饰包括：5′-单磷酸((HO)2(O)P--O-5′)；5′-二磷酸((HO)2(O)P--O--P(HO)
(O)--O-5′)；5′-三磷酸((HO)2(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5′)；5′-鸟
苷帽(7-甲基化或非甲基化的)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)
(O)--O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)，以及任何经修饰的或未经修饰的核苷酸帽结构
(N---O-5′-(HO)(O)P--O--(HO)(O)P--O--P(HO)(O)--O-5′)；5′-单硫代磷酸(硫代磷
酸酯；(HO)2(S)P--O-5′)；5′-单二硫代磷酸(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P--O-5′)，
5′-硫代磷酸酯(phosphorothiolate)((HO)2(O)P--S-5′)；氧/硫置换的单磷酸、二磷
酸和三磷酸的任何另外组合(例如5′-α-硫代三磷酸、5′-γ-硫代三磷酸等)，5′-氨
基磷酸酯((HO)2(O)P--NH-5′、(HO)(NH2)(O)P--O-5′)，5′-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲
基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)--O-5′-、(OH)2(O)P-5′-CH2-)，5′-烷基醚
膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)--O-5′-)。

[0191] 在本发明的一个实施方案中，有义链也可以进行修饰以灭活有义链且阻止活性RISC的形成，由此潜在地减少脱靶(off-target)效应。这可以通过阻止有义链的5′-磷
酸化的修饰来完成，例如通过用5′-O-甲基核糖核苷酸修饰(参见Nykanen等人，(2001)
ATP requirementsand small interfering RNA structure in the RNA interference
pathway.Cell107，309-321.)。还可以使用阻止磷酸化的其他修饰，例如由H而不是O-Me
简单置换5′-OH。可替代地，可以将大体积基团加入5′磷酸中，使其变成磷酸二酯键。

[0192] 在一个实施方案中，本发明的特征在于能够在细胞或重构的体外系统内介导RNA干扰(RNAi)的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中由2个分开的寡核苷酸装
配的siNA分子的1条或2条链不包含任何核糖核苷酸(例如，siNA分子的1条或2条链
是100％化学修饰的)。例如，siNA分子可以由单个寡核苷酸装配，其中所述siNA的有义
和反义区包含分开的寡核苷酸，其不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有
2′-OH基团的核苷酸)。在另一个例子中，siNA分子可以由单个寡核苷酸装配，其中siNA
的有义和反义区通过如本文所描述的核苷酸或非核苷酸接头进行连接或环化，其中所述寡
核苷酸不具有寡核苷酸中存在的任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。申
请人已惊讶地发现siNA分子内核糖核苷酸(例如，具有2′-羟基的核苷酸)的存在并非
支持RNAi活性所需或必需的。照这样，在一个实施方案中，siNA内的所有位置可以包括化
学修饰的核苷酸和/或非核苷酸，例如具有式I、II、III、IV、V、VI或VII或其任何组合的
核苷酸和或非核苷酸，其程度至siNA分子支持细胞中的RNAi活性的能力被维持。

[0193] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子是在细胞或重构的体外系统中介导RNAi活性的单链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包含与靶核酸序列具有互补性的单链多
核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的单链siNA分子包含5′-末端磷酸基。在另一个实
施方案中，本发明的单链siNA分子包含5′-末端磷酸基和3′-末端磷酸基(例如，2′，
3′-环磷酸)。在另一个实施方案中，本发明的单链siNA分子包含约15个-约30个(例
如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的单链siNA分子包含一个或多
个本文描述的化学修饰的核苷酸或非核苷酸。例如，siNA分子内的所有位置可以包括化学
修饰的核苷酸，例如具有式I-VII中的任何一个或其任何组合的核苷酸，其程度至siNA分
子支持细胞中的RNAi活性的能力被维持。

[0194] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子是在细胞或重构的体外系统中介导RNAi活性或可替代地调节RNAi活性的单链siNA分子，其包含与靶
核酸序列具有互补性的单链多核苷酸，其中所述siNA中存在的一个或多个嘧啶核苷酸是
2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二
氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫
代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核
苷酸，或可替代地多个嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、
2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘧啶核苷酸)，且其中所述反
义区中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸
是2′-O-甲基、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二
氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸，或可替代地多个嘌呤核苷酸是2′-O-甲基、4′-硫代、
2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、或2′-O-二氟甲氧基-乙氧基嘌呤核苷酸)，
和末端帽修饰，例如本文描述或图10中显示的任何修饰，其任选存在于反义序列的3′-末
端、5′-末端、或3′和5′-末端处。siNA任选进一步包含在siNA分子的3′-末端处
的约1个-约4个或更多(例如，约1个、2个、3个、4个或更多)末端2′-脱氧核苷酸，
其中所述末端核苷酸可以进一步包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或更多)硫代
磷酸酯、膦酰乙酸酯和/或硫代膦酰乙酸酯核苷酸间键，且其中所述siNA任选进一步包含
末端磷酸基，例如5′-末端磷酸基。在这些实施方案的任何一个中，反义区中存在的任何
嘌呤核苷酸可替代地是2′-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌
呤核苷酸，或可替代地多个嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸)。同样，在这些实施方案
的任何一个中，siNA中存在的任何嘌呤核苷酸(即，有义和/或反义区中存在的嘌呤核苷
酸)可以可替代地是锁定核酸(LNA)核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是LNA核苷酸，或
可替代地多个嘌呤核苷酸是LNA核苷酸)。同样，在这些实施方案的任何一个中，siNA中存
在的任何嘌呤核苷酸可替代地是2′-甲氧基乙基嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷
酸是2′-甲氧基乙基嘌呤核苷酸，或可替代地多个嘌呤核苷酸是2′-甲氧基乙基嘌呤核
苷酸)。在另一个实施方案中，本发明的单链siNA分子中存在的任何经修饰的核苷酸包含
具有与天然存在的核糖核苷酸类似的性质或特征的经修饰的核苷酸。例如，本发明的特征
在于包括具有Northern构型(例如，Northern假旋转环，参见例如Saenger，Principles
of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag编辑，1984)的经修饰的核苷酸的siNA分
子。照这样，本发明的单链siNA分子中存在的化学修饰的核苷酸优选对核酸酶降解有抗性
同时维持介导RNAi的能力。

[0195] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修饰或其任何组合的有
义链或有义区。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的有义链或有义区中的交
替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20等。

[0196] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)修饰或其任何组合的反
义链或反义区。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的反义链或反义区中的交
替位置处，例如位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20等。

[0197] 在一个实施方案中，本发明的化学修饰的短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含有义链或有义区和反义链或反义区，其各自具有2个或更多(例如，2个、3个、4个、
5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个15个、16个、17个、18个、19个、
20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多)2′-O-烷基(例如，2′-O-甲基)、2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧、或脱碱基化学修饰或其任何组合。
在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的有义链或有义区中的交替位置处，例如位
置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。在另一个实施方案中，2′-O-烷基修饰在siNA的反义链或反义区中的交替位置处，例如位置1、3、5、
7、9、11、13、15、17、19、21等，或位置2、4、6、8、10、12、14、16、18、20等。

[0198] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在siNA分子的1条或多条链或一个或多个区域内的交替位置处的化学修饰的核苷酸或非核苷酸(例
如，具有式I-VII中的任何一个，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三
氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。
例如，此种化学修饰可以在基于RNA的siNA分子每隔一个的位置处引入，起始于来自siNA
的3′-末端或5′-末端的第一个或第二个核苷酸。在非限制性例子中，在其中siNA的每
条链长度为21个核苷酸的本发明的双链siNA分子的特征在于其中每条链的位置1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19和21是化学修饰的(例如，由具有式I-VII中的任何一个的化合物，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧
基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在另一个非限制性例子中，在其
中siNA的每条链长度为21个核苷酸的本发明的双链siNA分子的特征在于其中每条链的
位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20是化学修饰的(例如，由具有式I-VII中的任何一个的化合物，例如2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙
基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸)。在一个实施方案
中，双链siNA分子的一条链包含在位置2、4、6、8、10、12、14、16、18和20处的化学修饰，和在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21处的化学修饰。此种siNA分子可以进一步包含如本文所描述的末端帽部分和/或主链修饰。

[0199] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含下述特征：如果嘌呤核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末
端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此
种嘌呤核苷是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，嘌呤核糖核苷酸当存在时与siNA分子的
有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。此种嘌呤核糖核苷酸可以存在于另
外包含经修饰的核苷酸的siNA稳定化基序中。

[0200] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含下述特征：如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末
端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此
种嘧啶核苷是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，嘧啶核糖核苷酸当存在时与siNA分子的
有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。此种嘧啶核糖核苷酸可以存在于另
外包含经修饰的核苷酸的siNA稳定化基序中。

[0201] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含下述特征：如果嘧啶核苷酸存在于siNA分子的反义链或反义区(也称为引导序列或引导链)的5′-末
端处(例如，来自5′-末端的末端核苷酸位置1、2、3、4、5或6中的任何一个处)，那么此
种嘧啶核苷是经修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，经修饰的嘧啶核糖核苷酸当存在
时与siNA分子的有义链或有义区(也称为过客链)的核苷酸碱基配对。经修饰的嘧啶
核苷酸的非限制性例子包括具有式I-VII中的任何一个的那些，例如2′-脱氧、2′-脱
氧-2′-氟、4′-硫代、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基、2′-O-二氟甲氧
基-乙氧基或2′-O-甲基核苷酸。

[0202] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SI的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0203] B——NX3——(N)X2B-3′

[0204] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0205] SI

[0206] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约
4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

[0207] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地
是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核
苷酸的组合；

[0208] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O1-甲基
核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

[0209] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0210] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SII的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0211] B——NX3——(N)X2B-3′

[0212] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0213] SII

[0214] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约
4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

[0215] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0216] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

[0217] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0218] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIII的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0219] B——NX3——(N)X2B-3′

[0220] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0221] SIII

[0222] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约
4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

[0223] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0224] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

[0225] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0226] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIV的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0227] B——NX3——(N)X2B-3′

[0228] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0229] SIV

[0230] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约
4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

[0231] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0232] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是脱氧核糖核苷酸；和

[0233] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0234] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SV的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0235] B——NX3——(N)X2B-3′

[0236] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0237] SV

[0238] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表其中存在时的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约
4的整数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；NX3与NX4和NX5互补，且

[0239] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下
部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

[0240] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；和

[0241] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0242] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVI的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0243] B——NX3——(N)X2B-3′

[0244] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0245] SVI

[0246] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表包含使得反义链(下部链)的5′-末端比有义链(上部链)的5′-末端更不热稳
定的序列的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的整数；X4
是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3与NX4
和NX5互补，且

[0247] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地
是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核
苷酸的组合；

[0248] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基
核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

[0249] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0250] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVII的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0251] B——NX3——(N)X2B-3′

[0252] B(N)X1——NX4——-5′

[0253] SVII

[0254] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表非碱基配对或突出端核苷酸；X1和X2独立地是约0-约4的整
数；X3是约9-约30的整数；X4是约11-约30的整数，NX3与NX4互补，且任何(N)核苷酸
是2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸。

[0255] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SVIII的双链核酸分子：

[0256]

[0257] SVIII

[0258] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表包含使得反义链(下部链)的5′-末端比有义链(上部链)的5′-末端更不热稳
定的序列的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4
的整数；X3是约9-约15的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；
X5是约1-约6的整数；X6是约1-约4的整数；X7是约9-约15的整数；NX7、NX6和NX3
与NX4和NX5互补，且

[0259] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地
是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核
苷酸的组合；

[0260] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外独立地是
2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷
酸的组合；和

[0261] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0262] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SIX的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0263] B——NX3——(N)X2B-3′

[0264] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0265] SIX

[0266] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的
整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3
与NX4和NX5互补，且

[0267] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地
是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核
苷酸的组合；

[0268] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地是2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基
核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷酸的组合；和

[0269] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0270] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SX的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0271] B——NX3——(N)X2B-3′

[0272] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0273] SX

[0274] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的
整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3
与NX4和NX5互补，且

[0275] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0276] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是核糖核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

[0277] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0278] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXI的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0279] B——NX3——(N)X2B-3′

[0280] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0281] SXI

[0282] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的
整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3
与NX4和NX5互补，且

[0283] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0284] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是核糖核苷酸；和

[0285] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0286] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXII的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0287] B——NX3——(N)X2B-3′

[0288] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0289] SXII

[0290] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的
整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3
与NX4和NX5互补，且

[0291] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；

[0292] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是脱氧核糖核苷酸；和

[0293] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0294] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXIII的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0295] B——NX3——(N)X2B-3′

[0296] B(N)X1——NX4——[N]X5-5′

[0297] SXIII

[0298] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是约0-约4的整数；X3是约9-约30的
整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的和为17-36；X5是约1-约6的整数；NX3
与NX4和NX5互补，且

[0299] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下
部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是2′-O-甲基核苷酸；

[0300] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是具有核糖样构型(例如，Northern或A型螺旋构型)的核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸是
2′-O-甲基核苷酸；和

[0301] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0302] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有结构SXIV的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子：

[0303]

[0304] SXIV

[0305] 其中每个N独立地是可以是未修饰或化学修饰的核苷酸；每个B是可以存在或不存在的末端帽部分；(N)代表可以是未修饰或化学修饰的非碱基配对或突出端核苷酸；[N]
代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；[N]代表是核糖核苷酸的核苷酸位置；X1和X2独立地是
约0-约4的整数；X3是约9-约15的整数；X4是约11-约30的整数，前提是X4和X5的
和为17-36；X5是约1-约6的整数；X6是约1-约4的整数；X7是约9-约15的整数；NX7、
NX6和NX3与NX4和NX5互补，且

[0306] (a)反义链(下部链)中存在的任何嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；除[N]核苷酸位置中的嘌呤核苷酸外的反义链(下部链)中存在的任何嘌呤核苷酸独立地
是2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核
苷酸的组合；

[0307] (b)有义链(上部链)中存在的任何嘧啶核苷酸除[N]核苷酸外是2′-脱氧-2′-氟核苷酸；有义链(上部链)中存在的任何嘌呤核苷酸除[N]核苷酸外独立地是
2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、或2′-脱氧核糖核苷酸和2′-O-甲基核苷
酸的组合；和

[0308] (c)任何(N)核苷酸任选是2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟或脱氧核糖核苷酸。

[0309] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在核酸分子的反义链或反义区的5′-末端处的末端磷酸基。

[0310] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含X5＝1、2或3；X1和X2各自＝1或2；X3＝12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29或30，和X4＝15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

[0311] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含X5＝1；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝18。

[0312] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含X5＝2；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝17。

[0313] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含X5＝3；X1和X2各自＝2；X3＝19，和X4＝16。

[0314] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在有义链或有义区的3′和5′-末端处的B。

[0315] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在反义链或反义区的3′-末端处的B。

[0316] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在有义链或有义区的3′和5′-末端处的B以及在反义链或反义区的3′-末端处的B。

[0317] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子进一步包含在核酸分子的有义链、反义链、或有义链和反义链的3′末端上的第一个末端(N)处的一
个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，双链核酸分子可以包含具有含硫代磷酸酯核苷酸
间键的突出端核苷酸位置的X1和/或X2＝2，例如(NsN)其中“s”指示硫代磷酸酯。

[0318] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含是2′-O-甲基核苷酸的(N)核苷酸。

[0319] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含是2′-脱氧核苷酸的(N)核苷酸。

[0320] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在反义链(下部链)中的(N)核苷酸，其与靶多核苷酸序列(例如，PCSK9靶和/或PCSK9途径
靶序列)中的核苷酸互补，所述靶多核苷酸序列中的核苷酸与反义(下部)链的N和[N]
核苷酸具有互补性。

[0321] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在有义链(上部链)中的(N)核苷酸，其包含靶多核苷酸序列(例如，PCSK9靶和/或PCSK9途
径靶序列)的约15个-约30个核苷酸的邻接核苷酸序列。

[0322] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含在有义链(上部链)中的(N)核苷酸，其包含对应与反义(下部)链具有互补性的靶多核苷酸序
列(例如，PCSK9靶和/或PCSK9途径靶序列)的核苷酸序列，从而使得有义链的邻接(N)
和N核苷酸序列包含靶核酸序列(例如，PCSK9靶和/或PCSK9途径靶序列)的核苷酸序
列。

[0323] 在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链或多核苷酸(例如siNA)核酸分子包含仅在双链核酸分子的有义(上部)链的5′-末端处的B。

[0324] 在一个实施方案中，具有结构SI、SII、SIII、SIV、SV、SVI、SVII、SVIII、SIX、SX、SXI、SXII、SXIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子进一步包含在反义(下部)链的5′-末端处非配对的末端核苷酸。非配对的核苷酸不与有义(上
部)链互补。在一个实施方案中，非配对的末端核苷酸与靶多核苷酸序列互补，所述靶多核
苷酸序列与反义(下部)链的N和[N]核苷酸具有互补性。在另一个实施方案中，非配对
的末端核苷酸不与靶多核苷酸序列互补，所述靶多核苷酸序列与反义(下部)链的N和[N]
核苷酸具有互补性。

[0325] 在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含X6＝1和X3＝10。

[0326] 在一个实施方案中，具有结构SVIII或SXIV中的任何一个的双链核酸分子包含X6＝2和X3＝9。

[0327] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含配制为表VI中所示的任何制剂的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子或RNAi抑制剂的组合物，例如LNP-051；
LNP-053；LNP-054；LNP-069；LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；
LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104(参见表VI)。

[0328] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含各自具有彼此互补的第一条链和第二条链的第一种双链核酸和第二种双链核酸分子的组合物，其中所述第一种双链核酸分子的
第二条链包含与第一种靶序列互补的序列，且所述第二种双链核酸分子的第二条链包含与
第二种靶或途径靶序列(例如PCSK9)互补的序列。在一个实施方案中，该组合物进一步包
含阳离子脂质、中性脂质和聚乙二醇-缀合物。在一个实施方案中，该组合物进一步包含阳
离子脂质、中性脂质、聚乙二醇-缀合物和胆固醇。在一个实施方案中，该组合物进一步包
含聚乙二醇-缀合物、胆固醇和表面活性剂。在一个实施方案中，阳离子脂质选自CLinDMA、
pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA和DMLBA。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DOBA和胆固
醇。在一个实施方案中，聚乙二醇-缀合物选自PEG-二肉豆蔻酰甘油和PEG-胆固醇。在
一个实施方案中，PEG是2KPEG。在一个实施方案中，表面活性剂选自棕榈醇、十八烷醇、油
醇和亚油醇(linoleyl alcohol)。在一个实施方案中，阳离子脂质是CLinDMA，中性脂质是
DSPC，聚乙二醇缀合物是2KPEG-DMG，胆固醇是胆固醇，且表面活性剂是亚油醇。在一个实施方案中，CLinDMA、DSPC、2KPEG-DMG、胆固醇和亚油醇分别以43∶38∶10∶2∶7的摩尔
比存在。

[0329] 在本文的任何一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子经由RNA干扰或RNA干扰的抑制调节一种或多种靶的表达。在一个实施方案中，RNA干扰是RISC
介导的靶的切割(例如，siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是靶的翻译
抑制(例如，miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰是靶的转录抑制(例
如，siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，RNA干扰在细胞质中发生。在一个实施
方案中，RNA干扰在核中发生。

[0330] 在本文的任何一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子经由内源靶RNA例如内源mRNA、siRNA、miRNA的抑制，或可替代地通过RISC的抑制调节一种或
多种靶的表达。

[0331] 在一个实施方案中，本发明的特征在于通过miRNA抑制、siRNA抑制、或RISC抑制调节一种或多种基因靶的表达的一种或多种RNAi抑制剂。

[0332] 在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是如本文所描述的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其具有与一种或多种靶miRNA或siRNA分子互补的一条或多条链。

[0333] 在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是与靶miRNA或siRNA分子或其部分互补的反义分子。本发明的反义RNAi抑制剂可以具有长度为约10个-约40个核苷酸的长度
(例如长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、
22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、
36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。本发明的反义RNAi抑制剂可以包含如本文所描
述的一个或多个经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见例如具有本文的式I-VII中任何一个或
其任何组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个
或所有2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个
或多个或所有2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂
可以包含一个或多个或所有2′-O-甲氧基-乙基(也称为2′-甲氧基乙氧基或MOE)核
苷酸。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有硫代磷酸
酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的反义RNAi抑制剂可以包含在反义RNAi抑制
剂的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端处的末端帽部分。

[0334] 在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂是对于RISC具有结合亲和力的核酸适体，例如可调节的适体(参见例如An等人，2006，RNA，12：710-716)。本发明的适体RNAi
抑制剂可以具有长度为约10个-约50个核苷酸的长度(例如长度为10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、
27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、
41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸)。本发明的适体
RNAi抑制剂可以包含如本文所描述的一个或多个经修饰的核苷酸或非核苷酸(参见例如
具有本文的式I-VII中任何一个或其任何组合的分子)。在一个实施方案中，本发明的适体
RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲基核苷酸。在一个实施方案中，本发明
的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-脱氧-2′-氟核苷酸。在一个实施
方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可以包含一个或多个或所有2′-O-甲氧基-乙基(也
称为2′-甲氧基乙氧基或MOE)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi抑制剂可
以包含一个或多个或所有硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的适体RNAi
抑制剂可以包含在适体RNAi抑制剂的3′-末端、5′-末端、或5′和3′末端处的末端帽
部分。

[0335] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一
包含与靶的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的靶基因表达的条
件下，将siNA分子引入细胞内。

[0336] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述siNA链之一
包含与靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与靶RNA的序列相同
或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的靶基因表达的条件下，
将siNA分子引入细胞内。

[0337] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所述
siNA链之一包含与靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中
的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

[0338] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的2种或更多靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的一种或多种siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰
的，其中所述siNA链包含与靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含
与靶RNAs的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的
靶基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

[0339] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中所
述siNA链之一包含与靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与靶
RNAs的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)细胞中的靶基
因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

[0340] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞内的靶和相应的调节剂基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰或未修饰的，其中
所述siNA链之一包含与靶和相应的调节剂基因的RNA互补的序列，其中所述siNA的有义
链序列包含与靶RNA的序列相同或基本上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)
细胞中的靶和相应的调节剂表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

[0341] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用作先体外后体内应用中的试剂。例如，为了疗效将siNA试剂引入移植到受试者内的组织或细胞内。细
胞和/或组织可以得自随后接受外植体的生物或受试者，或可以得自移植前的另一种生物
或受试者。siNA分子可以用于调节细胞或组织中的一种或多种基因的表达，从而使得细胞
或组织获得所需表型或当体内移植时能够执行功能。在一个实施方案中，从患者中提取某
些靶细胞。在适合于经由这些细胞摄取siNAs的条件下(例如，使用递送试剂例如阳离子
脂质、脂质体等，或使用技术例如电穿孔以促进siNAs递送到细胞内)，使这些提取的细胞
与靶向细胞内的特定核苷酸序列的siNAs接触。随后将细胞再引回到相同患者或其他患者
内。

[0342] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与
靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的靶基因表达
的条件下，将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，
该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的靶基因表达的条件下，将组织
外植体引回到组织从中获得的生物内或另一个生物内。

[0343] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含与
靶基因的RNA互补的序列，且其中所述siNA的有义链序列包含与靶RNA的序列相同或基本
上相似的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的靶基因表达的条件下，
将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一
步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的靶基因表达的条件下，将组织外植体引回
到组织从中获得的生物内或另一个生物内。

[0344] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体中的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之
一包含与靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的
靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定生物的组织外植体的细胞内。在另一个实
施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑制)那种生物中的靶基因表达的条件
下，将组织外植体引回到组织从中获得的生物或另一个生物内。

[0345] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包含
与靶基因的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的靶基因
表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。靶蛋白或RNA的水平可以使用本领域众
所周知的各种方法进行测定。

[0346] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链
之一包含与靶的RNA互补的序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的靶
基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。靶蛋白或RNA的水平可以如本领域
已知的进行测定。

[0347] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞(例如，肝或脂肪组织细胞)内的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中
所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)
细胞中的PCSK9基因表达的条件下，将siNA分子引入细胞内。

[0348] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于调节细胞(例如，肝或脂肪组织细胞)内的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学
修饰的，其中所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节
(例如，抑制)细胞中的靶基因表达的条件下，使细胞在体外或体内与siNA分子接触。

[0349] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体(例如，肝或如可以从一个生物移植给另一个或移植回器官、组织或细胞从中获得的相同生物的任何其他器官、组
织或细胞)中的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修
饰的，其中所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例
如，抑制)组织外植体中的靶基因表达的条件下，使得自特定受试者或生物的组织外植体
的细胞与siNA分子接触。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，
抑制)那种受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到组织从中获得的
受试者或生物内或另一个受试者或生物内。

[0350] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体(例如，肝或如可以从一个生物移植给另一个或移植回器官、组织或细胞从中获得的相同生物的任何其他器官、
组织或细胞)中的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可
以是化学修饰的，其中所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适
合于调节组织外植体中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入得自特定受试者或生物
的组织外植体的细胞内。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在适合于调节(例如，抑
制)那种受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将组织外植体引回到该组织由其获得的
受试者或生物内或另一个受试者或生物内。

[0351] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体(例如，如皮肤、毛发、肺或如可以从一个生物移植给另一个或移植回组织或细胞由其获得的相同生物的任何其他
组织或细胞)中的靶基因(例如PCSK9)表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，
其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)
在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的PCSK9靶基因表达的条件下，使衍生自特定受
试者或生物的组织外植体的细胞与siNA分子接触。在另一个实施方案中，该方法进一步包
括在适合于调节(例如，抑制)那种受试者或生物中的PCSK9靶基因表达的条件下，将组织
外植体引回到该组织由其获得的受试者或生物内，或引入另一个受试者或生物内。

[0352] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节组织外植体(例如，如皮肤、毛发、肺或如可以从一个生物移植给另一个或移植回组织或细胞由其获得的相同生物的任何其
他组织或细胞)中的超过一种靶基因(例如PCSK9)表达的方法，其包括：(a)合成本发明
的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与靶基因的RNA具有互补性的单链
序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)组织外植体中的靶基因表达的条件下，将siNA分
子引入衍生自特定受试者或生物的组织外植体的细胞。在另一个实施方案中，该方法进一
步包括在适合于调节(例如，抑制)那种受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将组织外
植体引回到该组织由其获得的受试者或生物内，或引入另一个受试者或生物内。

[0353] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包含与靶基
因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的靶
基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

[0354] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种靶基因表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA包
含与靶基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)受试者或生
物中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

[0355] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的靶基因表达的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发
明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0356] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种靶基因表达的方法，其包括在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的靶基因表达的条件下，
使受试者或生物与本发明的一种或多种核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0357] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的靶基因(例如PCSK9)表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述
siNA包含与PCSK9基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例如，抑制)
受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

[0358] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种靶基因(例如PCSK9)表达的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其
中所述siNA包含与PCSK9基因的RNA具有互补性的单链序列；和(b)在适合于调节(例
如，抑制)受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入受试者或生物内。

[0359] 在一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的靶基因(例如PCSK9)表达的方法，其包括在适合于调节(例如，抑制)受试者或生物中的靶基因表达的条
件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0360] VII.基于核酸的RNAi构建体的递送

[0361] 用于核酸递送以实现根据本发明的RNAi的合适方法被认为包括核酸(例如DNA、RNA，包括病毒或非病毒载体)可以由其引入细胞器、细胞、组织或生物内的事实上任何
方法，如本文描述的或将是本领域普通技术人员已知的。此种方法包括但不限于DNA的
直接递送，例如通过注射(美国专利号5,994,624；5,981,274；5,945,100；5,780,448；
5,736,524；5,702,932；5,656,610；5,589,466和5,580,859，所述专利各自引入本文作
为参考)，包括显微注射(引入本文作为参考的Harlan和Weintraub，1985，美国专利号
5,789,215)；通过电穿孔(引入本文作为参考的美国专利号5,384,253)；通过磷酸钙沉淀
(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；通过使用DEAE-葡聚糖随后为聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接超声装载(Fechheimer等人，1987)；通过
脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong
等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)；通过微粒轰击(PCT申请号94/09699
和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783；5,563,055；5,550,318；5,538,877和
5,538,880，所述专利各自引入本文作为参考)；通过用碳化硅纤维搅动(Kaeppler等人，
1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，所述专利各自引入本文作为参考)；通过土壤
杆菌属(Agrobacterium)介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，所述专利各
自引入本文作为参考)；或通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等人，1993；美国专利
号4,684,611和4,952,500，所述专利各自引入本文作为参考)；通过干燥/抑制介导的DNA
摄取(Potrykus等人，1985)。通过诸如这些的技术的应用，可以稳定或瞬时转化细胞器、细
胞、组织或生物。

[0362] 存在其中表达载体可以引入细胞内以产生dsRNA的许多途径。在本发明的某些实施方案中，表达载体包含衍生自病毒基因组的病毒或工程改造的载体，而在其他实施方案
中，它是非病毒载体。其他表达系统也是容易获得的。

[0363] 本领域技术人员将理解，RNAi在人和其他哺乳动物中用于诸如预防和治疗感染以及其他疾病和状况的目的的有效使用，将通过给其中需要抑制转录物的细胞有效递送RNAi
诱导实体得到增强，所述RNAi诱导实体例如siRNA、shRNA或RNAi诱导载体((即其在细胞
内的存在导致siRNA或shRNA的生产的载体)。对于在人中的使用，可能优选采用促进RNAi
诱导实体例如siRNA、shRNA或RNAi诱导载体(例如DNA载体)的细胞内摄取的非病毒方
法。

[0364] 与之一致，本发明的实施方案提供了包含多种非病毒递送试剂中的任何一种，用于siRNA、shRNA和/或RNAi诱导载体对细胞增强的递送的组合物。尽管预期本文描述的
递送试剂将主要用于增强RNA或DNA而不是完整病毒的递送，但不排除它们用于后面目的
的使用。

[0365] 如本文所使用的，“递送”的广泛概念包括RNAi诱导实体例如siRNA、shRNA和/或RNAi诱导载体从其进入身体的位点到它在其中发挥作用的细胞的位置的转运，加上实体的
细胞摄取和在使得siRNA或shRNA可用于细胞内RNAi机器(例如来自内体的释放或siRNA
或shRNA)中涉及的任何后续步骤。一般而言，本文描述的递送试剂充当媒介物或载体用于
递送RNA或载体，促进使得siRNA或shRNA可用于细胞内RNAi机器的过程中的一个或多个
步骤，和/或帮助保护或稳定身体内的RNAi诱导实体。

[0366] 在一个实施方案中，本发明提供了包含靶向PCSK9mRNA转录物的一种或多种RNAi诱导实体和多种递送试剂中的任何一种的组合物，所述递送试剂包括但不限于阳离子聚合
物，经修饰的阳离子聚合物，肽分子转运蛋白(包括富含精氨酸或组氨酸的肽)，脂质(包括
阳离子脂质、中性脂质及其组合)，脂质体，lipopolyplexes，非阳离子聚合物，经修饰的非阳离子聚合物，氯喹，布比卡因和适合于引入靶组织或细胞内的表面活性剂。某些递送试剂
进行修饰，以掺入增加一种或多种RNAi诱导实体对需要它在其中抑制特定转录物的细胞
的递送或选择性递送的部分。

[0367] 在本发明的某些实施方案中，疾病或状况或其症状与异常的PCSK9mRNA表达相关，特征在于异常的PCSK9mRNA表达，或涉及异常的PCSK9mRNA表达，例如突变PCSK9或由
mRNA转录物编码的多肽的异常功能活性。在本发明的优选实施方案中，RNAi诱导组合物的
施用抑制靶mRNA转录物例如PCSK9mRNA的表达，由此治疗疾病。在某些实施方案中，RNAi
诱导组合物的施用抑制PCSK9mRNA转录物，由此相对于组合物施用前降低LDL表达。因此，
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病或状况的方法，所述疾病或状况由细胞
或组织中的PCSK9水平介导，或与细胞或组织中的PCSK9水平相关，或将响应细胞或组织中
的PCSK9水平，所述方法包括施用包含RNAi诱导实体和递送试剂的组合物的步骤，其中所
述RNAi诱导实体靶向PCSK9mRNA转录物，所述递送试剂选自下述：阳离子聚合物，经修饰
的阳离子聚合物，肽分子转运蛋白(包括富含精氨酸或组氨酸的肽)，脂质(包括阳离子脂
质、中性脂质及其组合)，脂质体，lipopolyplexes，非阳离子聚合物，经修饰的非阳离子聚合物，氯喹，布比卡因和适合于引入肺内的表面活性剂。在本发明的优选实施方案中，RNAi
诱导实体是siRNA。在某些优选实施方案中，RNAi诱导实体是shRNA或RNAi诱导载体。本
发明的包含RNAi构建体的组合物可以用于预防、抑制或治疗高脂血症，包括高胆固醇血症
(hypercholoesterolemia)，I型高脂蛋白血症，II型高脂蛋白血症，III型高脂蛋白血症，
IV型高脂蛋白血症，V型高脂蛋白血症，继发性高甘油三酯血症(hypertrigliceridemia)
和家族性卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症；和心血管疾病例如冠心病(CHD)，脑血管病
(CVD)，主动脉瓣狭窄，外周血管病，动脉粥样硬化，动脉硬化，心肌梗死(心脏病发作)，脑血管病(中风)，短暂性缺血发作(TIA)，心绞痛(稳定型和不稳定型)，心房颤动，心律失
常，瓣膜病和/或充血性心力衰竭或任何其他性状。在某些实施方案中，组合物可以单独或
与其他疗法组合施用。

[0368] 在本发明的某些优选实施方案中，组合物提供了RNAi诱导实体对表达PCSK9mRNA的心脏组织或细胞的增强的递送。然而，本文描述的各种递送试剂的功效不限于具体细胞
类型。因此本发明的各种实施方案包含RNAi诱导实体对身体中的任何细胞、组织或实体器
官的递送。本发明的各种实施方案还包含RNAi诱导实体(例如siRNA、shRNA或RNAi诱导
载体)对血管的壁中的细胞(例如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等)和血
管其自身的细胞(例如淋巴细胞、嗜中性粒细胞等)的递送。

[0369] (i)阳离子聚合物和经修饰的阳离子聚合物-Han，S.O.等人，Development ofBiomaterials for gene therapy.Mol.Therapy 2：302-317已报道，基于阳离子聚合物的
系统作为用于DNA转染的载体是有效的。认为阳离子聚合物促进DNA的细胞摄取的能力
部分起于其与DNA结合且使大质粒DNA分子凝聚成较小的DNA/聚合物复合物用于更有
效的胞吞作用的能力。一些研究者已提出DNA/阳离子聚合物复合物也充当生物粘合剂
(bioadhesive)，这是由于它们与细胞表面糖蛋白的带负电的唾液酸残基的静电相互作用。
参见Soane，R.J.等人，Evaluation of theclearance characteristics of bioadhesive
systems in humans.Int.J.Pharm.178：55-65(1999)。同样，一些阳离子聚合物明显促进
内体膜的破裂和因此促进DNA释放到细胞溶胶内(Putnam，D.等人，Polymer-basedgene
delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chaintermini.Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 98：1200-1205.32(2001))。

[0370] 因此，本发明的实施方案提供了包含(i)RNAi诱导实体，其中核酸或多核苷酸(例如siNA)实体靶向PCSK9mRNA靶转录物；和(ii)阳离子聚合物的组合物。本发明进一步提
供了通过施用此种组合物抑制靶转录物的方法。

[0371] 一般而言，阳离子聚合物是在约生理pH下带正电的聚合物，例如约7.0-7.6的pH，优选约7.2-7.6，更优选约7.4。此种阳离子聚合物包括但不限于聚赖氨酸(PLL)，聚精氨
酸(PLA)，聚组氨酸，聚氮丙啶(PEI)(Boussif等人，A versatile vector for gene and
oligonucleotidetransfer into cells in culture and in vivo：polyethylenimine.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7297-7301(1995))，包括如例如(Kunath等人，J Control
Release 89(1)：113-25.76(2003))中描述的线性PEI和低分子量PEI，聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)和壳聚糖。将理解这些聚合物中的某些包含伯胺基团、亚胺基团、胍基团和/或咪唑
基团。优选的阳离子聚合物具有相对低的毒性和高DNA转染功效。参见于2003年9月29日
提交的授予Chen Jianzhu等人(其后的′617专利申请)的US20050008617，Compositions
and methods for delivery of short interferingRNA and short hairpin RNA。所引用
的每一个参考文献的内容都整体引入本文作为参考。

[0372] 尽管不希望受任何理论束缚，但认为阳离子聚合物例如PEI使DNA压密或凝聚成带正电的颗粒，所述颗粒能够与细胞表面上的阴离子蛋白聚糖相互作用且通过胞吞作用进
入细胞。此种聚合物可以具有充当“质子海绵”的性质，其缓冲内体pH且保护DNA不受降
解。连续的质子流入还诱导内体渗透膨胀和破裂，其提供了关于DNA颗粒至细胞质的逃避
机制。这些教导同样应用于本发明的RNAi诱导实体和DNA载体由′617专利申请的教导是
显而易见的。此外，′617申请中的发明人特别证实提供了用于合成shRNA的模板的siRNA
和DNA载体对于哺乳动物受试者中的细胞的有效递送，从而导致使用多种此种试剂抑制靶
转录物。还参见′617申请中引用的85-87；美国专利号6,013,240。同样，WO9602655提
供了关于在本发明的实践中有用的PEI和其他阳离子聚合物的进一步信息。根据本发明的
TM
某些实施方案，可以使用称为jetPEI .(Qbiogene，Carlsbad，Calif.)的商购可得的PEI试
剂，线性形式的PEI(美国专利号6,013,240)。

[0373] 在某些实施方案中，本发明的RNAi诱导实体可以经由本领域技术人员称为“流体转染(hydrodynamic transfection)”的技术进行递送。应当指出将RNAi诱导实体静脉
内递送给身体内的实体器官和组织的此种技术已知由于例如(参见例如，McCaffrey等人，
RNA interference in adultmice.Nature 418，38-39(2002)，McCaffrey等人，Inhibition of hepatitisB virus in mice by RNA interference.Nat Biotechnol 21，639-644(2003)
的教导是显而易见的。

[0374] 还可以使用多种另外的阳离子聚合物。已开发了来自二丙烯酸酯和胺单体的新型阳离子聚合物和寡聚物的大型文库，且在DNA转染中进行测试。例如，Lynn等人，
Accelerated discovery of synthetictransfection vectors：parallel synthesis and
screening of a degrable polymerlibrary.J.Am.Chem.Soc.123：8155-8156(2001)报道
来自7种二丙烯酸酯单体和20种胺单体的140种聚合物的文库的开发。更大型的文库可以
使用类似或相同的技术进行生产。在这个文库的140种成员中，发现70种是足够水溶性的
(2mg/ml，25mM乙酸盐缓冲液，pH＝5.0)。如通过电泳迁移率变动显示的，70种水溶性聚合
物中的56种与DNA相互作用。最重要的是，56种聚合物中的2种介导DNA转染到COS-7细
胞内。新聚合物的转染效率是PEI的4-8倍并且等于或优于Lipofectamine2000。因此，在
另一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种siRNA分子和阳离子聚合物的组合物，其
中所述阳离子聚合物是聚(β-氨基酯-参见Lyn同上)，和通过施用此种组合物抑制靶基
因表达，PCSK9mRNA的方法。上文提及的聚(β-氨基酯)在美国公开专利申请20020131951
中进一步描述，所述美国公开专利申请名称为“Biodegradable poly(beta-amino esters)
and uses thereof”，2002年9月19日由Langer等人提交。应当指出用于促进RNAi诱导
实体的递送的阳离子聚合物可以这样修饰，从而使得它们掺入除聚合物包含的主要单体亚
单位外的一种或多种残基。例如，一个或多个可替代的残基可以加入聚合物的末端，或聚合
物可以通过除聚合物包含的主要单体外的残基进行连接。

[0375] 还可以用于增强RNAi诱导实体的递送的另外阳离子聚合物包括聚酰胺型胺(PAMAM)树状聚体，聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯(pDMAEMA)，及其季胺类似物聚
(2-三甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯(pTMAEMA)，聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸(PAGA)，和
聚(4-羟基-1-脯氨酸酯)。关于这些试剂的进一步描述，参见Han(2000)。参见′617申
请。

[0376] (ii)肽分子转运蛋白-在某些实施方案中，本发明提供了包含与肽分子转运蛋白结合的，对于PCSK9mRNA特异的本文描述的任何一种或多种RNA诱导实体的组合物。研
究者已显示多种肽能够充当关于核酸的递送试剂。(如本文所使用的，多肽视为“肽”，如
果它的长度短于约50个氨基酸的话)。例如转录因子，包括HIV Tat蛋白质(Frankel等
人，Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiencyvirus.Cell
55：1189-1193，(1988))，单纯疱疹病毒的VP22蛋白质(Elliott，等人，Intercellular
trafficking and protein delivery by a herpes virusstructural protein.Cell 88：
223-233(1997)和果蝇的触角足蛋白(Joliot等人，Antennapedia homeobox peptide
regulates neural morphogenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868(1999)) 可
以从细胞表面穿透质膜。负责膜穿透的肽区段由11-34个氨基酸残基组成，高度富含精
氨酸，且通常称为富含精氨酸的肽(ARPs)或穿膜肽(penetratins)。当与更大的多肽共
价连接时，ARPs能够使融合的多肽转运经过质膜(Fawell等人，Tat-mediated delivery
of heterologous proteins into cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：664-668(1994)；
Schwarze等人，In vivoprotein transduction：delivery of a biologically active
protein.Science285：1569-1572(1999) 和 Derossi 等 人，Trojan peptides：the
penetratinsystem for intracellular delivery.Trends Cell Biol.8：84-87(1998)。

[0377] 同样，当寡核苷酸与ARPs共价连接时，它们快得多地由细胞摄取。参见′617专利申请中的参考文献49和50。同样，近期研究Futaki等人，Arginine-rich peptides.An
abundant source of membrane-permeablepeptides having potential as carriers for
intracellular protein delivery.J.Biol.Chem.276：5836-5840(2001)已显示8个精氨
酸的聚合物足以用于这种跨膜转运。如同阳离子聚合物，ARPs也是带正电的且可能能够结
合RNA，暗示可能无需使siRNA或shRNA与ARPs共价连接。

[0378] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含至少一种RNAi诱导实体和肽分子转运蛋白的组合物，以及通过施用此种组合物抑制靶转录物表达的方法，其中所述RNAi诱导
实体是靶向PCSK9mRNA转录物的siRNA。肽分子转运蛋白包括但不限于，如′617专利申请
中详述的参考文献46-51、120和134-136中描述的那些以及对于本领域普通技术人员显而
易见的其变体。富含精氨酸的肽包括仅由精氨酸残基组成的肽。

[0379] 优选的肽分子转运蛋白长度小于约50个氨基酸。在本发明的某些实施方案中，肽分子转运蛋白是具有约7-34个氨基酸的长度的肽。许多优选的肽是富含精氨酸的。在本发
明的某些实施方案中，肽是富含精氨酸的，如果它包括至少20％、至少30％、或至少40％、
或至少50％、或至少60％或至少70％、或至少80％、或至少90％的精氨酸的话。在本发明
的另外一个实施方案中，肽分子转运蛋白是包括6-20个精氨酸残基的富含精氨酸的肽。在
另外一个实施方案中，RNAi诱导实体例如siRNA和肽分子转运蛋白是共价结合的，而在本
发明的其他实施方案中，RNAi诱导实体和肽分子转运蛋白混合在一起但彼此未共价结合。

[0380] 在另外一个实施方案中，本发明的特征在于富含组氨酸的肽作为肽分子转运蛋白。参见Kichler等人，Histidine-rich amphipathic peptideantibiotics promote
efficient delivery of DNA into mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA.18；
100(4)：1564-8(2003)。富含组氨酸的肽可以显示出如对于富含精氨酸的肽所述的长度和
组氨酸残基百分比。因此，本发明的实施方案提供了包含靶向PCSK9mRNA转录物的至少一
种RNAi诱导实体和富含组氨酸的肽的组合物，以及通过施用此种组合物抑制靶转录物表
达的方法。

[0381] 促进RNAi诱导实体对受试者中的细胞的递送的另外肽或经修饰的肽也可以在本发明的组合物中使用。参见例如McKenzie等人，PotentNew Class of Reductively
Activated Peptide Gene Delivery Agents.J.Biol.Chem.，275(14)：9970-9977(2000)，其描述了富含赖氨酸的肽家族。还参见Park等人，Synthesis of Sulfhydryl Cross-Linking
Poly(Ethylene Glycol Peptides and Glycopeptides as Carriers for GeneDelivery.
Bioconjugate Chem.，13：232-239(2002)，其描述了包含巯基残基用于形成二硫键的肽可
以掺入聚乙二醇(PEG)，这被认为减少与血清蛋白质的非特异性结合。

[0382] 包括诸如半乳糖或甘露糖残基的部分的糖肽也可以用于增强依照本发明的RNAi诱导实体的选择性摄取。此种糖肽还可以包括巯基用于形成二硫键，Parks等人同上。本
发明进一步包含增强核酸离开胞吞小泡的各种试剂的施用。此种试剂包括例如如在Zhang
等人.The in vivouse of chloroquine to promote non-viral gene delivery to the
liver via theportal vein and bile duct.J.Gene Med.，5：209-218，2003中详述的氯喹，和如在Satishchandran C.Characterization of a new class of DNA deliverycomplexe
formed by the local anesthetic bupivacaine.Biochimica etBiophysica Acta 1468：
20-30(2000)中详述的布比卡因。脱离增强剂可以全身、口部和/或局部施用(例如在所需
作用部位处或与所需作用部位紧密接近)。它们可以连同RNAi诱导实体一起递送或分开递
送。

[0383] 本发明包含如本文描述的其他递送试剂(例如聚合递送试剂)的修饰，以掺入肽分子转运蛋白以促进递送试剂到细胞内的转运。

[0384] C.另外的聚合递送试剂

[0385] 在某些实施方案中，本发明提供了包含RNAi诱导实体和多种聚合递送试剂中的任何一种的组合物，包括经修饰的聚合物，加上上文描述的那些。本发明进一步提供了抑制
细胞中的PCSK9mRNA转录物表达的方法以及治疗或预防疾病或状况的方法，所述疾病或状
况与PCSK9mRNA或其编码的蛋白质相关，或者由PCSK9mRNA或其编码的蛋白质介导。

[0386] 合适的递送试剂包括已显示增强DNA到细胞的递送的各种试剂。这些包括经修饰形式的阳离子聚合物，例如上文提及的那些，例如聚(L-组氨酸)-接枝-聚(L-赖氨
酸)聚合物(Benns等人，pH-SensitiveCationic Polymer Gene Delivery Vehicle：N-A
c-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine)Comb Shaped Polymer，Bioconj.Chem.11：
637-645(2000))，聚组氨酸-PEG(Putnam等人，Polyhistidine-PEG：DNAnanocomposites
for gene delivery，Biomaterials 24：4425-4433(2003))，叶酸-PEG-接枝-聚氮丙啶
(Benns等人，Optimization of factorsinfluencing the transfection efficiency of
folate-PEG-folate-graftpolyethyleneimine，J.Cont.Release 79：255-269(2002))，
聚氮丙啶-硫酸葡聚糖(Tiyaboonchai等人，Formulation and characterization o
fDNA-polyethylenemimine-dextran sulfate nanoparticles.Eur.J.Pharm.Sci.19：
191-202(2003))。聚合物可以是分支的或线性的并且可以是接枝的或未接枝的。

[0387] 在某些实施方案中，聚合物与RNAi诱导实体形成复合物，所述复合物随后施用于受试者。复合物可以称为纳米颗粒(nanoparticle)或纳米复合物(nanocomposite)。任何
聚合物都可以进行修饰以掺入PEG或其他亲水聚合物，其用于减少补体激活和其他血浆蛋
白质的结合。阳离子聚合物可以进行多重修饰。例如，阳离子聚合物可以进行修饰以掺入
减少聚合物的负电荷的部分(例如咪唑)，并且可以用次级部分例如PEG进行进一步修饰。

[0388] 此外，还可以使用与上文描述的阳离子聚合物不同的多种聚合物和聚合物基质。此种聚合物包括许多非阳离子聚合物，即在生理pH下不具有正电荷的聚合物。此种聚合
物可以具有某些优点，例如减少的细胞毒性和在一些情况下FDA批准的。许多合适的聚合
物已显示在其他背景中增强药物和基因递送。此种聚合物包括例如聚(丙交酯)(PLA)、聚
(乙交酯)(PLG)、和聚(DL-丙交酯共乙交酯)(PLGA)(Panyam等人，Rapid endo-lysosomal
escape of poly(DL-lactide-co-glycol-ide)nanoparticles：implications for drug
and genedelivery，FASEB J.，16：1217-1226(2002))，这可以配制成纳米颗粒用于递送
本发明的RNAi诱导实体。可以使用前述共聚物和组合。在本发明的某些实施方案中，阳
离子聚合物用于凝聚siRNA、shRNA、微小RNA或载体，并且凝聚的复合物通过PLGA或另
一种非阳离子聚合物进行保护。可以使用的其他聚合物包括非凝聚的聚合物例如聚乙烯
醇或聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓(poly(N-ethyl-4-vinylpyridium)溴化物，其可以与
Pluronic 85复合。在本发明中使用的其他聚合物包括阳离子和非阳离子聚合物之间的
组合。例如，可以使用聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)-接枝的聚(L-赖氨酸)(Jeong等人，
Poly(L-lysine)-g-poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)micelles for low cytotoxic
biodegradablegene delivery carriers.J Control Release，82(1)：159-66(2002))和其
他组合，包括PLA、PLG或PLGA，以及任何阳离子聚合物或经修饰的阳离子聚合物，例如上文
讨论的那些。

[0389] D.掺入靶向部分的经修饰的递送试剂

[0390] 本发明还包含了任何一种递送试剂的修饰，以掺入增强试剂到细胞的递送和/或增强试剂到需要它在其中抑制靶转录物的细胞的选择性递送。此种试剂称为“递送增强试
剂”或“靶向部分”。

[0391] 可以使用多种靶向部分中的任何一种，包括但不限于，(i)与由其中需要抑制的细胞(例如呼吸上皮细胞)表达的分子特异性结合的抗体或抗体片段；(ii)与由其中需要抑
制的细胞表达的分子特异性结合的配体。

[0392] 在本发明的某些优选实施方案中，抗体或配体的结合诱导结合复合物的内在化。在本发明的某些实施方案中，递送增强试剂(例如，抗体、抗体片段或配体)与RNAi诱导载
体(例如，DNA载体)缀合以增加递送或增强选择性。用于使抗体或配体与核酸或本文描述
的各种递送试剂缀合的方法是本领域众所周知的。参见例如，″Cross-Linking″，Pierce
Chemical Technical Library，最初公开于1994-95 Pierce Catalog，以及其中引用的参
考文献，和Wong S S，Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking，CRC Press
Publishers，Boca Raton，1991。

[0393] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的PCSK9基因表达或PCSK9活性相关的疾病、病症、性状或状况的方法，其包括在适合于调节
受试者或生物中的靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。

[0394] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种代谢疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表
达的抑制剂表达的条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子
接触。在一个实施方案中，PCSK9基因表达的抑制剂是miRNA。

[0395] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种代谢疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9靶基因
表达的条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触，由此可
以达到一种或多种代谢疾病、性状或状况的治疗或预防。

[0396] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种心血管疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9靶基
因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触，由此
可以达到一种或多种心血管疾病、性状或状况的治疗或预防。

[0397] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种心血管疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节(例如抑制)受试者或生物中
的靶基因表达的抑制剂表达的条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如
siNA)分子接触。在一个实施方案中，靶基因表达的抑制剂是miRNA。

[0398] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的高血压的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或生
物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0399] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的冠状血栓形成的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9表达的条件下，使受试者或
生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0400] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的中风的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或生物
与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0401] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的脂质综合征的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者
或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0402] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的高血糖症的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或
生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0403] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的高甘油三酯血症的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受
试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0404] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的高脂血症的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或
生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0405] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的缺血的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或生物
与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0406] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的充血性心力衰竭的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受
试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0407] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的心肌梗死的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的PCSK9基因表达的条件下，使受试者或
生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触。

[0408] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于调节受试者或生物中的超过一种靶基因表达的方法，其包括使受试者或生物与本发明的一种或多种核酸或多核苷酸(例如siNA)
分子接触，特征在于经由局部施用于相关组织或细胞，例如肝、胰、小肠、脂肪组织或例如病症、性状或状况中涉及的细胞和组织，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个
实施方案中，本发明的特征在于经由全身施用(例如经由siNA的静脉内、肌内、皮下或GI
施用)于相关组织或细胞，例如受试者或生物中的代谢和/或心血管疾病、性状或状况的
维持或发展中涉及的组织或细胞，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。本发明的
siNA分子可以如本文描述的或本领域其他方面已知的进行配制或缀合，以靶向受试者或生
物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与本领域已知的其他治疗性处理和方式组合，用于
治疗或预防受试者或生物中的心血管疾病、性状、病症或状况。在一个实施方案中，心血管
疾病选自高血压、冠状血栓形成、中风、脂质综合征、高糖血症、高甘油三酯血症、高脂血症、缺血、充血性心力衰竭和心肌梗死。

[0409] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子或双链核酸分子配制为下述专利中描述的组合物：美国临时专利申请号60/678,531和于2005年7月29日提交的相关的美
国临时专利申请号60/703,946，和于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号
60/737,024(Vargeese等人)。

[0410] 在本文用于调节一种或多种PCSK9靶表达或用于治疗或预防细胞、受试者或生物中的PCSK9相关疾病、性状、状况或表型的任何方法中，本发明的核酸或多核苷酸(例如
siNA)分子经由RNA干扰调节一种或多种PCSK9靶的表达。在一个实施方案中，RNA干扰是
RISC介导的PCSK9靶的切割(例如，siRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干
扰是PCSK9靶的翻译抑制(例如，miRNA介导的RNA干扰)。在一个实施方案中，RNA干扰
是PCSK9靶的转录抑制(例如，siRNA介导的转录沉默)。在一个实施方案中，RNA干扰在
细胞质中发生。在一个实施方案中，RNA干扰在核中发生。

[0411] 本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以被设计为经由多种核酸分子的RNAi靶向下调或抑制靶(例如PCSK9)基因表达。在一个实施方案中，本发明的siNA分子
用于靶向对应于靶基因的各种DNA，例如经由异染色质基因沉默或转录抑制。在一个实施
方案中，本发明的siNA分子用于靶向对应于靶基因的各种RNAs，例如经由RNA靶切割或
翻译抑制。此种RNAs的非限制性例子包括信使RNA(mRNA)、非编码RNA(ncRNA)或调节元
件(参见例如Mattick，2005，Science，309，1527-1528和Claverie，2005，Science，309，
1529-1530)，其包括miRNA和其他小RNAs、一种或多种靶基因的可变RNA剪接变体、一种或
多种靶基因的转录后修饰的RNA、一种或多种靶基因的前mRNA、和/或RNA模板。如果可变
剪接产生通过使用合适的外显子加以区分的转录物家族，那么本发明可以用于抑制通过合
适的外显子的基因表达，以特异性抑制或区分基因家族成员的功能。例如，包含可变剪接的
跨膜结构域的蛋白质可以以膜结合和分泌形式进行表达。使用本发明靶向包含跨膜结构
域的外显子可以用于确定与蛋白质的分泌形式成对比的膜结合形式的药物靶向的功能结
果。涉及靶向这些RNA分子的本发明应用的非限制性例子包括治疗药物应用、化妆品应用、
兽医应用、药物发现应用、分子诊断和基因功能应用、和基因作图，例如用本发明的siNA分
子使用单核苷酸多态性作图。此种应用可以使用已知的基因序列或来自可从表达序列标签
(EST)获得的部分序列来实现。

[0412] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用于靶向对应于一种或多种具有同源序列的基因家族如PCSK9家族基因(例如，所有已知的PCSK9同种
型、或PCSK9同种型的选择定组)的保守序列。照这样，靶向多重PCSK9基因或RNA靶的
siNA分子可以提供增加的疗效。此外，通过避免其他PCSK9同种型，可以避免毒性。

[0413] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用于靶向对应于一种或多种基因家族如PCSK9家族基因的保守序列。例如，本发明的特征在于使用单个
siNA分子靶向(表达或功能的切割或抑制)超过一种PCSK9基因序列，通过靶向所靶向的
受体基因的保守序列。照这样，靶向多重PCSK9靶的siNA分子可以提供增加的疗效。

[0414] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以用于在多种应用中表征基因功能的途径。例如，本发明可以用于抑制途径中的一种或多种靶基因的活
性，以在基因功能分析、mRNA功能分析或翻译分析中确定未表征的一种或多种基因的功能。
本发明可以用于确定通向药物开发的涉及各种疾病和状况的潜在靶基因途径。本发明可以
用于了解例如与例如受试者或生物中的PCSK9基因表达或活性相关的代谢和/或心血管疾
病、病症、性状和状况的进展和/或维持中涉及的基因表达的途径。

[0415] 在一个实施方案中，本发明的一种或多种核酸或多核苷酸(siNA)分子和/或方法用于下调编码通过Genbank登记提及的RNA的一种或多种基因的表达，例如编码通过
Genbank登记号在本文中提及的一种或多种RNA序列的靶基因，例如表I中显示的Genbank
登记号或者PCT/US03/05028、美国临时专利申请号60/363,124或USSN 10/923,536中显示
的Genbank登记号，所述所有专利引入本文作为参考。

[0416] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的一种或多种代谢疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的靶基因表达的
条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触，由此可以达到
一种或多种代谢疾病、性状或状况的治疗或预防。在一个实施方案中，本发明的特征在于经
由局部施用于相关组织或细胞，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方
案中，本发明的特征在于经由全身施用(例如经由siNA的静脉内、肌内、皮下或GI施用)
于相关组织或细胞，例如受试者或生物中的代谢疾病、性状或状况的维持或发展中涉及的
组织或细胞(例如，肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞)，使受试者或生物与本发明的siNA分子
接触。本发明的siNA分子可以如本文描述的或本领域其他方面已知的进行配制或缀合，以
靶向受试者或生物中的合适组织或细胞(例如，肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞)。siNA分子
可以与本领域已知的其他治疗性处理和方式组合，用于治疗或预防受试者或生物中的代谢
疾病、性状或状况。在一个实施方案中，代谢疾病选自糖尿病(例如I型和/或II型糖尿
病)、胰岛素抵抗、肥胖或相关状况，包括但不限于睡眠性呼吸暂停、食管裂孔疝、反流性食管炎(esophagisitis)、骨关节炎、痛风、与重量增加相关的癌症、胆结石、肾结石、肺动脉高压、不育、心血管疾病、超过正常重量、和超过正常脂质水平、尿酸水平或草酸水平。

[0417] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于受试者或生物中的重量减轻的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的靶基因表达的条件下，使受试者或生物与本发明的
核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触，由此可以达到重量减轻。在一个实施方案中，本发
明的特征在于经由局部施用于相关组织或细胞，例如肝、胰、小肠、脂肪组织或细胞，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本发明的特征在于经由全身施用
(例如经由siNA的静脉内、肌内、皮下或GI施用)于相关组织或细胞，使受试者或生物与本
发明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可以如本文描述的或本领域其他方面已知的进
行配制或缀合，以靶向受试者或生物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与本领域已知的
其他治疗性处理和方式组合，用于受试者或生物中的重量减轻。

[0418] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防受试者或生物中的心血管疾病、病症和/或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的靶基因(例如PCSK9)
表达的条件下，使受试者或生物与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子接触，由此可
以达到代谢和/或心血管疾病、病症和/或状况的治疗或预防。在一个实施方案中，本发明
的特征在于经由局部施用于相关组织或细胞，例如受代谢和/或心血管疾病、病症和/或状
况影响的组织或细胞，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在一个实施方案中，本
发明的特征在于经由全身施用(例如经由siNA的静脉内或皮下施用)于相关组织或细胞，
例如受代谢和/或心血管疾病、病症和/或状况影响的组织或细胞，使受试者或生物与本发
明的siNA分子接触。本发明的siNA分子可以如本文描述的或本领域其他方面已知的进行
配制或缀合，以靶向受试者或生物中的合适组织或细胞。siNA分子可以与本领域已知的其
他治疗性处理和方式组合，用于治疗或预防受试者或生物中的心血管疾病、性状、病症或状
况。

[0419] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预防与受试者或生物中的基因表达相关的疾病、病症、性状或状况的方法，其包括在适合于调节受试者或生物中的靶基因
(例如PCSK9)表达的条件下，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。基因表达的减少
和因此分别的蛋白质/RNA水平中的减少在某种程度上减轻了疾病、病症、性状或状况的症
状。

[0420] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的PEG干扰素和本发明的一种或多种双链核酸分子或siNA分子的组合物。在另一个实施
方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的下述和本发明的一种
或多种双链核酸分子或siNA分子的组合物：但不限于(例如，阿伐他汀、辛伐他汀、普伐
他汀、氟伐他汀、洛伐他汀)，其他PCSK9抑制剂例如tocetrapib和JTT-705，以及抗高血
压剂，例如α1-肾上腺素能拮抗剂(例如哌唑嗪)、β-肾上腺素能拮抗剂(例如普萘洛
尔、纳多洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔)，组合的α/β肾上腺素能拮抗剂(例如拉
贝洛尔(Labetaol))，肾上腺素能神经元阻滞剂(例如，胍乙啶、利血平)，CNS-作用抗高
血压剂(例如，可乐定、甲基多巴、胍那苄)，抗血管紧张素II试剂，包括血管紧张素转变
酶(ACE)抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、赖诺普利)和维拉帕米、地尔硫 硝苯地
平)，利尿药(例如，氢氯噻嗪、Fhlorthalidone、呋塞米、氨苯蝶啶)和直接的血管舒张剂
(vasodialators)(例如肼屈嗪、米诺地尔、硝普钠、二氮嗪)。

[0421] 在一个实施方案中，本发明的治疗方法的特征在于与一种或多种其他治疗方式组合施用本发明的双链核酸分子，所述其他治疗方式包括抑制素(statin)(例如，阿伐
他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀)，其他PCSK9抑制剂例如tocetrapib和
JTT-705，以及抗高血压剂，例如α1-肾上腺素能拮抗剂(例如哌唑嗪)、β-肾上腺素能拮
抗剂(例如普萘洛尔、纳多洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔)，组合的α/β肾上腺素
能拮抗剂(例如拉贝洛尔)，肾上腺素能神经元阻滞剂(例如，胍乙啶、利血平)，CNS-作用
抗高血压剂(例如，可乐定、甲基多巴、胍那苄)，抗血管紧张素II试剂，包括血管紧张素转
变酶(ACE)抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、赖诺普利)和维拉帕米、地尔硫蕈、硝苯地
平)，利尿药(例如，氢氯噻嗪、Fhlorthalidone、呋塞米、氨苯蝶啶)和直接的血管舒张剂
(例如肼屈嗪、米诺地尔、硝普钠、二氮嗪)。在另一个实施方案中，此种组合疗法可以在本
文的任何一个实施方案中利用。

[0422] 在本发明的任何一种治疗或预防方法中，核酸或多核苷酸(例如siNA)可以作为疗程给受试者施用，例如以各种时间间隔施用，例如在疗程期间每天一次，在疗程期间每2
天一次，在疗程期间每3天一次，在疗程期间每4天一次，在疗程期间每5天一次，在疗程期
间每6天一次，在疗程期间每周一次，在疗程期间每隔一周一次，在疗程期间每月一次等。
在一个实施方案中，疗程是每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周一次。在一个实施方案中，疗程为约1-约52周或更长(例如，无限期)。在一个实施方案中，疗程为约1-约48个月或更
长(例如，无限期)。

[0423] 在一个实施方案中，治疗或预防过程涉及初始疗程，例如对于固定时间间隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，随后为维持疗程，例如对于另外的固定时间间隔(例如1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或更多)每4、6、8、10、15、20、25、30、35、40或更多周一次。在本发明的任何一种治疗或预防方法中，核酸或多核苷酸(例如siNA)可以如本文所描述的或本领域其他方面已知的全身
性地给受试者施用，单独作为单一疗法或与本文描述的或本领域已知的另外疗法组合。全
身施用可以包括例如，如本领域一般已知的肺(吸入、喷雾法等)静脉内、皮下、肌内、导管
插入、鼻咽、经皮或经口/胃肠施用。

[0424] 在本发明的任何一种治疗或预防方法中，核酸或多核苷酸(例如siNA)可以如本文描述的或本领域其他方面已知的局部地施用于受试者或施用于局部组织，单独作为单一
疗法或与本领域已知的另外疗法组合。局部施用可以包括例如，如本领域一般已知的吸入、
喷雾法、导管插入、植入、直接注射、皮肤/经皮应用、支架、滴耳剂/滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任何其他局部施用技术、方法或操作。

[0425] 在一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)产生具有预定复杂性的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体文库；和(b)在适合于测定靶RNA序列内的
RNAi靶位点的条件下，测定上文(a)的siNA构建体。在一个实施方案中，(a)的siNA分子
具有固定长度的链，例如长度为约23个核苷酸。在另一个实施方案中，(a)的siNA分子具
有不同长度，例如具有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、
20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在
一个实施方案中，该测定可以包含如本文所描述的重构的体外siNA测定。在另一个实施方
案中，该测定可以包括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。在另一个实施方案中，就可检测
的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过凝胶电泳、RNA印迹分析或RNA酶保护测定，以确
定靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。靶RNA序列可以如本领域已知的获得，例如
对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体内系统中通过细胞表达。

[0426] 在一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)产生具有预定复杂性例如4N的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体的随机文库，其中N代表在每条siNA构
建体链中碱基配对的核苷酸的数目(例如，对于具有含19个碱基对的21核苷酸有义和反
义链的siNA构建体，复杂性将是419)；和(b)在适合于测定靶RNA序列内的RNAi靶位点的
条件下，测定上文(a)的siNA构建体。在另一个实施方案中，(a)的siNA分子具有固定长
度的链，例如长度为约23个核苷酸。在另外一个实施方案中，(a)的核酸或多核苷酸(例如
siNA)分子具有不同长度，例如具有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、
18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在一个实施方案中，该测定可以包含如本文实施例6中所描述的重构的体外siNA
测定。在另一个实施方案中，该测定可以包括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。在另一
个实施方案中，就可检测的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过凝胶电泳、RNA印迹分析
或RNA酶保护测定，以确定靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。靶RNA序列可以如本
领域已知的获得，例如对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体内系统中通过细胞表达。

[0427] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于这样的方法，其包括：(a)分析由靶基因编码的RNA靶的序列；(b)合成与(a)的RNA的一个或多个区域具有序列互补性的一个或
多个核酸或多核苷酸(例如siNA)分子组；和(c)在适合于测定靶RNA序列内的RNAi靶的
条件下，测定(b)的siNA分子。在一个实施方案中，(b)的siNA分子具有固定长度的链，
例如长度为约23个核苷酸。在另一个实施方案中，(b)的siNA分子具有不同长度，例如具
有长度为约15个-约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的链。在一个实施方案中，该
测定可以包含如本文所描述的重构的体外siNA测定。在另一个实施方案中，该测定可以包
括在其中表达靶RNA的细胞培养系统。就可检测的切割水平分析靶RNA的片段，例如通过
凝胶电泳、RNA印迹分析或RNA酶保护测定，以确定靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位
点。靶RNA序列可以如本领域已知的获得，例如对于体外系统通过克隆和/或转录，和在体
内系统中通过表达。

[0428] “靶位点”意指靶RNA内对于由siNA构建体介导的切割“被靶向”的序列，所述siNA构建体在其反义区内包含与靶序列互补的序列。

[0429] “可检测的切割水平”意指靶RNA的切割(和切割产物RNAs的形成)至足以区分超过由靶RNA随机降解产生的RNAs背景的切割产物的程度。对于大多数检测方法，来自
1-5％靶RNA的切割产物的产生足以检测超过背景。

[0430] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明的siNA分子的组合物，所述本发明的siNA分子可以是化学修饰的。在另一个实施
方案中，本发明的特征在于包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的本发明核酸或多核苷
酸(例如siNA)分子的药物组合物，所述本发明核酸或多核苷酸(例如siNA分子)可以是
化学修饰的，靶向一种或多种基因。在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于诊断受试
者中的疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于诊断受试者中的疾病、性状或状况的条件
下，给受试者施用本发明的组合物。在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于治疗或预
防受试者中的疾病、性状或状况，例如代谢和/或心血管疾病、性状、状况或病症的方法，其包括在适合于治疗或预防受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用单独或与
一种或多种其他治疗化合物结合的本发明的组合物。

[0431] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于确认靶基因靶的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包括与靶基因的
RNA互补的序列；(b)在适合于调节细胞、组织、受试者或生物中的靶基因表达的条件下，将
siNA分子引入细胞、组织、受试者或生物内；和(c)通过测定细胞、组织、受试者或生物中的任何表型改变来确定基因的功能。

[0432] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于确认靶的方法，其包括：(a)合成本发明的siNA分子，其可以是化学修饰的，其中所述siNA链之一包括与靶基因的RNA互补的
序列；(b)在适合于调节生物系统中的靶基因表达的条件下，将siNA分子引入生物系统内；
和(c)通过测定生物系统中的任何表型改变来确定基因的功能。

[0433] “生物系统”意指来自生物源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或动物，其中所述系统包括对RNAi活性所需的组分。术语“生物系统”包括例如，细
胞、组织、受试者或生物、或其提取物。术语生物系统还包括可以在体外背景中使用的重构
的RNAi系统。

[0434] “表型改变”意指响应与本发明的核酸或多核苷酸分子(例如siNA)接触或用本发明的核酸或多核苷酸分子(例如siNA)治疗发生的关于细胞的任何可检测改变。此种可检
测的改变包括但不限于，如可以通过本领域已知的方法测定的形状、大小、增殖、运动性、蛋白质表达或RNA表达中的改变或者其他物理或化学变化。可检测的改变还可以包括报道基
因/分子的表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)或用于鉴定表达的蛋白质的各种标记或可以被
测定的任何其他细胞组分。

[0435] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的试剂盒，所述本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以是化学修饰的，
所述试剂盒可以用于调节生物系统包括例如细胞、组织、受试者或生物中的靶基因表达。在
另一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的超过一种siNA分子的试剂盒，所述本
发明的siNA分子可以是化学修饰的，所述试剂盒可以用于调节生物系统包括例如细胞、组
织、受试者或生物中的超过一种靶基因的表达。

[0436] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含本发明的一种或多种核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的细胞，所述本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以是化学修饰
的。在另一个实施方案中，包含本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的细胞是哺乳
动物细胞。在另外一个实施方案中，包含本发明的siNA分子的细胞是人细胞。

[0437] 在一个实施方案中，可以是化学修饰的本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的合成包括：(a)合成siNA分子的2条互补链；(b)在适合于获得双链siNA分子的条件
下，使2条互补链一起退火。在另一个实施方案中，siNA分子的2条互补链的合成是通过
固相寡核苷酸合成。在另外一个实施方案中，siNA分子的2条互补链的合成是通过固相串
联寡核苷酸合成。

[0438] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于合成核酸或多核苷酸(例如siNA)双链体分子的方法，其包括：(a)合成siNA分子的第一条寡核苷酸序列链，其中所述第一条寡
核苷酸序列链包含可切割的接头分子，其可以用作支架用于合成siNA的第二条寡核苷酸
序列链；(b)在第一条寡核苷酸序列链的支架上合成siNA的第二条寡核苷酸序列链，其中
所述第二条寡核苷酸序列链进一步包含可以用于纯化siNA双链体的化学部分；(c)在适合
于2条siNA寡核苷酸链杂交且形成稳定的双链体的条件下，切割(a)的接头分子；和(d)
利用第二条寡核苷酸序列链的化学部分纯化siNA双链体。在一个实施方案中，上文(c)中
的接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护期间发生，例如在使用烷基胺碱例如甲胺的水解条
件下。在一个实施方案中，合成方法包括在固体支持体例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙
烯上的固相合成，其中(a)的第一种序列在可切割接头例如琥珀酰接头上使用固体支持体
作为支架来合成。用作支架用于合成第二条链的(a)中的可切割接头可以包含与固体支持
体衍生的接头相似的反应性，从而使得固体支持体衍生的接头和(a)的可切割接头的切割
伴随发生。在另一个实施方案中，可以用于分离附着的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包
含三苯甲基，例如二甲氧三苯甲基，其可以在如本文所描述的三苯甲基依赖性(trityl-on)
合成策略中使用。在另外一个实施方案中，化学部分例如二甲氧三苯甲基在纯化期间例如
使用酸性条件去除。

[0439] 在进一步的实施方案中，用于核酸或多核苷酸(例如siNA)合成的方法是溶液相合成或混合相合成，其中siNA双链体的2条链使用与第一种序列附着的可切割接头串联合
成，所述可切割接头充当支架用于合成第二种序列。在适合于分开的siNA序列链杂交的条
件下切割接头导致双链siNA分子的形成。

[0440] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于合成核酸或多核苷酸(例如siNA)双链体分子的方法，其包括：(a)合成siNA分子的一条寡核苷酸序列链，其中所述序列包含
可切割的接头分子，其可以用作支架用于合成另一条寡核苷酸序列；(b)在(a)的支架上合
成与第一条序列链具有互补性的第二条寡核苷酸序列，其中所述第二条序列包含双链siNA
分子的另一条链，且其中所述第二条序列进一步包含可以用于分离附着的寡核苷酸序列的
化学部分；(c)在适合于分离包含由可切割接头连接的2条siNA寡核苷酸链的全长序列的
条件下，和在适合于2条siNA寡核苷酸链杂交且形成稳定的双链体的条件下，利用第二条
寡核苷酸序列链的化学部分纯化(b)的产物。在一个实施方案中，上文(c)中的接头分子的
切割在寡核苷酸的脱保护期间发生，例如在水解条件下。在另一个实施方案中，上文(c)中
的接头分子的切割在寡核苷酸的脱保护后发生。在另一个实施方案中，合成方法包括在固
体支持体例如可控孔度玻璃(CPG)或聚苯乙烯上的固相合成，其中(a)的第一种序列在可
切割接头例如琥珀酰接头上使用固体支持体作为支架来合成。用作支架用于合成第二条链
的(a)中的可切割接头可以包含与固体支持体衍生的接头相似的反应性或不同的反应性，
从而使得固体支持体衍生的接头和(a)的可切割接头的切割伴随或顺次发生。在一个实施
方案中，可以用于分离附着的寡核苷酸序列的(b)的化学部分包含三苯甲基，例如二甲氧
三苯甲基。

[0441] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于在单一合成法中制备双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括：(a)合成具有第一种和第二种序列的寡核苷酸，
其中第一种序列与第二种序列互补，且第一种寡核苷酸序列经由可切割接头与第二种序列
连接，且其中末端5′-保护基团例如5′-O-二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持在具有第
二种序列的寡核苷酸上；(b)使寡核苷酸脱保护，由此脱保护导致使2种寡核苷酸序列连接
的接头的切割；和(c)在适合于分离双链siNA分子的条件下，例如使用如本文所描述的三
苯甲基依赖性合成策略，纯化(b)的产物。

[0442] 在另一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的合成方法包括Scaringe等人，美国专利号5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教导，所述专利整体
引入本文作为参考。

[0443] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸(例如，PCSK9 RNA或DNA)的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含增加siNA
构建体的核酸酶抗性的一种或多种化学修饰，例如具有式I-VII中任何一个或其任何组合
的一种或多种化学修饰。

[0444] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有增加的核酸酶抗性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有I-VII中任何一个或其任何组合
的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有增加的核酸酶抗性的siNA分子的条
件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0445] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的毒理学概况(例如，具有减弱的或无免疫刺激性质)的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括
(a)将具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引
入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学概况的siNA分子的条件下，测定步
骤(a)的siNA分子。

[0446] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的毒理学概况(例如，具有减弱的或无免疫刺激性质)的核酸或多核苷酸(例如siNA)制剂的方法，其包括
(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或本领域其他方面已知的递送媒介物
或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离具有改善的毒理学概况的siNA制剂的条件
下，测定步骤(a)的siNA制剂。

[0447] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激干扰素应答(例如，无干扰素应答或减弱的干扰素应答)的核酸或多核苷酸(例如siNA)
分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何一个或其
任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激干扰素应答的siNA分子
的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0448] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激干扰素应答(例如，无干扰素应答或减弱的干扰素应答)的核酸或多核苷酸(例如siNA)
制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或本领域其他方面
已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激干扰素应答的siNA
制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，干扰素包括干扰素α。

[0449] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激炎症或促炎细胞因子应答(例如，无细胞因子应答或减弱的细胞因子应答)的核酸或多
核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基
序)中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激细胞
因子应答的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，细胞因子
包含白细胞介素例如白细胞介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死α(TNF-α)。

[0450] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激炎症或促炎细胞因子应答(例如，无细胞因子应答或减弱的细胞因子应答)的核酸或多
核苷酸(例如siNA)制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述
的或本领域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺
激细胞因子应答的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，细
胞因子包含白细胞介素例如白细胞介素-6(IL-6)和/或肿瘤坏死α(TNF-α)。

[0451] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激Toll样受体(TLR)应答(例如，无TLR应答或减弱的TLR应答)的核酸或多核苷酸(例
如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有I-VII(例如，表IV中提及的siNA基序)中任何
一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离不刺激TLR应答的siNA
分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，TLR包含TLR3、TLR7、TLR8
和/或TLR9。

[0452] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在细胞、受试者或生物中不刺激Toll样受体(TLR)应答(例如，无TLR应答或减弱的TLR应答)的核酸或多核苷酸(例
如siNA)制剂的方法，其包括(a)产生包含本发明的siNA分子和如本文所描述的或如本领
域其他方面已知的递送媒介物或递送颗粒的siNA制剂，和(b)在适合于分离不刺激TLR应
答的siNA制剂的条件下，测定步骤(a)的siNA制剂。在一个实施方案中，TLR包含TLR3、
TLR7、TLR8和/或TLR9。

[0453] 在一个实施方案中，与没有化学修饰或具有较少的化学修饰的相应siNA分子相比较，本发明的化学修饰的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子具有改善的毒理学概况。

[0454] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中：(a)所述siNA分子的每条链
长度为约18个-约38个核苷酸；(b)所述siNA分子的一条链包含与所述靶RNA具有足够
互补性的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割；和(c)其中所述siNA
分子内的核苷酸位置进行化学修饰，以将siNA分子的免疫刺激性质减少至低于相应的未
修饰的siNA分子那种的水平。与未修饰或最低限度修饰的siNA相比较，此种siNA分子被
说成具有改善的毒理学概况。

[0455] “改善的毒理学概况”意指与未修饰或未配制的siNA、或具有较少的修饰或在给予改善的毒理学方面较不有效的修饰的siNA分子相比较，化学修饰或配制的核酸或多核苷
酸(例如siNA)构建体在细胞、受试者或生物中显示出减少的毒性。此种siNA分子也被
视为具有“改善的RNAi活性”。在非限制性例子中，与未修饰或未配制的siNA、或具有较少
的修饰或在给予改善的毒理学方面较不有效的修饰的siNA分子相比较，具有改善的毒理
学概况的siNA分子和制剂与细胞、受试者或生物中减少的脱靶效应和/或免疫刺激性质相
关，例如减少的、降低的或减弱的脱靶效应和/或免疫刺激应答。在一个实施方案中，此种
改善的毒理学概况的特征可以在于取消的或减少的脱靶效应。在另一个例子中，此种改善
的毒理学概况的特征可以在于取消的或减少的免疫刺激，例如减少或取消干扰素(例如干
扰素α)、炎性细胞因子(例如白细胞介素例如IL-6和/或TNF-α)和/或toll样受体
(例如，TLR-3、TLR-7、TLR-8和/或TLR-9)的诱导。在一个实施方案中，具有改善的毒理
学概况的siNA分子或制剂不包含核糖核苷酸。在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况
的siNA分子或制剂包含少于5个核糖核苷酸(例如，1个、2个、3个或4个核糖核苷酸)。
在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂包含Stab 7、Stab 8、Stab
11、Stab 12、Stab13、Stab 16、Stab 17、Stab 18、Stab 19、Stab 20、Stab 23、Stab 24、Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 28、Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 32、Stab 33、Stab
34、Stab 35、Stab 36或其任何组合(参见表IV)。在本文中，数字Stab化学包括表IV中
所示化学的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。
在一个实施方案中，具有改善的毒理学概况的siNA分子或制剂包含本发明的siNA分子和
如美国专利申请公开号20030077829中所述的制剂，所述专利包括附图整体引入本文作为
参考。

[0456] 在一个实施方案中，与给定核酸或多核苷酸(例如siNA)分子相关的免疫刺激应答的水平可以如本文所描述的或如本领域其他方面已知的进行测量，例如通过在测定中测
定PKR/干扰素应答、增殖、B细胞激活和/或细胞因子生产水平，以定量特定siNA分子的
免疫刺激应答(参见，例如，Leifer等人，2003，J Immunother.26，313-9；和美国专利号
5,968,909，整体引入作为参考)。在一个实施方案中，与未修饰或最低限度修饰的siNA分
子相比较，减少的免疫刺激应答为约10％-约100％，例如10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％减少的免疫刺激应答。在一个实施方案中，与siNA分子相
关的免疫刺激应答可以通过化学修饰的程度进行调节。例如，可以选择在siNA分子中具有
约10％-约100％(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)修饰的核苷酸位置的siNA分子，以具有如本文所描述的相应程度的免疫刺激性质。

[0457] 在一个实施方案中，就最优化的RNAi活性选择减少的免疫刺激应答的程度。例如，对治疗病毒感染保留某一程度的免疫刺激可以是优选的，其中对于最大的抗病毒活性，
免疫刺激中小于100％的减少可以是优选的(例如，免疫刺激中约10％、20％、30％、40％、
50％、60％、70％、80％或90％的减少)，而关于具有最小免疫刺激性质的核酸或多核苷酸
(例如siNA)分子抑制内源基因靶的表达可以是优选的，以防止非特异性毒性或脱靶效应
(例如免疫刺激中约90％-约100％的减少)。

[0458] 在一个实施方案中，本发明的特征在于经由RNA干扰(RNAi)指导靶RNA切割的化学合成的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其中(a)所述siNA分子的每条链长度为
约18个-约38个核苷酸；(b)所述siNA分子的一条链包含与所述靶RNA具有足够互补性
的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割；和(c)其中所述siNA分子的
一个或多个核苷酸进行化学修饰，以将siNA分子的免疫刺激性质减少至低于相应的未修
饰的siNA分子那种的水平。在一个实施方案中，每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至
少约18个核苷酸。

[0459] 在另一个实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含反义区，所述反义区具有与靶基因的核苷酸序列或
其部分互补的核苷酸序列，且进一步包含有义区，其中所述有义区包含与所述靶基因的核
苷酸序列或其部分基本上类似的核苷酸序列。在其的一个实施方案中，反义区和有义区包
含约18个-约38个核苷酸，其中所述反义区包含与有义区的核苷酸互补的至少约18个核
苷酸。在其的一个实施方案中，有义区中的嘧啶核苷酸是2′-O-甲基嘧啶核苷酸。在其的
另一个实施方案中，有义区中的嘌呤核苷酸是2′-脱氧嘌呤核苷酸。在其的另外一个实施
方案中，有义区中存在的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另一个实
施方案中，所述反义区中的嘧啶核苷酸是2′-脱氧-2′-氟嘧啶核苷酸。在其的另外一
个实施方案中，所述反义区中的嘌呤核苷酸是2′-O-甲基嘌呤核苷酸。在其的另外一个实
施方案中，所述反义区中存在的嘌呤核苷酸包含2′-脱氧嘌呤核苷酸。在另一个实施方案
中，反义区包含在所述反义区的3′末端处的硫代磷酸酯核苷酸间键。在另一个实施方案
中，反义区包含在所述反义区的3′末端处的甘油基修饰。

[0460] 在其他实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以包含本文描述的siNA分子的任何结构特征。在其他
实施方案中，包含经修饰的核苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质的siNA分子可以包含
本文描述的siNA分子的任何化学修饰。

[0461] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生化学合成的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，所述双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子具有化学修饰的核
苷酸以减少siNA分子的免疫刺激性质，其包括(a)在siNA分子中引入一个或多个经修饰
的核苷酸，和(b)在这样的条件下测定步骤(a)的siNA分子，与具有未修饰的核苷酸的相
应siNA分子相比较，所述条件适合于分离具有减少的免疫刺激性质的siNA分子。siNA分
子的每条链长度为约18个-约38个核苷酸。siNA分子的一条链包含与靶RNA具有足够互
补性的核苷酸序列，用于siNA分子经由RNA干扰指导靶RNA切割。在一个实施方案中，减
少的免疫刺激性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，炎性或促炎细胞因子例如
白细胞介素(IL-6)或肿瘤坏死α(TNF-α)取消的或减少的诱导。在另一个实施方案中，
减少的免疫刺激性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，Toll样受体(TLRs)例
如TLR3、TLR7、TLR8或TLR9取消的或减少的诱导。在另一个实施方案中，减少的免疫刺激
性质包含响应于引入细胞、组织或生物中的siNA，干扰素例如干扰素α取消的或减少的诱
导。

[0462] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其调节siNA构建体的有义和反义链之间的结合亲和力。

[0463] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和力的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具
有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离在
siNA分子的有义和反义链之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的条件下，测定步骤(a)
的siNA分子。

[0464] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其调节siNA构建体的反义链和细胞内的互补靶RNA序列之间的结合亲和力。

[0465] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其调节siNA构建体的反义链和细胞内的互补靶DNA序列之间的结合亲和力。

[0466] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的反义链和互补靶RNA序列之间具有增加的结合亲和力的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包
括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合
于分离在siNA分子的反义链和互补靶RNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的
条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0467] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生在siNA分子的反义链和互补靶DNA序列之间具有增加的结合亲和力的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包
括(a)将具有式I-VII中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合
于分离在siNA分子的反义链和互补靶DNA序列之间具有增加的结合亲和力的siNA分子的
条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0468] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其调节能够产生另外的内源siNA分子的细胞聚合酶的聚合酶活性，所述内源siNA分子与
化学修饰的siNA构建体具有序列同源性。

[0469] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生能够介导细胞聚合酶增加的聚合酶活性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，所述细胞聚合酶能够产生与化学修
饰的siNA分子具有序列同源性的另外的内源siNA分子，所述方法包括(a)将具有式I-VII
中任何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离能够介导细胞聚
合酶增加的聚合酶活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子，所述细胞聚合酶
能够产生与化学修饰的siNA分子具有序列同源性的另外的内源siNA分子。

[0470] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对细胞中靶多核苷酸的RNAi的化学修饰的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述化学修饰不以降低经由此种siNA
构建体介导的RNAi的功效的方式显著影响siNA与靶RNA分子、DNA分子和/或蛋白质或
对于RNAi所必需的其他因子的相互作用。

[0471] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对多核苷酸靶改善的RNAi特异性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任
何一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi特
异性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。在一个实施方案中，改善的特异性
包含与未修饰的siNA分子相比较具有减少的脱靶效应。例如，在本发明的siNA分子的有义
链或区的3′-末端、5′-末端、或3′和5′-末端处引入末端帽部分可以指导siNA具有
改善的特异性，其通过阻止有义链或有义区充当用于针对相应靶的RNAi活性的模板实现，
所述相应靶与有义链或有义区具有互补性。

[0472] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶多核苷酸改善的RNAi活性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何
一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的RNAi活性
的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0473] 在另外一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶RNA改善的RNAi活性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个
或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有针对靶RNA改善的RNAi
活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0474] 在另外一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有针对靶DNA改善的RNAi活性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何一个
或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有针对靶DNA改善的RNAi
活性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0475] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其调节siNA构建体例如siNA的胆固醇缀合物的细胞摄取。

[0476] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的细胞摄取的针对靶多核苷酸的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将具有式I-VII中任何
一个或其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的细胞摄取的
siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0477] 在一个实施方案中，本发明的特征在于介导针对靶多核苷酸的RNAi的核酸或多核苷酸(例如siNA)构建体，其中所述siNA构建体包含本文描述的一个或多个化学修饰，
其增加siNA构建体的生物利用率，例如通过附着改善siNA构建体的药物代谢动力学的聚
合缀合物例如聚乙二醇或等价缀合物，或通过附着在体内靶向特定组织类型或细胞类型的
缀合物。此种缀合物的非限制性例子在引入本文作为参考的Vargeese等人，美国系列号
10/201,394中得到描述。

[0478] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将缀合物引入siNA分子的结构内，
和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA
分子。此种缀合物可以包括关于细胞受体的配体，例如衍生自天然存在的蛋白质配体的肽；
蛋白质定位序列，包括细胞ZIP编码序列；抗体；核酸适体；维生素和其他辅因子，例如叶酸和N-乙酰半乳糖胺；聚合物，例如聚乙二醇(PEG)；磷脂；胆固醇；胆固醇衍生物，聚胺，例如精胺或亚精胺；等。

[0479] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列以不能再充当引导序列用于有效介导RNA干扰
和/或由促进RNAi的细胞蛋白质识别的方式进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的
第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核苷
酸序列未修饰(例如，是全RNA)。

[0480] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列以阻止其进入RNAi途径作为引导序列或作为
与靶核酸(例如，RNA)序列互补的序列的方式进行设计或修饰。在一个实施方案中，siNA
的第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，siNA的第一种核
苷酸序列未修饰(例如，是全RNA)。此种设计或修饰预期增强siNA的活性和/或改善本发
明的siNA分子的特异性。这些修饰还预期使任何脱靶效应和/或相关毒性降到最低。

[0481] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列不能充当引导序列用于介导RNA干扰。在一个
实施方案中，siNA的第一种核苷酸序列如本文所描述的进行化学修饰。在一个实施方案中，
siNA的第一种核苷酸序列未修饰(例如，是全RNA)。

[0482] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列没有末端5′-羟基(5′-OH)或5′-磷酸基。

[0483] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列包含在所述第二种序列的5′-末端处的末端
帽部分。在一个实施方案中，末端帽部分包含反向脱碱基、反向脱氧脱碱基、反向核苷酸部
分、图10中显示的基团、烷基或环烷基、杂环、或阻止其中第二种序列充当引导序列或关于
RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基团。

[0484] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链短干扰核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，其包括与靶RNA序列或其部分互补的第一种核苷酸序列，和与所述第一种序列具有
互补性的第二种序列，其中所述第二种序列包含在所述第二种序列的5′-末端和3′-末
端处的末端帽部分。在一个实施方案中，每个末端帽部分个别地包含反向脱碱基、反向脱氧
脱碱基、反向核苷酸部分、图10中显示的基团、烷基或环烷基、杂环、或阻止其中第二种序
列充当引导序列或关于RNAi的模板的RNAi活性的任何其他基团。

[0485] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有关于下调或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，例如基因或其相应的RNA)的表达改善的特异性的本发明的核酸或多核苷酸
(例如siNA)分子的方法，所述方法包括(a)将一个或多个化学修饰引入siNA分子的结构
内，和(b)在适合于分离具有改善的特异性的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA
分子。在另一个实施方案中，用于改善特异性的化学修饰包含在siNA分子的5′-末端、
3′-末端、或5′和3′-末端处的末端帽修饰。末端帽修饰可以包含例如，图10中显示
的结构(例如反向脱氧脱碱基部分)，或使得siNA分子的部分(例如有义链)不能介导针
对脱靶核酸序列的RNA干扰的任何其他化学修饰。

[0486] “改善的特异性”意指与未修饰的或最低限度修饰的siNA分子相比较，本发明的经修饰的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子具有减少的或更少的脱靶效应。脱靶效应可以起
于具有RNAi或其他生物活性的siNA分子，例如经由免疫刺激应答，针对可以导致毒性的非
有意靶。

[0487] 在一个实施方案中，核酸或多核苷酸(例如siNA)分子被这样设计，从而使得只有siNA分子的反义序列可以充当引导序列用于RISC介导的相应靶RNA序列的降解。这可以通
过经由向有义链中引入化学修饰使得siNA的有义序列无活性来完成，所述化学修饰阻碍
有义链被识别为经由RNAi机器的引导序列。在一个实施方案中，此种化学修饰包含在siNA
的有义链的5′-末端处的任何化学基团，或用于使得有义链作为用于介导RNA干扰的引导
序列无活性的任何其他基团。这些修饰例如可以导致其中有义链的5′-末端不再具有游
离的5′-羟基(5′-OH)或游离的5′-磷酸基(例如，磷酸、二磷酸、三磷酸、环磷酸等)
的分子。此种siNA构建体的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab
7/8”、“Stab 7/19”、“Stab 17/22”、“Stab 23/24”、“Stab 24/25”和“Stab24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、23或24有义链的任何siNA)化学及其变体(参见表IV)，其中siNA的
有义链的5′-末端和3′-末端不包含羟基或磷酸基。在本文中，数字Stab化学包括表
IV中所示化学的2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F
等。

[0488] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有关于下调或抑制靶核酸(例如DNA或RNA，例如基因或其相应的RNA)的表达改善的特异性的本发明的核酸或多核苷酸
(例如siNA)分子的方法，所述方法包括将一个或多个化学修饰引入siNA分子的结构内，
所述化学修饰阻止siNA分子的链或部分充当关于RNAi活性的模板或引导序列。在一个
实施方案中，siNA分子的无活性链或有义区是siNA分子的有义链或有义区，即siNA的链
或区与靶核酸序列没有互补性。在一个实施方案中，此种化学修饰包含在siNA的有义链或
区的5′-末端处不包含5′-羟基(5′-OH)或5′-磷酸基的任何化学基团，或用于使
得有义链或有义区作为用于介导RNA干扰的引导序列无活性的任何其他基团。此种siNA
构建体的非限制性例子在本文中得到描述，例如“Stab 9/10”、“Stab7/8”、“Stab 7/19”、“Stab 17/22”、“Stab 23/24”、“Stab 24/25”和“Stab 24/26”(例如，具有Stab 7、9、17、
23或24有义链的任何siNA)化学及其变体(参见表IV)，其中siNA的有义链的5′-末
端和3′-末端不包含羟基或磷酸基。在本文中，数字Stab化学包括表IV中所示化学的
2′-氟和2′-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。

[0489] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于筛选在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)产生多个未修饰的
siNA分子，(b)在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的siNA分子的条
件下，筛选步骤(a)的siNA分子，和(c)将化学修饰(例如，如本文所描述的或如本领域其
他方面已知的化学修饰)引入(b)的活性siNA分子内。在一个实施方案中，该方法进一步
包括在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的siNA分子的
条件下，再次筛选步骤(c)的化学修饰的siNA分子。

[0490] 在一个实施方案中，本发明的特征在于用于筛选在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)产生多个
化学修饰的siNA分子(例如，如本文所描述的或如本领域其他方面已知的siNA分子)，和
(b)在适合于分离在介导针对靶核酸序列的RNA干扰中有活性的化学修饰的siNA分子的条
件下，筛选步骤(a)的siNA分子。

[0491] 术语“配体”指任何化合物或分子，例如药物、肽、激素或神经递质，其能够与另一种化合物例如受体直接或间接地相互作用。与配体相互作用的受体可以存在于细胞表面上，或可替代地可以是细胞间和/或细胞内受体。配体与受体的相互作用可以导致生化反
应，或可以仅仅是物理相互作用或结合。

[0492] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括：(a)将赋形剂制剂引入siNA分子，
和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA分子的条件下，测定步骤(a)的siNA
分子。此种赋形剂包括聚合物例如环糊精、脂质、阳离子脂质、聚胺、磷脂、纳米颗粒、受体、配体等。

[0493] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生具有改善的生物利用率的本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的方法，其包括(a)将将具有式I-VII中任何一个或
其任何组合的核苷酸引入siNA分子内，和(b)在适合于分离具有改善的生物利用率的siNA
分子的条件下，测定步骤(a)的siNA分子。

[0494] 在另一个实施方案中，聚乙二醇(PEG)可以与本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)化合物共价附着。附着的PEG可以是任何分子量，优选约100-约50,000道尔顿(Da)。

[0495] 本发明可以单独或作为试剂盒的组分使用，所述试剂盒具有执行在体外或体内将RNA引入测试样品和/或受试者所必需的至少一种试剂。例如，试剂盒的优选组分包括
本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子和如本文所描述的促进siNA引入目的细胞
内的媒介物(例如，使用脂质和本领域已知的其他转染方法，参见例如Beigelman等人，
US6,395,713)。该试剂盒可以例如在确定基因功能和/或活性，或在药物最优化中，和在药
物发现中用于靶确认(参见例如Usman等人，USSN60/402,996)。此种试剂盒还可以包括说
明书以允许试剂盒用户实践本发明。

[0496] 如本文所使用的，术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”、“核酸”或“多核苷酸”指能够通过介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默以序列特异性方式抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。这些术语可以指个别核酸分子、多个此种核酸分子、或此种核酸分
子库。siNA可以是包含自互补的有义和反义区的双链核酸分子，其中所述反义区包含与靶
核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或
其部分的核苷酸序列。siNA可以由2个分开的寡核苷酸装配，其中一条链是有义链而另一
条是反义链，其中所述反义和有义链是自互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸
序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链
区为约15个-约30个，例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个碱基对；反义链包含与靶核酸分子中的核苷
酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序
列(例如，siNA分子的约15个-约25个或更多核苷酸与靶核酸或其部分互补)。可替代
地，siNA由单个寡核苷酸装配，其中所述siNA的自互补的有义和反义区通过一种或多种基
于核酸或非基于核酸的接头进行连接。siNA可以是具有双链体、不对称的双链体、发夹或
不对称的发夹二级结构、具有自互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包含与
分开的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核
酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有2个或更多环结构和包含自互补的有义
和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或
其部分互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其
中环状多核苷酸可以在体内或体外进行加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA
还可以包含具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷
酸(例如，其中此种siNA分子不需要在siNA分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核
苷酸序列)，其中所述单链多核苷酸可以进一步包含末端磷酸基，例如5′-磷酸(参见例
如Martinez等人，2002，Cell.，110，563-574和Schwarz等人，2002，Molecular Cell，10，
537-568)或5’，3’-二磷酸。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包含分开的有义和反
义序列或区，其中所述有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头分子进行
共价连接，或可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德瓦尔斯(van der waals)相互作用、疏水作用和/或堆积相互作用进行非共价连接。在某些实施方案中，本发明的siNA分子包
含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子以
引起靶基因表达抑制的方式与靶基因的核苷酸序列相互作用。如本文所使用的，siNA分子
无需限于仅包含RNA的那些分子，而是进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些
实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺乏含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。申请人在某
些实施方案中描述了不需要存在具有2′-羟基的核苷酸用于介导RNAi的短干扰核酸，并
且照这样，本发明的短干扰核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基
团的核苷酸)。然而，在siNA分子内不需要存在核糖核苷酸以支持RNAi的此种siNA分子
可以具有一种或多种附着的接头或其他附着或结合的基团、部分、或包含一个或多个具有
2′-OH基团的核苷酸的链。任选地，siNA分子可以在约5、10、20、30、40或50％的核苷酸
位置处包含核糖核苷酸。本发明的经修饰的短干扰核酸分子还可以称为短干扰经修饰的
寡核苷酸“siMON”。如本文所使用的，术语siNA意欲等价于用于描述能够介导序列特异性
RNAi的核酸分子的其他术语，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、
短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰经修饰的寡核苷酸、化学修饰的
siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。本发明的siNA分子的非限制性例子显示于本文
的图4-6、以及表II和III中。此种siNA分子不同于本领域已知的介导基因表达抑制的其
他核酸技术，例如核酶、反义、三链体形成、适体、2，5-A嵌合体或诱饵寡核苷酸。

[0497] “RNA干扰”或“RNAi”意指如本领域一般已知的且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的生物过程，参见例如Zamore和Haley，2005，Science，309，
1519-1524；Vaughn 和 Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore 等 人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir 等 人，2001，Nature，411，
494-498；和Kreutzer等人，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等人，国际PCT
公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人，国际PCT公开
号WO00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国
际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，
Science，297，1818-1819；Volpe 等 人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和 Hall 等 人，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner 和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等人，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等人，
2002，Gene&Dev.，16，1616-1626；和Reinhart和Bartel，2002，Science，297，1831)。此外，如本文所使用的，术语RNAi意欲等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如
转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学(epigenetics)。例如，本发明的siNA
分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性例子中，基
因表达经由本发明的siNA分子的表观遗传调节可以起因于siNA介导的染色质结构的修
饰或甲基化模式以改变基因表达(参见，例如，Verdel等人，2004，Science，303，672-676；
Pal-Bhadra等人，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；
Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。在另一个非限制性例子中，基因表达经由本
发明的siNA分子的调节可以起因于siNA经由RISC介导的RNA(编码或非编码RNA)切
割，或可替代地，如本领域已知的翻译抑制。在另一个实施方案中，基因表达经由本发明的
siNA分子的调节可以起因于转录抑制(参见例如Janowski等人，2005，Nature Chemical
Biology，1，216-222)。

[0498] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子是双链体形成寡核苷酸“DFO”，(参见例如图14-15以及于2003年12月3日提交的Vaish等人，USSN 10/727,780和于2004年5月
24日提交的国际PCT申请号US04/16390)。

[0499] 在一个实施方案中，本发明的siNA分子是多功能siNA(参见例如图16-28以及于2004年2月10日提交的Jadhav等人，USSN 60/543,480和于2004年5月24日提交的国
际PCT申请号US04/16390)。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA可以包含靶向例如
PCSK9RNA的2个或更多区域的序列(参见例如表II和III中的靶序列)。在一个实施方
案中，本发明的多功能siNA可以包含靶向一种或多种PCSK9编码或非编码序列的序列。在
一个实施方案中，本发明的多功能siNA可以包含靶向一种或多种PCSK9RNA和一种或多种
Torc2编码或非编码序列的序列。

[0500] 如本文所使用的，“不对称发夹”意指包含反义区、可以包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和有义区的线性siNA分子，所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度至有
义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成具有环的双链体。例如，本发明的
不对称的发夹siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义
区(例如约15个-约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)和包含约4个-约12个(例如，约
4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个)核苷酸的环区域、和具有与反义区互
补的约3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13
个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸的有义区。不对称的发夹siNA分子还可以包含5′-末端磷酸基，其可以是化学修饰的。
不对称的发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或
缀合分子。

[0501] 如本文所使用的，“不对称的双链体”意指具有2条分开的链的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子，所述链包含有义区和反义区，其中所述有义区包含比反义区更少的核苷
酸，其程度至有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成双链体。例如，本发
明的不对称的双链体siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi
的反义区(例如约15个-约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22
个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)、和具有与反义区互补的约
3个-约25个(例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14
个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)核苷酸的有义区。

[0502] “RNAi抑制剂”意指可以在细胞或生物中下调、减少或抑制RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以下调、减少或抑制RNAi(例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、
翻译抑制或转录沉默)，其通过与RNAi途径的任何组分相互作用或干扰RNAi途径的任何
组分的功能实现，所述组分包括蛋白质组分例如RISC、或核酸组分例如miRNAs或siRNAs。
RNAi抑制剂可以是siNA分子，反义分子，适体，或者与RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物
中的RNAi途径的任何其他组分相互作用、或干扰RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的
RNAi途径的任何其他组分的功能的小分子。通过抑制RNAi(例如RNAi介导的靶多核苷酸
的切割、翻译抑制或转录沉默)，本发明的RNAi抑制剂可以用于调节(例如上调或下调)靶
基因的表达。在一个实施方案中，本发明的RNA抑制剂经由翻译抑制、转录沉默、或RISC介
导的多核苷酸(例如，mRNA)的切割，通过干扰(例如减少或阻止)基因表达的内源性下调
或抑制用于上调基因表达。通过干扰基因表达的内源阻遏、沉默或抑制机制，本发明的RNAi
抑制剂因而可以用于上调基因表达以治疗起因于功能丧失的疾病、性状或状况。在一个实
施方案中，术语“RNAi抑制剂”用于代替本文的各种实施方案中的术语“siNA”，例如具有增加基因表达的作用用于治疗功能丧失疾病、性状和/或状况。

[0503] 如本文所使用的，“适体”或“核酸适体”意指与靶分子特异性结合的多核苷酸，其中核酸分子具有与由靶分子在其天然背景中识别的序列不同的序列。可替代地，适体可
以是与靶分子结合的核酸分子，其中靶分子不与核酸天然结合。靶分子可以是任何目的分
子。例如，适体可以用于与蛋白质的配体结合结构域结合，从而阻止天然存在的配体与蛋
白质的相互作用。这是非限制性例子，并且本领域技术人员将认识到使用本领域一般已
知的技术可以容易地产生其他实施方案，参见例如Gold等人，1995，Annu.Rev.Biochem.，
64，763；Brody 和 Gold，2000，J.Biotechnol.，74，5；Sun，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.，2，
100；Kusser，2000，J.Biotechnol.，74，27；Hermann和Patel，2000，Science，287，820；和Jayasena，1999，Clinical Chemistry，45，1628。本发明的适体分子可以如本领域一般已知的或如本文描述的进行化学修饰。

[0504] 如本文所使用的，术语“反义核酸”指这样的核酸分子，其通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸；Egholm等人，1993Nature 365，566)相互作用与靶RNA结合，并且
通过空间相互作用或通过RNA酶H介导的靶识别改变靶RNA的活性(关于综述，参见Stein
和Cheng，1993 Science 261，1004和Woolf等人，美国专利号5,849,902)。一般地，反义
分子沿着反义分子的单个邻接序列与靶序列互补。然而，在某些实施方案中，反义分子可以
与底物结合，从而使得底物分子形成环，和/或反义分子可以结合，从而使得反义分子形成
环。因此，反义分子可以与2个(或甚至更多)非邻接的底物序列互补，或反义分子的2个
(或甚至更多)非邻接的序列部分可以与靶序列互补，或2者。关于目前的反义策略的综述，
参见Schmajuk等人，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等人，1997，Nature，
15，751-753，Stein等人，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49。此外，由2’-MOE和如本领域已知的其他修饰进行修饰的反义DNA或反义可以通过DNA-RNA相互作用用于靶向RNA，从而激活RNA酶H，所述RNA酶H消化双
链体中的靶RNA。反义寡核苷酸可以包含一个或多个RNA酶H激活区，其能够激活靶RNA的
RNA酶H切割。反义DNA可以经由使用单链DNA表达载体或其等价物进行化学合成或表达。
本发明的反义分子可以如本领域一般已知的或如本文描述的进行化学修饰。

[0505] “调节”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性得到上调或下调，从而使得表
达、水平或活性大于或小于在不存在调节剂的情况下观察到的那种。例如，术语“调节”可
以意指“抑制”，但措辞“调节”的用途不限于这个定义。

[0506] “抑制”、“下调”或“减少”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性减少低于在不存在本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的情况下观察到的那种。在一个实施方
案中，由siNA分子的抑制、下调或减少低于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种
水平。在另一个实施方案中，由siNA分子的抑制、下调或减少低于在例如具有杂乱序列或
具有错配的siNA分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由本发明的核酸
分子抑制、下调或减少基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一个实
施方案中，基因表达的抑制、下调或减少与转录后沉默，例如RNAi介导的靶核酸分子(例如
RNA)切割或翻译抑制相关。在一个实施方案中，基因表达的抑制、下调或减少与转录前沉默
相关，例如通过DNA甲基化模式和DNA染色质结构中的改变。

[0507] “上调”或“促进”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性增加高于在不存在本发明的核酸分子(例如，siNA)的情况下观察到的那种。在一个实施方案中，由siNA分子上
调或促进基因表达高于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施
方案中，由siNA分子上调或促进基因表达高于在例如具有杂乱序列或具有错配的siNA分
子的存在下观察到的那种水平。在另一个实施方案中，由本发明的核酸分子上调或促进基
因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在一个实施方案中，基因表达的上
调或促进与RNA介导的基因沉默抑制相关，例如RNAi介导的编码或非编码RNA靶的切割或
沉默，其下调、抑制或沉默待上调的目的基因的表达。基因表达的下调可以例如由编码RNA
或其编码的蛋白质进行诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可以例如由对
目的基因具有调节控制的非编码RNA进行诱导，例如经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、
RISC介导的RNA切割或翻译抑制通过沉默基因表达。照这样，下调、抑制或沉默目的基因的
靶的抑制或下调可以用于上调或促进目的基因朝向治疗用途表达。

[0508] 在一个实施方案中，本发明的RNAi抑制剂通过抑制RNAi或基因沉默用于上调基因表达。例如，本发明的RNAi抑制剂通过上调基因表达可以用于治疗功能丧失疾病和状
况，例如在其中特定基因的一个等位基因具有导致由突变等位基因编码的蛋白质功能丧失
的突变(例如，移码、错义或无义突变)的单倍性不足情况下。在此种情况下，RNAi抑制剂
可以用于上调由野生型或功能等位基因编码的蛋白质表达，从而通过补偿突变体或无效等
位基因校正单倍性不足。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调功能等位基
因的毒性获得的表达，而本发明的RNAi抑制剂伴随地用于上调野生型或功能等位基因的
表达，例如在本文或本领域其他方面已知的疾病、性状或状况治疗中(参见例如Rhodes等
人，2004，PNAS USA，101：11147-11152和Meisler等人2005，The Journal of Clinical
Investigation，115：2010-2017)。

[0509] “基因”、或“靶基因”或“靶DNA”意指编码RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于编码多肽的结构基因。基因或靶基因还可以编码功能RNA(fRNA)或非编码RNA(ncRNA)，例如小时序RNA(stRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、核仁小
RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)及其前体RNAs。此种非编码RNAs可以充
当在调节涉及功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中siNA介导的RNA干扰的靶核
酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的siNA分子进行调节。
靶向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表
型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工(例如，转氨基作用、甲基化等)实现。靶基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因
例如在感染其后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含靶基因的细胞可以衍生自
或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性例子包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性例子包括脊椎动物或无脊椎动
物。真菌的非限制性例子包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003，
Science，300，258-260。

[0510] “非规范碱基对”意指任何非沃森克里克碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，包括翻转错配(flipped mismatches)、单氢键错配、反式类型错配、三碱基相互作用、和四碱
基相互作用。此种非规范碱基对的非限制性例子包括但不限于，AC反Hoogsteen、AC摆动、
AU反Hoogsteen、GU摆动、AA N7氨基、CC 2-羰基-氨基(H1)-N3-氨基(H2)、GA剪切、UC
4-羰基-氨基、UU亚氨基-羰基、AC反摆动、AU Hoogsteen、AU反沃森克里克、CG反沃森
克里克、GC N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基对称、AA N7-氨基对称、GA N7-N1氨基-羰基、
GA+羰基-氨基N7-N1、GG N1-羰基对称、GG N3-氨基对称、CC羰基-氨基对称、CC N3-氨
基对称、UU 2-羰基-亚氨基对称、UU 4-羰基-亚氨基对称、AA氨基-N3、AA N1-氨基、AC
氨基2-羰基、AC N3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亚氨基、AU N3-亚氨
基、AU N7-亚氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、
GC氨基-N3、GC羰基-氨基、GC N3-氨基、GC N7-氨基、GG氨基-N7、GG羰基-亚氨基、GG
N7-氨基、GU氨基-2-羰基、GU羰基-亚氨基、GU亚氨基-2-羰基、GU N7-亚氨基、psiU亚
氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亚氨基-羰基、UU亚氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA
羰基-C2-H、UU亚氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A)N3(C)-羰基、GC亚氨基氨基-羰
基、Gpsi亚氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亚氨基氨基-2-羰基碱基对。

[0511] 如本文所使用的，“PCSK9”意指任何前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9或具有PCSK9活性的PCSK9蛋白质、肽或多肽，例如由表I中显示的PCSK9 Genbank登记号编码
的。术语PCSK9还指编码或调节具有PCSK9活性的任何PCSK9蛋白质、肽或多肽的表达的
核酸序列。术语“PCSK9”还意欲包括其他PCSK9编码序列，例如衍生自各种受试者或生物
的PCSK9序列，包括其他PCSK9同工型、突变PCSK9基因、PCSK9基因的剪接变体和PCSK9基
因多态性。

[0512] “PCSK9途径靶”意指基因表达或活性的PCSK9途径中涉及的任何靶，包括此种靶如ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋
白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9)、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和F-框
唯一蛋白质3。

[0513] 如本文所使用的，“靶”意指任何靶蛋白、肽或多肽，例如由本文(参见表I)以及USSN 10/923,536和PCT/US03/05028的Genbank登记号编码的，所述2个专利引入本文
作为参考。术语“靶”还指编码任何靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如
由具有本文和/或美国临时专利申请号60/363,124、USSN 10/923,536和/或USSNPCT/
US03/05028中显示的Genbank登记号的序列编码的蛋白质、肽或多肽。目的靶可以包括靶
多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。术语“靶”还意欲包括其他序列，例如相异同工型、突
变靶基因、靶多核苷酸的剪接变体、靶多态和非编码(例如，ncRNA、miRNA、stRNA)或如本文所描述的其他调节多核苷酸序列。因此，在本发明的各种实施方案中，与靶RNA具有互补性
的本发明的双链核酸分子(例如siNA)可以用于抑制或下调miRNA或其他ncRNA活性。在
一个实施方案中，miRNA或ncRNA活性的抑制可以用于下调或抑制依赖于miRNA或ncRNA活
性的基因表达(例如，本文描述的或本领域其他方面已知的基因靶)或病毒复制(例如，本
文描述的或本领域其他方面已知的病毒靶)。在另一个实施方案中，通过与miRNA或ncRNA
具有互补性的本发明的双链核酸分子(例如siNA)抑制miRNA或ncRNA活性可以用于上调
或促进靶基因表达(例如，本文描述的或本领域其他方面已知的基因靶)，其中此种基因的
表达通过miRNA或ncRNA得到下调、抑制或沉默。基因表达的此种上调可以用于治疗如本
领域一般已知的与功能丧失或单倍性不足相关的疾病和状况。

[0514] “途径靶”或“宿主靶”意指涉及基因表达途径或活性或细胞或宿主蛋白质或编码此种蛋白质或以其他方式涉及PCSK9表达和/或病毒、细菌或其他病原体感染和/或复制
的多核苷酸的任何靶。例如，任何给定靶都可以具有相关途径或宿主靶，其可以包括生物途
径中的上游、下游或修饰基因。这些途径和宿主靶基因可以在本文的疾病、状况和性状治疗
中提供加性或协同效应。

[0515] 在一个实施方案中，靶是任何靶RNA或其部分。

[0516] 在一个实施方案中，靶是任何靶DNA或其部分。

[0517] 在一个实施方案中，靶是任何靶mRNA或其部分。

[0518] 在一个实施方案中，靶是任何靶miRNA或其部分。

[0519] 在一个实施方案中，靶是任何靶siRNA或其部分。

[0520] 在一个实施方案中，靶是任何靶stRNA或其部分。

[0521] 在一个实施方案中，靶是靶和或途径靶或其部分。

[0522] 在一个实施方案中，靶是本文和/或美国临时专利申请号60/363,124、USSN10/923,536和/或PCT/US03/05028中描述的任何(例如，一个或多个)靶序列或其部分。
在一个实施方案中，靶是表I、II或III中显示的任何(例如，一个或多个)靶序列或其部
分。在另一个实施方案中，靶是对应于表II或表III中显示的任何(例如，一个或多个)
靶、上部链或下部链序列或其部分的siRNA、miRNA、shRNA或stRNA。在另一个实施方案中，
靶是对应于任何序列(例如，一个或多个)的任何siRNA、miRNA、shRNA或stRNA，所述序列
对应于本文或美国临时专利申请号60/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028
中描述的序列。

[0523] “同源序列”意指由一个或多个多核苷酸序列例如基因、基因转录物和/或非编码多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的2个或
更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成员，不同的蛋白质表位、不同的蛋白质
同工型或完全趋异的基因，例如细胞因子及其相应受体。同源序列可以是由2种或更多非
编码多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子、和转录控制或
调节位点。同源序列还可以包括由超过一种多核苷酸序列共享的保守序列区。同源性无
需是完全同源性(例如，100％)，因为部分同源的序列也由本发明预期(例如，99％、98％、
97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、
82％、81％、80％等)。

[0524] “保守序列区”意指多核苷酸中的一个或多个区域的核苷酸序列在世代之间或从一个生物系统、受试者或生物到另一个生物系统、受试者或生物没有明显变化。多核苷酸可
以包括编码或非编码DNA和RNA。

[0525] “有义区”意指与siNA分子的反义区具有互补性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序
列。在一个实施方案中，siNA分子的有义区称为有义链或过客链。

[0526] “反义区”意指与靶核酸序列具有互补性的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可以任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核
酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的反义区称为反义链或引导链。

[0527] “靶核酸”或“靶多核苷酸”意指其表达或活性待调节的任何核酸序列(例如，任何靶和/或途径靶序列)。靶核酸可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，本发明的靶核酸是靶RNA或DNA。

[0528] “互补性”意指核酸可以通过传统沃森-克里克或如本文所描述的其他非传统类型与另一种核酸序列形成一个或多个氢键。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例
如siNA分子，其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含双链核酸分子的2条链之间约
10％-约100％(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互补性。在另一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分子，其中一条链是有
义链且另一条链是反义链，其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含在双链核酸分子的
反义链中的核苷酸序列及其相应的靶核酸分子例如靶RNA或靶mRNA或病毒RNA的核苷酸
序列之间至少约10％-约100％(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％、90％或100％)的互补性。在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如siNA分
子，其中一条链包含称为有义区的核苷酸序列且另一条链包含称为反义区的核苷酸序列，
其中每条链长度为15个-30个核苷酸，包含在双链核酸分子的有义区和反义区之间约
10％-约100％(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)的互补性。提及本发明的核酸分子，关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸
的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周
知的(参见，例如，Turner等人，1987，CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier等人，
1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner等 人，1987，J.Am.Chem.Soc.109：
3783-3785)。百分比互补性指示可以与第二种核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱
基配对)的核酸分子中的邻接残基百分比(例如与具有10个核苷酸的第二种核酸序列碱
基配对的第一种寡核苷酸中总共10个核苷酸中的5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸
分别代表50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补性)。在一个实施方案中，本发明的
siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个
实施方案中，本发明的siNA分子与相应的靶核酸分子完全互补。“完全互补”意指核酸序列
的所有邻接残基将与第二种核酸序列中相同数目的邻接残基氢键合。在一个实施方案中，
本发明的siNA分子包含与一种或多种靶核酸分子或其部分互补的约15个-约30个或更
多(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、
27个、28个、29个或30个或更多)核苷酸。在一个实施方案中，本发明的siNA分子在siNA
分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在siNA分子的反义链或反义区和相应的
靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包括在
siNA结构内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多错
配或非碱基配对的核苷酸)，其可以导致在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区
之间或在siNA分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。

[0529] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸或多核苷酸(例如siNA)分子在核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在一个实施方案中，本发明的
双链核酸分子例如siNA分子与相应的靶核酸分子完全互补。

[0530] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子例如核酸或多核苷酸(例如siNA)分子在双链核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在核酸分子的反义链或反
义区和相应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补
性可以包括在双链核酸分子，结构内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、
3个、4个、5个或更多错配或非碱基配对的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其可以导致在双链核
酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在双链核酸分子的反义链或反义区和
相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。

[0531] 在一个实施方案中，本发明的双链核酸分子是微小RNA(miRNA)。“微小RNA”或“miRNA”意指通过mRNA切割、翻译阻遏/抑制或异染色质基因沉默调节靶信使RNAs的表
达的小双链RNA(参见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，
281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He 等 人，2004，Nat.Rev.Genet.，5，
522-531；和Ying等人，2004，Gene，342，25-28)。在一个实施方案中，本发明的微小RNA在miRNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在miRNA的反义链或反义区和相应
的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包
括在双链核酸分子，结构内的各种错配或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、
5个或更多错配或非碱基配对的核苷酸，例如核苷酸凸起)，其可以导致在miRNA的有义链
或有义区和反义链或反义区之间或在miRNA的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间
产生的凸起、环或突出端。

[0532] 在一个实施方案中，下调或减少PCSK9基因表达的本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子如本文所描述的或本领域其他方面已知的用于预防或治疗受试者或生物中
的代谢和/或心血管和相关疾病、病症、状况或性状。

[0533] “代谢疾病”意指如本领域已知的影响代谢途径的任何疾病或状况。代谢疾病可以导致异常的代谢过程，由于遗传酶异常(天生代谢错误)而是先天性的，或由于内分泌器官
的疾病或代谢上重要的器官例如肝的衰竭而是获得性的。在一个实施方案中，代谢疾病包
括高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或肥胖。“心血管疾病”意指影响心脏和脉管系统的疾病或
状况，包括但不限于冠心病(CHD)、脑血管病(CVD)、主动脉瓣狭窄、外周血管病、动脉粥样
硬化、动脉硬化、心肌梗死(心脏病发作)、脑血管病(中风)、短暂性缺血发作(TIA)、心绞
痛(稳定型和不稳定型)、心房颤动、心律失常、瓣膜病、充血性心力衰竭、高胆固醇血症、I型高脂蛋白血症、II型高脂蛋白血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症、V型高脂
蛋白血症、继发性高甘油三酯血症和家族性卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症。

[0534] 在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的每个序列长度独立地为约15个-约30个核苷酸，在具体实施方案中长度为约15个、16个、17
个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15个-约30个碱基对(例
如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、
28个、29个或30个)。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子的一条或多条链独立地
包含与靶核酸分子互补的约15个-约30个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19
个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)。在另外一个实施方案中，包含发夹或环状结构的本发明的siNA分子长度为约35个-约55个(例如，
约35个、40个、45个、50个或55个)核苷酸、或长度为约38个-约44个(例如，约38个、
39个、40个、41个、42个、43个或44个)核苷酸且包含约15个-约25个(例如，约15个、
16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个)碱基对。本发明的示例
性siNA分子显示于表II和III和/或图4-5中。

[0535] 如本文所使用的，“细胞”以其通常的生物学含义使用，并且不指完整多细胞生物，例如具体地不指人。细胞可以存在于生物内，例如鸟类、植物和哺乳动物，例如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物或植物细胞)。细胞可以具有体细胞或种系起源、全能或多能、分裂或非分裂。细胞还可以衍生
自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。细胞可以是如本领域一般公认的分
离的细胞、纯化的细胞或基本上纯化的细胞。

[0536] 本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以直接添加，或可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或以其他方式递送给靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以先体外
后体内、或在体内通过局部递送给肺局部地施用于相关组织，包括或不包括其掺入生物聚
合物中。在具体实施方案中，本发明的核酸分子包含表II和III和/或图4-5中显示的序
列。此种核酸分子的例子基本上由这些表和图中限定的序列组成。此外，表IV中描述的化
学修饰的构建体和表VI中显示的脂质纳米颗粒(LNP)制剂可以应用于本发明的任何siNA
序列或siNA序列组。

[0537] 在另一个方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的哺乳动物细胞。一种或多种siNA分子可以独立地被靶向本发明的靶多核苷酸
内的相同或不同位点。

[0538] “RNA”意指包含至少一种核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2′位置处具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例
如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及通过一个或多个核苷酸
的添加、缺失、置换和/或改变不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此种改变可以包括添
加非核苷酸材料，例如向siNA的一个或多个末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸
处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或
化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNAs可以称为类似物或天然存在的RNA的
类似物。

[0539] “受试者”意指其是外植细胞的供体或受体或细胞自身的生物。“受试者”还指本发明的核酸分子可以施用于其的生物。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或
人细胞。在一个实施方案中，受试者是婴儿(例如，小于1个月大，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11或12个月大的受试者)。在一个实施方案中，受试者是初学走路的孩子(例如，1、2、
3、4、5或6岁大)。在一个实施方案中，受试者是老人(例如，超过约65岁年龄的任何人)。

[0540] 如本文所使用的，“化学修饰”意指与天然siRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含天然siRNA或RNA核苷和核苷酸由经修饰的核
苷和经修饰的核苷酸如本文所描述的或如本领域其他方面已知的添加、置换或修饰。此种
化学修饰的非限制性例子包括但不限于，具有本文的式I、II、III、IV、V、VI或VII中的任
何一个的组合物，硫代磷酸酯核苷酸间键，2′-脱氧核糖核苷酸，2′-O-甲基核糖核苷酸，
2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸，4′-硫代核糖核苷酸，2′-O-三氟甲基核苷酸，2′-O-乙
基-三氟甲氧基核苷酸，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸(参见例如于2004年11月5
日提交的USSN 10/981,966，引入本文作为参考)，FANA，“通用碱基”核苷酸，“无环”核苷酸，
5-C-甲基核苷酸，末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基掺入，或具有本文的式I-VII中任
何一个的修饰。在一个实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化学
修饰部分修饰的(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％修饰的)。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子(例如，dsRNA、siNA等)是被化学修饰完全修饰的(例如，约100％修饰的)。

[0541] 如本文所使用的，术语“硫代磷酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含硫原子。因此，术语硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。

[0542] 如本文所使用的，术语“膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z和/或W包含乙酰基或保护的乙酰基。

[0543] 如本文所使用的，术语“硫代膦酰乙酸酯”指具有式I的核苷酸间键，其中Z包含乙酰基或保护的乙酰基且W包含硫原子，或可替代地W包含乙酰基或保护的乙酰基且Z包
含硫原子。

[0544] 如本文所使用的，术语“通用碱基”指与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少的区别。通用碱基的非限制性例子包括C-苯
基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、吡咯氨甲酰和硝基吡咯衍生物例如如本领域已知的
3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(参见例如Loakes，2001，Nucleic
AcidsResearch，29，2437-2447)。

[0545] 如本文所使用的，术语“无环核苷酸”指具有无环核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)中任何一个独立地或组合地在核苷酸中不存在。

[0546] 本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子独立地、或与其他药物组合或结合可以用于预防或治疗受试者或生物中本文描述的或本领域其他方面已知的疾病、病症、状况
和性状。例如，siNA分子可以在适合于治疗的条件下独立地或与一种或多种药物组合施用
于受试者，或可以施用于对于本领域技术人员显而易见的其他合适的细胞。

[0547] 本发明的核酸分子独立地、或与其他药物组合或结合可以用于预防或治疗受试者或生物中本文描述的或本领域其他方面已知的高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉
粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗、肥胖状况、病症性
状。

[0548] 例如，核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以在适合于治疗的条件下独立地或与一种或多种药物组合施用于受试者，或可以施用于对于本领域技术人员显而易见的其他合
适的细胞。

[0549] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以在适合于治疗的条件下独立地或与一种或多种药物组合施用于受试者，或可以施用于对于本领域技术
人员显而易见的其他合适的细胞。

[0550] 在进一步的实施方案中，siNA分子可以与其他已知治疗组合用于预防或治疗如本领域已知的受试者或生物中本文描述的疾病病症或状况、病症和性状。

[0551] 在进一步的实施方案中，siNA分子可以与其他已知治疗组合用于预防或治疗受试者或生物中。例如，所描述的分子可以与一种或多种已知化合物、治疗或操作组合用于预防
或治疗如本领域已知的受试者或生物中本文描述的疾病、病症、状况和性状。

[0552] 在一个实施方案中，本发明的特征在于以允许siNA分子表达的方式包含编码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列的表达载体。例如，载体可以包含编码siNA分子的
2条链的一种或多种序列，所述siNA分子包含双链体。载体还可以包含编码单个核酸分子
的一种或多种序列，所述单个核酸分子是自互补的且因此形成siNA分子。此种表达载体
的非限制性例子在Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，
2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology，19，500；和Novina等人，2002，NatureMedicine，预先在线公开doi：10.1038/nm725中得到描述。

[0553] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于包括本发明的表达载体的哺乳动物细胞，例如人细胞。

[0554] 在另外一个实施方案中，本发明的表达载体包含关于与RNA分子具有互补性的siNA分子的序列，所述RNA分子通过Genbank登记号提及，例如本文或美国临时专利申请号
60/363,124、USSN 10/923,536和/或PCT/US03/05028中描述的Genbank登记号。

[0555] 在一个实施方案中，本发明的表达载体包含编码2种或更多siNA分子的核酸序列，所述siNA分子可以是相同或不同的。

[0556] 在本发明的另一个方面，与靶RNA分子相互作用且下调编码靶RNA分子(例如在本文中通过Genbank登记号提及的靶RNA分子)的基因的siNA分子由插入到DNA或RNA
载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可
以基于但不限于下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。能够表达siNA
分子的重组载体可以如本文所描述的进行递送，且在靶细胞中持续。可替代地，可以使用提
供siNA分子的瞬时表达的病毒载体。必要时此种载体可以重复施用。一旦被表达，siNA分
子就经由RNA干扰(RNAi)结合且下调基因功能或表达。siNA表达载体的递送可以是全身
性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于来自受试者外植(ex-planted)的靶细胞随
后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式。

[0557] 在另外的实施方案中，本发明提供了验证候选蛋白质作为用于药物发现的合适靶的方法，通过将如本文所描述的siRNA引入细胞或生物内且在这样的条件下维持细胞或生
物，使得靶特异性RNAi可以发生，测定细胞或生物的特征或性质，且使特征或性质与合适
的对照比较，所述比较产生关于候选蛋白质是否是用于药物发现的合适靶的信息。

[0558] 示例性实施方案提供了评估基因产物是否是用于药物发现的合适靶的方法，其包括：(a)将靶向基因的mRNA用于降解的本发明的RNAi构建体引入细胞或生物内；(b)在其
中mRNA的降解发生导致减少的基因表达的条件下维持(a)的细胞或生物；和(c)测定减少
的基因表达对细胞或生物的作用，其中如果减少的表达具有作用，那么基因产物是用于药
物发现的靶。

[0559] “载体”意指用于递送所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。

[0560] 本发明的其他特征和优点由于其优选实施方案的下列描述和由于权利要求将是显而易见的。

[0561] 附图简述

[0562] 图1显示了用于合成siNA分子的方案的非限制性例子。互补的siNA序列链，链1和链2串联合成，且通过可切割键例如核苷酸琥珀酸酯或脱碱基琥珀酸酯进行连接，所述
可切割键可以与用于在固体支持体上的固相合成的可切割接头相同或不同。合成可以是固
相或液相，在显示的实例中，合成是固相合成。合成这样进行从而使得保护基团例如二甲氧
三苯甲基在串联寡核苷酸的末端核苷酸上保持完整。寡核苷酸切割和脱保护后，2条siNA
链自发地杂交以形成siNA双链体，其允许通过利用末端保护基团的性质纯化双链体，例如
通过应用其中仅分离具有末端保护基团的双链体/寡核苷酸的三苯甲基依赖纯化法。

[0563] 图2显示了通过本发明方法合成的纯化siNA双链体的MALDI-TOF质谱。显示的2个峰对应于分开的siNA序列链的预测质量。这个结果证实由串联合成产生的siNA双链
体可以作为单个实体使用简单的三甲苯基依赖纯化法进行纯化。

[0564] 图3显示了涉及RNAi的靶RNA降解的非限制性被提议的机制代表。通过依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP)由外来单链RNA产生的双链RNA(dsRNA)激活切酶(DICER)，所述
切酶依次产生siNA双链体，所述外来单链RNA例如病毒、转座子或其他外源RNA。可替代
地，合成或表达的siNA可以通过合适的方法直接引入细胞内。形成识别靶RNA的活性siNA
复合物，从而导致通过RISC内切核酸酶复合物降解靶RNA或导致通过依赖于RNA的RNA聚
合酶(RdRP)合成另外的RNA，其可以激活切酶且导致另外的siNA分子，从而扩大RNAi应
答。

[0565] 图4A-F显示了本发明的化学修饰的siNA构建体的非限制性例子。在该图中，N代表任何核苷酸(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿苷或任选地胸苷，例如胸苷可以在由圆括号指定的
突出端区域(N N)中被取代。显示了关于siNA构建体的有义和反义链的各种修饰。(N N)
核苷酸位置可以如本文所描述的进行化学修饰(例如，2′-O-甲基，2′-脱氧-2′-氟
等)且可以衍生自或不衍生自相应的靶核酸序列(参见例如图6C)。此外，图4中显示的
序列可以任选包括在来自有义链的5′-末端的第9位，或通过从引导链的5′-末端计数
11个核苷酸位置基于引导链的5′-末端的第11位处的核糖核苷酸(参见图6C)。

[0566] 图4A：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核
苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末
端甘油基部分，其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中存在的所有核苷
酸都是核糖核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷
酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

[0567] 图4B：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所
有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷
酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具
有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能
存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核
苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核
苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使有义和反义链
中的(N N)核苷酸连接。

[0568] 图4C：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′-O-甲基或2′
脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通
用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基
部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷
酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱
氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中
的(N N)核苷酸连接。

[0569] 图4D：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟
经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脱氧核苷酸。反义链
包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与靶
RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且
其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其
可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷
酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

[0570] 图4E：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟
经修饰的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中
2个末端3′-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′
脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-O-甲基经修饰
的核苷酸，除了(N N)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如
本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(N N)核苷酸连接。

[0571] 图4F：有义链包含具有5′和3′-末端帽部分的21个核苷酸，其中2个末端3′-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟
经修饰的核苷酸，除了(NN)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本
文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2′-脱氧核苷酸。反义
链包含21个核苷酸，任选具有3′-末端甘油基部分且其中2个末端3′-核苷酸任选与
靶RNA序列互补，且具有1个3′-末端硫代磷酸酯核苷酸间键，且其中可能存在的所有嘧
啶核苷酸都是2′脱氧-2′-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是
2′-脱氧核苷酸，除了(NN)核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本
文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酸、二硫代磷酸
酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的(NN)核苷酸连接。构建
体A-F的反义链包含与本发明的任何靶核酸序列互补的序列。此外，当对于图4A-F中显示
的任何构建体在反义链的3′-末端处存在甘油基部分(L)时，经修饰的核苷酸间键是任选
的。

[0572] 图5A-F显示了本发明的具体化学修饰的siNA序列的非限制性例子。A-F将图4A-F中描述的化学修饰应用于PCSK9siNA序列。此种化学修饰可以应用于任何PCSK9序列
和/或PCSK9多态性。此外，图5中显示的序列可以任选包括在来自有义链的5′-末端
的第9位，或通过从引导链的5′-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5′-末端的
第11位处的核糖核苷酸(参见图6C)。此外，图5中显示的序列可以任选包括在反义链的
5′-末端处最高达约4个位置的末端核糖核苷酸(例如，在反义链的5′-末端处的约1
个、2个、3个或4个末端核糖核苷酸)和/或细胞靶序列。

[0573] 图6A-C显示了本发明的不同siNA构建体的非限制性例子。

[0574] 图6A中显示的例子(构建体1、2和3)具有19个代表性碱基对；然而，本发明的不同实施方案包括本文描述的任何数目的碱基对。括弧区域代表核苷酸突出端，例如，包含
长度为约1个、2个、3个或4个核苷酸，优选约2个核苷酸。构建体1和2可以独立地用于
RNAi活性。构建体2可以包含多核苷酸或非核苷酸接头，其可以任选被设计为生物可降解
的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可以包含生物可降解的接头，其导致
在体内和/或体外形成构建体1。在另一个例子中，构建体3可以用于在相同原理下产生构
建体2，其中接头用于在体内和/或体外产生活性siNA构建体2，其可以任选利用另一种生
物可降解的接头以在体内和/或体外产生活性siNA构建体1。照这样，siNA构建体的稳定
性和/或活性可以基于用于在体内或体外和/或体外使用的siNA构建体的设计进行调节。

[0575] 图6B中显示的例子代表本发明的双链核酸分子的不同变化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互补性的突出端、凸起、环和茎-环。具有凸起、环和茎-环的此种基序
一般是miRNA的特征。凸起、环和茎-环可以起因于任何程度的部分互补性，例如在本发明
的双链核酸分子的1条或2条链中约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个
或更多核苷酸的错配或凸起。

[0576] 图6C中显示的例子代表本发明的模型双链核酸分子，其包含2个21核苷酸序列的具有二核苷酸3′-突出端的19个碱基对双链体。顶部链(1)代表有义链(过客链)，
中间链(2)代表反义链(引导链)，和下部链(3)代表靶多核苷酸序列。二核苷酸突出端
(NN)可以包含衍生自靶多核苷酸的序列。例如，引导链中的3′-(NN)序列可以与靶多核
苷酸的5′-[NN]序列互补。此外，过客链的5′-(NN)序列可以包含与靶多核苷酸序列的
5′-[NN]序列相同的序列。在其他实施方案中，突出端(NN)不衍生自靶多核苷酸序列，
例如其中引导链中的3′-(NN)序列与靶多核苷酸的5′-[NN]序列不互补，且过客链的
5′-(NN)序列可以包含与靶多核苷酸序列的5′-[NN]序列不同的序列。在另外的实施方
案中，任何(NN)核苷酸是化学修饰的，例如如2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟和/或本文
的其他修饰。此外，过客链可以包含过客链的核糖核苷酸位置N。对于显示的代表性19碱
基对21聚体双链体，位置N可以是在来自过客链的3′末端中的9个核苷酸。然而，在具有
不同长度的双链体中，位置N基于引导链的5′-末端进行确定，其通过从引导链的5′-末
端计数11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。通过Ago2的切割在
如箭标指出的位置10和11之间发生。在另外的实施方案中，在基于引导链的5′-末端的
位置10和11处存在2个核糖核苷酸，NN，其通过从引导链的5′-末端计数10和11个核
苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。

[0577] 图7A-C是在产生用于产生siNA发夹构建体的表达盒中利用的方案的图示。

[0578] 图7A：合成具有5′-限制位点(R1)序列随后为具有与预定靶序列等同的序列的区域(siNA的有义区)的DNA寡聚体，其中有义区包含例如长度约19个、20个、21个或22
个核苷酸(N)，其随后为限定序列(X)的环序列，所述限定序列包含例如约3个-约10个核
苷酸。

[0579] 图7B：合成构建体随后通过DNA聚合酶进行延伸以产生具有自互补序列的发夹结构，其将导致对于靶序列具有特异性和具有自互补的有义和反义区的siNA转录物。

[0580] 图7C：将构建体加热(例如至约95℃)以使序列线性化，从而允许使用引物将互补的第二条DNA链延伸至第一条链的3′-限制序列。随后将双链DNA插入合适的载体内
用于在细胞中表达。构建体可以这样设计从而使得3′-末端核苷酸突出端起因于转录，例
如如Paul等人，2002，Nature Biotechnology，29，505-508中描述的通过工程改造限制位
点和/或利用聚尿苷酸终止区域。

[0581] 图8A-C是在产生用于产生双链siNA构建体的表达盒中利用的方案的图示。

[0582] 图8A：合成具有5′-限制位点(R1)序列随后为具有与预定靶序列等同的序列的区域(siNA的有义区)的DNA寡聚体，其中有义区包含例如长度约19个、20个、21个或22
个核苷酸(N)，且其随后为与限定序列(X)的环序列相邻的3′-限制位点(R2)。

[0583] 图8B：合成构建体随后通过DNA聚合酶进行延伸以产生具有自互补序列的发夹结构。

[0584] 图8C：通过对R1和R2特异的限制酶加工构建体以产生双链DNA，随后将所述双链DNA插入合适的载体内用于在细胞中表达。转录盒这样设计从而使得U6启动子区在dsDNA
每一侧的侧面，其产生分开的siNA有义和反义链。可以给构建体添加聚T终止序列以在所
得到的转录物中产生U突出端。

[0585] 图9A-E是用于确定特定靶核酸序列例如信使RNA内关于siNA介导的RNAi的靶位点的方法图示。

[0586] 图9A：合成siNA寡核苷酸库，其中siNA构建体的反义区在靶核酸序列中与靶位点具有互补性，且其中有义区包含与siNA的反义区互补的序列。

[0587] 图9B-C：(图9B)合并序列并插入载体内，从而使得(图9C)载体转染到细胞内导致siNA表达。

[0588] 图9D：基于与靶核酸序列调节有关的表型改变分选细胞。

[0589] 图9E：从分选的细胞中分离siNA且测序以鉴定靶核酸序列内的有效靶位点。

[0590] 图10显示了不同稳定化学(1-10)的非限制性例子，所述稳定化学可以例如用于稳定本发明的siNA序列的3′-末端，包括(1)[3-3′]-反向脱氧核糖；(2)脱氧
核糖核苷酸；(3)[5′-3′]-3′-脱氧核糖核苷酸；(4)[5′-3′]-核糖核苷酸；(5)
[5′-3′]-3′-O-甲基核糖核苷酸；(6)3′-甘油基；(7)[3′-5′]-3′-脱氧核
糖核苷酸；(8)[3′-3′]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5′-2′]-脱氧核糖核苷酸；和(10)
[5-3′]-二脱氧核糖核苷酸。除了该图中指出的经修饰的和未修饰的主链化学外，这些化
学可以与如本文所描述的不同主链修饰例如具有式I的主链修饰组合。此外，显示的末端
修饰5′显示的2′-脱氧核苷酸可以是本文描述的另一种经修饰的或未修饰的核苷酸或
非核苷酸，例如具有式I-VII中任何一个或其任何组合的修饰。

[0591] 图11显示了用于鉴定本发明化学修饰的siNA构建体的策略的非限制性例子，所述siNA构建体是核酸酶抗性的同时保留介导RNAi活性的能力。基于教导的设计参数将化
学修饰引入siNA构建体内(例如，引入2′-修饰、碱基修饰、主链修饰、末端帽修饰等)。
经修饰的构建体在合适的系统中进行测试(例如，关于核酸酶抗性的人血清，显示，或关于
PK/递送参数的动物模型)。平行地，siNA构建体就RNAi活性例如在细胞培养系统例如萤
光素酶报道分子测定)中进行测试。随后鉴定具有特定特征同时维持RNAi活性的引导siNA
构建体，且其可以再一次进行进一步修饰和测定。相同方法可以用于鉴定具有改善的药物
代谢动力学概况、递送和RNAi活性的siNA-缀合物分子。

[0592] 图12显示了本发明的磷酸化siNA分子的非限制性例子，包括线性和双链体构建体及其不对称的衍生物。

[0593] 图13显示了本发明的化学修饰的末端磷酸基的非限制性例子。

[0594] 图14A显示了利用在靶核酸序列中鉴定的回文和/或重复核酸序列用于设计自互补的DFO构建体的方法的非限制性例子。(i)在核酸靶序列中鉴定回文或重复序列。(ii)
设计与靶核酸序列和回文序列互补的序列。(iii)给互补序列的3′-末端附加互补序列
的非回文/重复部分的反向重复序列，以产生包含与核酸靶互补的序列的自互补DFO分子。
(iv)DFO分子可以自我装配以形成双链寡核苷酸。图14B显示了双链体形成寡核苷酸序列
的非限制性代表性例子。图14C显示了代表性双链体形成寡核苷酸序列的自我装配示意图
的非限制性例子。图14D显示了代表性双链体形成寡核苷酸序列的自我装配示意图，随后
为与靶核酸序列的相互作用导致基因表达的调节的非限制性例子。

[0595] 图15显示了利用掺入DFO构建体内的回文和/或重复核酸序列设计自互补DFO构建体的非限制性例子，所述DFO构建体具有与任何目的靶核酸序列互补的序列。这些回
文/重复序列的掺入允许设计形成双链体的DFO构建体，其中每条链能够例如通过RNAi介
导靶基因表达的调节。首先，鉴定靶序列。随后产生互补序列，其中将核苷酸或非核苷酸修
饰(显示为X或Y)引入互补序列内，产生人工回文(在该图中显示为XYXYXY)。给互补序
列的3′-末端附加非回文/重复互补序列的反向重复，以产生包含与核酸靶互补的序列的
自互补DFO。DFO可以自我装配以形成双链寡核苷酸。

[0596] 图16显示了包含2种分开的多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割。图16A显示了
多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区
域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所述第一个和第二个
互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的3′-末端处。多功能siNA构建体的
每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于
靶核酸序列的互补性。图16B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶
核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互
补区域2)，其中所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的
5′-末端处。多功能siNA构建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体
的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸序列的互补性。

[0597] 图17显示了包含单一多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述单一多核苷酸序列包含各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割的不同区
域。

[0598] 图17A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中
所述第二个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端处。多功能siNA构
建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具
有对于靶核酸序列的互补性。

[0599] 图17B显示多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中所
述第一个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端处。多功能siNA构建
体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有
对于靶核酸序列的互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外进行
加工，以产生如图16中所示的多功能siNA构建体。

[0600] 图18显示了包含2种分开的多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述多核苷酸序列各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割，且其中所述多
功能siNA构建体进一步包含自互补的、回文或重复区域，从而使得较短的双功能siNA构建
体成为可能，所述双功能siNA构建体可以介导针对不同靶核酸序列的RNA干扰。

[0601] 图18A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中
所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的3′-末端处，且
其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构
建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具
有对于靶核酸序列的互补性。

[0602] 图18B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中
所述第一个和第二个互补区域位于多功能siNA中的每种多核苷酸序列的5′-末端处，且
其中所述第一个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构
建体的每种多核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具
有对于靶核酸序列的互补性。

[0603] 图19显示了包含单一多核苷酸序列的本发明多功能siNA分子的非限制性例子，所述单一多核苷酸序列包含各自能够介导RNAi指导的不同靶核酸序列的切割的不同区
域，且其中所述多功能siNA构建体进一步包含自互补的、回文或重复区域，从而使得较短
的双功能siNA构建体成为可能，所述双功能siNA构建体可以介导针对不同靶核酸序列的
RNA干扰。

[0604] 图19A显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中
所述第二个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的3′-末端处，且其中所述第一
个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多
核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸
序列的互补性。

[0605] 图19B显示了多功能siNA分子的非限制性例子，其具有与第一种靶核酸序列互补的第一个区域(互补区域1)和与第二种靶核酸序列互补的第二个区域(互补区域2)，其中
所述第一个互补区域位于多功能siNA中的多核苷酸序列的5′-末端处，且其中所述第一
个和第二个互补区域进一步包含自互补的、回文或重复区域。多功能siNA构建体的每种多
核苷酸序列的虚线部分具有关于siNA双链体的相应部分的互补性，但不具有对于靶核酸
序列的互补性。在一个实施方案中，这些多功能siNA构建体在体内或体外进行加工，以产
生如图18中所示的多功能siNA构建体。

[0606] 图20显示了本发明的多功能siNA分子如何能够靶向2种分开的靶核酸分子的非限制性例子，例如编码不同蛋白质(例如，本文的任何PCSK9靶)的分开的RNA分子，例如
细胞因子及其相应受体、不同的病毒品系、病毒和涉及病毒感染或复制的细胞蛋白质、或涉
及共同或分歧生物途径的不同蛋白质，所述生物途径牵涉于疾病进展的维持。多功能siNA
构建体的每条链包含与分开的靶核酸分子具有互补性的区域。多功能siNA分子这样设计，
从而使得可以由RISC复合物利用siNA的每条链，以起始RNA干扰介导的其相应靶的切割。
这些设计参数可以包括siNA构建体的每个末端的去稳定作用(参见例如Schwarz等人，
2003，Cell，115，199-208)。此种去稳定作用可以例如通过使用如本领域已知的鸟苷-胞苷
碱基对、交替碱基对(例如，摆动)、或在末端核苷酸位置处使化学修饰的核苷酸去稳定来
完成。

[0607] 图21显示了本发明的多功能siNA分子如何能够靶向相同靶核酸分子内的2种分开的靶核酸序列的非限制性例子，例如RNA的交替编码区、RNA的编码和非编码区、或RNA的
可变剪接变体区域。多功能siNA构建体的每条链包含与靶核酸分子的分开区域具有互补
性的区域。多功能siNA分子这样设计，从而使得可以由RISC复合物利用siNA的每条链，
以起始RNA干扰介导的其相应靶区域的切割。这些设计参数可以包括siNA构建体的每个
末端的去稳定作用(参见例如Schwarz等人，2003，Cell，115，199-208)。此种去稳定作用
可以例如通过使用如本领域已知的鸟苷-胞苷碱基对、交替碱基对(例如，摆动)、或在末端
核苷酸位置处使化学修饰的核苷酸去稳定来完成。

[0608] 图22(A-H)显示了本发明的束缚多功能siNA构建体的非限制性例子。在显示的例子中，接头(例如，核苷酸或非核苷酸接头)使2个siNA区域(例如，2个有义、2个反义、
或可替代地有义和反义区连接在一起。对应于第一种靶序列和第二种靶序列的分开的有
义(或有义和反义)序列与多功能siNA中其对应的有义和/或反义序列杂交。此外，各种
缀合物、配体、适体、聚合物或报道分子可以与接头区域附着，用于选择性或改善的递送和/或药物代谢动力学性质。

[0609] 图23显示了各种基于树状聚体的多功能siNA设计的非限制性例子。

[0610] 图24显示了各种超分子的多功能siNA设计的非限制性例子。

[0611] 图25显示了使用30核苷酸前体siNA构建体的切酶激活的多功能siNA设计的非限制性例子。30碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成22和8碱基对产物(8b.p.片段
未显示)。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了3个靶向序
列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。要求亲本30b.p.siNA的N’s的2’-OH位置的
位点以使切酶切割成为可能，如果这在稳定化学中进行测试的话。应当指出30聚体双链体
经由切酶RNA酶III的加工不产生精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产物(其
中22+8是主要位点)。因此，经由切酶的加工将产生一系列活性siNAs。

[0612] 图26显示了使用40核苷酸前体siNA构建体的切酶激活的多功能siNA设计的非限制性例子。40碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成20碱基对产物。为了易于呈现，
由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了4个靶向序列。具有同源性的靶序列
由框包围。这种设计形式可以延伸至较大的RNAs。如果化学稳定的siNAs由切酶结合，那
么策略上定位的核糖核苷酸键可以使设计者切割产物成为可能，其允许更广泛的多功能设
计谱。例如不限于约22-核苷酸的切酶标准的切割产物可以允许多功能siNA构建体具有
例如约3个-约15个核苷酸的靶序列同一性重叠。

[0613] 图27显示了本发明的另外多功能siNA构建体设计的非限制性例子。在一个例子中，缀合物、配体、适体、标记或其他部分与多功能siNA的区域附着，以使得改善的递送或
药物代谢动力学概况分析成为可能。

[0614] 图28显示了本发明的另外多功能siNA构建体设计的非限制性例子。在一个例子中，缀合物、配体、适体、标记或其他部分与多功能siNA的区域附着，以使得改善的递送或
药物代谢动力学概况分析成为可能。

[0615] 图29显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限制性例子，其可以用于合成本发明的胆固醇缀合的siNA分子。显示了具有与siNA分子的有义链5′-末端连接的胆固醇部分
的例子。

[0616] 图30A和30B显示了在稳定表达PCSK9的细胞和对照细胞系中PCSK9沉默的蛋白质印迹分析的非限制性例子。

[0617] 图31显示了通过对照细胞系和PCSK9表达细胞系的diI-LDL摄取(荧光标记的LDL颗粒)的非限制性例子。

[0618] 图32显示了在Hepa1-6细胞中PCSK9 ShRNA质粒的体外筛选的非限制性例子。

[0619] 图33显示了证实在Hepa1-6细胞中Ad-PCSK9ShRNA介导的小鼠PCSK9击倒的数据的非限制性例子。

[0620] 图34A显示了在C57BL6小鼠的肝中腺病毒介导的PCSK9抑制的非限制性例子。

[0621] 图34B显示了肝击倒对于血浆LDL水平的非限制性例子。

[0622] 图35显示了PCSK9的肝击倒对于体重的非限制性例子。

[0623] 发明详述

[0624] 本发明的核酸分子的作用机制

[0625] 随后的讨论讨论了由短干扰RNA介导的RNA干扰被提议的机制，如目前已知的并且不意欲是限制性的且不是现有技术的承认。申请人在本文中证实化学修饰的短干扰核酸
如siRNA分子一样具有类似或改善的介导RNAi的能力，且预期具有改善的体内稳定性和活
性；因此，这个讨论不意欲仅限于siRNA且可以整体应用于siNA。“改善的介导RNAi的能
力”或“改善的RNAi活性”意欲包括在体外和/或体内测量的RNAi活性，其中RNAi活性是
siNA介导RNAi的能力和本发明siNAs的稳定性的反映。在本发明中，与包含多个核糖核苷
酸的全RNA siRNA或siNA相比较，这些活性的产物可以在体外和/或体内得到增加。在一
些情况下，siNA分子的活性或稳定性可以是减少的(即，小于10倍)，但siNA分子的总体
活性在体外和/或体内得到增强。

[0626] RNA干扰指动物中由短干扰RNAs(siRNAs)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，1998，Nature，391，806)。植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默
或RNA沉默，并且在真菌中也称为压抑。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外来基
因表达的进化上保守的细胞防御机制，所述细胞防御机制通常由不同的植物区系和门共享
(Fire等人，1999，Trends Genet.，15，358)。使免于外来基因表达的此种保护可能响应双链RNAs(dsRNAs)的产生而经由细胞应答发展出来，所述双链RNAs衍生自病毒感染或转座子
元件随机整合到宿主基因组内，所述细胞应答特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。
细胞中dsRNA的存在通过仍需充分表征的机制触发RNAi应答。这种机制似乎不同于起因
于dsRNA介导的蛋白激酶PKR激活和通过核糖核酸酶L导致mRNA的非特异性切割的2′，
5′-寡腺苷酸合成酶的干扰素应答。

[0627] 细胞中长dsRNAs的存在刺激称为切酶的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及dsRNA加工成称为短干扰RNAs(siRNAs)的dsRNA短片段(Berstein等人，2001，Nature，
409，363)。衍生自切酶活性的短干扰RNAs一般为长度约21个-约23个核苷酸并且包含
约19碱基对双链体。切酶也已牵涉于来自保守结构的前体RNA的21-和22-核苷酸小时序
RNAs(stRNAs)的切割，所述小时序RNAs牵涉于翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science，
293，834)。RNAi应答还以通常称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的包含siRNA的内切核
酸酶复合物为特征，所述复合物介导具有与siRNA同源的序列的单链RNA切割。靶RNA的切
割在与siRNA双链体的引导序列互补的区域中间发生(Elbashir等人，2001，Genes Dev.，
15，188)。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA(例如，微小RNA或miRNA)介导的基因沉默，
推测是通过调节染色质结构且从而阻止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，
2002，Science，297，1818-1819；Volpe 等 人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，
2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237)。照这样，本发明的siNA分子可以用于经由与RNA转录物相互作用或可替代地通过与特定基因序列相
互作用来介导基因沉默，其中此种相互作用导致在转录水平或转录后水平上的基因沉默。

[0628] RNAi已在多种系统中进行研究。Fire等人，1998，Nature，391，806首先在秀丽隐杆线虫中观察到RNAi。Wianny和Goetz，1999，NatureCell Biol.，2，70描述了在小鼠胚
胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA转染
的果蝇细胞中的RN Ai。Elbashir等人，2001，Nature，411，494描述了在培养的哺乳动物
细胞中通过引入合成的21-核苷酸RNAs的双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人
胚肾和HeLa细胞。果蝇胚胎溶解产物中的近期工作已揭示了关于siRNA长度、结构、化学
组成、和介导有效RNAi活性所必需的序列的某些要求。这些研究已显示21核苷酸siRNA
双链体在包含2个2-核苷酸3′-末端核苷酸突出端时是最有活性的。此外，用2′-脱
氧或2′-O-甲基核苷酸置换1条或2条siRNA链取消了RNAi活性，而用脱氧核苷酸置换
3′-末端siRNA核苷酸显示是耐受的。siRNA双链体中心处的错配序列也显示取消了RNAi
活性。此外，这些研究还指出靶RNA中切割位点的位置由siRNA引导序列的5′-末端而不
是3′-末端限定(Elbashir等人，2001，EMBO J.，20，6877)。其他研究已指出siRNA双链
体的靶互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所需的，并且ATP用于维持siRNA上的5′-磷
酸部分(Nykanen等人，2001，Cell，107，309)；然而，缺乏5′-磷酸的siRNA分子当外源引
入时是有活性的，从而暗示siRNA构建体的5′-磷酸化可以在体内发生。

[0629] 本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)

[0630] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含双链体形成寡核苷酸(DFO)的siNA分子，所述DFO可以自我装配成双链寡核苷酸。本发明的双链体形成寡核苷酸可以化学合成
或由转录单位和/或载体表达。本发明的DFO分子提供用于多种治疗、诊断、农业、兽医、靶
确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的有用试剂和方法。

[0631] 申请人在本文中证实某些寡核苷酸是基因表达的序列特异性调节的有效介质，所述寡核苷酸为了方便起见且非限制性地在本文中称为双链体形成寡核苷酸或DFO分子。本
发明的寡核苷酸与本领域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的不同之处在于它们代表被设计为自我装配成双链寡核苷酸的一类线性多核
苷酸序列，其中双链寡核苷酸中的每条链包含与靶核酸分子互补的核苷酸序列。本发明的
核酸分子因此可以自我装配成功能双链体，其中双链体的每条链包含相同的多核苷酸序列
且每条链包含与靶核酸分子互补的核苷酸序列。

[0632] 一般地，双链寡核苷酸通过2种不同的寡核苷酸序列装配形成，其中一条链的寡核苷酸序列与第二条链的寡核苷酸序列互补；此种双链寡核苷酸由2种分开的寡核苷酸装
配，或由在其自身上折叠以形成双链结构的单个分子装配，所述单个分子在本领域中通常
称为发夹茎环结构(例如，shRNA或短发夹RNA)。本领域已知的这些双链寡核苷酸都具有
共同特征，因为双链体的每条链具有不同的核苷酸序列。

[0633] 不同于本领域已知的双链核酸分子，申请人已开发了由单链或线性寡核苷酸开始形成双链核酸分子的新的、潜在地节省成本和简化的方法。根据本发明形成的双链寡核苷
酸的2条链具有相同的核苷酸序列并且彼此不共价连接。此种双链寡核苷酸分子可以通过
本领域已知的方法和试剂容易地进行合成后连接，并且在本发明的范围内。在一个实施方
案中，形成双链寡核苷酸的本发明的单链寡核苷酸(双链体形成寡核苷酸)包含第一个区
域和第二个区域，其中所述第二个区域包括其是第一个区域中的核苷酸序列或其部分的反
向重复的核苷酸序列，从而使得单链寡核苷酸自我装配以形成双链体寡核苷酸，其中双链
体的一条链的核苷酸序列与第二条链的核苷酸序列相同。此种双链体形成寡核苷酸的非限
制性例子在图14和15中举例说明。这些双链体形成寡核苷酸(DFOs)可以任选包括某些
回文或重复序列，其中此种回文或重复序列存在于DFO的第一个区域和第二个区域之间。

[0634] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链体形成寡核苷酸(DFO)分子，其中所述DFO包含双链体形成自互补核酸序列，其具有与靶核酸序列互补的核苷酸序列。DFO分子
可以包含单个自互补序列或起因于此种自互补序列装配的双链体。

[0635] 在一个实施方案中，本发明的双链体形成寡核苷酸(DFO)包含第一个区域和第二个区域，其中所述第二个区域包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含第一个区域的核苷酸
序列的反向重复，从而使得DFO分子可以装配成双链寡核苷酸。此种双链寡核苷酸可以充
当短干扰核酸(siNA)以调节基因表达。由本发明的DFO分子形成的双链寡核苷酸双链体
的每条链可以包含与靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA)中的相同核苷酸序列互补的核苷酸
序列区域。

[0636] 在一个实施方案中，本发明的特征在于可以装配成双链寡核苷酸的单链DFO。申请人已惊讶地发现具有自互补性的核苷酸区域的单链寡核苷酸可以容易地装配成双链体寡
核苷酸构建体。此种DFOs可以装配成可以以序列特异性方式抑制基因表达的双链体。本
发明的DFO分子包含具有核苷酸序列的第一个区域，所述核苷酸序列与第二个区域的核苷
酸序列互补，且其中所述第一个区域的序列与靶核酸(例如RNA)互补。DFO可以形成双链
寡核苷酸，其中双链寡核苷酸的每条链的部分包含与靶核酸序列互补的序列。

[0637] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链寡核苷酸，其中所述双链寡核苷酸的2条链彼此不共价连接，且其中双链寡核苷酸的每条链包含与靶核酸分子中的相同核苷酸序
列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)互补的核苷酸序列。在另一个实施方案中，双链寡核苷
酸的2条链共享至少约15个，优选至少约16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸的
相同核苷酸序列。

[0638] 在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含具有式DFO-I的结构：

[0639] 5′-p-X Z X′-3′

[0640] 其中Z包含任选具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复核酸序列，例如
长度为偶数数目的约2个-约24个核苷酸(例如，约2个、4个、6个、8个、10个、12个、14
个、16个、18个、20个或22个或24个核苷酸)，X代表例如长度约1个-约21个核苷酸(例
如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、
16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约1个-约
21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或
其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端磷酸基，且其中序
列X和Z独立或共同包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列或其部分互补且具有足够的
长度以与靶核酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)相互作用(例如，碱基配对)。例如，
X独立地可以包含长度为约12个-约21个或更多(例如，约12个、13个、14个、15个、16
个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)核苷酸的序列，其与靶RNA中的核苷酸序列或
其部分互补。在另一个非限制性例子中，当X存在时，与靶RNA或其部分(例如，PCSK9RNA
靶)互补的X和Z的核苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约
12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另外一个非限制性例子中，当X不存在时，与PCSK9靶RNA或其部分互补的Z的核苷酸序列长度为约12
个-约24个或更多核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个或更多)。
在一个实施方案中，X、Z和X′独立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包含足够长度的核苷酸
序列，以与靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)相互作用(例如，碱基
配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷
酸X和X′的长度不同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和X’，或X、Z和X’的
长度相同或不同。

[0641] 当序列在本说明书中被描述为具有“足够的”长度以与另一种序列相互作用(即，碱基配对)时，它意指长度是这样的，从而使得2种序列之间形成的键(例如，氢键)数目
足以使得2种序列在目的条件下能够形成双链体。此种条件可以是体外的(例如，对于诊
断或测定目的)或体内的(例如，对于治疗目的)。测定此种长度是简单和常规的事情。

[0642] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-I(a)的双链寡核苷酸构建体：

[0643] 5′-p-X Z X′-3′

[0644] 3′-X′Z X-p-5′

[0645] 其中Z包含回文或重复核酸序列或者具有一个或多个经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤、2-氨基-1，6-二氢嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文
或重复样核酸序列，例如长度为偶数数目的约2个-约24个核苷酸(例如，约2个、4个、6
个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个或24个核苷酸)，X代表例如长度约1
个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、
12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′
包含例如长度约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、
9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的
末端磷酸基，且其中X和Z各自独立地包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列或其部分
(例如，PCSK9 RNA靶)互补且具有足够的长度以与靶核酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA
靶)相互作用。例如，序列X独立地可以包含长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例
如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)的序列，其与靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)互补。在另一个非限制性例子中，
与靶或其部分互补的X和Z的核苷酸序列一起(当X存在时)的长度为约12个-约21个
或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另外一个非限制性例子中，当X不存在时，与靶RNA或其部分互补的Z的核苷酸
序列长度为约12个-约24个或更多核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22
个、24个或更多)。在一个实施方案中，X、Z和X′独立地是寡核苷酸，其中X和/或Z包
含足够长度的核苷酸序列，以与靶RNA中的核苷酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)相
互作用(例如，碱基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个
实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和Z，或Z和
X’，或X、Z和X’的长度相同或不同。在一个实施方案中，式DFO-I(a)的双链寡核苷酸构建
体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此种错配不显著地减少双
链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0646] 在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含具有式DFO-II的结构：

[0647] 5′-p-X X′-3′

[0648] 其中X和X′各自独立地是长度约12个核苷酸-约21个核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、
18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约12个-约21个核苷
酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、
具有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末
端磷酸基，且其中X包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列(例如，PCSK9 RNA)或其部分
互补且具有足够的长度以与靶核酸序列或其部分相互作用(例如，碱基配对)。在一个实施
方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度不
同。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定的双链寡核苷酸。

[0649] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-II(a)的双链寡核苷酸构建体：

[0650] 5′-p-X X′-3′

[0651] 3′-X′X-p-5′

[0652] 其中X和X′各自独立地是长度约12个核苷酸-约21个核苷酸的寡核苷酸，其中X包含例如长度约12个-约21个核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、
18个、19个、20个或21个核苷酸)的核酸序列，X′包含例如长度约12个-约21个核苷酸
(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)的、具
有对于序列X或其部分的核苷酸序列互补性的核酸序列，p包含可以存在或不存在的末端
磷酸基，且其中X包含这样的核苷酸序列，其与靶核酸序列或其部分(例如，PCSK9 RNA靶)
互补且具有足够的长度以与靶核酸序列(例如，PCSK9 RNA)或其部分相互作用(例如，碱
基配对)。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施方案中，寡核
苷酸X和X′的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度足以形成相对稳定
的双链寡核苷酸。在一个实施方案中，式DFO-II(a)的双链寡核苷酸构建体包括一个或多
个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此种错配不显著地减少双链寡核苷酸抑制
靶基因表达的能力。

[0653] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有式DFO-I(b)的DFO分子：

[0654] 5′-p-Z-3′

[0655] 其中Z包含任选包括一个或多个非标准的或经修饰的核苷酸(例如具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷酸)的回文或重复核酸序列，所述非标准的或经
修饰的核苷酸可以促进与其他核苷酸的碱基配对。Z可以具有例如足以与靶核酸(例如，
PCSK9 RNA)分子的核苷酸序列相互作用(例如，碱基配对)的长度，优选长度至少12个核
苷酸，具体地约12个-约24个核苷酸(例如，约12个、14个、16个、18个、20个、22个或
24个核苷酸)。p表示可以存在或不存在的末端磷酸基。

[0656] 在一个实施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)、DFO-I(b)、DFO-II(a)或DFO-II中任何一个的DFO分子可以包含化学修饰，其如本文所描述，但不限于，例如具有式I-VII中
任何一个的核苷酸、如表IV中描述的稳定化学、或如本文的各种实施方案中描述的经修饰
的核苷酸和非核苷酸的任何其他组合。

[0657] 在一个实施方案中，具有式DFO-I、DFO-I(a)和DFO-I(b)的DFO构建体的Z中的回文或重复序列或经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基
的核苷酸)包含化学修饰的核苷酸，其能够与靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成
沃森克里克碱基对或非沃森克里克碱基对的经修饰的碱基类似物)。

[0658] 在一个实施方案中，本发明的DFO分子，例如具有式DFO-I或DFO-II的DFO包含约15个-约40个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23
个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。在一个实施方案中，本发明的DFO分子包含一种或多种化
学修饰。在一个非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸和/或非核苷酸引入本发明的核酸
分子内提供了克服外源递送的未修饰的RNA分子固有的体内稳定性和生物利用率的潜在
局限性中的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可以使对于给定疗效较低剂量的
特定核酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中或在细胞或组织中倾向于具有
较长的半衰期。此外，通过不仅增强半衰期而且促进核酸分子靶向特定器官、细胞或组织和
/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核酸分子的生物利用率和/或效力。
因此，即使与天然/未修饰的核酸分子相比较，例如，当与未修饰的RNA分子相比较时，化学
修饰的核酸分子的活性在体外减少，但由于分子改善的稳定性、效力、效应持续时间、生物
利用率和/或递送，经修饰的核酸分子的总体活性也可以大于天然或未修饰的核酸分子。

[0659] 本发明的多功能或多靶向siNA分子

[0660] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子的siNA分子，其调节生物系统例如细胞、组织或生物中的一种或多种靶基因的表达。本
发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子可以靶向PCSK9靶核酸序列的超过一个区
域，或可以靶向超过一种不同的靶核酸分子(例如，PCSK9或PCSK9途径RNA和/或DNA靶)
的序列。本发明的多功能siNA分子可以化学合成或由转录单位和/或载体表达。本发明
的多功能siNA分子提供用于多种人应用、治疗、诊断、农业、兽医、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的有用试剂和方法。

[0661] 申请人在本文中证实某些寡核苷酸是基因表达的序列特异性调节的有效介质，所述寡核苷酸为了方便起见且非限制性地在本文中称为多功能短干扰核酸或多功能siNA分
子。本发明的多功能siNA分子与本领域已知的其他核酸序列(例如，siRNA、miRNA、stRNA、
shRNA、反义寡核苷酸等)的不同之处在于它们代表这样设计的一类多核苷酸分子，从而使
得多功能siNA构建体中的每条链包含与一种或多种靶核酸分子中的不同核酸序列互补的
核苷酸序列。本发明的单个多功能siNA分子(一般是双链分子)因此可以靶向超过一种
(例如，2种、3种、4种、5种或更多)不同的靶核酸靶分子。本发明的核酸分子也可以靶向
相同靶核酸序列的超过一个(例如，2个、3个、4个、5个或更多)区域。照这样，本发明的
多功能siNA分子在下调或抑制一种或多种靶核酸分子的表达中是有用的。例如，本发明的
多功能siNA分子可以靶向(例如，与之具有互补性)选自下述的核酸分子：PCSK9、H6PD、
PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶
1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结
构域11、凋亡抑制6、F-框唯一蛋白质3或其任何组合。通过用一种多功能siNA构建体减
少或抑制超过一种靶核酸分子的表达，本发明的多功能siNA分子代表一类有效的治疗剂，
其可以提供疾病(例如血管生成)相关途径内的多重靶的同时抑制。此种同时抑制可以提
供协同治疗处理策略，而无需分开的临床前和临床开发努力或复杂的管理机构批准过程。

[0662] 靶向靶核酸分子(例如，信使RNA)的超过一个区域的多功能siNA分子的用途预期提供基因表达的有效抑制。例如，本发明的单个多功能siNA构建体可以靶向靶核酸分子
(例如，PCSK9 RNA或DNA)的保守和可变区，从而允许下调或抑制由单一基因编码的不同剪
接变体，或允许靶向靶核酸分子的编码和非编码区。

[0663] 一般地，双链寡核苷酸由2种不同的寡核苷酸装配形成，其中一条链的寡核苷酸序列与第二条链的寡核苷酸序列互补；此种双链寡核苷酸一般由2种分开的寡核苷酸(例
如，siRNA)装配。可替代地，双链体可以由在其自身上折叠的单个分子(例如，shRNA或短
发夹RNA)形成。这些双链寡核苷酸是本领域已知介导RNA干扰的且全部具有共同特征，其
中只有1个核苷酸序列区域(引导序列或反义序列)与靶核酸序列具有互补性，且另一条
链(有义序列)包含与靶核酸序列同源的核苷酸序列。一般地，反义序列保留在活性RISC
复合物中，且通过反义序列与靶序列的互补碱基配对将RISC引导至靶核苷酸序列，用于介
导序列特异性RNA干扰。本领域已知在一些细胞培养系统中，某些类型的未修饰的siRNAs
可以显示出“脱靶”效应。假设这种脱靶效应涉及在RISC复合物中siRNA的有义序列而不
是反义序列的参与(参见例如Schwarz等人，2003，Cell，115：199-208)。在这种情况下，
有义序列被认为将RISC复合物指导至不同于预期靶序列的序列(脱靶序列)，从而导致脱
靶序列的抑制。在这些双链核酸分子中，每条链与不同的靶核酸序列互补。然而，受这些
dsRNAs影响的脱靶是完全无法预测的且是非特异性的。

[0664] 不同于本领域已知的双链核酸分子，申请人已开发了使用单个多功能siNA构建体下调或抑制超过一种靶核酸序列的表达的新的、潜在地节省成本和简化的方法。本发明
的多功能siNA分子被设计为双链或部分双链的，从而使得多功能siNA的每条链或区域的
部分与选择的靶核酸序列互补。照这样，本发明的多功能siNA分子不限于彼此互补的靶向
序列，而是任何2种不同的靶核酸序列。本发明的多功能siNA分子被这样设计，从而使得
与给定靶核酸序列互补的多功能siNA分子的每条链或区域具有合适的长度(例如，长度为
约16个-约28个核苷酸，优选长度为约18个-约28个核苷酸)用于介导针对靶核酸序
列的RNA干扰。靶核酸序列和多功能siNA的链或区域之间的互补性必须是足够的(至少
约8个碱基对)以用于经由RNA干扰切割靶核酸序列。本发明的多功能siNA预期使对于
某些siRNA序列例如(Schwarz等人，同上)中描述的那些可见的脱靶效应降到最低。

[0665] 已报道长度29个碱基对-36个碱基对的dsRNAs(Tuschl等人，国际PCT公开号WO02/44321)不介导RNAi。这些dsRNAs无活性的一个原因可能是缺乏周转或与靶RNA序列
相互作用的链的解离，从而使得RISC复合物不能与靶RNA的多个拷贝有效相互作用，从而
导致RNAi过程的效力和功效显著下降。申请人已惊讶地发现本发明的多功能siNAs可以
克服这个障碍且能够增强RNAi过程的功效和效力。照这样，在本发明的某些实施方案中，
长度约29个-约36个碱基对的多功能siNAs可以这样设计，从而使得多功能siNA分子的
每条链的部分包含长度足以有效介导RNAi(例如，约15个-约23个碱基对)的与靶核酸
互补的核苷酸序列区域和与靶核酸不互补的核苷酸序列区域。通过在多功能siNA的每条
链中具有互补和非互补部分，多功能siNA可以介导针对靶核酸序列的RNA干扰，而不被抑
制周转或解离(例如，当每条链的长度太长而不能介导针对分别的靶核酸序列的RNAi时)。
此外，具有内部重叠区的本发明多功能siNA分子的设计允许多功能siNA分子具有有利的
(减少的)大小用于介导RNA干扰，和具有非常适合于用作治疗剂的大小(例如，其中每条
链独立地长度为约18个-约28个核苷酸)。非限制性例子在图16-28中举例说明。

[0666] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含第一个区域和第二个区域，其中多功能siNA的所述第一个区域包含与第一种靶核酸分子的核酸序列互补的核苷酸序
列，且多功能siNA的所述第二个区域包含与第二种靶核酸分子的核酸序列互补的核酸序
列。在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含第一个区域和第二个区域，其中多
功能siNA的所述第一个区域包含与靶核酸分子的第一个区域的核酸序列互补的核苷酸序
列，且多功能siNA的所述第二个区域包含与靶核酸分子的第二个区域的核酸序列互补的
核苷酸序列。在另一个实施方案中，多功能siNA的第一个区域和第二个区域可以包含共享
某一程度的互补性(例如，约1个-约10个互补核苷酸)的分开的核酸序列。在某些实施
方案中，包含分开的核酸序列的多功能siNA构建体可以通过本领域已知的方法和试剂容
易地进行合成后连接，并且此种连接的构建体在本发明的范围内。可替代地，多功能siNA
的第一个区域和第二个区域可以包含具有某一程度的自互补性的单一核酸序列，例如在发
夹或茎环结构中。此种双链和发夹多功能短干扰核酸的非限制性例子分别在图16和17中
举例说明。这些多功能短干扰核酸(多功能siNAs)可以任选包括某些重叠核苷酸序列，其
中此种重叠核苷酸序列存在于多功能siNA的第一个区域和第二个区域之间(参见例如图
18和19)。

[0667] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的每条链独立地包含与不同的靶核酸序列互补的核酸序列的第一个区域和
与靶序列不互补的核苷酸序列的第二个区域。每条链的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不
同靶核酸分子中。

[0668] 在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非
互补区域1)；(b)多功能siNA的第二条链包含与靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补
区域2)，所述靶核酸序列不同于与第一条链核苷酸序列互补的靶核苷酸序列，和与互补区
域2的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1
包含与第二条链的非互补区域2中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区
域2包含与与第一条链的非互补区域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。互补区域1和
互补区域2的靶核酸序列在相同靶核酸分子或不同靶核酸分子中。

[0669] 在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与衍生自基因(例如，第一种PCSK9基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与
互补区域1的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域1)；(b)多功能siNA的第
二条链包含与衍生自基因(例如，第二种PCSK9基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区
域(互补区域2)，所述基因不同于互补区域1的基因，和与互补区域2的靶核苷酸序列没有
序列互补性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1包含与第二条链的非互补
区域2中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区域2包含与与第一条链的
非互补区域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

[0670] 在另一个实施方案中，多功能siNA包含2条链，其中：(a)第一条链包含与衍生自基因(例如，PCSK9基因)的靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域1)，和与互补区
域1的靶核苷酸序列没有序列互补性的区域(非互补区域1)；(b)多功能siNA的第二条链
包含与第二种靶核酸序列具有序列互补性的区域(互补区域2)，所述第二种靶核酸序列不
同于互补区域1的第一种靶核酸序列，然而，前提是关于互补区域1的靶核酸序列和关于互
补区域2的靶核酸序列都衍生自相同基因，和与互补区域2的靶核苷酸序列没有序列互补
性的区域(非互补区域2)；(c)第一条链的互补区域1包含与第二条链的非互补区域2中
的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二条链的互补区域2包含与与第一条链的非互补区
域1中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

[0671] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2种互补核酸序列，其中第一种序列包含与第一种靶核酸分子内的
核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域，且其中第二种序列包含与相同靶核酸分
子内的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域。优选地，第一种序列的第一
个区域也与第二种序列的第二个区域的核苷酸序列互补，且第二种序列的第一个区域与第
一种序列的第二个区域的核苷酸序列互补。

[0672] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中所述多功能siNA包含2种互补核酸序列，其中第一种序列包含与第一种靶核酸分子内的
核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域，且其中第二种序列包含与第二种靶核酸
分子内的不同核苷酸序列具有核苷酸序列互补性的第一个区域。优选地，第一种序列的第
一个区域也与第二种序列的第二个区域的核苷酸序列互补，且其中第二种序列的第一个区
域与第一种序列的第二个区域的核苷酸序列互补。

[0673] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含第一个区域和第二个区域的多功能siNA分子，其中所述第一个区域包含与第一种靶核酸分子内的核酸序列互补的具有约18
个-约28个核苷酸的核酸序列，且所述第二个区域包含与第二种靶核酸分子内的不同核酸
序列互补的具有约18个-约28个核苷酸的核苷酸序列。

[0674] 在一个实施方案中，本发明的特征在于包含第一个区域和第二个区域的多功能siNA分子，其中所述第一个区域包含与靶核酸分子内的核酸序列互补的具有约18个-约
28个核苷酸的核酸序列，且所述第二个区域包含与相同靶核酸分子内的不同核酸序列互补
的具有约18个-约28个核苷酸的核苷酸序列。

[0675] 在一个实施方案中，本发明的特征在于双链多功能短干扰核酸(多功能siNA)分子，其中多功能siNA的一条链包含具有与第一种靶核酸序列互补的核苷酸序列的第一个
区域，且第二条链包含具有与第二种靶核酸序列互补的核苷酸序列的第一个区域。第一种
和第二种靶核酸序列可以存在于分开的靶核酸分子中，或可以是相同靶核酸分子内的不同
区域。照这样，本发明的多功能siNA分子可以用于靶向不同基因、相同基因的剪接变体、一
种或多种基因转录物的突变和保守区、或相同或不同基因或基因转录物的编码和非编码序
列的表达。

[0676] 在一个实施方案中，本发明的靶核酸分子编码单一蛋白质。在另一个实施方案中，靶核酸分子编码超过一种蛋白质(例如，1种、2种、3种、4种、5种或更多蛋白质)。照这样，本发明的多功能siNA构建体可以用于下调或抑制几种蛋白质的表达。例如，在一条链中包
含与衍生自编码一种蛋白质的基因的第一种靶核酸序列具有核苷酸序列互补性的区域，和
第二条链包含与衍生自编码2种或更多蛋白质(例如2种不同蛋白质)的基因的靶核酸分
子中存在的第二种靶核酸序列具有核苷酸序列互补性的区域的多功能siNA分子，通过靶
向多种PCSK9或PCSK9基因可以用于下调、抑制或关闭特定生物途径，所述2种或更多蛋白
质选自PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR
靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6、F-框唯一蛋白质3或其任何组合。

[0677] 在一个实施方案中，本发明利用不同PCSK9变体中存在的保守核苷酸序列。通过设计多功能siNAs，其方式为其中一条链包括与各种同工型中保守的靶核酸序列互补的序
列，且另一条链包括与靶核酸序列互补的序列，所述靶核酸序列例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、
凋亡抑制6、F-框唯一蛋白质3的任一种，可能使用单个多功能siNA有选择地和有效地调
节或抑制生物途径(例如高脂血症和/或胰岛素抵抗)或生物途径中的多重基因。

[0678] 在一个实施方案中，本发明的多功能短干扰核酸(多功能siNA)包含第一个区域和第二个区域，其中所述第一个区域包含与第一种PCSK9靶的第一种PCSK9RNA互补的核苷
酸序列，且所述第二个区域包含与第二种PCSK9靶的第二种PCSK9RNA互补的核苷酸序列。
在一个实施方案中，第一个和第二个区域可以包含与相同PCSK9靶序列内的不同PCSK9靶
位点的共享或保守RNA序列或不同PCSK9靶序列中共享的互补的核苷酸序列。

[0679] 在一个实施方案中，本发明的双链多功能siNA分子包含具有式MF-I的结构：

[0680] 5′-p-X Z X′-3′

[0681] 3′-Y′Z Y-p-5′

[0682] 其中5’-p-XZX’-3’和5’-p-YZY’-3’各自独立地是长度约20个核苷酸-约300个核苷酸的寡核苷酸，优选约20个-约200个核苷酸，约20个-约100个核苷酸，约20
个-约40个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约24个-约38个核苷酸，或约26个-约
38个核苷酸；XZ包含与第一种靶核酸序列互补的核酸序列；YZ是包含与第二种靶核酸序列
互补的核酸序列的寡核苷酸；Z包含自互补的长度约1个-约24个核苷酸(例如，约1个、
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个核苷酸)的核苷酸序列；X包含与区域Y’
中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约
21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；Y包含与区域X’中存
在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个
核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、
14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；每个p包含独立地存在或不
存在的末端磷酸基；XZ和YZ各自独立地具有足以分别与第一种和第二种靶核酸序列或其
部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度。例如，每种序列X和Y可以独立地包含长度
为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个或更多)的序列，其与不同靶核酸分子例如靶RNAs或其部分中的靶核苷
酸序列互补。在另一个非限制性例子中，与第一种靶核酸序列或其部分互补的X和Z的核
苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13个、14个、15
个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在另一个非限制性例子中，与第二种靶核酸序列或其部分互补的Y和Z的核苷酸序列一起的长度为约12个-约21个或更多核苷
酸(例如，约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)。在
一个实施方案中，第一种靶核酸序列和第二种靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，
PCSK9靶RNA或PCSK9途径靶RNA，例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶
枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯
一蛋白质3RNA)中。在另一个实施方案中，第一种靶核酸序列和第二种靶核酸序列存在于
不同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA和PCSK9途径靶RNA)中。在一个实施方案中，Z包
含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X’的长度相同。在另一个实施方案
中，寡核苷酸X和X’的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度相同。在另
一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y’的长度不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡核苷
酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此种错配不显著地
减少双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0683] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-II的结构：

[0684] 5′-p-X X′-3′

[0685] 3′-Y′Y-p-5′

[0686] 其中5’-p-XX’-3’和5’-p-YY’-3’各自独立地是长度约20个核苷酸-约300个核苷酸的寡核苷酸，优选约20个-约200个核苷酸，约20个-约100个核苷酸，约20个-约
40个核苷酸，约20个-约40个核苷酸，约24个-约38个核苷酸，或约26个-约38个核
苷酸；X包含与第一种靶核酸序列互补的核酸序列；Y是包含与第二种靶核酸序列互补的核
酸序列的寡核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核
苷酸的核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、
7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；Y包含与区域X′中存在的核苷酸序列互补的长度约1个-约100个核苷酸的
核苷酸序列，优选约1个-约21个核苷酸(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、
8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个核苷酸)；每个p包含独立地存在或不存在的末端磷酸基；X和Y各自独立地具有足以分别与
第一种和第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度。例如，每
种序列X和Y可以独立地包含长度为约12个-约21个或更多核苷酸(例如，约12个、13
个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多)的序列，其与不同靶核酸分子例如靶RNAs或其部分中的靶核苷酸序列互补。在一个实施方案中，第一种靶核酸序列和
第二种靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA或PCSK9途径靶RNA，例如
H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV和/或CETP RNA)中。在另一个实施方案中，第一种靶核酸
序列和第二种PCSK9靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA和PCSK9途
径靶RNA，例如H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV和/或CETP RNA)中。在一个实施方案中，
Z包含回文或重复序列。在一个实施方案中，寡核苷酸X和X′的长度相同。在另一个实施
方案中，寡核苷酸X和X′的长度不同。在一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y′的长度相同。
在另一个实施方案中，寡核苷酸Y和Y′的长度不同。在一个实施方案中，式I(a)的双链寡
核苷酸构建体包括一个或多个，具体地1个、2个、3个或4个错配，其程度至此种错配不显
著地减少双链寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。

[0687] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-III的结构：

[0688] X X′

[0689] Y′-W-Y

[0690] 其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在
的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序
列；X和X′各自独立地具有足以分别与第一种和第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互
作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷酸接头；且多
功能siNA经由RNA干扰指导第一种和第二种靶序列的切割。在一个实施方案中，第一种靶
核酸序列和第二种靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA或PCSK9途径
靶RNA，例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin
9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯一蛋白质3RNA)中。在另
一个实施方案中，第一种靶核酸序列和第二种靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，
PCSK9靶RNA和PCSK9途径靶RNA，例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶
枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯一
蛋白质3RNA)中。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末
端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。
在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实
施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，
末端磷酸基存在于序列X的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′
的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端处。在一个实
施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末端处。在一个实施方案中，W经由生物可
降解的接头使序列Y和Y′连接。在一个实施方案中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配
体、脂质或聚合物。

[0691] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-IV的结构：

[0692] X X′

[0693] Y′-W-Y

[0694] 其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在
的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序
列；Y和Y′各自独立地具有足以分别与第一种和第二种靶核酸序列或其部分稳定地相互
作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷酸接头；且多
功能siNA经由RNA干扰指导第一种和第二种靶序列的切割。在一个实施方案中，第一种靶
核酸序列和第二种靶核酸序列存在于相同靶核酸分子(例如，PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/
CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑
制6和/或F-框唯一蛋白质3RNA)中。在另一个实施方案中，第一种靶核酸序列和第二种
靶核酸序列存在于不同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA和PCSK9途径靶RNA，例如PCSK9、
H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋
白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯一蛋白质3RNA)中。在一个实施方案中，区域W
使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′
的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末
端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末端与序列
Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端处。在一
个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基
存在于序列Y的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′的5′-末
端处。在一个实施方案中，W经由生物可降解的接头使序列Y和Y′连接。在一个实施方案
中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配体、脂质或聚合物。

[0695] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子包含具有式MF-V的结构：

[0696] X X′

[0697] Y′-W-Y

[0698] 其中X、X’、Y和Y’各自独立地是长度约15个核苷酸-约50个核苷酸的寡核苷酸，优选约18个-约40个核苷酸，或约19个-约23个核苷酸；X包含与区域Y′中存在的核
苷酸序列互补的核苷酸序列；X′包含与区域Y中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列；X、
X’、Y或Y’各自独立地具有足以分别与第一种、第二种、第三种或第四种靶核酸序列或其部分稳定地相互作用(即，碱基配对)的长度；W代表使序列Y′和Y连接的核苷酸或非核苷
酸接头；且多功能siNA经由RNA干扰指导第一种、第二种、第三种和/或第四种靶序列的切
割。在一个实施方案中，第一种、第二种、第三种和第四种靶核酸序列全都存在于相同靶核
酸分子(例如，PCSK9靶RNA或PCSK9途径靶RNA，例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/
AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白
5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6
和/或F-框唯一蛋白质3RNA)中。在另一个实施方案中，第一种、第二种、第三种和第四种
靶核酸序列独立地存在于不同靶核酸分子(例如，PCSK9靶RNA和PCSK9途径靶RNA，例如
PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、
金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯一蛋白质3RNA)中。在一个实施方案中，
区域W使序列Y′的3′-末端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使
序列Y′的3′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′
的5′-末端与序列Y的5′-末端连接。在一个实施方案中，区域W使序列Y′的5′-末
端与序列Y的3′-末端连接。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X的5′-末端
处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列X′的5′-末端处。在一个实施方案中，
末端磷酸基存在于序列Y的5′-末端处。在一个实施方案中，末端磷酸基存在于序列Y′
的5′-末端处。在一个实施方案中，W经由生物可降解的接头使序列Y和Y′连接。在一
个实施方案中，W进一步包含缀合物、标记、适体、配体、脂质或聚合物。

[0699] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子(例如，具有式MF-I-MF-V中的任何一个)的区域X和Y与相同靶核酸分子的部分的不同靶核酸序列互补。在一个实施方案
中，此种靶核酸序列位于RNA转录物的编码区内的不同位置处。在一个实施方案中，此种靶
核酸序列包含相同RNA转录物的编码和非编码区。在一个实施方案中，此种靶核酸序列包
含可变剪接转录物或此种可变剪接转录物的前体的区域。

[0700] 在一个实施方案中，具有式MF-I-MF-V中的任何一个的多功能siNA分子可以包含化学修饰，其如本文所描述但不限于，例如具有本文描述的式I-VII中任何一个的核苷酸、
如表IV中描述的稳定化学、或如本文的各种实施方案中描述的经修饰的核苷酸和非核苷
酸的任何其他组合。

[0701] 在一个实施方案中，具有式MF-I或MF-II的多功能siNA构建体的Z中的回文或重复序列或经修饰的核苷酸(例如，具有经修饰的碱基例如2-氨基嘌呤或通用碱基的核苷
酸)包含化学修饰的核苷酸，其能够与靶核酸序列的部分相互作用(例如，可以形成沃森克
里克碱基对或非沃森克里克碱基对的经修饰的碱基类似物)。

[0702] 在一个实施方案中，本发明的多功能siNA分子，例如具有式MF-I-MF-V的多功能siNA的每条链独立地包含约15个-约40个核苷酸(例如，约15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、
33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸)。在一个实施方案中，本发明
的多功能siNA分子包含一种或多种化学修饰。在非限制性例子中，将化学修饰的核苷酸和
/或非核苷酸引入本发明的核酸分子内提供了克服外源递送的未修饰的RNA分子固有的体
内稳定性和生物利用率的潜在局限性中的有力工具。例如，化学修饰的核酸分子的使用可
以使对于给定疗效较低剂量的特定核酸分子成为可能，因为化学修饰的核酸分子在血清中
或在细胞或组织中倾向于具有较长的半衰期。此外，通过不仅增强半衰期而且促进核酸分
子靶向特定器官、细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取，某些化学修饰可以改善核
酸分子的生物利用率和/或效力。因此，即使与天然/未修饰的核酸分子相比较，例如，当
与未修饰的RNA分子相比较时，化学修饰的核酸分子的活性在体外减少，但由于分子改善
的稳定性、效力、效应持续时间、生物利用率和/或递送，经修饰的核酸分子的总体活性也
可以大于天然或未修饰的核酸分子。

[0703] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNAs，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中每条有义链的一个末端与另一种siNA分子的有义链的末
端栓系，从而使得2条反义siNA链与其相应的有义链退火，所述有义链在一个末端处彼此
栓系(参见图22)。系链或接头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的
接头或非基于核苷酸的接头。

[0704] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条有义链的5′-末端与另一种siNA分子的有义链
的5′-末端栓系，从而使得2条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有
义链在一个末端处彼此栓系，彼此背向(在相反方向上)(参见图22(A))。系链或接头可以
是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0705] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条有义链的3′-末端与另一种siNA分子的有义链
的3′-末端栓系，从而使得2条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有
义链在一个末端处彼此栓系，彼此面对(参见图22(B))。系链或接头可以是如本领域一般
已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0706] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条有义链的5′-末端与另一种siNA分子的有义链
的3′-末端栓系，从而使得一条反义siNA链的5′-末端与其相应的有义链退火，所述有
义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条反义链的3′-末端(参见图22(C-D))。系链或接
头可以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0707] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条反义链的5′-末端与另一种siNA分子的反义链
的3′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的5′-末端与其相应的反义链退火，所述反
义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图22(G-H))。在一个
实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的3′-末端之间的键以这样的方
式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链
的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可
以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0708] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条反义链的5′-末端与另一种siNA分子的反义
链的5′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的3′-末端与其相应的反义链退火，所述
反义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图22(E))。在一个
实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的5′-末端之间的键以这样的方
式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链
的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可
以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0709] 在一个实施方案中，本发明的特征在于多功能siNA，其中所述多功能siNAs由2种分开的双链siNAs装配，其中siNA的一条反义链的3′-末端与另一种siNA分子的反义
链的3′-末端栓系，从而使得一条有义siNA链的5′-末端与其相应的反义链退火，所述
反义链在一个末端处彼此栓系，面对另一条有义链的3′-末端(参见图22(F))。在一个
实施方案中，第一条反义链的5′-末端和第二条反义链的5′-末端之间的键以这样的方
式设计，以便容易地切割(例如，生物可降解的接头)，从而使得多功能siNA的每条反义链
的5′末端具有适合于介导基于RNA干扰的靶RNA切割的游离5′-末端。系链或接头可
以是如本领域一般已知或如本文所描述的基于核苷酸的接头或非基于核苷酸的接头。

[0710] 在上述实施方案中的任何一个中，第一种靶核酸序列或第二种靶核酸序列可以独立地包含PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、
LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯一蛋白质3RNA、DNA或其部分。
在一个实施方案中，第一种靶核酸序列是PCSK9靶RNA、DNA或其部分，和第二种PCSK9RNA、
DNA或其部分。在一个实施方案中，第一种靶核酸序列是与PCSK9相关的疾病过程中涉及
的多核苷酸编码或非编码序列，例如PCSK9、H6PD、PTP-1B、apoAI/CIII/AIV、CETP、ApoB、SREBP-1a、SREBP-2、依赖于钙/钙调蛋白的蛋白激酶1D、脂肪酸结合蛋白5、前蛋白转化酶
枯草杆菌蛋白酶/kexin 9、LXR靶基因、金属蛋白酶结构域11、凋亡抑制6和/或F-框唯
一蛋白质3RNA或其部分。

[0711] 核酸分子的合成

[0712] 长度超过100个核苷酸的核酸合成使用自动化方法是困难的，且此种分子的治疗成本是价格高得惊人的。在本发明中，小核酸基序(“小”指核酸基序长度只不过100个核
苷酸，优选长度只不过80个核苷酸，和最优选长度只不过50个核苷酸；例如串联合成的个
别siNA寡核苷酸序列或siNA序列)优选用于外源递送。这些分子的简单结构增加了核酸
侵入蛋白质和/或RNA结构的靶区的能力。本发明的示例性分子是化学合成的，且其他类
似地可以是合成的。

[0713] 寡核苷酸(例如，某些经修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)使用本领域已知的规程合成，例如如下述参考文献中所述：Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等人，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等人，
1995，Nucleic AcidsRes.23，2677-2684，Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311。
所有这些参考文献都引入本文作为参考。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基
团，例如在5′-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端处的亚磷酰胺。在非限制性例
子中，小规模的合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，其使用0.2μmol规
模规程，对于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分钟的偶联步骤和对于2′-脱氧核苷酸或
2′-脱氧-2′-氟核苷酸使用45秒的偶联步骤。表V概述了在合成循环中使用的试剂
的量和接触时间。可替代地，以0.2μmol规模的合成可以在96孔板合成仪上进行，例如
由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器，其伴随对循环最低限度的修改。相对于聚合物
结合的5′-羟基，在2′-O-甲基残基的每个偶联循环中可以使用33倍过量的(0.11M的
60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亚磷酰胺和105倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝
15μmol)。相对于聚合物结合的5′-羟基，在脱氧残基的每个偶联循环中可以使用22倍过
量(0.11M的40μL＝4.4μmol)脱氧亚磷酰胺和70倍过量的S-乙基四唑(0.25M的40μL
＝10μmol)。通过三苯甲基级分的比色定量测定的，在394 AppliedBiosystems，Inc.合
成仪上的平均偶联得率一般为97.5-99％。关于394Applied Biosystems，Inc.合成仪的
其他寡核苷酸合成试剂包括下述：脱三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；
加帽用溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基
吡啶(ABI)来进行；且氧化溶液是溶于THF的16.9mM I2，49mM吡啶，9％水(PerSeptive
Biosystems，Inc.)。Burdick&Jackson SynthesisGrade乙腈直接从试剂瓶中使用。S-乙
基四唑溶液(溶于乙腈的0.25M)由从American International Chemical，Inc.获得的
固体制成。可替代地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫
醇-3-酮1，1-二氧化物，溶于乙腈的0.05M)。

[0714] 基于DNA的寡核苷酸的脱保护如下进行：将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于40％含水甲胺溶液(1mL)
中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持体中取出上清液。将支持体用1.0mL
EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤3次，涡旋且随后将上清液加入第一次的上清液中。使
包含寡核糖核苷酸的组合的上清液干燥成白色粉末。在一个实施方案中，本发明的核酸分
子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分析：US 6,995,259、US 6,686,463、US
6,673,918、US 6,649,751、US 6,989,442和USSN 10/190,359，所述所有专利整体引入本
文作为参考。

[0715] 对于包括本发明的某些siNA分子的RNA使用的合成方法遵循如下述参考文献中描述的程序：Usman等人，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433；和Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684 Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，且利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5′-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3′-末端处的亚磷酰胺。在非限制性例子中，小规模的合成
在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，其使用0.2μmol规模规程，对于烷基甲
硅烷基保护的核苷酸使用7.5分钟的偶联步骤和对于2′-O-甲基化核苷酸使用2.5分钟
的偶联步骤。表V概述了在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。可替代地，以0.2μmol
规模的合成可以在96孔板合成仪上进行，例如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器，
伴随对循环最低限度的修改。相对于聚合物结合的5′-羟基，在2′-O-甲基残基的每个
偶联循环中可以使用33倍过量的(0.11M的60μL＝6.6μmol)2′-O-甲基亚磷酰胺和
75倍过量的S-乙基四唑(0.25M的60μL＝15μmol)。相对于聚合物结合的5′-羟基，
在核糖(ribo)残基的每个偶联循环中可以使用66倍过量(0.11M的120μL＝13.2μmol)
烷基甲硅烷基(核糖)保护的亚磷酰胺和150倍过量的S-乙基四唑(0.25M的120μL＝
30μmol)。通过三苯甲基级分的比色定量测定的，在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪
上的平均偶联得率一般为97.5-99％。关于394 Applied Biosystems，Inc.合成仪的其他寡
核苷酸合成试剂包括下述：脱三苯甲基作用溶液是溶于二氯甲烷的3％TCA(ABI)；加帽用
溶于THF的16％N-甲基咪唑(ABI)和溶于THF的10％乙酸酐/10％2，6-二甲基吡啶(ABI)
来进行；氧化溶液是溶于THF的16.9mM I2，49mM吡啶，9％水(PerSeptiveBiosystems，
Inc.)。Burdick&Jackson Synthesis Grade乙腈直接从试剂瓶中使用。S-乙基四唑溶液
(溶于乙腈的0.25M)由从AmericanInternational Chemical，Inc.获得的固体制成。可替
代地，对于硫代磷酸酯键的引入，使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮1，1-二
氧化物，溶于乙腈的0.05M)。

[0716] RNA的脱保护使用双罐或单罐规程进行。对于双罐规程，将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于40％含水甲胺溶液
(1mL)中10分钟。冷却至-20℃后，从聚合物支持体中取出上清液。将支持体用1.0mL
EtOH∶MeCN∶H2O/3∶1∶1洗涤3次，涡旋且随后将上清液加入第一次的上清液中。使
包含寡核糖核苷酸的组合的上清液干燥成白色粉末。将碱基脱保护的寡核糖核苷酸重悬浮
于无水TEA/HF/NMP溶液(300μL的1.5mL N-甲基吡咯烷酮、750μL TEA和1mL TEA·3HF
溶液以提供1.4M HF浓度)中且加热至65℃。1.5小时后，寡聚体用1.5M NH4HCO3猝灭。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分
析：US 6,995,259、US 6,686,463、US 6,673,918、US 6,649,751、US 6,989,442和USSN
10/190,359，所述所有专利整体引入本文作为参考。

[0717] 可替代地，对于单罐规程，将聚合物结合的三苯甲基依赖寡核糖核苷酸转移至4mL玻璃螺旋盖小瓶，且于65℃悬浮于33％乙醇甲胺/DMSO：1/1(0.8mL)溶液中15分钟。将小
瓶置于室温，加入TEA·3HF(0.1mL)且使小瓶于65℃加热15分钟。使样品于-20℃冷却且
随后用1.5M NH4HCO3猝灭。

[0718] 对于三苯甲基依赖寡聚体的纯化，将猝灭的NH4HCO3溶液装载到包含C-18的药液筒上，所述药液筒用乙腈随后为50mM TEAA预先洗涤。用水将装载的药液筒洗涤后，RNA用
0.5％TFA脱三苯甲基13分钟。药液筒随后再次用水洗涤，用1M NaCl进行盐交换且再次
用水洗涤。寡核苷酸随后用30％乙腈进行洗脱。

[0719] 平均逐步偶联得率一般为＞98％(Wincott等人，1995 Nucleic AcidsRes.23，2677-2684)。本领域技术人员将认识到合成的规模可以调整至大于或小于上述例子，包括
但不限于96孔形式。

[0720] 可替代地，本发明的核酸分子可以分开合成且在合成后连接在一起，例如通过连接(Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际PCT公开号WO
93/23569；Shabarova等人，1991，NucleicAcids Research 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)，或通过在合成和/或脱保护后杂交。

[0721] 本发明的siNA分子可以经由如本文实施例1中描述的串联合成方法进行合成，其中2条siNA链被合成为由可切割接头分开的单个邻接寡核苷酸片段或链，其随后进行切割
以提供分开的siNA片段或链，所述siNA片段或链杂交且允许siNA双链体的纯化。接头可
以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。如本文所描述的siNA的串联合成可以容易地适应多
孔/多板合成平台，例如96孔或类似地更大的多孔平台。如本文所描述的siNA的串联合
成还可以容易地适应使用分批反应器、合成柱等的大规模合成平台。

[0722] siNA分子还可以由2种不同的核酸链或片段装配，其中一个片段包括有义区且第二个片段包括RNA分子的反义区。

[0723] 本发明的核酸分子可以通过用核酸酶抗性基团修饰进行广泛修饰以增强稳定性，所述核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H(关于
综述参见Usman和Cedergren，1992，TIBS17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.
Ser.31，163)。siNA构建体可以通过凝胶电泳使用一般方法进行纯化，或可以通过高压液相
层析(HPLC；参见Wincott等人，同上，其在此整体引入本文作为参考)进行纯化且重悬浮
于水中。

[0724] 在本发明的另一个方面，本发明的siNA分子由插入到DNA或RNA载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于
下述进行构建：腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。能够表达siNA分子的重组载体
可以如本文所描述的递送，且在靶细胞中持续。可替代地，可以使用提供siNA分子的瞬时
表达的病毒载体。

[0725] 本发明的核酸公子的活性最优化

[0726] 化学合成具有修饰(碱基、糖和/或磷酸)的核酸分子可以防止其经由血清核糖核酸酶的降解，这可以增加其效力(参见例如，Eckstein等人，国际公开号WO 92/07065；
Perrault等人，1990 Nature 344，565；Pieken 等人，1991，Science 253，314；Usman和
Cedergren，1992，Trends in Biochem.Sci.17，334；Usman等人，国际公开号WO 93/15187；
和Rossi等人，国际公开号WO 91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；Gold等人，美国
专利号6,300,074；和Burgin等人，同上；所述所有专利引入本文作为参考)。所有上述
参考文献描述了可以对本文描述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖部分进行的各种化学修
饰。需要增强其在细胞中的功效，和从核酸分子中去除碱基以缩短寡核苷酸合成时间且减
少化学需求的修饰。

[0727] 在本领域中存在描述糖、碱基和磷酸修饰的几个例子，所述修饰可以引入核酸分子内，显著增强其核酸酶稳定性和功效。例如，通过用核酸酶抗性基团修饰对寡核苷酸进行
修饰以增强稳定性和/或增强生物活性，所述核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙
基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H、核苷酸碱基修饰(关于综述参见Usman
和Cedergren，1992，TIBS.17，34；Usman等 人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；
Burgin等人，1996，Biochemistry，35，14090)。核酸分子的糖修饰在本领域中已得到广泛
描述(参见Eckstein等人，国际公开PCT号WO 92/07065；Perrault等人，Nature，1990，
344，565-568；Pieken等 人，Science，1991，253，314-317；Usman和Cedergren，Trendsin Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等人，国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat，美
国专利号5,334,711和Beigelman等人，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等
人，国际PCT公开号WO97/26270；Beigelman等人，美国专利号5,716,824；Usman等人，美
国专利号5,627,053；Woolf等人，国际PCT公开号WO 98/13526；Thompson等人，于1998
年4月20日提交的USSN 60/082,404；Karpeisky等人，1998，Tetrahedron Lett.，39，
1131；Earnshaw 和 Gait，1998，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)，48，39-55；Verma和Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等人，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010；所述所有参考文献在此整体引入本文作为参考)。此种出版物描述了
确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入核酸分子内而不调节催化的位置的一般方法和策略，
并且引入本文作为参考。考虑到此种教导，类似修饰可以如本文所描述的用于修饰本发明
的siNA核酸分子，只要siNA在细胞中促进RNAi的能力未被显著抑制。

[0728] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子如US 20050020521中所述的进行化学修饰，所述专利整体引入本文作为参考。

[0729] 尽管用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯键化学修饰寡核苷酸核苷酸间键改善稳定性，但过度修饰可以引起某些毒性或减少的活性。因此，当设计核酸分子
时，这些核苷酸间键的量应降到最低。这些键浓度中的减少应降低毒性，从而导致这些分子
增加的功效和更高的特异性。

[0730] 提供了具有维持或增强活性的化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子。此种核酸一般也比未修饰的核酸对核酸酶更有抵抗力。因此，体外和/或体内活性不应显著降低。在其
中调节是目的的情况下，外源递送的治疗核酸分子应最优地在细胞内是稳定的，直至靶RNA
的翻译已足够长久地调节，以减少不希望有的蛋白质的水平。取决于疾病状态，这个时间段
从数小时到数天不等。RNA和DNA化学合成中的改善(Wincott等人，1995，Nucleic Acids
Res.23，2677；Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19(引入本文作为参考))已通过引入核苷酸修饰以增强其核酸酶稳定性扩大修饰核酸分子的能力，如上文描
述的。

[0731] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)G-封条(clamp)核苷酸。G-封条核苷酸
是经修饰的胞嘧啶类似物，其中所述修饰给予与双链体内的互补鸟嘌呤的沃森-克里克
和Hoogsteen面氢键合的能力，参见例如Lin和Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc.，120，
8531-8532。当与互补寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内的单个G-封条类似物置换可以导致基
本上增强的螺旋热稳定性和错配区分。在本发明的核酸分子中包括此种核苷酸导致对核酸
靶、互补序列或模板链增强的亲和力和特异性。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子
包括一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)
LNA“锁定核酸”核苷酸，例如2′，4′-C亚甲基二环核苷酸(参见例如Wengel等人，国际
PCT公开号WO00/66604和WO 99/14226)。

[0732] 在另一个实施方案中，本发明的特征在于本发明的siNA分子的缀合物和/或复合物。此种缀合物和/或复合物可以用于促进siNA分子递送到生物系统例如细胞内。由本
发明提供的缀合物和复合物可以给予治疗活性，其通过将治疗化合物转移经过细胞膜，改
变药物代谢动力学和/或调节本发明的核酸分子的定位实现。本发明包含用于使分子递
送经过细胞膜的新缀合物和复合物的设计和合成，所述分子包括但不限于，小分子、脂质、
胆固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、负电荷聚合物和其他聚合物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺。一般而言，描述的转运蛋白被设计为单独或作为
多组分系统的部分使用，包括或不包括可降解接头。这些化合物预期改善本发明的核酸分
子在血清的存在或不存在下在源于不同组织的许多细胞类型内的递送和/或定位(参见
Sullenger和Cech，美国专利号5,854,038)。本文描述的分子的缀合物可以经由接头与生
物活性分子附着，所述接头是生物可降解的，例如生物可降解的核酸接头分子。

[0733] 如本文所使用的，术语“生物可降解的接头”指核酸或非核酸接头分子，其被设计为生物可降解的接头，以使一种分子与另一种分子例如生物活性分子与本发明的siNA分
子或本发明的siNA分子的有义与反义链连接。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳
定性可以就特定目的进行调节，例如递送给特定组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解
的接头分子的稳定性可以通过使用各种化学进行调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸
和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨
基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基、和其他2′-修饰的或碱基修饰的核苷
酸。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸分子，例如长
度为约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的键例如氨基磷酸
酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包含核酸主链、核酸糖、
或核酸碱基修饰。

[0734] 如本文所使用的，术语“生物可降解的”指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。

[0735] 如本文所使用的，术语“生物活性分子”指能够在系统中引发或修饰生物应答的化合物或分子。由本发明预期的单独或与其他分子组合的生物活性siNA分子的非限制性例
子包括治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸、2，5-A嵌合体、siNA、dsRNA、同种异型酶、适体、诱饵及其类似物。本发明的生物活性分子还包括能够调节其他生物活性分子的药物代谢动力学和/或药物动力学的分子，所述其他生物活性分子
例如脂质和聚合物，例如聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚醚。

[0736] 如本文所使用的，术语“磷脂”指包含至少一个磷基团的疏水性分子。例如，磷脂可以包含含磷基团和饱和或不饱和的烷基，任选由OH、COOH、氧、胺、或取代或未取代的芳基取代。

[0737] 外源递送的治疗核酸分子(例如siNA分子)最优地在细胞内是稳定的，直至RNA的逆转录已足够长久地调节，以减少RNA转录物的水平。核酸分子对核酸酶是有抵抗力的
以充当有效的细胞内治疗剂。本发明和本领域中描述的核酸分子的化学合成中的改善已通
过如上文描述的引入核苷酸修饰以增强其核酸酶稳定性扩大修饰核酸分子的能力。

[0738] 在另外一个实施方案中，提供了具有化学修饰的siNA分子，所述化学修饰维持或增强涉及RNAi的蛋白质的酶促活性。此种核酸一般也比未修饰的核酸对核酸酶更有抵抗
力。因此，体外和/或体内活性不应显著降低。

[0739] 本发明的基于核酸的分子的使用通过提供组合疗法的可能性(例如，靶向不同基因的多重siNA分子；与已知小分子调节剂偶联的核酸分子；或使用分子组合的间歇疗法，
所述分子组合包括不同基序和/或其他化学或生物分子)将导致更佳的治疗。用siNA分
子治疗受试者还可以包括不同类型的核酸分子的组合，例如酶促核酸分子(核酶)、同种异
型酶、反义、2，5-A寡腺苷酸、诱饵和适体。

[0740] 在另一个方面，本发明的siNA分子包含一个或多个5′和/或3′-帽结构，例如仅在有义siNA链、反义siNA链或2条siNA链上。

[0741] “帽结构”意指化学修饰，其已在寡核苷酸的任一末端处掺入(参见例如引入本文作为参考的Adamic等人，美国专利号5,998,203)。这些末端修饰保护核酸分子不受外切核
酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5′-末端处(5′-帽)
或3′-末端处(3′-帽)，或可以存在于2个末端上。在非限制性例子中，5′-帽包括但
不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型
赤藓糖基(erythrofuranosyl))核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇
核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏糖型-呋喃型戊
糖基核苷酸；无环3′，4′-断裂核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟戊基
核苷酸；3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部
分；3′-2′-反向脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨己
基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部
分。帽部分的非限制性例子显示于图10中。

[0742] 3′-帽的非限制性例子包括但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷
酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸
酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3′，
4′-断裂核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟戊基核苷酸；5′-5′-反向核苷酸部
分；5′-5′-反向脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；
5′-氨基；桥连或非桥连5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥
连甲基膦酸酯和5′-巯基部分(关于更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron
49，1925；引入本文作为参考)。

[0743] 术语“非核苷酸”意指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，包括糖和/或磷酸置换，且允许剩余碱基显示出其酶促活性。基团或化合物是脱
碱基的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，且因此在1′-位置处缺乏碱基。

[0744] “烷基”指饱和脂族烃，包括直链、支链和环状烷基。优选地，烷基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级烷基，更优选地1个-4个碳。烷基可以是取代或未
取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。该术语还包括链烯基，其是包含至少一个碳-碳双键的不饱和烃基团，包括直链、支链
和环状基团。优选地，链烯基具有1个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级链烯
基，更优选地1个-4个碳。链烯基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟
基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2、卤素、N(CH3)2、氨基或SH。术语“烷基”还包括炔基，其是包含至少一个碳-碳三键的不饱和烃基团，包括直链、支链和环状基团。优选地，炔基具有1
个-12个碳。更优选地，它是1个-7个碳的低级炔基，更优选地1个-4个碳。炔基可以是
取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、NO2或N(CH3)2、氨基或SH。

[0745] 此种烷基还可以包括芳基、烷芳基、碳环芳基、杂环芳基、酰胺和酯基团。“芳基”指芳族基团，其具有含共轭π电子系统的至少一个环且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以是任选取代的。芳基的优选取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、氰基、烷氧基、烷基、链烯基、炔基和氨基。“烷芳基”指与芳基(如上所述)共价连接的烷基(如上所
述)。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环
芳基是在芳族环中具有1个-3个杂原子作为环原子和剩余环原子是碳原子的基团。合适
的杂原子包括氧、硫和氮，且包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选取代。“酰胺”指-C(O)-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。“酯”指-C(O)-OR′，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。

[0746] 如本文所使用的，“核苷酸”如本领域公认的包括天然碱基(标准)和本领域众所周知的经修饰的碱基。此种碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸基。核苷酸可以是未修饰的或在糖、磷酸和/或碱基部分处修饰的(也可互换地
称为核苷酸类似物，经修饰的核苷酸，非天然核苷酸，非标准核苷酸等；参见例如，Usman和McSwiggen，同上；Eckstein等人，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等人，国际PCT公开
号WO 93/15187；Uhlman&Peyman，同上，所有在此引入本文作为参考)。如由Limbach等人，
1994，Nucleic Acids Res.22，2183概括的，存在本领域已知的经修饰的核酸碱基的几个例
子。可以引入核酸分子内的碱基修饰的一些非限制性例子包括，肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、
5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，胸腺嘧啶核苷)、5-卤尿苷(例如，
5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等人，
1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman&Peyman，同上)。“经修饰的碱基”在这个方面意指在1′位置处除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷酸碱基或其类似物。

[0747] 在一个实施方案中，本发明的特征在于具有磷酸主链修饰的经修饰的siNA分子，所述磷酸主链修饰包含一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗
啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺化(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、氨磺酰、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛和/或烷基甲硅烷基、取代。关于寡核苷酸主链
修饰的综述，参见Hunziker和Leumann，1995，NucleicAcid Analogues：Synthesis and
Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417，和Mesmaeker等人，1994，Novel Backbone Replacementsfor Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in
AntisenseResearch，ACS，24-39。

[0748] “脱碱基”意指在糖部分的1′位置处缺乏核碱基(nucleobase)或具有氢原子(H)或其他非核碱基化学基团代替核碱基的糖部分，参见例如Adamic等人，美国专利号
5,998,203。在一个实施方案中，本发明的脱碱基部分是核糖、脱氧核糖或双脱氧核糖。

[0749] “未修饰的核苷”意指与β-D-呋喃型核糖的1′碳连接的下述碱基之一：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

[0750] “经修饰的核苷”意指在未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸的化学结构中包含修饰的任何核苷酸碱基。经修饰的核苷酸的非限制性例子由式I-VII和/或本文描述的其他
修饰显示。

[0751] 与如关于本发明描述的2′-经修饰的核苷酸结合，“氨基”意指2′-NH2或2′-O-NH2，其可以是修饰的或未修饰的。此种经修饰的基团在例如Eckstein等人，美国专
利号5,672,695和Matulic-Adamic等人，美国专利号6,248,878中得到描述，所述2个专
利整体引入作为参考。

[0752] 可以对核酸siNA结构进行各种修饰以增强这些分子的效用。此种修饰将增强保存期限、体外半衰期、稳定性和易于将此种寡核苷酸引入靶位点，例如以增强细胞膜的渗
透，并且给予识别靶细胞且与靶细胞结合的能力。

[0753] 核酸分子的施用

[0754] 本发明的siNA分子可以适合单独或与其他疗法组合用于预防或治疗本文描述的或本领域其他方面已知与PCSK9基因或PCSK9途径基因表达相关的疾病、性状、病症和/或
状况，和/或涉及细胞或组织中的PCSK9多核苷酸或由其表达的蛋白质水平的任何其他性
状、疾病、病症或状况，和/或将对细胞或组织中的PCSK9多核苷酸或由其表达的蛋白质水
平反应的任何其他性状、疾病、病症或状况。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制
剂或组合物如本文描述的和本领域一般已知的施用于细胞、受试者或生物。

[0755] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)组合物可以包含对于给受试者施用的递送媒介物包括脂质体，载体和稀释剂及其盐，和/或可以存在
于药学上可接受的制剂中。用于递送核酸分子的方法在下述参考文献中得到描述：
Akhtar 等 人，1992，Trends CellBio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense
OligonucleotideTherapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等人，1999，Mol.Membr.Biol.，
16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；和Lee等人，
2000，ACS Symp.Ser.，752，184-192，所有这些参考文献引入本文作为参考。Beigelman等
人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核
酸分子的一般方法。这些规程可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本
领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被囊化在脂质体中，通过离子电
渗疗法，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊
精(参见例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，国
际PCR公开号WO 03/47518和WO 03/46185)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA小球
体(参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US 2002130430)、生物可降解纳
米胶囊(nanocapsule)、和生物粘附小球体，或通过蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际
PCT公开号WO 00/53722)。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子还可以用聚氮丙啶及
其衍生物配制或与聚氮丙啶及其衍生物复合，例如聚氮丙啶-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺
(PEI-PEG-GAL)或聚氮丙啶-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配
制，所述专利申请整体引入本文作为参考。

[0756] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子配制为下述专利中所述的组合物：美国临时专利申请号60/678,531以及于2005年7月29日提交的相
关美国临时专利申请号60/703,946，于2005年11月15日提交的美国临时专利申请号
60/737,024，和于2006年2月14日提交的USSN 11/353,630(Vargeese等人)，所有这些专
利都整体引入本文作为参考。此种siNA制剂一般称为“脂质核酸颗粒”(LNP)。在一个实
施方案中，本发明的siNA分子用本文表VI中描述的一种或多种LNP组合物进行配制(还
参见引入本文作为参考的USSN 11/353,630和11/586,102)。

[0757] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂或组合物如US 2006/0062758；US 2006/0014289；和US2004/0077540中所述施用于肺组织和细
胞。

[0758] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合，所述专利包括附图整体引入本文
作为参考。在另一个实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和siNA分子还与阳离子脂质或辅
助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合，所述专利包括附图整体引
入本文作为参考。

[0759] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子与如下述专利中描述的递送系统复合：美国专利申请公开号2003077829以及国际PCT公开号WO 00/03683
和WO 02/087541，所有专利包括附图整体引入本文作为参考。

[0760] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子与如下述专利中一般描述的递送系统复合：美国专利申请公开号US-20050287551；
US-20050164220；US-20050191627；US-20050118594；US-20050153919；US-20050085486；
和US-20030158133，所有专利包括附图整体引入本文作为参考。

[0761] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子经由去端肽胶原(atelocollagen)复合或缀合施用于骨骼组织(例如，骨、软骨、腱、韧带)或骨转移性肿瘤(参见例如Takeshita
等人，2005，PNAS，102，12177-12182)。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于作为与去端肽胶原复合的组合物的一种或多种dsiNA分子。在另一个实施方案中，本发明的特征
在于经由如本文所描述的或本领域其他方面已知的接头与去端肽胶原缀合的一种或多种
siNA分子。

[0762] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂(例如，本发明的双链核酸分子的LNP制剂)经由肺递送施用，例如通过经由吸入设备或喷雾器施
用的气溶胶或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子快速的局部摄取进入相关肺组织
内。包含微粉化核酸组合物的可吸收干燥颗粒的固体微粒组合物可以通过下述制备：将干
燥或冻干的核酸组合物研磨，且随后使微粉化组合物通过例如400目筛以破碎或分出大附
聚物。包含本发明的核酸组合物的固体微粒组合物可以任选包含分散剂，所述分散剂用于
促进气溶胶以及其他治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任
何合适的比率如1∶1重量比掺合。

[0763] 包含本发明的核酸组合物的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如用喷雾器(参见例如US 4,501,729)。喷雾器是商购可得的设备，其借助于使压缩气体一
般是空气或氧通过狭窄的文丘里管孔加速或借助于超声搅拌，将活性成分的溶液或悬浮液
转变成治疗气溶胶雾。用于在喷雾器中使用的合适制剂包含以最高达40％w/w优选小于
20％w/w制剂的量溶于液体载体的活性成分。载体一般是水或稀释含水醇溶液，优选通过
添加例如氯化钠或其他合适的盐制成与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂，如果制剂未
制成无菌的话，例如羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂，调味剂，挥发性油，缓冲剂和乳化剂及其他制剂表面活性剂。包含活性组合物和表面活性剂的固体颗粒的气溶胶可以同样地用任何固
体微粒气溶胶发生器来生产。用于给受试者施用固体微粒疗法的气溶胶发生器产生可吸收
的颗粒，如上文说明的，且以适合于人施用的速率产生包含治疗组合物的预定计量剂量的
气溶胶体积。

[0764] 在一个实施方案中，本发明的固体微粒气溶胶发生器是吹入器。用于通过吹入法施用的合适制剂包括精细捣碎的粉末，其可以借助于吹入器进行递送。在吹入器中，粉末例
如有效执行本文描述的治疗的其计量剂量包含在一般由明胶或塑料制成的胶囊或药液筒
中，其穿入或原位打开并且经由在吸入后通过设备吸取的空气或借助于手工操作的泵递送
粉末。吹入器中使用的粉末单独由活性成分组成，或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂例
如乳糖和任选的表面活性剂的粉末掺合物组成。活性成分一般构成0.1-100w/w制剂。第
二种类型的举例说明性气溶胶发生器包含计量剂量吸入器。计量剂量吸入器是增压气溶胶
分配器，一般包含活性成分在液化推进剂中的悬浮液或溶液制剂。在使用期间，这些设备
通过适合于递送计量容积的阀排出制剂，以产生包含活性成分的细颗粒喷雾。合适的推进
剂包括某些含氯氟烃，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制剂可
以另外包含一种或多种助溶剂例如乙醇，乳化剂和其他制剂表面活性剂例如油酸或失水山
梨醇三油酸酯，抗氧化剂和合适的调味剂。用于肺递送的其他方法在例如美国专利申请号
20040037780以及美国专利号6,592,904；6,582,728；6,565,885中得到描述，所有专利引
入本文作为参考。

[0765] 在一个实施方案中，本文提供的用于在肺递送中使用的核酸或多核苷酸(例如siNA)和LNP组合物和制剂进一步包含一种或多种表面活性剂。用于增强本发明的组合
物摄取的合适表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面
活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二饱和
磷脂酰胆碱(除二棕榈酰外)，二棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌
醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸；磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱，棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱，脱氢表雄酮，多萜醇，sulfatidic acid，甘油-3-磷酸，二羟丙酮
磷酸，甘油，甘油-3-磷酸胆碱，二羟丙酮，棕榈酸盐，胞苷二磷酸(CDP)二酰甘油，CDP胆
碱，胆碱，磷酸胆碱；以及天然和人造片层体，其是关于表面活性剂组分的天然载体媒介物，ω-3脂肪酸，聚烯酸(polyenic acid)，多烯酸，卵磷脂，棕榈酸，氧化乙烯或丙烯的非离子嵌段共聚物，聚氧丙烯、单体和聚合的，聚氧乙烯、单体和聚合的，具有葡聚糖和/或烷酰
基侧链的聚乙烯胺，Brij 35，Triton X-100和合成表面活性剂ALEC，Exosurf，Survan和
Atovaquone，除了别的以外。这些表面活性剂可以在制剂中作为单个表面活性剂或多组分
表面活性剂的部分使用，或作为与本文的药物组合物的核酸组分的5′和/或3′末端共价
结合的附加物使用。

[0766] 本发明的组合物可以作为包括可吸收大小的颗粒的制剂施用到呼吸系统内，例如大小足够小的颗粒以在吸入后经过鼻、口和喉以及通过肺的支气管和肺泡。一般而言，可吸
收颗粒大小为约0.5-10微米。包括在气溶胶中的不可吸收大小的颗粒倾向于沉积在喉中
且被吞咽，并且气溶胶中不可吸收颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，10-500um的粒度是
优选的，以确保保留在鼻腔中。

[0767] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝(参见例如Wen等人，2004，World J Gastroenterol.，10，
244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，Gene Ther.，10，180-7；
Hong等人，2003，J Pharm Pharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，
1611-7；和Matsuno等人，2003，Gene Ther.，10，1559-66)。

[0768] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用离子透入法施用于例如特定器官或区室(例如，眼、眼的后面、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等)。
离子透入法的非限制性例子通过神经元递送核酸。作为给神经细胞局部施用核酸的例子，
Sommer等人，1998，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，8，75，描述了其中针对c-fos的15聚
体硫代磷酸酯反义核酸分子经由显微注射到脑内施用于大鼠的研究。用四甲基罗丹明-异
硫氰酸酯(TRITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义分子在注射后30分钟经由神经元
专有地吸收。在这些细胞中观察到弥散细胞质染色和核染色。作为给神经细胞全身施用核
酸的例子，Epa等人，2000，Antisense Nuc.Acid DrugDev.，10，469，描述了其中β-环糊
精-金刚烷-寡核苷酸缀合物用于靶向神经元分化的PC 12细胞中的p75神经营养蛋白受
体的体内小鼠研究。2周IP施用过程后，在背根神经节(DRG)细胞中观察到p75神经营养
蛋白受体反义的显著摄取。此外，在DRG神经元中观察到p75明显和一致的下调。使核酸
靶向神经元的另外方法在下述参考文献中得到描述：Broaddus等人，1998，J.Neurosurg.，
88(4)，734；Karle等人，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannai等人，1998，Brain Research，784(1，2)，304；Rajakumar等人，1997，Synapse，26(3)，199；Wu-pong等人，1999，BioPharm，12(1)，32；Bannai等 人，1998，Brain Res.Protoc.，3(1)，83；Simantov等 人，
1996，Neuroscience，74(1)，39。本发明的核酸分子因此顺应经由细胞递送和摄取，所述
细胞表达重复扩充的等位基因变体用于调节RE基因表达。靶向RE的本发明核酸分子的
递送通过多种不同策略提供。可以使用的对于CNS递送的传统方法包括但不限于，鞘内和
脑室内施用、导管和泵的植入、在损伤或损害位点处直接注射或灌注、注射到脑动脉系统
内、或通过血脑屏障的化学或渗透开放。其他方法可以包括各种转运和载体系统的使用，
例如通过使用缀合物和生物可降解聚合物。此外，基因治疗方法例如如Kaplitt等人，US
6,180,613和Davidson，WO 04/013280中描述的，可以用于在CNS中表达核酸分子。

[0769] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子施用于中枢神经系统(CNS)和/或外周神经系统(PNS)。实验已证实核酸经由神经元的有效体内摄取。作为给神经细胞局部施用
核酸的例子，Sommer等人，1998，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，8，75，描述了其中针对c-fos的15聚体硫代磷酸酯反义核酸分子经由显微注射到脑内施用于大鼠的研究。用四
甲基罗丹明-异硫氰酸酯(TRITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义分子在注射后30
分钟经由神经元专有地吸收。在这些细胞中观察到弥散细胞质染色和核染色。作为给神经
细胞全身施用核酸的例子，Epa等人，2000，Antisense Nuc.Acid Drug Dev.，10，469，描述了其中β-环糊精-金刚烷-寡核苷酸缀合物用于靶向神经元分化的PC12细胞中的p75
神经营养蛋白受体的体内小鼠研究。2周IP施用过程后，在背根神经节(DRG)细胞中观察
到p75神经营养蛋白受体反义的显著摄取。此外，在DRG神经元中观察到p75明显和一致
的下调。使核酸靶向神经元的另外方法在下述参考文献中得到描述：Broaddus等人，1998，
J.Neurosurg.，88(4)，734；Karle 等 人，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannai等人，1998，Brain Research，784(1，2)，304；Rajakumar等人，1997，Synapse，26(3)，199；
Wu-pong等人，1999，BioPharm，12(1)，32；Bannai等人，1998，Brain Res.Protoc.，3(1)，
83；Simantov等人，1996，Neuroscience，74(1)，39。本发明的核酸分子因此顺应经由CNS
和/或PNS中的细胞递送和摄取。

[0770] 本发明的核酸分子给CNS的递送通过多种不同策略提供。可以使用的对于CNS递送的传统方法包括但不限于，鞘内和脑室内施用、导管和泵的植入、在损伤或损害位点处直
接注射或灌注、注射到脑动脉系统内、或通过血脑屏障的化学或渗透开放。其他方法可以包
括各种转运和载体系统的使用，例如通过使用缀合物和生物可降解聚合物。此外，基因治疗
方法例如如Kaplitt等人，US 6,180,613和Davidson，WO 04/013280中描述的，可以用于
在CNS中表达核酸分子。

[0771] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)化合物和组合物约每1-50周(例如，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身或局部地进行施用，单独或与本文的其他化合物和/或疗法组合。在一个
实施方案中，本发明的siNA化合物和组合物约每1-50周(例如，约每1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50周)全身地(例如，经由静脉内、皮下、肌内、输注、泵、植入等)进行施用，单独或与本文描述的和/或本领域其他方面已知
的其他化合物和/或疗法组合。

[0772] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用离子透入法施用于例如特定器官或区室(例如，肺、鼻咽、皮肤、滤泡、眼、眼的后面、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等)。离子透入法递送的非限制性例子在例如WO 03/043689和WO03/030989
中得到描述，所述专利整体引入本文作为参考。

[0773] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝(参见例如Wen等人，2004，WorldJ Gastroenterol.，10，
244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，Gene Ther.，10，180-7；
Hong等人，2003，J Pharm Pharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，
1611-7；和Matsuno等人，2003，Gene Ther.，10，1559-66)。

[0774] 在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的核酸分子递送给造血细胞，包括单核细胞和淋巴细胞的方法的用途。这些方法由Hartmann等人，1998，J.Phamacol.
Exp.Ther.，285(2)，920-928；Kronenwett 等 人，1998，Blood，91(3)，852-862；Filion 和Phillips，1997，Biochim.Biophys.Acta.，1329(2)，345-356；Ma和Wei，1996，Leuk.Res.，
20(11/12)，925-930；和Bongartz等人，1994，Nucleic AcidsResearch，22(22)，4681-8详细描述。如上所述的此种方法包括使用游离寡核苷酸、阳离子脂质制剂、包括pH敏感性脂
质体和免疫脂质体的脂质体制剂、以及包括与融合肽缀合的寡核苷酸的生物缀合物，用于
由寡核苷酸转染造血细胞。

[0775] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的直接或地方性地(例如，局部地)施用于真皮或滤泡(参见例
如Brand，2001，Curr.Opin.Mol.Ther.，3，244-8；Regnier等人，1998，J.Drug Target，5，
275-89；Kanikkannan，2002，BioDrugs，16，339-47；Wraight等人，2001，Pharmacol.Ther.，
90，89-104；和Preat和Dujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68)。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物直接或地方性地施用，其中使用包含醇(例如，
乙醇或异丙醇)、水且任选包括另外试剂例如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的含水醇凝胶
制剂。

[0776] 在一个实施方案中，本发明的递送系统包括例如，含水和非水凝胶、乳膏、多重乳剂、微乳、脂质体、软膏、水性和非水溶液、洗剂、气溶胶、烃基质和粉末，并且可以包含赋形剂例如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是脂质体或经
皮增强剂。可以在本发明中使用的脂质体例子包括下述：(1)CellFectin，阳离子脂质N，
NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基-精胺和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)
的1∶1.5(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE的
2∶1(M/M)脂质体制剂(Glen Research)；(3)DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧)-N，N，N-三甲
基-甲基硫酸铵)(BoehringerManheim)；和(4)Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA和中
性脂质DOPE的3∶1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)。

[0777] 在一个实施方案中，本发明的递送系统包括贴剂、片剂、栓剂、阴道栓、凝胶和乳膏，并且可以包含赋形剂例如增溶剂和增强剂(例如，丙二醇、胆汁盐和氨基酸)、和其他媒
介物(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物、以及亲水聚合物例如羟丙基甲基纤维素和透明
质酸)。

[0778] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用离子透入法施用于例如真皮或其他相关组织。离子透入法递送的非限制性例子在例如WO 03/043689和
WO 03/030989中得到描述，所述专利整体引入本文作为参考。

[0779] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子用聚氮丙啶(例如，线性或分支PEI)和/或聚氮丙啶衍生物配制，或与聚氮丙啶(例如，线性或分支PEI)
和/或聚氮丙啶衍生物复合，所述聚氮丙啶衍生物包括例如接枝PEIs例如半乳糖PEI、胆
固醇PEI、抗体衍生的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(参见例如Ogris等人，
2001，AAPA PharmSci，3，1-11；Furgeson 等 人，2003，BioconjugateChem.，14，840-847；
Kunath 等 人，2002，Phramaceutical Research，19，810-817；Choi 等 人，2001，Bull.Korean Chem.Soc.，22，46-52；Bettinger等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，558-561；
Peterson等人，2002，Bioconjugate Chem.，13，845-854；Erbacher等人，1999，Journal of Gene Medicine Preprint，1，1-18；Godbey 等 人，1999.，PNASUSA，96，5177-5181；Godbey等人，1999，Journal of Controlled Release，60，149-160；Diebold等人，1999，Journal of Biological Chemistry，274，19087-19094；Thomas 和 Klibanov，2002，PNAS USA，99，
14640-14645；和Sagara，US 6,586,524，引入本文作为参考。

[0780] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子包含生物缀合物，例如如Vargeese等人，于2003年4月30日提交的USSN 10/427,160；US 6,528,631；US
6,335,434；US 6,235,886；US6,153,737；US 5,214,136；US 5,138,045中描述的核酸缀合
物，所述所有专利引入本文作为参考。

[0781] 因此，本发明的特征在于在可接受的载体例如稳定剂、缓冲剂等中包含本发明的一种或多种核酸的药物组合物。本发明的多核苷酸可以通过任何标准方法施用(例如，
RNA、DNA或蛋白质)且引入受试者中，包括或不包括稳定剂、缓冲剂等，以形成药物组合物。
当需要使用脂质体递送机制时，可以遵从用于脂质体配制的标准规程。本发明的组合物还
可以如本领域已知的配制且用作乳膏、凝胶、喷雾剂、油及其他合适的组合物，用于地方性、皮肤、或经皮施用。

[0782] 本发明还包括所述化合物的药学上可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。

[0783] 药理学组合物、制剂或盐指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂，所述受试者包括例如人。合适的形式部分依赖使用或进入途径，
例如经口、经皮或通过注射。此种形式不应阻止组合物或制剂达到靶细胞(即，需要给其递
送带负电荷核酸的细胞)。例如，注射到血流内的药理学组合物应当是可溶的。其他因素是
本领域已知的，且包括考虑，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。

[0784] 在一个实施方案中，本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子通过全身施用在药学上可接受的组合物、制剂或盐中施用于受试者。“全身施用”意指药物在血流中的体内
全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。导致全身性吸收的施用途径包括但不限于：静
脉内、皮下、门静脉、腹膜内、吸入、喷雾法、经口、肺内和肌内。这些施用途径中的每一种使本发明的siNA分子暴露于可到达的患病组织(例如肺)。药物进入循环内的速率已显示是
分子量或大小的函数。包含本发明的化合物的脂质体或其他药物载体的使用可以潜在地使
药物局部化于例如某些组织类型，例如网状内皮系统(RES)的组织。可以促进药物与细胞
例如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制剂也是有用的。这种方法通过利用异常细胞
的巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别的特异性可以提供药物对靶细胞的增强递送。

[0785] “药学上可接受的制剂”、“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的盐”意指允许本发明的核酸分子在最适合于其所需活性的物理位置中有效分布的组合物、制剂或盐。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性例子包括：P-糖蛋白抑制剂(例如
Pluronic P85)；生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物
小球体(Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58)；和装载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性例子包
括在下述参考文献中描述的材料：Boado等人，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNASUSA.，92，5592-5596；
Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。药学上可接受的盐的非限制性例子包括但不限于，(a)由阳离子例如钠、钾、铵、镁、钙、聚胺例如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)由无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)由有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸马来酸、延胡索酸、cluconic acid、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸(polygalacuronic acid)等形成的盐；和(d)由元素阴离子例如氯、溴和
碘形成的盐。

[0786] 本发明的特征还在于包含表面修饰的脂质体的组合物的用途，所述表面修饰的脂质体包含聚乙二醇脂质(PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体)和本发明的核酸或
多核苷酸(例如siNA)分子。这些制剂提供用于增加药物(例如，siNA)在靶组织中积累
的方法。这类药物载体经得住经由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和消除，从
而使胶囊化的药物更长的血液循环时间和增强的组织暴露成为可能(Lasic等人，Chem.
Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata 等 人，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。 此种脂质体已显示在肿瘤中选择性积累，推测是通过在新血管形成的靶组织中的外渗和捕
获(Lasic等人，Science 1995，267，1275-1276；Oku等人，1995，Biochim.Biophys.Acta，
1238，86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药物代谢动力学和药物动力学，特别是与
已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比较(Liu等人，J.Biol.Chem.1995，42，
24864-24870；Choi等人，国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人，国际PCT公开号WO
96/10390；Holland等人，国际PCT公开号WO 96/10392)。基于其避免在代谢攻击性MPS组
织例如肝和脾中积累的能力，长循环脂质体也可能保护药物不受核酸酶降解至与阳离子脂
质体相比较更大的程度。

[0787] 在一个实施方案中，本发明的脂质体制剂包含用下述专利中描述的化合物和组合物配制，或与下述专利中描述的化合物和组合物复合的本发明的双链核酸或多核苷酸(例
如siNA)分子：US 6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；
6,815,432；US 6,586,001；6,120,798；US 6,977,223；US 6,998,115；5,981,501；
5,976,567；5,705,385；US 2006/0019912；US 2006/0019258；US2006/0008909；
US 2005/0255153；US 2005/0079212；US 2005/0008689；US 2003/0077829，US
2005/0064595，US 2005/0175682，US2005/0118253；US 2004/0071654；US 2005/0244504；
US 2005/0265961和US 2003/0077829，所述所有专利都整体引入本文作为参考。

[0788] 本发明还包括制备用于贮存或施用的组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中药学或治疗有效量的所需化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药
学领域中众所周知的，并且例如在引入本文作为参考的Remington′s Pharmaceutical
Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)中得到描述。例如可以提供防腐
剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

[0789] 药学有效剂量是预防、抑制发生、或治疗(使症状减轻至某一程度，优选所有症状)疾病状态所需的那种剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、使用的组合物、施用途径、
待治疗的哺乳动物类型、正在考虑的具体哺乳动物的身体特征、并存的药疗法、以及医学
领域技术人员将认识到的其他因素。一般地，取决于带负电荷聚合物的效力，施用0.1mg/
kg-100mg/kg体重/天的活性成分量。

[0790] 治疗有效量指提供待治疗的受试者中的所需药物水平所需的组合物中存在的量，以产生预期的生理学应答。“治疗有效量”是在受体动物或患者中有效产生有利结果的那些
量。

[0791] 本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子及其制剂可以在包含常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和/或媒介物的剂量单位制剂中经口、地方性、肠胃外、经由吸入
或喷雾、或经直肠施用。如本文所使用的，术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内、或鞘内注射或输注技术等。此外，提供了包含本发明的核酸分子和药学上可接受的载体的药物制剂。本发明的一种或多种核酸分子可以与一种或多种无毒的药学上可接受
的载体和/或稀释剂和/或佐剂，以及需要时其他活性成分结合存在。包含本发明的核酸
分子的药物组合物可以是适合于经口使用的形式，例如作为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性
悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。

[0792] 预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且此种组合物可以包含一种或多种此种甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂
以提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性
成分，所述赋形剂适合于制备片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂；例如碳酸钙、碳酸
钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的，或它们可以通过已知技术进行包被。在某些情况下此种包被可以通过已知技术进行制备，以延迟在胃肠
道中的崩解和吸收且因此提供经过较长时间段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料
例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

[0793] 用于经口使用的制剂也可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或呈现为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液
体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。

[0794] 水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此种赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与
脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物例如十七
乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇
的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇
酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种
防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调
味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。

[0795] 油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中来制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、
硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过
添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。

[0796] 适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散的粉末和颗粒提供与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散或湿润剂或悬浮剂由上文已提及
的那些例示。还可以存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。

[0797] 本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存
在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇酐
单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还
可以包含甜味剂和调味剂。

[0798] 糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。此种制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射
的水性或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，其中使用上文已提
及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接
受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为溶于1，3-丁二醇的溶液。在可
以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油
照惯例用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油包括合成的甘油
单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制备中找到用途。

[0799] 本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下是固体
的但在直肠温度下是液体的，并且因此在直肠中将熔化以释放药物。此种材料包括可可脂
和聚乙二醇。

[0800] 本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂可以溶
解于媒介物中。

[0801] 约0.1mg-约140mg/千克体重/天的级别的剂量水平在上述状况的治疗中是有用的(约0.5mg-约7g/受试者/天)。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量
依赖于治疗的宿主和具体施用方式而变。剂量单位形式一般包含约1mg-约500mg活性成
分。

[0802] 应当理解对于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、和排泄率、药物组合和经历治疗的特定疾病的严重度。

[0803] 对于给非人动物的施用，组合物也可以加入动物饲料或饮用水中。配制动物饲料和饮用水组合物可以是方便的，以便动物连同其饮食接受治疗合适量的组合物。将组合物
呈现为预混合料用于加入饲料或饮用水中也可以是方便的。

[0804] 本发明的核酸分子也可以与其他治疗化合物组合施用于受试者以增加总体疗效。使用多重化合物以治疗适应症可以增加有利效应，同时减少副作用的存在。

[0805] 在一个实施方案中，本发明包含适合于给特定细胞类型施用本发明的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的组合物。例如，脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu和Wu，1987，
J.Biol.Chem.262，4429-4432)是肝细胞特有的并且结合分支半乳糖-末端糖蛋白，例如脱
唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)。在另一个例子中，叶酸受体在许多癌症细胞中超表达。此
种糖蛋白、合成复合糖、或叶酸与受体的结合以强烈依赖寡糖链的分支程度的亲和力发生，
例如，三触角(triatennary)结构以比二触角(biatenarry)或单触角(monoatennary)链
更大的亲和力结合(Baenziger和Fiete，1980，Cell，22，611-620；Connolly等人，1982，
J.Biol.Chem.，257，939-945)。Lee和Lee，1987，Glycoconjugate J.，4，317-328，通过使用N-乙酰-D-半乳糖胺作为碳水化合物部分获得这种高特异性，与半乳糖相比较所述N-乙
酰-D-半乳糖胺具有对受体更高的亲和力。这种“成簇效应”也已对于甘露糖-末端糖蛋白
或复合糖的结合和摄取进行描述(Ponpipom等人，1981，J.Med.Chem.，24，1388-1395)。使
用基于半乳糖、半乳糖胺或叶酸的缀合物转运外源化合物跨越细胞膜可以提供例如治疗肝
病、肝癌或其他癌症的靶向递送方法。生物缀合物的使用还提供对于治疗所需的治疗化合
物的所需剂量中的减少。此外，治疗生物利用率、药物动力学和药物代谢动力学参数可以通
过使用本发明的核酸生物缀合物进行调节。此种生物缀合物的非限制性例子在2001年8月
13日提交的Vargeese等人，USSN10/201,394；和2002年3月6日提交的Matulic-Adamic
等人，USSN60/362,016中得到描述。

[0806] 可替代地，本发明的某些核酸或多核苷酸(例如siNA)分子可以在细胞内从真核启动子表达(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，
1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
88，10591-5；Kashani-Sabet 等 人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等 人，
1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等人，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang等人，
1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，
4581-9；Sarver等人，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，NucleicAcids Res.，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45。本领域技术人员认识到任何核酸都可以在真核细胞中从合适的DNA/RNA载体表达。此种核酸的活性可以通过其经由酶促核
酸从初级转录物中释放得到增大(Draper等人，PCT WO 93/23569,和Sullivan等人，PCT
WO 94/02595；Ohkawa等人，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.，27，15-6；Taira等人，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等人，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；
Chowrira等人，1994，J.Biol.Chem.，269，25856。

[0807] 在本发明的另一个方面，本发明的RNA分子可以由插入到DNA或RNA载体内的转录单位(参见例如Couture等人，1996，TIG.，12，510)表达。重组载体可以是DNA质粒或病
毒载体。表达核酸或多核苷酸(例如siNA)的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：
腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。在另一个实施方案中，基于pol III的构建体
用于表达本发明的核酸分子(参见例如Thompson，美国专利号5,902,880和6,146,886)。
能够表达siNA分子的重组载体可以如本文所描述的递送，且在靶细胞中持续。可替代地，
可以使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。必要时此种载体可以重复施用。一旦被表
达，siNA分子就与靶mRNA相互作用且产生RNAi应答。siNA分子表达载体的递送可以是
全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于从受试者外植的靶细胞随后重新引入
受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式(关于综述参见Couture等人，
1996，TIG.，12，510)。

[0808] 在一个方面，本发明的特征在于包含编码本发明的至少一种核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的核酸序列的表达载体。表达载体可以编码siNA双链体的一条或两条链，或
自我杂交成siNA双链体的单条自互补链。编码本发明的siNA分子的核酸序列可以以允
许siNA分子表达的方式可操作地连接(参见例如Paul等人，2002，NatureBiotechnology，
19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，预先在线公开doi：
10.1038/nm725)。

[0809] 在另一个方面，本发明的特征在于包含下述的表达载体：a)转录起始区(例如，真核polI、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核polI、II或III终止区)；和c)编
码本发明的至少一种siNA分子的核酸序列，其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递
送的方式与所述起始区和所述终止区可操作地连接。载体可以任选包括关于在编码本发明
siNA的序列的5′侧或3′-侧上可操作地连接的蛋白质的可读框(ORF)；和/或内含子
(间插序列)。

[0810] siNA分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶I(polI)、RNA聚合酶II(polII)、或RNA聚合酶III(polIII)的启动子驱动。来自polII或pol III启动子的转
录在所有细胞中以高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近
存在的基因调节序列(增强子、沉默基因等)的性质。原核RNA聚合酶启动子也可以使用，
只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.
Sci.US A，87，6743-7；Gao 和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72；Lieber 等人，1993，Methods Enzymol.，217，47-66；Zhou等人，1990，Mol.Cell.Biol.，10，4529-37)。
几个研究者已证实由此种启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用(例如，
Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Ojwang等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，89，10802-6；Chen等 人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Yu 等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，90，6340-4；L′Huillier等人，1992，EMBO J.，11，
4411-8；Lisziewicz等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，8000-4；Thompson等人，
1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger和Cech，1993，Science，262，1566)。更具体而言，转录单位例如衍生自编码U6小核(snRNA)、转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的
基因的那些在细胞中产生高浓度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的(Thompson等
人，同上；Couture和Stinchcomb，1996，同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，
22，2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther.，4，45；
Beigelman等人，国际PCT公开号WO 96/18736。上述siNA转录单位可以掺入多种载体内用
于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如，腺病毒或腺伴
随病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录病毒或甲病毒载体)(关于综述参见Couture
和Stinchcomb，1996，同上)。

[0811] 在另一个方面，本发明的特征在于以允许那种siNA分子表达的方式包含编码本发明的至少一种核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的核酸序列的表达载体。在一个实施方
案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；和c)编码siNA分子的至少一条链的
核酸序列，其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式与起始区和终止区可操作
地连接。

[0812] 在另一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)可读框；和d)编码核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列与可
读框的3′-末端可操作地连接，且其中所述序列以允许siNA分子表达和/或递送的方式
与起始区、可读框和终止区可操作地连接。在另外一个实施方案中，表达载体包含：a)转录
起始区；b)转录终止区；c)内含子；和d)编码至少一种siNA分子的核酸序列，其中所述序
列以允许核酸分子表达和/或递送的方式与起始区、内含子和终止区可操作地连接。

[0813] 在另一个实施方案中，表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)可读框；和e)编码核酸或多核苷酸(例如siNA)分子的至少一条链的核酸序列，其中所
述序列与可读框的3′-末端可操作地连接，且其中所述序列以允许siNA分子表达和/或
递送的方式与起始区、内含子、可读框和终止区可操作地连接。

[0814] 本发明还覆盖用于将短发夹RNA递送到靶细胞的方法。所述方法包括向动物施用有效量的制剂的步骤，所述制剂包括合适的递送媒介物和药学上可接受的载体，所述媒介
物在其内部包括编码根据本发明的shRNA的质粒DNA。

[0815] 因而，在一方面，本发明提供了组合物，其包含：(i)RNAi诱导实体，其中所述RNAi诱导实体靶向mRNA靶转录物；和(ii)选自下述的递送试剂：阳离子聚合物、经修饰的阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、适合于引入肺内的表面活性剂、脂质体、非阳离子聚合物、经修饰的非阳离子聚合物、布比卡因和氯喹。在本发明的某些实施方案中，递送试剂掺合靶向或
递送增强部分以增强递送或递送到目的细胞的特异性。在本发明的各种实施方案中，RNAi
诱导实体可以是siRNA、sHRNA或RNAi诱导载体。

[0816] PCSK9生物学和生物化学

[0817] 前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-kexin 9型(在下文中称为PCSK9)也称为神经凋亡调节转化酶1(“NARC-1”)，是鉴定为分泌型枯草杆菌酶(subtilase)家族的第9个成
员的蛋白酶K样枯草杆菌酶；参见Seidah等人，2003PNAS 100：928-933。PCSK9在能够增
殖和分化的细胞中表达，例如肝细胞、肾间充质细胞、回肠和结肠上皮以及胚胎脑端脑神经
元；Seidah等人，同上。

[0818] PCSK9基因(或NARC-1基因)编码NARC-1蛋白质或多肽。它是丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶家族近期发现的成员，并且受细胞的胆固醇状态调节。关于长～22-kb，
具有编码692氨基酸蛋白质的12个外显子的人PCSK9的蛋白质序列，可以在例如保藏
号NP_777596.2处找到。PCSK9在下述几个专利公开中公开和/或要求保护，包括但不
限于：PCT公开号WO 01/31007、WO 01/57081、WO 02/14358、WO01/98468、WO 02/102993、
WO 02/102994、WO 02/46383、WO 02/90526、WO 01/77137和WO 01/34768；美国公开号
US 2004/0009553和US2003/0119038，以及欧洲公开号EP 1440981、EP 1067182和EP
1471152。NARC-1基因的序列已在专利申请WO 01/57081和WO 02/14358中进行描述，并且
在Seidah等人(2003)中部分表征。

[0819] 它的NARC-1首字母简略词反映下述事实：在神经元原代培养物中诱导凋亡时，它的mRNA上调，和它类似于称为前蛋白转化酶的其他8个枯草杆菌酶样蛋白酶(参见例如国
际PCT公开号WO 01/57081)。PCs牵涉于通过分泌途径运输的激素、受体、表面糖蛋白等的
前体的加工(和激活)。它们中的7种PC1/3、PC2、弗林蛋白酶(furin)、PC4、PACE4、PC5/6
和PC7/LPC识别基本位点且属于kexin亚家族。第8个成员SKI-1/S1P分类为枯草杆菌酶
的pyrolysin亚家族。它已牵涉于内质网(ER)锚定的转录因子例如固醇调节元件(SRE)结
合蛋白(SREBPs)的加工，且因此在胆固醇稳态中起关键作用。当细胞胆固醇低时，SREBPs
从ER再定位到高尔基体，在其中SKI-1/S1P切割其腔环。在其第一个跨膜结构域中经由金
属蛋白酶S2P的第二次切割释放胞质N-末端区域，其前往核且激活靶基因。在肝中占优势
的同工型SREBP-1c调节脂肪生成途径，而SREBP-2优先激活胆固醇代谢的基因。

[0820] 关于PCSK9的基因定位于人染色体1p33-p34.3；Seidah等人，同上。PCSK9在能够增殖和分化的细胞中表达，所述细胞包括例如肝细胞、肾间充质细胞、回肠和结肠上皮以
及胚胎脑端脑神经元；Seidah等人，同上。

[0821] PCSK9的最初合成是～72-kDa的无活性酶前体或酶原的形式，其在内质网(“ER”)中经历自催化的分子内加工以激活其功能性。这种内部加工事件已报道在
SSVFAQ↓SIPWNL158基序处发生，从而使变为前3个N末端残基Ser-Ile-Pro(Benjannet
等人，2004J.Biol.Chem.279：48865-48875)，并且已报道为离开ER的必要条件；Benjannet
等人，同上；Seidah等人，同上。随后分泌切割的蛋白质。切割的肽保持与激活和分泌的酶
结合；同上。

[0822] PCSK9已归于肝和神经元细胞分化中的作用(Seidah等人，同上)，在胚胎肝中高度表达，且已强烈牵涉于胆固醇稳态。近期研究似乎暗示在胆固醇生物合成或摄取中的特
定作用。在胆固醇饲喂大鼠的研究中，Maxwell等人发现PCSK9下调，其方式类似于胆固醇
生物合成中涉及的3种其他基因，Maxwell等人，2003 J.Lipid Res.44：2109-2119。有趣
的是，同样，PCSK9的表达受固醇调节元件结合蛋白(“SREBP”)的调节，如胆固醇代谢中涉
及的其他基因可见的；同上。这些发现随后得到PCSK9转录调节的研究的支持，所述研究证
实此种调节是脂蛋白代谢中牵涉的其他基因相当一般的；Dubuc等人，2004 Arterioscler.
Thromb.Vasc.Biol.24：1454-1459。PCSK9表达以归因于药物的胆固醇降低效应的方式由
抑制素上调；同上。此外，PCSK9启动子具有胆固醇调节中涉及的2个保守位点--固醇调
节元件和Sp1位点；同上。PCSK9的腺病毒表达已显示导致循环LDL中显著的时间依赖性增
加(Benjannet等人，2004 J.Biol.Chem.279：48865-48875)。此外，PCSK9基因缺失的小鼠
具有增加水平的肝LDL受体且从血浆中更快速地清除LDL；Rashid等人，2005 Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 102：5374-5379。

[0823] 基因PCSK9中的许多突变已与常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)最终相关，特征在于血浆中的低密度脂蛋白(“LDL”)颗粒显著升高的遗传性代谢病症，其可以导致
过早的心血管衰竭；参见Abifadel等人，2003 Nature Genetics 34：154-156；Timms等
人，2004Hum.Genet.114：349-353；Leren，2004 Clin.Genet.65：419-422。Abifadel等人，同上关于S127R突变的随后公开的研究报道，携带此种突变的患者显示出血浆中更高的总
胆固醇和ApoB100，这归因于(1)包含ApoB100的脂蛋白的过超量生产，例如低密度脂蛋
白(“LDL”)、极低密度脂蛋白(“VLDL”)和中密度脂蛋白(“IDL”)，和(2)所述脂蛋白
的清除或转化中的相关减少；Ouguerram等人，2004 Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：
1448-1453。

[0824] PCSK9在胚胎肝中高度表达。它随后在成体肝中减少但在肝切除术后显著增加。转录物也在特定区域例如端脑、皮肤、肾、肠和小脑中短暂地检测到。已假定PCSK9可以在
祖细胞中优先表达且在肝和神经元分化中起作用。在人类中，PCSK9基因长约22千碱基，且
包含编码692氨基酸蛋白质的12个外显子。位于染色体1p32上，PCSK9近期鉴定为牵涉于
常染色体显性高胆固醇血症(“ADH”)、黄瘤和高频率的冠状动脉疾病的第3个基因座，所述
ADH特征在于高水平的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇。大多数家族性高胆固醇血症病例归因
于编码LDL受体(LDLR)和载脂蛋白B(apoB)的基因中的突变，所述LDLR和apoB是LDL颗
粒的主要组分。通过几个法国家族的遗传分析，2个外显子PCSK9突变--S127R和F216L和
与疾病分离的单元型相关。这项工作近来通过大Utah家族中的新PCSK9突变D374Y和2个
日本多态性内含子1/C(-161)T和I474V的鉴定得到证实，全都与LDL-胆固醇的异常高水
平相关。(参见Dubuc等人，2004，Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，
24：1454)。

[0825] 基于PCSK9功能的目前了解，PCSK9和其他相关基因的调节在用于代谢疾病的新疗法的开发中是有帮助的。照这样，使用短干扰核酸(siNA)介导的RNAi调节PCSK9表示
与PCSK9活性和/或基因表达相关的疾病和状况的治疗和研究的新方法，所述疾病和状况
包括高脂血症、高胆固醇血症、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗、肥胖和/或与受试者或生物中的PCSK9基因表达或活性相关
的其他疾病状态、状况或性状。

[0826] 实施例：

[0827] 下述是显示本发明的核酸的选择、分离、合成和活性的非限制性例子。

[0828] 实施例1：siNA构建体的串联合成

[0829] 本发明的示例性siNA分子使用可切割接头例如基于琥珀酰的接头串联合成。如本文所描述的串联合成随后为以高得率提供RNAi分子的单步纯化过程。这种方法高度顺
应siNA合成支持高通量RNAi筛选，并且可以容易地适应多柱或多孔合成平台。

[0830] 其中5′-末端二甲氧三苯甲基(5′-O-DMT)保持完整(三苯甲基依赖合成)的siNA寡核苷酸(oligo)及其互补体串联合成完成后，寡核苷酸如上所述进行脱保护。脱保
护后，允许siNA序列链自发地杂交。这种杂交产生其中一条链已保留5′-O-DMT基团而
互补链包含末端5′-羟基的双链体。新形成的双链体在常规固相提取纯化(三苯甲基依
赖(Trityl-On)纯化)期间表现为单个分子，即使只有1个分子具有二甲氧三苯甲基。因
为链形成稳定的双链体，所以这种二甲氧三苯甲基(或等价基团，例如其他三苯甲基或其
他疏水性部分)是纯化寡核苷酸对所全部需要的，例如通过使用C18药液筒。

[0831] 使用标准亚磷酰胺合成化学直至引入串联接头的点，例如反向脱氧脱碱基琥珀酸酯或琥珀酸甘油酯接头(参见图1)或等价可切割接头。可以使用的接头偶联条件的非限
制性例子包括阻碍碱基例如二异丙基乙胺(DIPA)和/或DMAP，在活化剂例如六氟磷酸溴三
吡咯烷鏻(PyBrOP)的存在下。接头偶联后，使用标准合成化学以完成第二种序列的合成，
使末端5′-O-DMT保持完整。合成后，所得到的寡核苷酸根据本文描述的程序进行脱保护，
且用合适的缓冲液例如用50mMNaOAc或1.5M NH4H2CO3猝灭。

[0832] siNA双链体的纯化可以使用固相提取容易地完成，例如使用用1柱体积(CV)的乙腈、2CV H2O和2CV 50mM NaOAc调节的WatersC18 SepPak 1g药液筒。装载样品且随后用
1CV H2O或50mM NaOAc洗涤。失败序列用1CV 14％ACN(水性具有50mM NaOAc和50mMNaCl)
洗脱。随后例如使用1 CV H2O洗涤柱，随后为柱上脱三苯甲基作用，例如通过使1 CV 1％
含水三氟乙酸(TFA)经过柱，随后向柱中添加第二次CV 1％含水TFA且允许静置约10分
钟。去除剩余TFA溶液且用H2O随后为1 CV 1M NaCl和另外的H2O洗涤柱。随后例如使
用1 CV 20％含水CAN洗脱siNA双链体产物。

[0833] 图2提供了纯化的siNA构建体的MALDI-TOF质谱分析法分析的例子，其中每个峰对应于siNA双链体的个别siNA链的计算质量。当通过毛细管凝胶电泳(CGE)进行分析时，
相同纯化的siNA提供了3个峰，1个峰推测对应于双链体siNA，且2个峰推测对应于分开
的siNA序列链。相同siNA构建体的离子交换HPLC分析只显示了单个峰。与由分开合成
的寡核苷酸序列链产生的siNA构建体相比较，使用下述萤光素酶报道分子测定测试纯化
的siNA构建体证实相同的RNAi活性。

[0834] 实施例2：在任何RNA序列中潜在siNA靶位点的鉴定

[0835] 例如通过使用计算机折叠算法就靶位点筛选目的RNA靶序列，例如人mRNA转录物(例如，在本文中通过Genbank登记号提及的任何序列)。在非限制性例子中，衍生自数据
库，例如Genbank的基因或RNA基因转录物的序列用于产生与靶具有互补性的siNA靶。此
种序列可以从数据库获得，或可以如本领域已知的用实验方法测定。已知的靶位点，例如基
于使用其他核酸分子例如核酶或反义的研究测定为有效靶位点的那些靶位点，或已知与疾
病、性状或状况相关的那些靶例如包含突变或缺失的那些位点，可以用于设计靶向那些位
点的siNA分子。各种参数可以用于测定哪些位点是靶RNA序列内最合适的靶位点。这些参
数包括但不限于，二级或三级RNA结构，靶序列的核苷酸碱基组成，靶序列的各个区域之间
的同源性程度，或靶序列在RNA转录物内的相对位置。基于这些测定，可以选择RNA转录物
内的任何数目的靶位点，以例如通过使用体外RNA切割测定、细胞培养或动物模型就功效
筛选siNA分子。在非限制性例子中，基于使用的siNA构建体的大小选择转录物内1-1000
个靶位点的任何地方。可以开发高通量筛选测定用于使用本领域已知的方法筛选siNA分
子，例如使用多孔或多板测定以测定靶基因表达中的有效减少。

[0836] 实施例3：RNA中的核酸或多核苷酸(例如siNA)分子靶位点的选择

[0837] 下述非限制性步骤可以用于执行靶向给定基因序列或转录物的siNAs的选择。

[0838] 1.靶序列在计算机芯片上分解成在靶序列内包含的特定长度的所有片段或子序列例如23核苷酸片段列表。这个步骤一般使用定制Perl脚本进行，但也可以使用商业序
列分析程序例如Oligo、MacVector或GCG Wisconsin Package。

[0839] 2.在一些情况下，siNAs对应于超过一种靶序列；例如在靶向相同基因的不同转录物、靶向超过一种基因的不同转录物、或用于靶向人基因和动物同源物中确实如此。在这
种情况下，对于每种靶产生特定长度的子序列列表，且随后比较列表以发现每个列表中的
匹配序列。子序列随后根据包含给定子序列的靶序列数目进行分级；目的是发现 存在于大
多数或所有靶序列中的子序列。可替代地，分级可以鉴定靶序列独有的子序列，例如突变体
靶序列。此种方法将使得能够使用siNA以特异性靶向突变序列且不影响正常序列的表达。

[0840] 3.在一些情况下，siNA子序列在一种或多种序列中不存在而存在于所需靶序列中；如果siNA靶向具有保持未靶向的旁系同源家族成员的基因则确实如此。如上文情况
2中一样，对于每种靶产生特定长度的子序列列表，且随后比较列表以发现存在于靶基因中
但在未靶向的旁系同源物中不存在的序列。

[0841] 4.分级的siNA子序列可以根据GC含量进行进一步分析且分级。对包含30-70％GC的位点给予优先，而对于包含40-60％GC的位点给予进一步优先。

[0842] 5.分级的siNA子序列可以根据自折叠和内部发夹进行进一步分析且分级。较弱的内部折叠是优选的；强发夹结构是被避免的。

[0843] 6.分级的siNA子序列可以根据它们在序列中是否具有GGG或CCC串进行进一步分析且分级。在任一链中的GGG(或甚至更多的Gs)可以使得寡核苷酸合成有问题且可以
潜在干扰RNAi活性，因此只要较佳的序列是可用的它就被避免。在靶链中搜索CCC，因为那
将在反义链中放置GGG。

[0844] 7.分级的siNA子序列可以根据它们在序列的3′-末端上是否具有二核苷酸UU(尿苷二核苷酸)，和/或在序列的5′-末端上是否具有AA(以在反义序列上产生
3′UU)进行进一步分析且分级。这些序列允许人们设计具有末端TT胸苷二核苷酸的siNA
分子。

[0845] 8.从如上所述的分级的子序列列表中选择4个或5个靶位点。例如，在具有23个核苷酸的子序列中，随后对于siNA双链体的上部(有义)链设计且合成每种所选23-聚体
子序列的右侧21个核苷酸，同时对于siNA双链体的下部(反义)链设计且合成每种所选
23-聚体子序列的左侧21个核苷酸的反向互补物(参见表II)。如果末端TT残基对于序
列是所需的(如段落7中所述)，那么有义和反义链的2个3′末端核苷酸在合成寡核苷酸
前由TT替换。

[0846] 9.在体外、细胞培养或动物模型系统中筛选siNA分子，以鉴定最有活性的siNA分子或靶RNA序列内最优选的靶位点。

[0847] 10.当选择靶核酸序列时可以使用其他设计考虑，参见例如，Reynolds等人，2004，Nature Biotechnology Advanced Online Publication，2004 年 2 月 1 日，doi：
10.1038/nbt936和Ui-Tei等 人，2004，NucleicAcids Research，32，doi：10.1093/nar/
gkh247。

[0848] 在可替代方法中，使用对靶序列特异的siNA构建体库以在表达靶RNA的细胞中筛选靶位点，所述细胞例如培养的Jurkat、HeLa、A549或293T细胞。在这种方法中使用的一
般策略显示于图9中。表达靶RNA的细胞用siNA构建体库转染且分选显示与靶抑制相关的
表型的细胞。siNA构建体库可以由插入到合适的载体内的转录盒表达(参见例如图7和图
8)。对来自显示阳性表型改变(例如，减少的增殖，减少的靶mRNA水平或减少的靶蛋白质表
达)的细胞的siNA进行测序，以测定靶靶RNA序列内最合适的一个或多个靶位点。在一个
实施方案中，使用下述方法选择本发明的siNA分子。汇编下述指导以预测包含本文描述的
化学修饰的高活性siNAs。这些规则由针对几种不同靶的高活性(靶mRNA水平＞75％的
击倒)和无活性(靶mRNA水平＜75％的击倒)siNAs的比较分析显现出来。分析总共242
个siNA序列。242个siNAs中的35个siNAs被分类成高活性的并且剩余siNAs被分类成
无活性组。高活性siNAs在siNA序列内的特定核苷酸位置上明显显示出对于某些碱基的
优先。例如，A或U核碱基在高活性siNAs的有义链的第19位上压倒性地存在，并且对于
无活性的siNAs确实是对立的。在高活性siNAs中还存在有义链的第15-19位之间A/U富
含(5个碱基中的3个是A或U)区和第1-5位之间G/C富含区(5个碱基中的3个是G或
C)的模式。如表VII中所示，鉴定高活性siNAs特有的12种此种模式。应当指出并非每种
模式都存在于每种高活性siNA中。因此，为了设计用于预测高活性siNAs的算法，对每种
模式指定不同得分。取决于此种模式在高活性siNAs对无活性siNAs中以多大频率发生，
对设计参数指定得分，其中最高的是10。如果某一核碱基在位置上不是优选的，那么指定负
得分。例如，在有义链的第9和13位上，G核苷酸在高活性siNAs中不是优选的，且因此它
们被给予-3分(减3)。关于每种模式的差别得分在表VII中给出。模式#4被给予-100
的最大得分。这主要是淘汰包含4Gs或4Cs串的任何序列，因为它们对于合成可以是高度
不相容的且可以允许序列自聚集，从而使得siNA无活性。使用这种算法，对于任何siNA可
能的最高得分是66。因为存在可能针对合理大小(～1000核苷酸)的任何给定靶的众多
siNA序列，所以这种算法对于产生高活性siNAs是有用的。

[0849] 在一个实施方案中，表VII中显示的规则1-11用于产生本发明的活性siNA分子。在另一个实施方案中，表VII中显示的规则1-12用于产生本发明的活性siNA分子。

[0850] 实施例4：PCSK9 siNA设计

[0851] siNA靶位点通过下述进行选择：分析PCSK9 RNA靶的序列且任选基于上文实施例3中呈现的规则，和可替代地基于折叠(分析任何给定序列的结构以测定siNA对靶的可接
近性)将靶位点区分优先次序，或使用如实施例3中描述的siNA分子文库，或可替代地使
用如本文实施例6中描述的体外siNA系统。设计这样的siNA分子，其可以结合每种靶并且
使用上文的算法进行选择且任选通过计算机折叠进行个别分析，以评估siNA分子是否可
以与靶序列相互作用。可以选择改变siNA分子的长度以最优化活性。一般地，选择足够数
目的互补核苷酸碱基，以与靶RNA结合或以其他方式相互作用，但可以调节互补性程度以
适应siNA双链体或改变长度或碱基组成。通过使用此种方法，可以设计针对任何已知RNA
序列内的靶位点的siNA分子，例如对应于任何基因转录物的那些RNA序列。

[0852] 分析靶序列以产生由其设计双链siNA的靶(表II)。为了产生合成siNA构建体，使用实施例3中描述的算法以挑选活性双链构建体及其化学修饰的形式。例如，在表II中，
显示了靶序列连同siNA双链体的上部(有义链)和下部链(反义链)。通过搜索不同靶序
列之间的同源位点(例如，共享同源性的约5-约15核苷酸的区域)且允许非规范碱基对
(例如G：U摆动碱基配对)或错配碱基对来设计多功能siNAs。

[0853] 化学修饰的siNA构建体如本文所描述的进行设计(参见例如表V)，以提供用于在体内全身施用的核酸酶稳定性和/或改善的药物代谢动力学、定位和递送性质，同时保持
介导RNAi活性的能力。如本文所描述的化学修饰使用本文描述的合成方法和本领域一般
已知的那些合成引入。随后就在血清和/或细胞/组织提取物(例如，肝提取物)中的核
酸酶稳定性测定合成的siNA构建体。还使用合适的测定就RNAi活性平行测试合成的siNA
构建体，所述测定例如如本文描述的萤光素酶报道分子测定或可以定量RNAi活性的另一
种合适的测定。具有核酸酶稳定性和RNAi活性的合成的siNA构建体可以进一步修饰且在
稳定性和活性测定中重新评估。稳定的活性siNA构建体的化学修饰随后可以应用于靶向
任何所选RNA的任何siNA序列，且例如在靶筛选测定中用于挑选前导siNA化合物用于治
疗开发(参见例如图11)。

[0854] 实施例5：siNA的化学合成、纯化和分析

[0855] 可以设计siNA分子以与RNA信使中的各个位点相互作用，例如本文描述的RNA序列内的靶序列。一种或多种siNA分子的一条链的序列与上文描述的靶位点序列互补。siNA
分子可以使用本文描述的方法进行化学合成。用作对照序列的无活性siNA分子可以通过
下述合成：使siNA分子的序列混乱，从而使得它与靶序列不互补。一般地，siNA构建体可
以通过使用如本文所描述的固相寡核苷酸合成法进行合成(参见例如Usman等人，美国专
利 号 5,804,683；5,831,071；5,998,203；6,117,657；6,353,098；6,362,323；6,437,117；
6,469,158；Scaringe等人，美国专利号6,111,086；6,008,400；6,111,086，全部整体引入
本文作为参考)。

[0856] 在非限制性例子中，RNA寡核苷酸以逐步方式使用如本领域已知的亚磷酰胺化学来合成。标准亚磷酰胺化学涉及包含下述中的任何一种的核苷的使用：5′-O-二甲氧三苯
甲基、2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、3′-O-2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺基团、和
环外胺保护基团(例如N6-苯甲酰腺苷、N4乙酰基胞苷、和N2-异丁酰鸟苷)。可替代地，
2′-O-甲硅烷基醚可以与酸不稳定的2′-O-原酸酯保护基团结合在如由Scaringe同上
描述的RNA合成中使用。不同的2′化学可以需要不同的保护基团，例如2′-脱氧-2′-氨
基核苷可以利用如Usman等人，美国专利5,631,360中描述的N-邻苯二甲酰保护，所述专
利整体引入本文作为参考)。

[0857] 在固相合成期间，向固体支持体结合的寡核苷酸中顺次加入(3′-至5′-方向)每种核苷酸。在链的3′-末端处的第一个核苷使用各种接头与固体支持体(例如，可控孔
度玻璃或聚苯乙烯)共价附着。使核苷酸前体、核糖核苷亚磷酰胺和活化剂组合，从而导致
第二个核苷亚磷酰胺偶联在第一个核苷的5′-末端上。随后洗涤支持体且用加帽试剂例
如乙酸酐给任何未反应的5′-羟基加帽，以产生无活性的5′-乙酰基部分。随后使三价
的磷键氧化成更稳定的磷酸键。在核苷酸的加入循环结束时，在合适的条件下(例如用于
基于三苯甲基的基团的酸性条件和用于基于甲硅烷基的基团的氟化物)切割5′-O-保护
基团。对于每个后续核苷酸重复该循环。

[0858] 可以使用合成条件的修改以最优化偶联效率，取决于待合成的siNA的具体化学组成，例如通过使用不同的偶联时间、不同的试剂/亚磷酰胺浓度、不同的接触时间、不同
的固体支持体和固体支持体接头化学。siNA的脱保护和纯化可以如下述参考文献中一般
描述的进行：Usman等人，US 5,831,071、US 6,353,098、US 6,437,117，和Bellon等人，
US 6,054,576、US 6,162,909、US 6,303,773，或Scaringe同上，所述参考文献整体引入本
文作为参考。此外，可以修改脱保护条件以提供siNA构建体最佳的可能得率和纯度。例
如，申请人已观察到包含2′-脱氧-2′-氟核苷酸的寡核苷酸可以在不合适的脱保护条
件下降解。此种寡核苷酸使用含水甲胺于约35℃30分钟进行脱保护。如果包含2′-脱
氧-2′-氟的寡核苷酸还包含核糖核苷酸，那么用含水甲胺于约35℃30分钟脱保护后，添
加TEA-HF且使反应于约65℃维持另外15分钟。siNA脱保护的单链通过阴离子交换进行
纯化，以达到高纯度同时维持高得率。为了形成siNA双链体分子，使单链在盐水溶液中以
等摩尔比率组合以形成双链体。在冻干之前通过切向过滤使双链体siNA浓缩且脱盐。

[0859] siNA组合物的制备

[0860] 在非限制性例子中，对于每种siNA组合物，使用固相合成分开合成siNA的2条个别的互补链，随后通过离子交换层析分开进行纯化。使互补链退火以形成双链(双链体)。
随后使双链体超滤且冻干以形成固体siNA组合物(例如，药物组合物)。制备过程的非限
制性例子显示于表VIII的流程图中。

[0861] 固相合成

[0862] 使用亚磷酰胺化学在自动化固相合成仪，例如AmershamPharmacia AKTAOligopilot(例如，Oligopilot或Oligopilot 100 plus)上合成单链寡核苷酸。将可调节
的合成柱装满由第一个核苷残基衍生的固体支持体。通过酸不稳定的5′-O-二甲氧三苯
甲基的脱三苯甲基作用以释放5′-羟基来起始合成。将溶于乙腈的亚磷酰胺和合适的活
化剂同时递送给合成柱，从而导致亚磷酰胺(amidite)与5′-羟基的偶联。随后用乙腈洗
涤柱。将碘泵过柱以使亚磷酸三酯键P(III)氧化成其磷酸三酯P(V)类似物。在2，6-二
甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反应的5′-羟基使用试剂例如乙酸酐进行加帽。对
于下一个亚磷酰胺掺入，延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始。重复这个过程直至所
需序列已合成。通过去除末端二甲氧三苯甲基终止合成。

[0863] 切割和脱保护

[0864] 合成结束时，将固体支持体和结合的寡核苷酸转移至过滤漏斗，在真空下干燥，且转移至反应容器。添加水基且使混合物加热，以实现琥珀酰键的切割，氰乙基磷酸保护基团
的去除和环外胺保护的脱保护。

[0865] 对不包含核糖核苷酸的单链执行下述过程：用水基处理固体支持体后，在真空下过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用水漂洗固体支持体，将其
与滤液组合。所得到的碱性溶液用酸中和以提供粗制单链的溶液。

[0866] 对包含核糖核苷酸的单链执行下述过程：用水基处理固体支持体后，在真空下过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲基亚砜(DMSO)漂洗固
体支持体，将其与滤液组合。使混合物冷却，添加氟化物试剂例如三氢氟酸三乙胺，并使溶
液加热。用合适的缓冲液猝灭反应以提供粗制单链的溶液。

[0867] 阴离子交换纯化

[0868] 每种粗制单链的溶液使用层析纯化进行纯化。使用合适的缓冲液梯度洗脱产物。将级分收集在封闭卫生处理的容器中，通过HPLC分析，且使合适的级分组合以提供产物
库，所述产物库就纯度(HPLC)、同一性(HPLC)和浓度(UV A260)进行分析。

[0869] 退火

[0870] 基于产物库的分析，将等摩尔量的(使用理论消光系数计算的)有义和反义寡核苷酸链转移至反应容器。将溶液混合且通过层析法就双链体的纯度进行分析。如果分析指
出任一链的过量，那么滴定另外的非过量链直至双链体形成完成。当分析指出已达到靶产
物纯度时，将材料转移至切向流过滤(TFF)系统用于浓缩和脱盐。

[0871] 超滤

[0872] 退火的产物溶液使用包含合适的分子量截止膜的TFF系统进行浓缩。浓缩后，产物溶液经由渗滤使用WFI质量的水进行脱盐，直至滤液的传导性是水的那种。

[0873] 冻干

[0874] 将浓缩的溶液转移至在柜式冷冻干燥机中的卫生处理的盘。随后将产物冷冻干燥成粉末。从冷冻干燥机中取出盘且转移至等级100的层气流(Laminar Air Flow)(LAF)通
风橱用于包装。

[0875] 药品的包装

[0876] 包含冷冻干燥产物的冷冻干燥机盘在等级100的LAF通风橱中打开。将产物转移至合适大小的卫生处理的容器中，随后将所述卫生处理的容器密封且加上标签。

[0877] 药品容器封闭系统

[0878] 在具有卫生处理的盖的卫生处理的Nalgene容器中批量包装冻干的药品。使用的瓶大小取决于在其内放置材料的量。填充后，用聚乙烯带在封闭处将每个瓶另外密封。

[0879] 分析法和规格

[0880] 原材料和过程中(In-Process)方法

[0881] 在引入药品制备过程内前就同一性测试原材料。关键的原材料，掺入药品分子内的那些，使用适当的纯度测试或测定测试另外进行测试。在制备方法中的关键控制点上测
试过程中的样品，以监控且确保最终药品的质量。

[0882] 药品分析法和规格

[0883] 合并关于寡核苷酸的分析法和验收标准的控制在批量siNA组合物的临床测试前确立。下述测试法和验收标准反映了这些控制的例子。表IX概括了对于siNA药物组合物
的材料规格的例子。

[0884] 分析法概括

[0885] 同一性(ID)测试

[0886] ID寡核苷酸主峰：药品的同一性使用层析法确立。用于这种测定的数据通过HPLC测试法之一产生(参见纯度测试)。比较药品样品和标准注射剂的峰保留时间。药品同一
性由主峰保留时间的有利比较支持。

[0887] 分子量：药品的同一性使用分光镜法确立。通过与含水乙酸铵一起沉淀制备药品样品用于分析。药品的分子量通过质谱分析法进行测定。将测试控制在来自理论分子量的
原子质量单位的设定数目内。

[0888] 解链温度：这种方法通过测量双链药品的解链温度(Tm)支持药品的同一性。使溶液中的样品加热同时监控溶液的紫外(UV)吸光度。Tm标记为随着由于双链体解离成单链
吸光度增加的吸光度曲线的拐点。

[0889] 测定测试

[0890] 寡核苷酸含量：这种测定确定药品中的寡核苷酸总含量。寡核苷酸吸收UV光，在260nm处具有局部极大值。存在的寡核苷酸种类由双链siRNA产物和来自制备过程的其他
较少的相关寡核苷酸物质包括残留单链组成。将药品样品精确地称重，溶解，且测定体积地
在水中稀释。使用UV分光光度计在石英池中测量吸光度。使用工作标准的用实验测定的
摩尔吸光系数计算寡核苷酸总测定值，且以微克钠寡核苷酸/毫克固体药品报告。

[0891] 纯度测试：纯度将使用一种或多种层析法进行测量。取决于存在的药品的核酸类似物的分离和数目，可以使用正交分离法以监控API的纯度。分离可以通过下述方法达到：

[0892] SAX-HPLC：寡核苷酸磷酸二酯和使用缓冲的盐梯度的强阴离子交换HPLC柱之间的离子交换相互作用以进行分离。

[0893] RP-HPLC：寡核苷酸和使用含水缓冲液对有机溶剂梯度的疏水反相HPLC柱之间的分配相互作用以进行分离。

[0894] 毛细管凝胶电泳(CGE)：在凝胶填充的毛细管内在缓冲溶液中通过分子筛分的电泳分离。当应用电场时发生分离，从而随着它们通过凝胶基质迁移引起阴离子寡核苷酸按
照分子大小分离。在所有分离法中，峰一般按寡核苷酸长度的顺序洗脱且通过UV在260nm
处进行检测。

[0895] 其他测试

[0896] 物理外观：视觉检查药品样品。这种测试确定材料具有冻干固体的特征，鉴定固体的颜色，且确定是否存在任何可见的污染物。

[0897] 细菌内毒素测试：细菌内毒素测试通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定使用动态比浊法在96孔板中进行。关于药品的内毒素限度将适当地设定，以便当与赋形剂组合时，在
施用的药物产品中不超过关于内毒素的每日容许限度。

[0898] 需氧生物负荷：需氧生物负荷通过合同实验室(contract laboratory)使用基于USP第<61>章的方法进行。

[0899] 乙腈含量：残留乙腈分析通过合同实验室使用气相层析(GC)进行。乙腈是上游合成步骤中使用的主要有机溶剂，尽管在合成中使用几种其他有机试剂。后续纯化过程步骤
一般去除药品中的溶剂。取决于过程发展工作的结果，可以监控其他溶剂。溶剂将限制在
ICH限度内。

[0900] 含水量：含水量通过容量Karl Fischer(KF)滴定法使用固体蒸发器单单元(烤箱)确定。水一般作为组合物的几个重量百分比存在于核酸药品中，且因此将得到监控。

[0901] pH：将监控重构药品的pH以确保用于人注射的适合性。

[0902] 离子含量：关于钠、氯化物和磷酸盐的测试将通过合同实验室使用标准原子吸收作用和离子层析法进行。将进行离子的一般监控，以确保掺入药品的药物产品的重量摩尔
渗透压浓度将在可接受的生理学范围内。

[0903] 金属含量：关于有关材料的测试通过合同实验室使用标准分析法-电感偶合等离子体(ICP)光谱学进行。

[0904] 实施例6：RNAi体外测定以评估siNA活性

[0905] 在无细胞系统中重演RNAi的体外测定用于评估靶向靶RNA靶的siNA构建体。该测定包含由Tuschl等人，1999，Genes and Development，13，3191-3197和Zamore等人，
2000，Cell，101，25-33描述的适合对靶RNA使用的系统。衍生自合胞胚层的果蝇提取物
用于在体外重构RNAi活性。靶RNA经由体外转录使用T7RNA聚合酶由合适的靶表达质粒
产生，或经由如本文所描述的化学合成产生。有义和反义siNA链(例如各20uM)通过在
缓冲液(例如100mM乙酸钾，30mMHEPES-KOH，pH 7.4，2mM乙酸镁)中于90℃温育1分钟
随后为于37℃1小时进行退火，随后在裂解缓冲液(例如100mM乙酸钾，pH 7.4的30mM
HEPES-KOH，2mM乙酸镁)中进行稀释。可以通过在琼脂糖凝胶上在TBE缓冲液中凝胶电泳
且用溴化乙锭染色监控退火。果蝇裂解物使用来自酵母糖蜜琼脂上收集的Oregon R蝇0-2
小时龄的胚胎进行制备，所述胚胎被去绒毛膜(dechorionated)且裂解。将裂解物离心且
分离上清液。该测定包含反应混合物，所述反应化合物包含50％裂解物[体积/体积]、
RNA(10-50pM终浓度)、和包含siNA(10nM终浓度)的10％[体积/体积]裂解缓冲液。反
应混合物还包含10mM磷酸肌酸、10ug/ml肌酸磷酸激酶、100um GTP、100uM UTP、100uMCTP、
500uM ATP、5mM DTT、0.1U/uL RNA酶抑制剂(RNasin)(Promega)和100uM的每种氨基酸。将
乙酸钾的终浓度调整至100mM。反应在冰上预组装且在加入RNA前于25℃预温育10分钟，
随后于25℃温育另外60分钟。反应用4体积的1.25x Passive Lysis Buffer(Promega)
猝灭。靶RNA切割通过RT-PCR分析或本领域已知的其他方法进行测定，且与其中siNA从
反应中省略的对照反应比较。

[0906] 可替代地，关于该测定的内部标记的靶RNA通过在[α-32P]CTP的存在下的体外转录制备，通过旋转层析经过G50 Sephadex柱，且无需进一步纯化用作靶RNA。任选地，
靶RNA是使用T4多核苷酸激酶进行5′-32P末端标记的。测定如上所述进行，并且通过
RNAi产生的靶RNA和特异性RNA切割产物在凝胶的放射自显影图上显现。切割百分比通过
PHOSPHOR (放射自显影术)定量条带来测定，所述条带代表完整对照RNA或来
自无siNA的对照反应的RNA和通过测定产生的切割产物。

[0907] 在一个实施方案中，这种测定用于确定靶RNA靶中用于siNA介导的RNAi切割的靶位点，其中就RNAi介导的靶RNA靶的切割筛选多个siNA构建体，例如通过分析经由标记
的靶RNA的电泳的测定反应，或通过RNA印迹，以及通过本领域众所周知的其他方法。

[0908] 实施例7：PCSK9靶RNA的核酸抑制

[0909] 如上所述设计且合成靶向人PCSK9RNA的siNA分子。可以例如使用下述程序就体内切割活性测试这些核酸分子。PCSK9 RNA内的靶序列和核苷酸位置在表II和III中给
出。

[0910] 使用2种形式以测试靶向PCSK9的siNAs的功效。首先，使用HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T细胞在细胞培养中测试试剂，以测定RNA和蛋白质抑制的程度。如本文所描述
的选择针对PCSK9靶的siNA试剂(例如，参见表II和III)。在通过合适的转染剂将这些
试剂递送给例如HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T细胞后测量RNA抑制。使用扩增的实
时PCR监控(例如，ABI 7700 )测量靶RNA对肌动蛋白的相对量。与对无关
的靶制备的寡核苷酸序列的混合物或随机化的siNA对照进行比较，所述随机化的siNA对
照具有相同的总体长度和化学，但在每个位置上进行随机置换。就靶和进行的最优化选择
初级和次级前导试剂。选择最佳转染剂浓度后，用前导siNA分子进行RNA的时程的抑制。
此外，可以使用细胞铺平板形式以测定RNA抑制。

[0911] 此外，可以使用细胞铺平板形式以测定RNA抑制。这个系统在Rice等人，US5,874,565和US 6,127,116中得到描述，所述2个专利引入本文作为参考。

[0912] siNA给细胞的递送

[0913] 在转染前一天例如以6孔皿每孔溶于EGM-2(BioWhittaker)的1×105细胞接种细胞(例如HepG2、Jurkat、HeLa、A549或293T)。siNA(终浓度，例如20nM)和阳离子脂质
(例如，终浓度2□g/ml)在EGM基础培养基(Bio Whittaker)中在聚苯乙烯管中于37℃
复合30分钟。涡旋后，向每个孔中加入复合siNA且温育指示时间。对于最初最优化实验，
3
如所述的例如在96孔板中以1×10 接种细胞且添加siNA复合物。siNA给细胞递送的效
率使用与脂质复合的荧光siNA进行测定。6孔皿中的细胞与siNA温育24小时，用PBS进
行漂洗且在2％低聚甲醛中在室温下固定15分钟。siNA的摄取使用荧光显微镜进行显现。

[0914] mRNA的 (扩增的实时PCR监控)和Lightcycler定量。

[0915] siNA递送后由细胞制备总RNA，例如对于6孔使用Qiagen RNA纯化试剂盒或对于96孔测定使用Rneasy提取试剂盒。对于 分析(扩增的实时PCR监控)，合成
双重标记的探针，其具有在5′-末端处共价连接的报道分子染料FAM或JOE，和与3′-末
端缀合的猝灭剂染料TAMRA。在例如ABI PRISM 7700 Sequence Detector上进行单步
RT-PCR扩增，其中使用由下述组成的50μl反应物：10μl总RNA，100nM正向引物，900nM反
向引物，100nM探针，1X TaqMan PCR反应缓冲液(PE-Applied Biosystems)，5.5mM MgCl2，
各300μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，10U RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)(Promega)，
1.25U AMPLITAQ (DNA聚合酶)(PE-AppliedBiosystems)和10U M-MLV逆转录
酶(Reverse Transcriptase)(Promega)。热循环条件可以由下述组成：于48℃30分钟，于
95℃10分钟，随后为于95℃15秒和于60℃1分钟的40个循环。mRNA水平的定量相对于
标准进行测定，所述标准由系列稀释的总细胞RNA(300、100、33、11ng/反应)产生，且在平
行 反应(扩增的实时PCR监控)中对β-肌动蛋白或GAPDH mRNA进行标准
化。对于每种目的基因，设计上部和下部引物以及荧光标记的探针。SYBR Green I染料向
特异性PCR产物内的实时掺入可以在玻璃毛细管中使用lightcyler进行测量。使用对照
cRNA对于每个引物对产生标准曲线。值表示为每种样品中针对GAPDH的相对表达。

[0916] 蛋白质印迹

[0917] 使用标准标准微量制备技术可以制备核提取物(参见例如Andrews和Faller，1991，Nucleic Acids Research，19，2499)。例如使用TCA沉淀制备来自上清液的蛋白质提
取物。向细胞上清液中加入等体积的20％TCA，在冰上温育1小时且通过离心5分钟进行
沉淀。沉淀在丙酮中进行洗涤，干燥且重悬浮于水中。细胞蛋白质提取物在10％Bis-Tris
NuPage(核提取物)或4-12％Tris-甘氨酸(上清液提取物)聚丙烯酰胺凝胶上运行，且
转移到硝酸纤维素膜上。通过例如与5％脱脂乳温育1小时随后与第一抗体于4℃温育16
小时可以阻断非特异性结合。洗涤后，在室温下应用第二抗体例如(1∶10,000稀释)1小
时且用SuperSignal试剂(Pierce)检测信号。

[0918] 实施例8：用于评估PCSK9基因表达的下调的模型

[0919] 在动物模型中评估本发明的siNA分子的功效是关于人临床试验的重要先决条件。如本领域已知的代谢和心血管疾病、状况或病症的各种动物模型可以适合于用于临床
前评估本发明的核酸组合物针对治疗或研究用途在调节靶(例如，PCSK9)基因表达中的功
效。Goldberg，2004，J Clin Invest.114(5)：613615，提供了用于评估关于代谢疾病包括高脂血症和糖尿病的治疗剂的动物模型的综述。这些模型和其他可以用于评估本发明的siNA
分子和分子组合物的功效。照这样，在治疗代谢和相关疾病和状况中用本发明的核酸分子
处理的细胞。靶向PCSK9RNA的(例如siNA)与具有杂乱的或无活性序列的匹配对照核酸
分子相比较将预期具有减少的PCSK9表达能力。在非限制性例子中，培养人T细胞且例如
通过时间分辨免疫荧光测定定量PCSK9表达。在培养细胞中用RT-PCR定量PCSK9信使RNA
表达。未处理的细胞与由用合适试剂转染的siNA分子处理的细胞进行比较，所述合适试剂
例如阳离子脂质例如lipofectamine，并且定量PCSK9蛋白质和RNA水平。随后执行剂量响
应测定以确定PCSK9表达的剂量依赖性抑制。在非限制性例子中，细胞培养实验如Curiel
等人，2003，Nature Medicine，9，562中所述进行适应。

[0920] 实施例9：RNAi介导的PCSK9基因表达的抑制

[0921] 体外siNA介导的PCSK9 RNA的抑制

[0922] 就在细胞(例如HepG2细胞)中减少PCSK9 RNA表达的功效测试siNA构建体。细胞在转染前约24小时以5,000-7,500细胞/孔，100μl/孔在96孔板中铺平板，从而使得
转染时细胞为70-90％汇合。对于转染，退火的siNAs与转染试剂(Lipofectamine 2000，
Invitrogen)以50μl/孔的体积混合且在室温下温育20分钟。将siNA转染混合物加入
细胞中，以产生在150μl的体积中25nM的siNA终浓度。将每种siNA转染混合物加入3
个孔中，用于一式三份的siNA处理。细胞在siNA转染混合物的连续存在下于37℃温育24
小时。在24小时时，由每孔处理的细胞制备RNA。首先取出具有转染混合物的上清液且弃
去，随后裂解细胞且由每个孔制备RNA。处理后的靶基因表达通过RT-PCR对于靶基因和用
于标准化的对照基因(36B4，RNA聚合酶亚单位)进行评估。一式三份的数据取平均值且对
于每种处理测定标准差。标准化数据用图表表示，且测定与其各自的反向对照siNAs相比
较经由活性siNAs的靶mRNA的百分比减少。

[0923] 载体介导的PCSK9 RNA表达的击倒

[0924] 确立2种稳定的细胞系--一种表达对照载体pcDNA和另一种表达野生型PCSK9，以表征PCSK9的siRNA击倒对LDL受体水平的作用。通过蛋白质印迹(图30)和通过测量
荧光标记的LDL颗粒的摄取(图31)分析对于PCSK9特异的siRNA的作用。

[0925] 参考图30A，数据显示PCSK9蛋白质仅在稳定表达PCSK9的细胞中检测到，而对照细胞系具有不可检测水平的PCSK9(比较泳道3和6)。用靶向PCSK9的siRNAs混合物处理
这些细胞导致表达PCSK9的稳定细胞系中PCSK9蛋白质的特异性击倒(泳道5)；相比之下
非靶向siRNAs对PCSK9水平没有作用(泳道4)。

[0926] 此外，数据显示PCSK9经由siRNA的特异性击倒在野生型PCSK9稳定细胞系中(图30B)，而不是对照pcDNA稳定细胞系中导致LDL受体水平的增加。此外，LDL受体的水平在
对照细胞系中是显著和容易检测出的。相比之下，表达PCSK9的稳定细胞系显示出减少得
多的(几乎不可检测的)LDL受体蛋白质水平(比较图30B中的泳道3和6)。这个结果与
图30中显示的dI-LDL摄取测定数据一致。

[0927] 参考图31，泳道1-3证实在对照稳定细胞系中diI-LDL摄取的水平未受siRNA处理的显著影响；然而，在表达PCSK9的稳定细胞系中观察到总体低水平的diI-LDL摄取(泳
道4和6)。PCSK9经由siRNA的特异性击倒因此导致diI-LDL摄取中的增加，与LDL受体
水平中的增加一致。

[0928] PCSK9经由所描述的反向转染法进行击倒。使siPORT胺试剂(1.5ul，来自Ambion)与10ul OptiMEM(还原血清，来自Gibco)在室温下混合10分钟(试剂A)。在分开的反应
(试剂B)中，使对于PCSK9特异的siRNAs的10uM原液的1ul(每种siRNA为3.3uM)与
10ulOptiMEM(还原血清)在室温下混合10分钟。下文列出的对于PCSK9特异的3种双链
siRNAs序列由Proligo定购。

[0929] RNAi双链体#1.GUGCUCAACUGCCAAGGGATT(SEQ ID NO：597)

[0930] CACGAGUUGACGGUUCCCUAA(SEQ ID NO：598)

[0931] RNAi双链体#2.CAGCAAGUGUGACAGUCAUTT(SEQ ID NO：599)

[0932] GUCGUUCACACUGUCAGUGAA(SEQ ID NO：600)

[0933] RNAi双链体#3.CACGGUACCGGGCGGAUGATT(SEQ ID NO：601)

[0934] GUGCCAUGGCCCGCCUACUAA(SEQ ID NO：602)

[0935] 对照siRNA序列(非靶向siRNA#1-siCONTROL非靶向siRNA#1D-001210-01-05)由Dharmacon定购。

[0936] 组合反应A和B，并且将22.5ul这种混合物加入96孔板中包含20,000个细胞的每个孔中。向每个孔中加入细胞培养基(100ul DMEM，补加有丙酮酸钠和谷氨酰胺、无抗生
素、5％胎牛血清的高葡萄糖培养基)。48小时后，收获细胞以通过蛋白质印迹测量PCSK9
蛋白质和LDL-受体蛋白质水平。

[0937] 关于dI-LDL摄取测定的规程：

[0938] LDL摄取是提供LDL受体水平的功能读数的领域公认的方法。细胞以20,000个细胞/孔的密度在96孔聚D-赖氨酸包被的板(Fisher目录#3665)中进行铺平板，并且如
上所述将siRNA转染混合物加入细胞中。48小时后，去除细胞培养基且用OptiMEM(Gibco)
洗涤细胞。向细胞中加入混合物A(100ul)，这是包含缺乏脂蛋白血清(来自IntraCel)和
dI-LDL(以10ug/ml的浓度)的DMEM培养基。为了测量非特异性结合，向对照孔中加入
还包含400ug/ml未标记的LDL的100ul混合物A。板于37℃温育6小时。在包含2mg/ml
BSA(来自Sigma，目录#A3059)的TBS(BioRad，#170-6435)中快速洗涤细胞。重复洗涤步
骤，但这次使洗涤缓冲液与细胞温育2分钟。最后，细胞用TBS(无BSA)洗涤2次(但快速
地)。细胞在100ul RIPA缓冲液(来自TekNova，#R3792)中进行裂解，并且将裂解物转移
至黑色板(来自Fisher的MicroFluor2 Black“U”型底板)。使用520nm的激发波长和
580nm的发射波长测量板中的荧光。使用BCA蛋白测定(Protein Assay)(来自Pierce，目
录#23225)测量每个孔中的细胞总总蛋白，并且使荧光单位对总蛋白进行标准化。特异性
LDL摄取的量是测量的总计数(在不存在未标记的LDL的情况下)和在未标记的LDL的存
在下测量的计数(非特异性背景荧光)之间的差异。

[0939] 实验规程：

[0940] ShRNA设计：使用有专利权的算法在Rosetta处设计关于小鼠PCSK9的6ShRNA序列。从核苷酸1566(NM 153565)开始的Sh2的19聚体序列是SEQ ID NO：
909，GCACATGCTTCATGTCACA，和从核苷酸2402开始的Sh6序列是SEQ ID NO：910，
GTGGCAAGAGTCCATGACA。通过整合DNA技术合成ShRNA盒的正向和反向寡核苷酸。

[0941] Sh2：

[0942] 正向：

[0943] ATCCCCGCACATGCTTCATGTCACATTCAAGAGATGTGACATGAAGCATGTGCTTTTTGGA(SEQ IDNO：605)

[0944] 反向：

[0945] AGCTTCCAAAAAGCACATGCTTCATGTCACATCTCTTGAATGTGACATGAAGCATGTGCGGG(SEQ IDNO：606)

[0946] Sh6：

[0947] 正向：

[0948] GATCCCCGTGGCAAGAGTCCATGACATTCAAGAGATGTCATGGACTCTTGCCACTTTTTGGA(SEQ IDNO：607)

[0949] 反向：

[0950] AGCTTCCAAAAAGTGGCAAGAGTCCATGACATCTCTTGAATGTCATGGACTCTTGCCACGGG(SEQ IDNO：608)

[0951] ShRNA质粒产生和筛选：使ShRNA盒的正向和反向寡核苷酸退火，且连接到包含人H1启动子的Gateway进入载体pENTR1AH1内。为了评估这些ShRNAs在体内的效力，使
用Lipofectamine 2000转染试剂将6种pENTR1SH1-PCSK9ShRNA质粒转染到小鼠肝癌细胞
Hepa1-6内，并且在转染后48小时收获细胞。制备总RNA用于实时PCR分析。相对mRNA表
达水平针对β肌动蛋白的表达进行标准化。关于小鼠PCSK9和βACTB的taqman引物和
探针组购自AppliedBiosystems。

[0952] 重组腺病毒制备和体外击倒证实：为了产生表达关于mPCSK9的ShRNAs的重组腺病毒载体，将所选择的mPCSK9Sh2和Sh6重组到基于Gateway的pAd-Block-iT DEST载体
(Invitrogen，Carlsbad，CA)内。在HEK293细胞中生产重组腺病毒，且通过2轮CsCl密度
梯度超速离心进行纯化。纯化的病毒通过透析进行脱盐，并且经过CentriPrepYM-50柱进
行浓缩，且在使用前贮藏于-80℃。为了证实Ad-mPCSK9Sh2和Ad-mPCSK9Sh6在体外在mRNA
水平上用于下调PCSK9，用2种ShRNA腺病毒以不同MOIs(感染复数)转导Hepa 1-6细胞，
并且在转导后72小时收获细胞用于下游总RNA分离和实时PCR分析。

[0953] 动物规程：这项研究中使用的所有动物规程得到Merck InstitutionalAnimalcare and Use Committee的批准。雄性C57BL6小鼠购自TaconicFarm，并且个别豢养。在
研究开始时将9周大的小鼠分成相等平均体重的实验组。经由尾静脉以溶于100ul盐水的
终体积的2.5×109PFU/小鼠Ad-Cont、Ad-PCSK9Sh2或Ad-PCSK9Sh6注射小鼠。注射后4
和8天测量体重和食物摄取。在注射后第4天和第8天时，在饲喂条件下对动物实施安死
术用于血液和组织收集。

[0954] LDL测量：来自这项研究中的小鼠的新鲜血浆用脂肪酶抑制剂进行处理，通过0.65uM过滤管进行过滤，且然后应用于RoboFLAN，FPLC分析仪。参考图32，将在pENTR1AH1
载体中的6种PCSK9 ShRNA转染到内源性表达小鼠PCSK9的Hepa 1-6细胞内。包含H1启
动子和终止序列的pENTR1A载体用作载体对照。通过实时PCR分析测定6种PCSK9 ShRNA
在击倒PCSK9中的功效。如所示的，如通过实时PCR分析测定的，相对于对照，mPCSK9Sh2和
mPCSK9Sh6使PCSK9mRNA表达水平下调约80％。数据点表示平均值±SD(n＝3)。

[0955] 参考图33，将Ad-PCSK9Sh2和Ad-PCSK9Sh6以不同MOIs转导到Hepa1-6细胞内，以证实腺病毒介导的ShRNA击倒的功效。注射后72小时，收获细胞且实施实时PCR分析。
PCSK9Sh2和Sh6以病毒剂量依赖性方式减少PCSK9 mRNA。在MOI 400时，Ad-PCSK9sh2和
Ad-PCSK9Sh6使PCSK9 mRNA减少～90％。数据点表示平均值±SD(n＝4)。

[0956] 为了评估PCSK9抑制在肝中的作用，将表达对照载体、PCSK9Sh2或PCSK9sh6的重组腺病毒载体静脉内注射到雄性C57/BL6小鼠内。在文献中已充分证明通过这种方法腺
病毒介导的表达是肝特异性的(Zinn等人Gene Ther.1998，5：798；Dentin等人Diabetes
2006，55：2159；Ragozin等人Arterioscler Thromb Vasc Biol.2005，25：1433)。

[0957] 参考图34，用表达PCSK9 Sh2、PCSK9 Sh9或空载体的2.5×109pfu重组腺病毒注射C57BL/6小鼠。注射后4天和8天，在饲喂条件下对动物实施安死术用于血液和组织收
集。

[0958] 如图34A中所示，注射后4天，PCSK9水平经由Ad-PCSK9Sh2减少约55％，且经由Ad-PCSK9-Sh6减少约65％。注射后8天，PCSK9水平经由Ad-PCSK9Sh2减少约～50％，且
经由Ad-PCSK9-Sh6减少约～65％。数据点表示平均值±SD(n＝5)。

[0959] 参考图34B，通过RoboFlan测量小鼠血浆的脂蛋白概况。用表达PCSK9 Sh2或Sh6的腺病毒处理的小鼠中的LDL水平类似于腺病毒对照组。转导后8天，PCSK9经由
Ad-PCSK9ShRNA6的肝击倒导致LDL约80％的减少，而在用表达PCSK9Sh2的腺病毒处理的
小鼠中未观察到LDL水平的改变。数据点表示平均值±SEM(n＝5)。尽管不希望受任何假
设束缚，但认为在第8天时用表达PCSK9Sh2和Sh6的腺病毒处理的小鼠之间的LDL水平差
异可以通过在mRNA水平上的击倒差异得到部分解释。

[0960] 参考图35图例，在腺病毒转导后第4天和第8天时监控体重和食物摄取。如所示的，在注射后第4天和第8天时与用对照腺病毒处理的小鼠相比较，在用表达PCSK9sh2或
PCSK9sh6的腺病毒处理的小鼠中未观察到体重和食物摄取(未显示)中的统计学上显著的
改变。数据点表示平均值±SEM(n＝5)。

[0961] shRNA构建体序列的概括：

[0962] SEQ ID NO：597-shRNA构建体/双链体#1的有义链。

[0963] SEQ ID NO：598-与PCSK9mRNA的部分互补的shRNA构建体/双链体#1的反义链。

[0964] SEQ ID NO：599-shRNA构建体/双链体#2的有义链。

[0965] SEQ ID NO：600-与PCSK9mRNA的部分互补的shRNA构建体/双链体#2的反义链。

[0966] SEQ ID NO：601-shRNA构建体/双链体#3的有义链。

[0967] SEQ ID NO：60-与PCSK9mRNA的部分互补的shRNA构建体/双链体#3的反义链。

[0968] SEQ ID NO：603-氨基酸序列-由通过本发明的RNAi构建体靶向的PCSK9mRNA编码的人PCSK9。

[0969] SEQ ID NO：604-编码如SEQ ID NO：597中所示的氨基酸序列的mRNA序列。

[0970] SEQ ID NO：605-关于PCSK9-sh2的正向寡核苷酸(由Genbank登记号NM 153565产生)。

[0971] SEQ ID NO：606-关于PCSK9-sh2的反向寡核苷酸(由Genbank登记号NM 153565产生)。

[0972] SEQ ID NO：607-关于PCSK9-sh6的正向寡核苷酸(由Genbank登记号NM 153565产生)。

[0973] SEQ ID NO：608-关于PCSK9-sh6的反向寡核苷酸(由Genbank登记号NM 153565产生)。

[0974] 实施例10：适应症

[0975] 可以与基因表达调节相关的具体状况和疾病状态包括但不限于，如本文描述的或本领域其他方面已知的代谢和心血管疾病、状况或病症，以及与细胞或组织中的靶(例如，
靶PCSK9蛋白质或靶PCSK9多核苷酸)水平相关或将对所述细胞或组织中的靶水平反应的
任何其他疾病、状况或病症，单独或与其他疗法组合。此种疾病和状况的非限制性例子包括
高胆固醇血症、脂血异常、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病(例如，I型和/或II型糖尿病)、胰岛素抵抗和/或肥胖和/或代谢综合征、I型高脂蛋白血症、II型高脂蛋白
血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症、V型高脂蛋白血症、继发性高甘油三酯血
症和家族性卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症；和心血管疾病，例如冠心病(CHD)、脑血管病
(CVD)、主动脉瓣狭窄、外周血管病、动脉粥样硬化、动脉硬化、心肌梗死(心脏病发作)、脑血管病(中风)、短暂性缺血发作(TIA)、心绞痛(稳定型和不稳定型)、心房颤动、心律失
常、瓣膜病、和/或充血性心力衰竭，或者与细胞或组织中的PCSK9水平相关或将对细胞或
组织中的PCSK9水平反应的任何其他性状、疾病或状况，单独或与其他疗法组合。

[0976] 可以与本发明的RNAi构建体组合使用的化合物的非限制性例子包括但不限于抑制素(例如，阿伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀)，其他PCSK9抑制剂，例如torcetrapib和JTT-705，以及抗高血压剂，例如α1-肾上腺素能拮抗剂(例如哌唑嗪)、
β-肾上腺素能拮抗剂(例如普萘洛尔、纳多洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔)，组合的α/β肾上腺素能拮抗剂(例如拉贝洛尔)，肾上腺素能神经元阻滞剂(例如，胍乙啶、利血
平)，CNS-作用抗高血压剂(例如，可乐定、甲基多巴、胍那苄)，抗血管紧张素II试剂，包括血管紧张素转变酶(ACE)抑制剂(例如，卡托普利、依那普利、赖诺普利)和血管紧张素II
受体拮抗剂(例如氯沙坦)，钙通道阻断剂(例如，维拉帕米、地尔硫 、硝苯地平)，利尿药
(例如，氢氯噻嗪、Fhlorthalidone、呋塞米、氨苯蝶啶)和直接的血管舒张剂(例如肼屈嗪、米诺地尔、肼屈嗪、硝普钠、二氮嗪)及其组合。上文化合物列表是可以与本发明的RNAi构
建体(例如RNAi构建体)组合或结合使用的化合物和/或方法的非限制性例子，用于预防
或治疗本文的性状、疾病和病症。本领域技术人员将认识到其他药物化合物和疗法类似地
可以与本发明的RNAi构建体(例如RNAi构建体)容易地组合，并且因此在本发明的范围
内。

[0977] 实施例11：干扰素

[0978] 干扰素代表可以与本发明的siNA分子结合用于治疗本文描述的疾病和/或状况的一类化合物的非限制性例子。I型干扰素(IFN)是一类天然细胞因子，其包括超
过25种IFN-α(Pesta，1986，Methods Enzymol.119，3-14)以及IFN-β和IFN-ω的家
族。尽管在进化上衍生自相同基因(Diaz等人，1994，Genomics 22，540-552)，但这些分
子的基本序列中存在许多差异，从而暗示生物活性中的进化趋异。所有I型IFN共享从
IFN与细胞表面受体的结合开始的生物学效应的共同模式(Pfeffer和Strulovici，1992，
Transmembrane secondary messengers forIFN-α/β.In：Interferon.Principles and
Medical Applications.，S.Baron，D.H.Coopenhaver，F.Dianzani，W.R.Fleischmann Jr.，T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.J.Stanton和S.K.Tyring，编辑151-160)。
结合随后为酪氨酸激酶包括Janus酪氨酸激酶和STAT蛋白质的活化，这导致几种IFN刺
激的基因产物的产生(Johnson等人，1994，Sci.Am.270，68-75)。IFN刺激的基因产物负
责I型IFN的多效性(pleotropic)生物学效应，包括抗病毒、抗增殖和免疫调谐效应、细
胞因子诱导、以及HLAI类和II类调节(Pestka等人，1987，Annu.Rev.Biochem 56，727)。
IFN刺激的基因产物的例子包括2-5-寡腺苷酸合成酶(2-5OAS)、β2-微球蛋白、新蝶呤、
p68激酶、和Mx蛋白质(Chebath和Revel，1992，The 2-5A system：2-5A synthetase，
isospecies and functions.In：Interferon.Principles and Medical Applications，
S.Baron，D.H.Coopenhaver，F.Dianzani，W.R.Jr.Fleischmann，T.K.Jr Hughes，
G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.J.Stanton和 S.K.Tyring，编 辑，第225-236 页；Samuel，
1992，The RNA-dependent P1/eIF-2αprotein kinase.In：Interferon.Principles and
Medical Applications.S.Baron，D.H.Coopenhaver，F.Dianzani，W.R.Fleischmann Jr.，
T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.H.Stanton和S.K.Tyring，编辑237-250；
Horisberger，1992，MX protein：function and Mechanism of Action.In：Interferon.
Principles and Medical Applications.S.Baron，D.H.Coopenhaver，F.Dianzani，
W.R.Fleischmann Jr.，T.K.Hughes Jr.，G.R.Kimpel，D.W.Niesel，G.H.Stanton 和
S.K.Tyring，编辑215-224)。尽管所有I型IFN具有类似的生物学效应，但并非所有活性都
由每种I型IFN共享，且在许多情况下，对于每种IFN亚型活性程度相当大量地改变(Fish
等人，1989，J.Interferon Res.9，97-114；Ozes等人，1992，J.Interferon Res.12，55-59)。
更具体而言，深入IFN-α的不同亚型和IFN-α的分子杂种性质之中的研究已显示出药理
学性质中的差异(Rubinstein，1987，J.Interferon Res.7，545-551)。这些药理学差异可
以起于少至3个氨基酸残基变化(Lee等人，1982，Cancer Res.42，1312-1316)。

[0979] 85-166个氨基酸在已知的IFN-α亚型中是保守的。除去IFN-α假基因，存在约25个已知的不同IFN-α亚型。这些非等位基因亚型的逐对比较显示出2％-23％的基本序
列差异。除了天然存在的IFNs外，称为共有干扰素(CIFN)的非天然重组I型干扰素已作
为治疗化合物合成(Tong等人，1997，Hepatology 26，747-754)。

[0980] 干扰素目前用于至少12种不同的适应症，包括传染病和自身免疫疾病以及癌症(Borden，1992，N.Engl.J.Med.326，1491-1492)。对于自身免疫疾病，IFN已用于治疗类风
湿性关节炎、多发性硬化和Crohn氏病。对于癌症治疗，IFN已单独或与许多不同化合物组
合使用。IFN已用于其的癌症的具体类型包括鳞状细胞癌、黑素瘤、肾上腺样瘤、血管瘤、毛细胞性白血病和卡波西肉瘤。在传染病治疗中，IFNs增加巨噬细胞的吞噬活性和淋巴细
胞的细胞毒性且抑制细胞病原体的繁殖。IFN已用作关于其的治疗的具体适应症包括乙型
肝炎、人乳头瘤病毒6和11型(即生殖器疣)(Leventhal等人，1991，N Engl J Med 325，
613-617)、慢性肉芽肿病和丙型肝炎病毒。

[0981] 在慢性HCV感染治疗中使用IFN-α的众多良好控制的临床试验已证实到6个月的治疗结束时，每周治疗3次导致约50％(范围40％-70％)患者中的血清ALT值降
低(Davis等人，1989，N.Engl.J.Med.321，1501-1506；Marcellin等人，1991，Hepatology
13，393-397；Tong 等 人，1997，Hepatology 26，747-754；Tong 等 人，Hepatology 26，
1640-1645)。然而，干扰素治疗停止后，约50％的响应患者复发，从而如通过约20-25％的
血清ALT浓度的标准化评估的，导致“持久的”应答率。此外，已使用HCV RNA值中的改变
作为临床终点检查6个月的1型干扰素治疗的研究已证实最高达35％的患者到治疗结束时
将具有HCV RNA的丧失(Tong等人，1997，同上)。然而，与ALT终点一样，约50％的患者在
治疗停止后6个月复发，从而导致仅12％的持久病毒学应答(23)。已检查48周治疗的研
究已证实持续病毒学应答最高达25％。

[0982] 聚乙二醇化(Pegylated)干扰素，即与聚乙二醇(PEG)缀合的干扰素已证实超过干扰素的改善特征。由PEG缀合造成的优点可以包括与缺乏PEG的干扰素相比较改善的药
物代谢动力学概况，从而给予更方便的给药方案、改善的耐受和改善的抗病毒功效。此种改
善已在聚乙二醇干扰素α-2a(PEGASYS，Roche)和聚乙二醇干扰素α-2b(VIRAFERON PEG，
PEG-INTRON，Enzon/Schering Plough)的临床研究中得到证实。

[0983] 实施例12：靶RNA表达的多功能siNA抑制

[0984] 多功能siNA设计

[0985] 一旦已鉴定关于多功能siNA构建体的靶位点，就设计具有长度例如约18个-约28个核苷酸的互补区的siNA的每条链，所述互补区与不同靶核酸序列互补。设计具有约4
个-约22个核苷酸的邻近侧翼区的每个互补区，所述侧翼区与靶序列不互补，但包含与另
一种序列的互补区的互补性(参见例如图16)。可以同样地设计发夹构建体(参见例如图
17)。在不同靶核酸序列之间共享的互补、回文或重复序列的鉴定可以用于缩短多功能siNA
构建体的总体长度(参见例如图18和19)。

[0986] 在非限制性例子中，呈现了另外3类另外的多功能siNA设计，其允许单个siNA分子沉默多个靶。第一种方法利用接头以直接方式连接siNAs(或多功能siNAs)。这可以允
许连接最有效的siNAs，而不产生有可能触发干扰素应答的长的、连续RNA段。第二种方法
是重叠的或连接的多功能设计的树状聚体延伸；或可替代地siNA以超分子形式的组织。第
三种方法使用长度超过30个碱基对的螺旋。这些siNAs经由切酶加工将揭示新的、活性
5′反义末端。因此，长siNAs可以靶向由原始5′末端限定的位点和由新末端限定的那些，
所述新末端由切酶加工产生。当与常规多功能siNAs(其中有义和反义链各自限定1个靶)
组合时，该方法可以用于例如靶向4个或更多位点。

[0987] I.栓系的双功能siNAs

[0988] 基本想法是设计其中2条反义siNA链与单条有义链退火的多功能siNAs的新方法。有义链寡核苷酸包含接头(例如，如本文所描述的非核苷酸接头)和与反义siNA链退
火的2个片段(参见图22)。接头还可以任选包含基于核苷酸的接头。关于这种方法的几
个潜在优点和变化包括但不限于：

[0989] 1.2个反义siNAs是独立的。因此，靶位点的选择不受关于2个位点之间的序列保守的需求的约束。可以组合任何2个高活性siNAs以形成多功能siNA。

[0990] 2.当与具有同源性的靶位点组合使用时，靶向存在于2种基因(例如，不同同工型)中的序列的siNAs，该设计可以用于靶向超过2个位点。单个多功能siNA可以例如用
于靶向2种不同靶RNAs的RNA。

[0991] 3.使用有义和反义链以靶向基因的多功能siNAs也可以掺入栓系的多功能设计内。这使得展现用单个复合物靶向6个或更多位点的可能性。

[0992] 4.可能使超过2个反义链siNAs与单个栓系的有义链退火。

[0993] 5.该设计避免了长的连续dsRNA段。因此，不太可能起始干扰素应答。

[0994] 6.接头(或与其附着的修饰，例如本文描述的缀合物)可以改善复合物的药物代谢动力学性质或改善其掺入脂质体内。对接头引入的修饰不应影响siNA活性至如果它们
与siNA直接附着而具有的相同程度(参见例如图27和28)。

[0995] 7.有义链可以延长超过退火的反义链，以提供用于附着缀合物的另外位点。

[0996] 8.复合物的极性可以这样转变，从而使得2个反义3′末端邻近接头，且5′末端远离接头或其组合。

[0997] 树状聚体和超分子siNAs

[0998] 在树状聚体siNA方法中，siNA的合成通过首先合成树状聚体模板起始，随后为附着各种功能siNAs。各种构建体在图23中描述。可以附着的功能siNAs的数目仅受使用的
树状聚体的尺寸限制。

[0999] 关于多功能siNA的超分子方法

[1000] 超分子形式简化了树状聚体合成的挑战。在这种形式中，siNA链通过标准RNA化学合成，随后为各种互补链的退火。个别链合成在5′-末端处包含1个siNA的反义有义
序列，随后为核酸或合成接头，例如六乙二醇(hexaethyleneglyol)，其依次随后为以5′
至3′方向的另一个siNA的有义链。因此，siNA链的合成可以以标准3′至5′方向进行。
三功能和四功能siNAs的代表性例子在图24中描述。基于相似原则，可以设计更高功能性
的siNA构建体，只要达到各种链的有效退火。

[1001] 切酶允许的多功能siNA

[1002] 使用多重靶的生物信息学分析，可以鉴定长度约2个-约14个核苷酸的不同靶序列之间共享的相同序列段。这些相同区域可以设计成延长的siNA螺旋(例如，＞30个碱
基对)，从而使得经由切酶的加工揭示次级功能5′-反义位点(参见例如图25)。例如，当
siNA反义链(例如，具有3′-TT突出端的双链体中的21核苷酸链)的前17个核苷酸与
靶RNA互补时，在25nM时观察到强沉默。以相同形式由仅16核苷酸的互补性观察到80％
的沉默。

[1003] 将这种性质掺入约30个-40个或更多碱基对的siNAs设计内导致另外的多功能siNA构建体。图25中的例子举例说明了30碱基对双链体在经由切酶-RNA酶III加工后
如何能够靶向3个不同序列；这些序列可以在相同的mRNA或分开的RNAs上，例如病毒和宿
主因子信使，或沿着给定途径(例如，炎症级联)的多重点。此外，40碱基对双链体可以组
合串联双功能设计，以提供靶向4个靶序列的单个双链体。更加广泛的方法可以包括使用
同源序列以使得对于1个多功能双链体能够沉默5或6个靶。图25中的例子举例说明了
如何能够达到这点。30碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成22和8碱基对产物(8b.
p.片段未显示)。为了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。显示了3个
靶向序列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。要求亲本30b.p.siNA的N’s的2’-OH
位置的位点以使切酶切割成为可能，如果这在稳定化学中进行测试的话。应当指出30聚体
双链体经由切酶RNA酶III的加工不产生精确的22+8切割，而是产生一系列紧密相关的产
物(其中22+8是主要位点)。因此，经由切酶的加工将产生一系列活性siNAs。另一个非限
制性例子显示于图26中。40碱基对双链体经由切酶从任一末端切割成20碱基对产物。为
了易于呈现，由切酶产生的突出端未显示-但可以被补偿。以4种颜色-蓝色、浅蓝色以及
红色和橙色显示了4个靶向序列。重叠的所需序列同一性由灰色框指出。这种设计形式可
以延伸至较大的RNAs。如果化学稳定的siNAs由切酶结合，那么策略上定位的核糖核苷酸
键可以使设计者切割产物成为可能，其允许更广泛的多功能设计谱。例如不限于约22-核
苷酸的切酶标准的切割产物可以允许多功能siNA构建体具有例如约3个-约15个核苷酸
的靶序列同一性重叠。

[1004] 实施例13：诊断用途

[1005] 本发明的siNA分子可以在多种诊断应用中使用，例如在多种应用中的分子靶(例如，RNA)的鉴定中，例如在临床、工业、环境、农业和/或研究背景中。siNA分子的此种诊断用途涉及利用重构的RNAi系统，例如使用细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物。本发明的
siNA分子可以用作诊断工具，以检查在患病细胞内的遗传漂变和突变，或检测内源或外源
例如病毒RNA在细胞中的存在。siNA活性和靶RNA的结构之间的紧密关联允许检测分子的
任何区域中的突变，所述突变改变靶RNA的碱基配对和三维结构。通过使用在本发明中描
述的多重siNA分子，人们可以对核苷酸变化作图，这对于体外以及细胞和组织中的RNA结
构和功能是重要的。用siNA分子切割靶RNAs可以用于抑制基因表达，且限定特定基因产
物在疾病或感染进展中的作用。以这种方式，其他遗传靶可以定义为疾病的重要介质。通
过提供组合疗法(例如，靶向不同基因的多重siNA分子、与已知小分子抑制剂偶联的siNA
分子、或使用siNA分子和/或其他化学或生物分子组合的间歇疗法)的可能性，这些实验
将导致疾病进展的更佳治疗。本发明的siNA分子的其他体外用途是本领域众所周知的，且
包括与疾病、感染或相关状况相关的mRNAs存在的检测。此种RNA通过测定在用siNA治疗
后切割产物的存在进行检测，其中使用标准方法例如荧光共振发射转移(FRET)。

[1006] 在具体例子中，对于测定使用仅切割野生型或突变型靶RNA的siNA分子。第一种siNA分子(即，仅切割野生型靶RNA的那些)用于鉴定样品中存在的野生型RNA，且第二种
siNA分子(即，仅切割突变型靶RNA的那些)用于鉴定样品中的突变型RNA。作为反应对
照，野生型和突变RNA的合成底物由2种siNA分子进行切割，以证实在反应和不存在“非靶
向的”RNA种类切割的情况下的相对siNA有效性。来自合成底物的切割产物也用于产生大
小标记，用于分析样品群体中的野生型和突变RNAs。因此，每次分析需要2种siNA分子、2
种底物和1种未知样品，其组合成6种反应。使用RNA酶保护测定确定切割产物的存在，从
而使得每种RNA的全长和切割片段可以在聚丙烯酰胺凝胶的1个泳道中进行分析。并非绝
对需要定量结果，以了解突变RNAs的表达和靶细胞中所需表型改变的推定危险。其蛋白质
产物牵涉于表型(即，疾病相关或感染相关的)发展的mRNA的表达足以确定危险。如果对
于2种转录物使用可比较比活性的探针，那么RNA水平的定性比较是足够的且减少初次诊
断的成本。较高的突变型与野生型比与较高的危险相关，无论RNA水平进行定性还是定量
比较。

[1007] 本发明的siNA构建体可以在多种诊断应用中使用，例如在多种应用中的分子靶(例如，RNA)的鉴定中，例如在临床、工业、环境、农业和/或研究背景中。siNA构建体的此
种诊断用途涉及利用重构的RNAi系统，例如使用细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物。本
发明的siNA构建体可以用作诊断工具，以检查在患病细胞内的遗传漂变和突变，或检测内
源或外源例如病毒RNA在细胞中的存在。RNAi构建体活性和靶RNA的结构之间的紧密关
联允许检测分子的任何区域中的突变，所述突变改变靶RNA的碱基配对和三维结构。通过
使用在本发明中描述的多重RNAi构建体，人们可以对核苷酸变化作图，这对于体外以及细
胞和组织中的RNA结构和功能是重要的。用RNAi构建体切割靶RNAs可以用于抑制基因表
达，且限定特定基因产物在疾病或感染进展中的作用。以这种方式，其他遗传靶可以定义为
疾病的重要介质。通过提供组合疗法(例如，靶向不同基因的多重RNAi构建体、与已知小
分子抑制剂偶联的RNAi构建体、或使用RNAi构建体和/或其他化学或生物分子组合的间
歇疗法)的可能性，这些实验将导致疾病进展的更佳治疗。本发明的RNAi构建体的其他体
外用途是本领域众所周知的，且包括与疾病、感染或相关状况相关的mRNAs存在的检测。此
种RNA通过测定在用RNAi构建体治疗后切割产物的存在进行检测，其中使用标准方法例如
荧光共振发射转移(FRET)。

[1008] 在具体例子中，对于测定使用仅切割野生型或突变型靶RNA的RNAi构建体。第一种RNAi构建体(即，仅切割野生型靶RNA的那些)用于鉴定样品中存在的野生型RNA，且第
二种RNAi构建体(即，仅切割突变型靶RNA的那些)用于鉴定样品中的突变型RNA。作为
反应对照，野生型和突变PCSK9 RNA的合成底物由2种RNAi构建体进行切割，以证实在反
应和不存在“非靶向的”RNA种类切割的情况下的相对RNAi构建体有效性。来自合成底物
的切割产物也用于产生大小标记，用于分析样品群体中的野生型和突变RNAs。因此，每次分
析需要2种RNAi构建体、2种底物和1种未知样品，其组合成6种反应。使用RNA酶保护
测定确定切割产物的存在，从而使得每种RNA的全长和切割片段可以在聚丙烯酰胺凝胶的
1个泳道中进行分析。并非绝对需要定量结果，以了解突变RNAs的表达和靶细胞中所需表
型改变的推定危险。其蛋白质产物牵涉于表型(即，疾病相关或感染相关的)发展的mRNA
的表达足以确定危险。如果对于2种转录物使用可比较比活性的探针，那么RNA水平的定
性比较是足够的且减少初次诊断的成本。较高的突变型与野生型比与较高的危险相关，无
论RNA水平进行定性还是定量比较。

[1009] 本说明书中提及的所有专利和出版物是本发明所属领域技术人员的技术水平的指示。本公开内容中引用的所有参考文献引入作为参考，其程度如同每个参考文献已个别
地整体引入作为参考一样。

[1010] 技术人员应当理解本发明非常适合于执行目标且获得提及的目标和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不
意欲作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是可想到
的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。

[1011] 在不背离本发明的范围和精神的情况下，可对本文公开的本发明进行各种替换和修饰，这对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，此种另外的实施方案在本发明和随后
权利要求的范围内。本发明教导本领域技术人员测试本文描述的化学修饰的各种组合和/
或替换，以产生具有用于介导RNAi活性的改善活性的核酸构建体。此种改善的活性可以包
含改善的稳定性、改善的生物利用率、和/或介导RNAi的细胞应答的改善的活化。因此，本
文描述的具体实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员可易于理解无需过度实验即可
测试本文描述的修饰的具体组合，以鉴定具有改善的RNAi活性的siNA分子。

[1012] 本文举例说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下适当地进行实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语
“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个可以用另2个术语中的任一替换。已使用的术语和表达用作描述性而非限制性的术语，并且在此种术语和表达的
使用中不意欲排除所显示和所描述的特征的任何等价物或其部分，但应认识到在本发明要
求保护的范围内的各种修饰是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案具
体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开概念的任选特征、修饰和变化，并且此种修饰
和变化视为在如由说明书和附加权利要求限定的本发明范围内。

[1013] 此外，当本发明的特征或方面按照马库什(Markush)组或可替代方案的其他分组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照马库什组或其他组的任何个别成
员或成员亚组进行描述。

[1014] 表I：PCSK9登记号

[1015] NM_174936

[1016] 智人(Homo sapiens)前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)，mRNA

[1017] gi|31317306|ref|NM_174936.2|[31317306]

[1018] (SEQ ID NO：597)

[1019] cagcgacguc gaggcgcuca ugguugcagg cgggcgccgc cguucaguuc agggucugag

[1020] ccuggaggag ugagccaggc agugagacug gcucgggcgg gccgggacgc gucguugcag

[1021] cagcggcucc cagcucccag ccaggauucc gcgcgccccu ucacgcgccc ugcuccugaa

[1022] cuucagcucc ugcacagucc uccccaccgc aaggcucaag gcgccgccgg cguggaccgc

[1023] gcacggccuc uaggucuccu cgccaggaca gcaaccucuc cccuggcccu caugggcacc

[1024] gucagcucca ggcgguccug guggccgcug ccacugcugc ugcugcugcu gcugcuccug

[1025] ggucccgcgg gcgcccgugc gcaggaggac gaggacggcg acuacgagga gcuggugcua

[1026] gccuugcguu ccgaggagga cggccuggcc gaagcacccg agcacggaac cacagccacc

[1027] uuccaccgcu gcgccaagga uccguggagg uugccuggca ccuacguggu ggugcugaag

[1028] gaggagaccc accucucgca gucagagcgc acugcccgcc gccugcaggc ccaggcugcc

[1029] cgccggggau accucaccaa gauccugcau gucuuccaug gccuucuucc uggcuuccug

[1030] gugaagauga guggcgaccu gcuggagcug gccuugaagu ugccccaugu cgacuacauc

[1031] gaggaggacu ccucugucuu ugcccagagc aucccgugga accuggagcg gauuaccccu

[1032] ccacgguacc gggcggauga auaccagccc cccgacggag gcagccuggu ggagguguau

[1033] cuccuagaca ccagcauaca gagugaccac cgggaaaucg agggcagggu cauggucacc

[1034] gacuucgaga augugcccga ggaggacggg acccgcuucc acagacaggc cagcaagugu

[1035] gacagucaug gcacccaccu ggcaggggug gucagcggcc gggaugccgg cguggccaag

[1036] ggugccagca ugcgcagccu gcgcgugcuc aacugccaag ggaagggcac gguuagcggc

[1037] acccucauag gccuggaguu uauucggaaa agccagcugg uccagccugu ggggccacug

[1038] guggugcugc ugccccuggc ggguggguac agccgcgucc ucaacgccgc cugccagcgc

[1039] cuggcgaggg cuggggucgu gcuggucacc gcugccggca acuuccggga cgaugccugc

[1040] cucuacuccc cagccucagc ucccgagguc aucacaguug gggccaccaa ugcccaagac

[1041] cagccgguga cccuggggac uuuggggacc aacuuuggcc gcugugugga ccucuuugcc

[1042] ccaggggagg acaucauugg ugccuccagc gacugcagca ccugcuuugu gucacagagu

[1043] gggacaucac aggcugcugc ccacguggcu ggcauugcag ccaugaugcu gucugccgag

[1044] ccggagcuca cccuggccga guugaggcag agacugaucc acuucucugc caaagauguc

[1045] aucaaugagg ccugguuccc ugaggaccag cggguacuga cccccaaccu gguggccgcc

[1046] cugcccccca gcacccaugg ggcagguugg cagcuguuuu gcaggacugu auggucagca

[1047] cacucggggc cuacacggau ggccacagcc gucgcccgcu gcgccccaga ugaggagcug

[1048] cugagcugcu ccaguuucuc caggaguggg aagcggcggg gcgagcgcau ggaggcccaa

[1049] gggggcaagc uggucugccg ggcccacaac gcuuuugggg gugagggugu cuacgccauu

[1050] gccaggugcu gccugcuacc ccaggccaac ugcagcgucc acacagcucc accagcugag

[1051] gccagcaugg ggacccgugu ccacugccac caacagggcc acguccucac aggcugcagc

[1052] ucccacuggg agguggagga ccuuggcacc cacaagccgc cugugcugag gccacgaggu

[1053] cagcccaacc agugcguggg ccacagggag gccagcaucc acgcuuccug cugccaugcc

[1054] ccaggucugg aaugcaaagu caaggagcau ggaaucccgg ccccucagga gcaggugacc

[1055] guggccugcg aggagggcug gacccugacu ggcugcagug cccucccugg gaccucccac

[1056] guccuggggg ccuacgccgu agacaacacg uguguaguca ggagccggga cgucagcacu

[1057] acaggcagca ccagcgaagg ggccgugaca gccguugcca ucugcugccg gagccggcac

[1058] cuggcgcagg ccucccagga gcuccaguga cagccccauc ccaggauggg ugucugggga

[1059] gggucaaggg cuggggcuga gcuuuaaaau gguuccgacu ugucccucuc ucagcccucc

[1060] auggccuggc acgaggggau ggggaugcuu ccgccuuucc ggggcugcug gccuggcccu

[1061] ugaguggggc agccuccuug ccuggaacuc acucacucug ggugccuccu ccccaggugg

[1062] aggugccagg aagcucccuc ccucacugug gggcauuuca ccauucaaac aggucgagcu

[1063] gugcucgggu gcugccagcu gcucccaaug ugccgauguc cgugggcaga augacuuuua

[1064] uugagcucuu guuccgugcc aggcauucaa uccucagguc uccaccaagg aggcaggauu

[1065] cuucccaugg auaggggagg gggcgguagg ggcugcaggg acaaacaucg uuggggggug

[1066] agugugaaag gugcugaugg cccucaucuc cagcuaacug uggagaagcc ccugggggcu

[1067] cccugauuaa uggaggcuua gcuuucugga uggcaucuag ccagaggcug gagacaggug

[1068] cgccccuggu ggucacaggc ugugccuugg uuuccugagc caccuuuacu cugcucuaug

[1069] ccaggcugug cuagcaacac ccaaaggugg ccugcgggga gccaucaccu aggacugacu

[1070] cggcagugug caguggugca ugcacugucu cagccaaccc gcuccacuac ccggcagggu

[1071] acacauucgc accccuacuu cacagaggaa gaaaccugga accagagggg gcgugccugc

[1072] caagcucaca cagcaggaac ugagccagaa acgcagauug ggcuggcucu gaagccaagc

[1073] cucuucuuac uucacccggc ugggcuccuc auuuuuacgg guaacaguga ggcugggaag

[1074] gggaacacag accaggaagc ucggugagug auggcagaac gaugccugca ggcauggaac

[1075] uuuuuccguu aucacccagg ccugauucac uggccuggcg gagaugcuuc uaaggcaugg

[1076] ucgggggaga gggccaacaa cugucccucc uugagcacca gccccaccca agcaagcaga

[1077] cauuuaucuu uugggucugu ccucucuguu gccuuuuuac agccaacuuu ucuagaccug

[1078] uuuugcuuuu guaacuugaa gauauuuauu cuggguuuug uagcauuuuu auuaauaugg

[1079] ugacuuuuua aaauaaaaac aaacaaacgu uguccu

[1080] AK075365

[1081] 智人cDNA PSEC0052fis，克隆NT2RP2000279，与AQUALYSIN I前体(EC 3.4.21.-)弱相似

[1082] gi|22761404|dbj|AK075365.1|[22761404]

[1083] AK122717

[1084] 智人cDNA FLJ16214fis，克隆CTONG2024614，与AQUALYSIN I前体(EC 3.4.21.-)弱相似

[1085] gi|34527909|dbj|AK122717.1|[34527909]

[1086] BC042095

[1087] 智人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型，mRNA(cDNA克隆IMAGE：5767792)，部分cds

[1088] gi|27694359|gb|BC042095.1|[27694359]

[1089] AK124635

[1090] 智人cDNA FLJ42644fis，克隆BRACE3025630

[1091] gi|34530476|dbj|AK124635.1|[34530476]

[1092] AC091609

[1093] 智人染色体1克隆RP11-109I2，全序列

[1094] gi|15042908|gb|AC091609.2|[15042908]

[1095] AY829011

[1096] 智人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)基因，完全cds

[1097] gi|55925153|gb|AY829011.1|[55925153]

[1098] AL589790

[1099] 在染色体1上来自克隆GS1-118I5的人DNA序列包含关于barttin(BSND)的基因的3′末端和关于前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型的PCSK9基因的5′末端，全
序列

[1100] gi|17973948|emb|AL589790.22|[17973948]

[1101] AY415992

[1102] 智人HCM5742基因，病毒转录物(VIRTUAL TRANSCRIPT)，部分序列，基因组查询序列

[1103] gi|39771952|gb|AY415992.1|[39771952]

[1104] NM_000389

[1105] 智人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21，Cip1)(CDKN1A)，转录物变体1，mRNA

[1106] gi|17978496|ref|NM_000389.2|[17978496]

[1107] NM_078467

[1108] 智人细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21，Cip1)(CDKN1A)，转录物变体2，mRNA

[1109] gi|17978494|ref|NM_078467.1|[17978494]

[1110] NM_000384

[1111] 智人载脂蛋白B(包括Ag(x)抗原)(APOB)，mRNA

[1112] gi|105990531|ref|NM_000384.2|[105990531]

[1113] NM_002746

[1114] 智人促分裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)，转录物变体1，mRNA

[1115] gi|91718898|ref|NM_002746.2|[91718898]

[1116] NM_001040056

[1117] 智人促分裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)，转录物变体2，mRNA

[1118] gi|91718896|ref|NM_001040056.1|[91718896]

[1119] NM_138957

[1120] 智人促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，转录物变体2，mRNA

[1121] gi|75709179|ref|NM_138957.2|[75709179]

[1122] NM_002745

[1123] 智人促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，转录物变体1，mRNA

[1124] gi|75709178|ref|NM_002745.4|[75709178]

[1125] NM_001005291

[1126] 智人固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)，转录物变体1，mRNA

[1127] gi|52630418|ref|NM_001005291.1|[52630418]

[1128] NM_004176

[1129] 智人固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)，转录物变体2，mRNA

[1130] gi|52630417|ref|NM_004176.3|[52630417]

[1131] NM_005896

[1132] 智人异柠檬酸脱氢酶1(NADP+)，可溶的(IDH1)，mRNA

[1133] gi|28178824|ref|NM_005896.2|[28178824]

[1134] NM_004599

[1135] 智人固醇调节元件结合转录因子2(SREBF2)，mRNA

[1136] gi|27477112|ref|NM_004599.2|[27477112]

[1137] 1AM9H

[1138] H链，与Ldl受体启动子结合的人Srebp-1a

[1139] gi|3318717|pdb|1AM9|H[3318717]

[1140] 1AM9G

[1141] G链，与Ldl受体启动子结合的人Srebp-1a

[1142] gi|3318716|pdb|1AM9|G[3318716]

[1143] 1AM9F

[1144] F链，与Ldl受体启动子结合的人Srebp-1a

[1145] gi|3318715|pdb|1AM9|F[3318715]

[1146] 1AM9E

[1147] E链，与Ldl受体启动子结合的人Srebp-1a

[1148] gi|3318714|pdb|1AM9|E[3318714]

[1149]

[1150]

[1151]

[1152]

[1153]

[1154]

[1155]

[1156]

[1157]

[1158]

[1159]

[1160]

[1161]

[1162]

[1163] 表IV

[1164] 关于化学修饰的siNA构建体的稳定化学的非限制性例子

[1165]

[1166]

[1167]

[1168] CAP＝任何末端帽，参见例如图10。

[1169] 所有Stab 00-34化学可以包含3′-末端胸苷(TT)残基

[1170] 所有Stab 00-34化学一般包含约21个核苷酸，但可以如本文所描述的改变。

[1171] 所有Stab 00-36化学还可以包括如从反义或引导链的5′-末端测定的，在双链核酸双链体的第11个碱基配对位置处在有义或过客链中的单个核糖核苷酸(参见图6C)

[1172] S＝有义链

[1173] AS＝反义链

[1174] *Stab 23具有与3′-帽邻近的单个核糖核苷酸

[1175] *Stab 24和Stab 28具有在5′-末端处的单个核糖核苷酸

[1176] *Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 35和Stab 36具有在5′-末端处的3个核糖核苷酸

[1177] *Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34在来自5′-末端的前3个核苷酸位置处的任何嘌呤是核糖核苷酸

[1178] p＝硫代磷酸酯键

[1179] 35具有在3′-突出端处的2′-O-甲基U和在5′-末端处的3个核糖核苷酸

[1180] 36具有与靶序列互补的2′-O-甲基突出端(天然存在的突出端)和在5′-末端处的3个核糖核苷酸

[1181] 表V

[1182] A.2.5μmol合成循环ABI 394仪器

[1183]试剂 当量 量 等待时间*DNA 等待时间*2′-O-甲基 等待时间*RNA
亚磷酰胺 6.5 163μL 45秒 2.5分钟 7.5分钟
S-乙基四唑 23.8 238μL 45秒 2.5分钟 7.5分钟
乙酸酐 100 233μL 5秒 5秒 5秒
N-甲基咪唑 186 233μL 5秒 5秒 5秒
TCA 176 2.3mL 21秒 21秒 21秒
碘 11.2 1.7mL 45秒 45秒 45秒
Beaucage 12.9 645μL 100秒 300秒 300秒
乙腈 NA 6.67mL NA NA NA

[1184] B.0.2μmol合成循环ABI 394仪器

[1185]试剂 当量 量 等待时间*DNA 等待时间*2′-O-甲基 等待时间*RNA
亚磷酰胺 15 31μL 45秒 233秒 465秒
S-乙基四唑 38.7 31μL 45秒 233分钟 465秒
乙酸酐 655 124μL 5秒 5秒 5秒
N-甲基咪唑 1245 124μL 5秒 5秒 5秒
TCA 700 732μL 10秒 10秒 10秒
碘 20.6 244μL 15秒 15秒 15秒
Beaucage 7.7 232μL 100秒 300秒 300秒
乙腈 NA 2.64mL NA NA NA

[1186] C.0.2μmol合成循环96孔仪器

[1187]试剂 当量：DNA/2′-O- 量：DNA/2′-O-甲 等待时间* 等待时间* 等待时间*核
甲基/核糖 基/核糖 DNA 2′-O-甲基 糖
亚磷酰胺 22/33/66 40/60/120μL 60秒 180秒 360秒
S-乙基四唑 70/105/210 40/60/120μL 60秒 180分钟 360秒
乙酸酐 265/265/265 50/50/50μL 10秒 10秒 10秒
N-甲基咪唑 502/502/502 50/50/50μL 10秒 10秒 10秒
TCA 238/475/475 250/500/500μL 15秒 15秒 15秒
碘 6.8/6.8/6.8 80/80/80μL 30秒 30秒 30秒
Beaucage 34/51/51 80/120/120 100秒 200秒 200秒
乙腈 NA 1150/1150/1150 NA NA NA
μL

[1188] ·等待时间不包含递送期间的接触时间

[1189] ·串联合成使用接头分子的双重偶联

[1190] 表VI

[1191] 脂质纳米颗粒(LNP)制剂

[1192]制剂# 组成 摩尔比
L051 CLinDMA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG 48/40/10/2
L053 DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG 30/20/48/2
L054 DMOBA/DSPC/Chol/PEG-n-DMG 50/20/28/2
L069 CLinDMA/DSPC/胆固醇/PEG- 48/40/10/2
胆固醇
L073 pCLinDMA或CLin DMA/DMOBA/DSPC 25/25/20/28/2
/Chol/PEG-n-DMG
L077 eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 48/40/10/2
Chol
L080 eCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 48/40/10/2
DMG
L082 pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 48/40/10/2
DMG
L083 pCLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 48/40/10/2
Chol
L086 CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/2/7
DMG/亚油醇
L061 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG 52/45/3
L060 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG N/P 52/45/3
比5
L097 DMLBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG 50/20/28
L098 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比3
L099 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比4
L100 DMOBA/DOBA/3％PEG-DMG，N/P比 52/45/3
3
L101 DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇 52/45/3
L102 DMOBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇， 52/45/3
N/P比5
L103 DMLBA/胆固醇/2KPEG-胆固醇 52/45/3
L104 CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/2/7
胆固醇/亚油醇
L105 DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P 52/45/3
比2
L106 DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P 67/30/3
比3
L107 DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P 52/45/3
比1.5
L108 DMOBA/胆固醇/2KPEG-Chol，N/P 67/30/3
比2
L109 DMOBA/DSPC/胆固醇/2KPEG-Chol， 50/20/28/2
N/P比2
L110 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比1.5
L111 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 67/30/3
比1.5
L112 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比1.5
L113 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 67/30/3
比1.5
L114 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比2
L115 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 67/30/3
比2
L116 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比2
L117 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/45/3
比2
L118 LinCDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/2/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L121 2-CLIM/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG/， 48/40/10/2
N/P比3
L122 2-CLIM/胆固醇/2KPEG-DMG/，N/P 68/30/2
比3
L123 CLinDMA/DSPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/3/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L124 CLinDMA/DSPC/2KPEG- 43/36/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L130 CLinDMA/DOPC/Chol/PEG-n-DMG， 48/39/10/3
N/P比3
L131 DMLBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/43/5
比3
L132 DMOBA/胆固醇/2KPEG-DMG，N/P 52/43/5
比3
L133 CLinDMA/DOPC/Chol/PEG-n-DMG， 48/40/10/2
N/P比3
L134 CLinDMA/DOPC/Chol/PEG-n-DMG， 48/37/10/5
N/P比3
L149 COIM/DSPC/胆固醇/2KPEG-DMG/，N/P 48/40/10/2
比3
L155 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/2/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L156 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 45/43/10/2
N/P比2.85
L162 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 45/43/10/2
N/P比2.5
L163 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 45/43/10/2
N/P比2
L164 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 45/43/10/2
N/P比2.25
L165 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 40/43/15/2
N/P比2.25
L166 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 40/43/15/2
N/P比2.5
L167 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 40/43/15/2
N/P比2
L174 CLinDMA/DSPC/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/9/27/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L175 CLinDMA/DSPC/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/27/9/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L176 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2.85
L180 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2.25
L181 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG- 43/38/10/4/7
DMG/亚油醇，N/P比2
L182 CLinDMA/DOPC/胆固醇/2KPEG-DMG， 45/41/10/4
N/P比2.25

[1193]

[1194]

[1195] N/P比＝阳离子脂质和核酸之间的氮：亚磷比

[1196] 使用的2KPEG是PEG2000，一般可以从～1500到～3000Da不等的多分散性(即，其中PEG(n)为约33-约67，或平均～45)。

[1197] CLinDMA结构

[1198]

[1199] pCLinDMA结构

[1200]

[1201] eCLinDMA结构

[1202]

[1203] DEGCLinDMA结构

[1204]

[1205] PEG-n-DMG结构

[1206]

[1207] n＝约33-67，平均值＝45对于2KPEG/PEG2000

[1208] DMOBA结构

[1209]

[1210] DMLBA结构

[1211]

[1212] DOBA结构

[1213]

[1214] DSPC结构

[1215]

[1216] 胆固醇结构

[1217]

[1218] 2KPEG-胆固醇结构

[1219]

[1220] n＝约33-67，平均值＝45对于2KPEG/PEG2000

[1221] 2KPEG-DMG结构

[1222]

[1223] n＝约33-67，平均值＝45对于2KPEG/PEG2000

[1224] COIM结构

[1225]

[1226] 5-CLIM和2-CLIM结构

[1227]

[1228] 表VII

[1229]模式描述 模式# 得分
在第1位处的G或C 1 5
在第19位处的A或U 2 10
在第15-19位之间富含A/U 3 10
4Gs或4Cs串(非优选) 4 -100
在第1-5位之间富含G/C 5 10
在第18位处的A或U 6 5
在第10位处的A或U 7 10
在第13位处的G(非优选) 8 -3
在第13位处的A 9 3
在第9位处的G(非优选) 10 -3
在第9位处的A 11 3
在第14位处的A或U 12 10

[1230] 表VII：用于预测高活性siNAs的描述模式与其相对得分的Sirna算法。

[1231] 给出的所有位置是关于19聚体siNA的有义链。

[1232] 表VIII：制备流程图

[1233]

[1234] 表IX：用于siNA表征的分析法

[1235]