KATII抑制剂转让专利
申请号 : CN201180057792.0
文献号 : CN103228631B
文献日 : 2015-04-29
发明人 : A·B·杜奈 , C·J·赫拉尔 , J·B·塔特尔 , P·R·维尔霍斯特
申请人 : 辉瑞大药厂
摘要 :
本发明涉及化合物3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-甲腈,3-氨基-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，和3-氨基-1-羟基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，包括其外消旋混合物和拆分的对映异构体，其可药用盐和治疗包括人类的哺乳动物中与精神分裂症及其它精神病有关的认知缺陷、神经变性和/或神经障碍。
权利要求 :
1.式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物∶或其可药用盐。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物为∶
或其可药用盐。
3.权利要求2的化合物，其中所述化合物为式IA的化合物或其可药用盐。
4.权利要求3的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少95％ ee。
5.权利要求3的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少99％ ee。
6.权利要求1的化合物，其中所述化合物为∶
或其可药用盐。
7.权利要求6的化合物，其中所述化合物为式IIA的化合物或其可药用盐。
8.权利要求7的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少95％ ee。
9.权利要求7的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少99％ ee。
10.权利要求1的化合物，其中所述化合物为∶
或其可药用盐。
11.权利要求10的化合物，其中所述化合物为式IIIA的化合物或其可药用盐。
12.权利要求11的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少95％ ee。
13.权利要求11的化合物，其中所述化合物或其可药用盐具有至少99％ ee。
14.一种药物组合物，其包括权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐和可药用载体。
15.权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防哺乳动物中选自下述疾病的药物的应用：急性神经和精神障碍；中风；脑缺血；脊髓创伤；认知缺陷；头部创伤；围产期缺氧；心脏停搏；低血糖神经元损伤；痴呆；阿尔茨海默病；亨廷顿氏舞蹈病；肌萎缩侧索硬化；视网膜病；认知障碍；原发性及药物导致的帕金森病；肌痉挛和与肌痉挛状态相关的病症；癫痫；惊厥；偏头痛；尿失禁；物质耐受；物质戒断；精神分裂症；与精神分裂症相关的阴性症状；孤独症；双相性精神障碍；抑郁症；焦虑；情感障碍；炎性病症；脓毒症；肝硬化；与免疫应答逃避相关的癌症和/或肿瘤；三叉神经痛；听力丧失；
耳鸣；眼睛的黄斑变性；呕吐；脑水肿；迟发性运动障碍；睡眠障碍；及注意力缺陷障碍。
16.权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防哺乳动物中选自下述疾病的药物的应用：震颤；与抑郁症相关的认知缺陷；与癌治疗相关的认知缺陷；症状为注意力和/或认知不足的病症。
17.权利要求1至13中任一项的化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防哺乳动物中选自下述疾病的药物的应用：眼睛损伤；精神病；疼痛；注意力缺陷/多动病症；及行为障碍。
说明书 :
KAT II抑制剂
发明领域
[0001] 本发明涉及化合物3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-甲腈、3-氨基-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮和3-氨基-1-羟
基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，包括其外消旋混合物和拆分的对映异构体，其可药用盐及其治疗包括人类的哺乳动物中与精神分裂症及其他精神病学、神经变性和/或神经障碍有关的认知缺陷。
基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，包括其外消旋混合物和拆分的对映异构体，其可药用盐及其治疗包括人类的哺乳动物中与精神分裂症及其他精神病学、神经变性和/或神经障碍有关的认知缺陷。
[0002] 发明背景
[0003] KAT(犬尿氨酸转氨酶)II是大脑中催化犬尿氨酸转氨基化成KYNA(犬尿喹啉酸)的主要酶(E.Okuno et al.,J.Neurochem.,vol.57,533-540,1991)。KYNA是一种有效的兴奋性氨基酸(EAA)受体拮抗剂，且对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体复合物的甘氨酸调节部位具有亲和力(M.Kessler et al.,J.Neurochem.,vol.52,pp.1319-1328,1989)。作为天然存在的脑代谢物，KYNA有可能充当大脑谷氨酸能功能的负内源调节物(R.Schwarcz et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,vol.648,pp.140-153,1992)，和芳 基烃受体 的激活 剂(B.DiNatale et al.,Toxicol.Sci.vol.115,pp.89-97,2010)。
[0004] 已知EAA受体且特别是NMDA受体在哺乳动物脑机能中起着重要作用(J.C.Watkins and G.L.Collingridge,Eds.,The NMDA Receptor,Oxford University Press,Oxford,1989,p.242)。例如，NMDA受体激活是比如例如学习和记忆方面的认知过程所必需的(Watkins and Collingridge,supra,pp.137-151)。因此，通过抑制KYNA的合成酶而减少其合成可增强EAA发信号且改善认知过程，尤其是在预测到NMDA机能减退的疾病状态中。因此，需要对充当KAT II抑制剂以降低脑部内的KYNA合成从而改善人类疾病状态中的认知障碍的化合物。
[0005] 发明简述
[0006] 本发明提供3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-甲腈、3-氨基-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，和3-氨基-1-羟基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，包括其外消旋混合物和拆分的对映异构体，以及其可药用盐。为了简便起见，将讨论3(S)对映异构体，但本发明不仅涉及3(S)，而且涉及其对映异构体和外消旋混合物，包括其可药用盐。
[0007] 本发明包括化合物(3S)-3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-甲腈，其由式IA代表：
[0008]
[0009] 本发明包括化合物(3S)-3-氨基-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，其由式IIA代表：
[0010]
[0011] 本发明包括化合物(3S)-3-氨基-1-羟基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，其由式IIIA代表：
[0012]
[0013] 本发明还包括式I、式II和式III的化合物的可药用盐、水合物、溶剂化物、异构体、结晶和非结晶形式、同晶型物、多晶型物和代谢物。本发明还包括这些的所有互变异构体和立体化学异构体。
[0014] 本发明还部分地涉及用于治疗哺乳动物中的KAT II介导的病症的方法。这些病症包括与精神分裂症和其他神经变性和/或神经障碍有关的认知缺陷。所述方法包括向哺乳动物给药可治疗所述病症的有效量的式I、式II或式III的化合物、或其可药用盐。
[0015] 发明详述
[0016] 本发明的一个实施方案为式I、式IA或式IB的化合物∶
[0017] 或
[0018] 如本文使用的“本发明的化合物”包括式I、式II和式III的化合物。这样的术语也定义为包括所有形式的式I、式II和式III的化合物，包括其外消旋混合物、对映异构体、水合物、溶剂化物、异构体、结晶和非结晶形式、同晶型物、多晶型物和代谢物。
[0019] 本发明的另一个实施方案为在氨基取代的碳位置具有至少95%对映异构体过量的式IA、式IIA和式IIIA的对映异构体纯化合物。本发明的另一个方面包括在氨基取代的碳位置具有至少99%对映异构体过量(ee)的式IA、式IIA和式IIIA的对映异构体纯化合物。
[0020] 本发明的另一个实施方案为式II、式IIA或式IIB的化合物∶
[0021]或
[0022] 本发明的另一个实施方案为式III、式IIIA或式IIIB的化合物∶
[0023]或
[0024] 本发明的另一个实施方案为制备本发明的化合物的方法，包括在氨基取代的碳位置具有至少95%ee或者在氨基取代的碳位置也具有至少99%ee的式IA、IIA和IIIA的对映异构体纯化合物。
[0025] 本发明的另一个实施方案是一种制备用于治疗或预防哺乳动物中选自下述疾病的药物的方法：急性神经和精神障碍；中风；脑缺血；脊髓创伤；认知缺陷，包括轻度认知缺陷；头部创伤；围产期缺氧；心脏停搏；低血糖神经元损伤；痴呆；阿尔茨海默病；亨廷顿氏舞蹈病；肌萎缩侧索硬化；眼睛损伤；视网膜病；认知障碍；原发性及药物导致的帕金森病；肌痉挛和与肌痉挛状态相关的病症，包括震颤；癫痫；惊厥；偏头痛；尿失禁；物质耐受；物质戒断；精神病；精神分裂症；与精神分裂症相关的阴性症状；孤独症，包括孤独症谱群疾病；双相性精神障碍；抑郁症，包括但不限于严重的抑郁性障碍和抗治疗抑郁症；与抑郁症相关的认知缺陷；与癌治疗相关的认知缺陷；焦虑；情感障碍；炎性病症；脓毒症；肝硬化；
与免疫应答逃避相关的癌症和/或肿瘤；三叉神经痛；听力丧失；耳鸣；眼睛的黄斑变性；
呕吐；脑水肿；疼痛；迟发性运动障碍；睡眠障碍；注意力缺陷/多动病症；注意力缺陷障碍；包括症状为注意力和/或认知不足的病症；及行为障碍；其包括给药选自式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物。
与免疫应答逃避相关的癌症和/或肿瘤；三叉神经痛；听力丧失；耳鸣；眼睛的黄斑变性；
呕吐；脑水肿；疼痛；迟发性运动障碍；睡眠障碍；注意力缺陷/多动病症；注意力缺陷障碍；包括症状为注意力和/或认知不足的病症；及行为障碍；其包括给药选自式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物。
[0026] 本发明的另一个实施方案是用于制备治疗或预防在哺乳动物中选自下述的病症的方法：痴呆；阿尔茨海默病的认知缺陷症状；阿尔茨海默病的注意力缺陷症状；多发性脑梗塞痴呆、酒精性痴呆或其他药物相关的痴呆、与颅内肿瘤或脑外伤相关的痴呆、与亨廷顿舞蹈病或帕金森病相关的痴呆，或者AIDS相关的痴呆；谵忘；遗忘症；创伤后应激障碍；智力迟钝；学习障碍(例如，阅读障碍、数学障碍或书面表达障碍)；注意力缺陷/多动症；年龄相关性认知减退；与精神病相关的认知缺陷；或者与精神分裂症相关的认知缺陷，包括给药选自下述的化合物：式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物。
[0027] 异构体
[0028] 当式I、式II或式III的化合物(以下简称本发明的化合物)中存在不对称中心时，所述化合物可以存在光学异构体(对映异构体)形式。在一个实施方案中，本发明包括本发明的化合物的对映异构体和混合物，包括外消旋混合物。在另一个实施方案中，对于包含超过一个不对称中心的本发明的化合物，本发明包括化合物的非对映异构体形式(单独的非对映异构体及其混合物)。
[0029] 互变异构形式
[0030] 本发明包括本发明的化合物的互变异构形式。当结构异构体经由低能障可互变时，可发生互变异构同分异构现象(互变异构)。这可采用包含例如亚氨基、酮或肟基的本发明化合物的质子互变异构形式，或包含芳香部分的化合物中所谓的价互变异构形式。由此可见，单一的化合物可以呈现出多于一种类型的异构现象。固体和液体形式的互变异构体的各个比例取决于分子上的各个取代基以及分离化合物所用的特定结晶技术。
[0031] 盐
[0032] 本发明的化合物可以以源于无机酸或有机酸的盐形式使用。根据特定的化合物，化合物的盐由于该盐的一种或多种物理性质(比如在不同的温度和湿度下增强的药学稳定性，或者期望的水或油溶解度)而是有利的。在某些情况下，化合物的盐也可以作为化合物的分离、纯化和/或拆分中的助剂。
[0033] 当预期将盐向患者给药时(例如，与用于体外的情况相反)，该盐优选是可药用的。术语“可药用盐”是指通过使本发明的化合物与酸(其阴离子通常被认为适合人类消费)或碱(其阳离子通常被认为适合人类消费)组合而制备的盐。可药用盐作为本发明方法的产物特别有用，这是因为其相对于母体化合物具有更大的水溶性。为了在药物中应用，本发明化合物的盐是无毒的“可药用盐”。涵盖在术语“可药用盐”范围内的盐是指本发明化合物的无毒盐，其通常通过使游离碱与合适的有机酸或无机酸反应来制备。
[0034] 本发明化合物的合适的可药用酸加成盐在可能的情况下包括源自无机酸(比如盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硼酸、氟硼酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、碳酸、磺酸和硫酸)和有机酸(比如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、乙醇、异硫羰酸(isothionic)、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、琥珀酸、甲苯磺酸、酒石酸和三氟乙酸)的那些盐。合适的有机酸通常包括例如有机酸的脂族、环脂族、芳香族、芳族脂族(araliphatic)、杂环、羧酸和磺酸种类。
[0035] 合适的有机酸的具体实例包括乙酸、三氟乙酸、甲酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、二葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(扑酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己氨基磺酸、藻酸(algenic acid)、β-羟丁酸、半乳糖二酸、半乳糖醛酸、己二酸、藻酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊烷丙酸、十二烷基硫酸、糖庚酸(glycoheptanoate)、磷酸甘油、庚酸、己酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、palmoate、果胶酸盐、3-苯丙酸、苦味酸、特戊酸、硫氰酸、甲苯磺酸和十一酸。
[0036] 此外，当本发明化合物携带酸性部分时，其合适的可药用盐可以包括碱金属盐，即钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如钙盐或镁盐；以及与合适的有机配体形成的盐，例如，季铵盐。在另一个实施方案中，碱式盐可以由形成无毒盐的碱形成，包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐(benzathine)、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、葡甲胺、乙醇胺盐、氨基丁三醇盐和锌盐。
[0037] 有机盐可以由仲胺盐、叔胺盐或季铵盐制得，比如氨基丁三醇、二乙胺、N,N’-双苄乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡甲胺)和普鲁卡因。含碱性氮的基团可以利用下述试剂进行季铵化：比如低级烷基(C1-C6)卤化物(例如，甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(即，二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)、长链卤化物(即，癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基卤化物(即，苄基和苯乙基溴化物)等。
[0038] 在一个实施方案中，酸和碱的半盐也可以由例如半硫酸盐和半钙盐形成。
[0039] 同位素
[0040] 本发明还包括同位素标记的化合物，其与本发明的化合物中列举的那些相同，但是存在下述事实，即一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子替换。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、2 3 13 11 14 15 18 17 32 35 18 36
磷、硫、氟和氯的同位素，分别比如 H、H、C、C、C、N、O、O、P、S、F和 Cl。包含前述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明的化合物、其前体药物及所述化合物或所述前体药物的可药用盐都在本发明的范围内。本发明的某些同位素标记的化合物，例如其中
3 14
引入放射性同位素比如 H和 C的那些化合物，用于药物和/或底物组织分布测定中。氚化
3 14
即 H和碳-14即 C同位素由于其容易制备和可检测性而是特别优选的。此外，利用较重
2
同位素比如氘，即 H进行的取代可提供由于较大代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如，体内半衰期增加或剂量需求量降低，因此，该取代在一些情况下是优选的。本发明的同位素标记化合物及其前体药物一般可以通过实施在下面的方案中和/或实施例和制备中所公开的步骤、通过用易于得到的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂来制备。
磷、硫、氟和氯的同位素，分别比如 H、H、C、C、C、N、O、O、P、S、F和 Cl。包含前述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明的化合物、其前体药物及所述化合物或所述前体药物的可药用盐都在本发明的范围内。本发明的某些同位素标记的化合物，例如其中
3 14
引入放射性同位素比如 H和 C的那些化合物，用于药物和/或底物组织分布测定中。氚化
3 14
即 H和碳-14即 C同位素由于其容易制备和可检测性而是特别优选的。此外，利用较重
2
同位素比如氘，即 H进行的取代可提供由于较大代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如，体内半衰期增加或剂量需求量降低，因此，该取代在一些情况下是优选的。本发明的同位素标记化合物及其前体药物一般可以通过实施在下面的方案中和/或实施例和制备中所公开的步骤、通过用易于得到的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂来制备。
[0041] 本发明还涉及式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物的前体药物。因此，本身可能具有少量药理学活性或无药理学活性的式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物的某些衍生物当给药进入体内或给药于身体上时，通过例如水解分解能够被转化为具有期望活性的式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物。这样的衍生物被称为“前药”。关于前体药物应用的其他信息可见于Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vol.14,ACS Symposium Series(T.Higuchi and W.Stella)and Bioreversible Carriers in Drug Design,Pergamon Press,1987(Ed.E.B.Roche,AmericanPharmaceutical Association)。
[0042] 根据本发明的前药可以通过例如用本领域技术人员已知的作为“前体部分(pro-moieties)”的某些部分取代式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物中存在的适当的官能团而产生，例如如在Design of Prodrugs by H.Bundgaard(Elsevier,1985)中所述。
[0043] 根据本发明的前药的一些非限制性实例包括∶
[0044] (i)式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物包含羧酸官能团，该羧酸官能团被官能化成在式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物上的适当代谢不稳定基团(酯、氨基甲酸酯等)；
[0045] (ii)式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物包含醇官能团，该醇官能团被官能化成在式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物上的适当代谢不稳定基团(酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、缩醛、缩酮等)；
[0046] (iii)式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物包含伯氨基或仲氨基官能团或酰胺，其被官能化成在式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB化合物上的适当代谢不稳定基团，例如可水解基团(酰胺、氨基甲酸酯、脲、膦酸盐、磺酸盐等)。
[0047] 根据上述实例和其它前药类型实例的替代基团的进一步实例可以参见上述参考文献。
[0048] 而且，某些式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物本身可以充当其它式I、IA、IB、II、IIA、IIB、III、IIIA或IIIB的化合物的前药。
[0049] 给药和药量
[0050] 通常，本发明的化合物以有效治疗如本文所述病症的量给药。本发明的化合物通过任意合适的途径以适于此种途径的药物组合物的形式且以对预期治疗有效的剂量给药。治疗医学病症发展所需化合物的治疗有效剂量是本领域技术人员利用医学领域熟知的临床前及临床方法容易确定的。
[0051] 本发明的化合物可以口服给药。口服给药可以包括吞服，以便化合物进入胃肠道，或者可以采用含服或舌下给药，藉此化合物直接从口腔进入血流。
[0052] 在另一个实施方案中，本发明化合物还可以直接给药到血流中、肌肉中或者给药到内脏器官中。用于肠胃外给药的合适方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、膜内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下给药。用于肠胃外给药的合适的装置包括针状(包括显微针)注射器、无针注射器和输注技术。
[0053] 在另一个实施方案中，本发明的化合物还可以局部给药于皮肤或粘膜，即，皮肤或经皮施用。在另一个实施方案中，本发明的化合物也可以鼻内给药或通过吸入给药。在另一个实施方式中，本发明的化合物可以直肠或阴道给药。在另一个实施方案中，本发明的化合物还可以被直接给药于眼部或耳部。
[0054] 所述化合物和/或包含所述化合物的组合物的给药方案基于多种因素，其包括患者的类型、年龄、体重、性别和医学病症；病症的严重程度；给药途径；及所用的具体化合物的活性。因此，给药方案可以在很大程度上变化。约0.01mg至约100mg/kg体重/天级别的剂量水平用于治疗上述病症。在一个实施方案中，本发明化合物的日总剂量(以单次剂量或分份剂量给药)通常为约0.01至约100mg/kg。在另一个实施方案中，本发明化合物的日总剂量为约0.1至约50mg/kg，且在另一个实施方案中，为约0.5至约30mg/kg(即，mg本发明化合物/kg体重)。在一个实施方案中，剂量为0.01至10mg/kg/天。在另一个实施方案中，剂量为0.1至1.0mg/kg/天。剂量单位组合物可以包含这些量或约量以构成日剂量。在许多情况中，化合物的给药在一天重复多次(通常不超过4次)。如果需要，每日多剂量通常可用于增加日总剂量。
[0055] 对于口服给药，组合物可以是以片剂形式提供，其包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、75.0、100、125、150、175、200、250和500毫克的活性成分，以便对患者进行症状剂量调整。药物通常包含约0.01mg至约500mg的活性成分，或者在另一个实施方案中，约1mg至约100mg有效成分。在恒速输注期间，静脉内剂量范围可以为约
0.01至约10mg/kg/分钟。
0.01至约10mg/kg/分钟。
[0056] 根据本发明，合适的受试者包括哺乳动物受试对象。根据本发明，哺乳动物包括但不限于犬、猫、牛、山羊、马、绵羊、猪、啮齿类、兔类动物、灵长类等，并且包括在子宫内的哺乳动物。在一个实施方案中，人类是合适的受试者。人类受试者可以是任一性别以及可以处于发育的任意阶段。
[0057] 在制备药物中的用途
[0058] 在另一个实施方案中，本发明包括一种或多种本发明化合物在制备用于治疗本文所述病症的药物中的用途。
[0059] 药物组合物
[0060] 为治疗本文所提及的病症，本发明的化合物本身可以作为化合物施用。可选地，可药用盐适于医学应用，因为其相对于母体化合物具有更大水溶性。
[0061] 在另一个实施方案中，本发明包括药物组合物。这样的药物组合物包括本发明化合物以及可药用载体。所述载体可以是固体、液体或者二者，而且可以与所述化合物作为单位剂量组合物来配制，例如，片剂，其可包含0.05％至95％重量的活性化合物。本发明的化合物可以与作为可靶向药物载体的合适的聚合物偶联。其它药理学活性物质也可以存在。
[0062] 本发明的化合物可以通过任意合适途径给药，优选以适于此种途径的药物组合物的形式以及以对预期治疗有效的剂量给药。活性化合物和组合物例如可以口服、直肠、肠胃外或局部给药。
[0063] 固体剂量形式的口服给药例如可以以单独的单元呈现，比如，硬胶囊或软胶囊、丸剂、扁囊剂、锭剂或片剂，每种都包含预定量的至少一种本发明化合物。在另一个实施方案中，口服给药可以是粉剂或颗粒形式。在另一个实施方案中，口服剂量形式是舌下的，比如例如锭剂。在此类固体剂型中，本发明的化合物通常与一种或多种助剂结合。这样的胶囊或片剂可包含控制释放。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，剂型也可以包含缓冲剂或可以与肠溶包衣一起制备。
[0064] 在另一个实施方案中，口服给药可以是液体剂量形式。用于口服给药的液体剂型包括例如包含本领域常用的惰性稀释剂(即，水)的可药用乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。这类组合物还可以包含助剂，比如湿润剂、乳化剂、助悬剂、调味剂(例如，甜味剂)和/或芳香剂。
[0065] 在另一个实施方案中，本发明包括肠胃外剂量形式。“肠胃外给药”包括例如皮下注射、静脉注射、腹膜内、肌内注射、胸骨内注射和输注。可注射制剂(即，无菌注射水性或油性悬浮液)可以根据已知的技术利用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂配制。
[0066] 在另一个实施方案中，本发明包括局部剂量形式。“局部给药”包括例如经皮给药(比如经由透皮贴剂或离子电渗疗法装置)、眼内给药或者鼻内或吸入给药。用于局部给药的组合物还包括例如局部凝胶、喷雾剂、软膏和乳膏。局部制剂可以包括可增强有效成分经过皮肤或其他受侵袭区域的吸收或穿透的化合物。当本发明的化合物通过透皮装置给药时，给药可以利用贮药库和多孔膜型的贴片或者固体基质类型的贴片完成。用于该目的的典型制剂包括凝胶剂、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、扑粉、敷料、泡沫剂、膜剂、皮肤斑贴、糯米纸囊剂(wafers)、植入剂、海绵、纤维、绷带和微乳剂。还可以使用脂质体。典型的载体包括醇、水、矿物油、液体石蜡、白矿脂、甘油、聚乙二醇和丙二醇。可以引入渗透促进剂-参见例如J Pharm Sci,88(10),955-958,by Finnin and Morgan(October1999)。
[0067] 适合局部给药至眼的制剂包括例如滴眼剂，其中本发明的化合物被溶解或悬浮在合适的载体中。适用于眼部或耳部给药的典型制剂可以是微粉化悬浮液滴剂形式或者可以是等渗、pH-经调整的无菌盐水中的溶液的形式。适用于眼部及耳部给药的其它制剂包括软膏、生物降解的(即，可吸收的凝胶海绵、胶原)和非生物降解的(即，硅氧烷)植入物、糯米纸囊剂、镜片(lenses)和微粒或囊状系统(vesicular systems)，比如囊泡体(niosomes)或脂质体。聚合物，比如交联聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明质酸、纤维素聚合物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素)或杂多糖聚合物(例如，琼脂糖胶)，可以与防腐剂(比如氯苄烷铵)一起引入。这样的制剂也可以通过离子电渗疗法递送。
[0068] 对于鼻内给药或吸入给药而言，本发明的活性化合物通常以溶液或悬浮液形式从由患者挤压或泵送的泵式喷雾容器方便地递送，或者作为喷雾剂形式利用合适的推进剂从加压容器或喷雾器方便地递送。适用于鼻内给药的制剂通常为干粉形式(单独的，作为混合物，例如，以与乳糖的干掺合物，或者作为混合的组分颗粒，例如，与磷脂(比如磷脂酰胆碱))从干粉吸入器给药，或者作为喷雾剂从加压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选利用电动水力学的雾化器，以产生细雾)或喷酒器给药，利用或不利用合适的推进剂，比如1,1,1,2-四氟乙烷或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷。对于鼻内使用而言，粉剂可包含生物粘合剂，例如，壳聚糖或环糊精。
[0069] 在另一个实施方案中，本发明包括直肠剂量形式。这样的直肠剂量形式可以是例如栓剂的形式。可可脂是传统的栓剂基质，但是可以视情况使用各种备选物。
[0070] 还可以采用制药领域已知的其他载体材料和给药方式。本发明的药物组合物可以通过任一种熟知的药学技术来制备，比如有效配制和给药步骤。关于有效配制和给药步骤的上述考虑是本领域熟知的且描述于标准教科书中。药物的配制例如在Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,1975;Liberman et al.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980;and Kibbe et al.,Eds.,Handbook of Pharmaceutical Excipients(3rd Ed.),American Pharmaceutical Association,Washington,1999中进行了讨论。
[0071] 共同给药
[0072] 本发明的化合物可以单独或者与其它治疗剂组合使用，以治疗多种病症或疾病状态。本发明的化合物和其它治疗剂可以同时(在同一剂型中或在单独的剂型中)或顺序给药。示例性的治疗剂例如可以是代谢型谷氨酸受体激动剂。
[0073] 两种或多种化合物“组合”给药是指两种化合物给药时间足够接近，使得一种化合物的存在影响另一种的生物效应。两种或多种化合物可以同时、并存或顺序给药。另外，同时给药可以通过在给药前混合化合物进行，或者通过在相同时间点但在不同解剖位置或者利用不同给药途径来进行。
[0074] 措辞“共同给药”、“共给药”、“同时给药”及“同时地给药”指组合给药化合物。
[0075] 在一个实施方案中，本发明的化合物作为辅助治疗与已知的抗精神病药一起给药，所述抗精神病药比如齐拉西酮(Geodon)、氯氮平、吗茚酮、洛沙平、匹莫齐特、利培酮、奥氮平、瑞莫必利、舍吲哚、氨磺必利、喹硫平、丙氯拉嗪、氟奋乃静、三氟拉嗪、甲硫哒嗪、氟派啶醇、氯丙嗪、三氟噻吨和哌泊噻嗪。
[0076] 在另一个实施方案中，本发明的化合物还可以与CNS药剂组合使用，所述CNS药剂比如抗抑郁药(比如舍曲林)，抗帕金森症药(比如塞利吉林、左旋多巴、Requip、Mirapex、MAOB抑制剂比如司来吉兰和雷沙吉兰、comT抑制剂比如Tasmar、A-2抑制剂、多巴胺重吸收抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱激动剂、神经元型一氧化氮合酶的多巴胺受体激动药和抑制剂)、抗阿尔茨海默病药物，比如多奈哌齐、他克林、α2δ抑制剂、COX-2抑制剂、gaba pentenoids、丙戊茶碱或美曲膦脂，以及抗精神病药，比如PDE10抑制剂、5HT2C激动剂、α7烟碱性受体激动剂、CB1拮抗剂以及具有拮抗多巴胺D2受体活性的化合物。
[0077] 试剂盒
[0078] 本发明进一步包括适合用于进行上述治疗方法的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒含包含一种或多种本发明化合物的第一剂量形式和剂量容器，该剂量的量足以实施本发明的方法。
[0079] 在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包括一种或多种本发明化合物。
[0080] 中间体
[0081] 在另一个实施方案中，本发明涉及用于制备本发明的化合物的新中间体。
[0082] 实验方法和操作实施例
[0083] 下述实施例阐述本发明。然而，应当理解，如本文充分描述和权利要求书中列出的本发明并不意味着受到下述实施例详细内容的限制。
[0084] 本文中使用下述缩写：
[0085] brine:饱和的氯化钠水溶液
[0086] EtOAc:乙酸乙酯
[0087] min:分钟
[0088] psi:磅/平方英寸
[0089] RT:室温
[0090] 实验步骤
[0091] 通常在惰性气氛(氮或氩)下进行实验，尤其是采用氧或水分敏感的试剂或中间体的情况下。商业溶剂和反应物通常无需进一步纯化即可使用，包括适当的无水溶剂(通TM常来自Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin的产物Sure-Seal )。在进行进一步反应或提供用于生物学试验之前，通常将产物在真空下干燥。来自液相色谱-质谱(LCMS)、大气压化学电离(APCI)或气相色谱-质谱(GCMS)报告质谱数据。核磁共振(NMR)数据的化学位移以参考来自所用氘化溶剂的残留峰的百万分率(ppm，δ)表达。
[0092] 对于在其它实施例或方法中的合成参考步骤，反应条件(反应时间和温度)可变。一般而言，反应之后进行薄层层析或质谱，并且适时进行后处理(work-up)。在实验间纯化是可变的：通常，选择洗脱剂/梯度所用的溶剂和溶剂比，以提供合适的Rfs或保留时间。
实施例
实施例
[0093] 实施例1
[0094] (3S)-3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-7-甲腈,HCl盐(1)
[0095]
[0096] 步骤1.N-（叔丁氧基羰基）-4-氰基-2-硝基-L-苯基丙氨酸甲酯的合成（C1）。给装有机械搅拌器和温度传感器的3-颈、2-升圆底烧瓶装入锌粉末(86.41g，1.32mol)。
加入N,N-二甲基甲酰胺(500mL)，且将烧瓶在水浴中冷却至10至12℃。滴加三甲基甲硅烷基氯化物(62.73mL,493.4mmol)，同时保持内部温度在20至25℃，将得到的悬浮液在18至22℃下搅拌30分钟。停止搅拌，且使固体沉降；经由套管使用抽吸除去深黄色上清液，然后弃去。向该固体中加入N,N-二甲基甲酰胺(250mL)，且将该悬浮液搅拌5分钟。停止搅拌，并且经由套管再次除去上清液。在相同条件下进行该洗涤过程再两次。将N,N-二甲基甲酰胺(100mL)加入到烧瓶中，以得到活化锌的悬浮液。
加入N,N-二甲基甲酰胺(500mL)，且将烧瓶在水浴中冷却至10至12℃。滴加三甲基甲硅烷基氯化物(62.73mL,493.4mmol)，同时保持内部温度在20至25℃，将得到的悬浮液在18至22℃下搅拌30分钟。停止搅拌，且使固体沉降；经由套管使用抽吸除去深黄色上清液，然后弃去。向该固体中加入N,N-二甲基甲酰胺(250mL)，且将该悬浮液搅拌5分钟。停止搅拌，并且经由套管再次除去上清液。在相同条件下进行该洗涤过程再两次。将N,N-二甲基甲酰胺(100mL)加入到烧瓶中，以得到活化锌的悬浮液。
[0097] 经由加料漏斗，将N-(叔丁氧基羰基)-3-碘代-L-丙氨酸甲酯(其可以根据S.van Zutphen等人，Tetrahedron Lett.2007，48，2857-2859制备)（173.98g，528.59mmol）在N,N-二甲基甲酰胺(500mL)中的溶液滴加到活化锌悬浮液中，同时在8至10℃的水浴中冷却烧瓶。在加料期间，内部温度保持低于25℃。除去冷却浴，且将该混合物在20至25℃下搅拌30分钟。通过薄层色谱(4:1庚烷/EtOAc)分析显示起始原料完全转化成锌酸盐。停止搅拌，且在固体沉降之后，使用氮气压，经由套管将有机锌溶液转移到加料漏斗中，同时留下固体锌。将N,N-二甲基甲酰胺(100mL)加入到锌残余物中，并将该混合物搅拌5分钟。停止搅拌，且以相同方式经由套管将上清液转移到加料漏斗。
[0098] 向装有机械搅拌器、加料漏斗和温度传感器的4-颈、5-圆底烧瓶中装入4-溴-3-硝基苯甲腈(100g，440.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1L)中的溶液。加入2-二环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯基(XPhos)(21.0g，44.0mmol)和乙酸钯(II)(4.94g，
22.0mmol)，并将烧瓶在14至16℃的水浴中冷却。将已经转移到加料漏斗的锌酸盐溶液作为小物流加入，同时保持内部温度在18至20℃。将得到的混合物在20℃下搅拌16小时，此时加入EtOAc(1L)，并且将混合物过滤穿过硅藻土。用EtOAc(500mL)洗涤硅藻土垫，并且向滤液中加入EtOAc(1L)和叔丁基甲基醚(500mL)。用20%盐水(3×1L)洗涤有机相，然后浓缩，得到深橙色油状物。将该油状物溶于叔丁基甲醚(500mL)中，过滤穿过硅藻土，且用叔丁基甲醚(2×100mL)洗涤硅藻土垫。浓缩滤液至干，得到深褐色油状物，将其在二氧化硅上进行层析(庚烷/EtOAc梯度洗脱)，得到浅褐色固体(178g)，其在庚烷(900mL)中浆液化16小时。将固体过滤，用庚烷(2×100mL)洗涤，且在真空下于30℃干燥4小时，得
1
到呈黄白色固体的C1。产率：94.67g，271.0mmol，62%产率。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.34(s,9H),3.25(dd,J=13.4,8.8Hz,1H),3.65(dd,J=13.4,5.5Hz,1H),3.75(s,3H),4.63-4.72(m,1H),5.24(br d,J=7.9Hz,1H),7.57(d,J=8.0Hz,1H),7.81(br d,J=8.0Hz,1H),8.26(br s,1H)。
22.0mmol)，并将烧瓶在14至16℃的水浴中冷却。将已经转移到加料漏斗的锌酸盐溶液作为小物流加入，同时保持内部温度在18至20℃。将得到的混合物在20℃下搅拌16小时，此时加入EtOAc(1L)，并且将混合物过滤穿过硅藻土。用EtOAc(500mL)洗涤硅藻土垫，并且向滤液中加入EtOAc(1L)和叔丁基甲基醚(500mL)。用20%盐水(3×1L)洗涤有机相，然后浓缩，得到深橙色油状物。将该油状物溶于叔丁基甲醚(500mL)中，过滤穿过硅藻土，且用叔丁基甲醚(2×100mL)洗涤硅藻土垫。浓缩滤液至干，得到深褐色油状物，将其在二氧化硅上进行层析(庚烷/EtOAc梯度洗脱)，得到浅褐色固体(178g)，其在庚烷(900mL)中浆液化16小时。将固体过滤，用庚烷(2×100mL)洗涤，且在真空下于30℃干燥4小时，得
1
到呈黄白色固体的C1。产率：94.67g，271.0mmol，62%产率。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.34(s,9H),3.25(dd,J=13.4,8.8Hz,1H),3.65(dd,J=13.4,5.5Hz,1H),3.75(s,3H),4.63-4.72(m,1H),5.24(br d,J=7.9Hz,1H),7.57(d,J=8.0Hz,1H),7.81(br d,J=8.0Hz,1H),8.26(br s,1H)。
[0099] 步骤2.[(3S)-7-氰基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-3-基]氨基甲酸叔丁酯(C2)的合成。向1升Atlantis压力反应器(Biotage)中装入5%硫化的铂碳[Pt(S)/C](7.00g)和C1(70g，200mmol)。加入吡啶(700mL)，并在23℃和5psi的氢气下，氢化该混合物。在2小时之后，过滤反应物以除去催化剂，并且真空浓缩滤液至最小体积。将残余物与庚烷(4×500mL)共蒸发，以除去残余吡啶。在20℃下，将得到的固体在叔丁基甲基醚(350mL)中浆液化16小时；过滤浆液，并且将固体用叔丁基甲基醚(2×50mL)洗涤，在30℃下真空干燥1小时，得到呈黄白色固体的C2(45.75g)。浓缩滤液，得到C2的第二次收获物1
(6.08g)。总产率∶51.83g，170.9mmol，85%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.41(s,9H),3.06-3.15(m,2H),4.28-4.37(m,1H),7.30(d,J=8.7Hz,1H),7.43-7.49(m,3H),10.76(s,1H)。
(6.08g)。总产率∶51.83g，170.9mmol，85%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.41(s,9H),3.06-3.15(m,2H),4.28-4.37(m,1H),7.30(d,J=8.7Hz,1H),7.43-7.49(m,3H),10.76(s,1H)。
[0100] 步骤3.实施例1的合成。向装有机械搅拌器的3-颈、2-升圆底烧瓶中装入HCl在2-丙醇(5-6M,1.05L)中的溶液。向该烧瓶中一次性加入C2(53.13g，175.2mmol)，且在20℃下搅拌该混合物。在1.5小时之后，过滤稠悬浮液，并且用2-丙醇(100mL)和二乙醚(2×100mL)洗涤固体，然后在30℃下真空干燥16小时，得到呈白色固体的实施例1。产1
率∶41g，170mmol，97%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.21(dd,J=15.2,14.6Hz,1H),3.33(dd,J=15.6,6.5Hz,1H,推测：被溶剂峰部分遮盖)，4.47(dd,J=14.5,6.5Hz,1H),7.56-7.58(m,2H),7.59-7.60(m,1H),8.75(br s,3H),11.16(br s,1H)。HPLC保留时间∶1.347分钟(柱∶Waters Atlantis T3,3.0x75mm,3μm；流动相A∶0.05%的三氟乙酸水溶液；流动相B∶0.05%三氟乙酸乙腈溶液；梯度∶经10分钟5%至95%B；流速∶1.2ml/分钟)。
率∶41g，170mmol，97%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.21(dd,J=15.2,14.6Hz,1H),3.33(dd,J=15.6,6.5Hz,1H,推测：被溶剂峰部分遮盖)，4.47(dd,J=14.5,6.5Hz,1H),7.56-7.58(m,2H),7.59-7.60(m,1H),8.75(br s,3H),11.16(br s,1H)。HPLC保留时间∶1.347分钟(柱∶Waters Atlantis T3,3.0x75mm,3μm；流动相A∶0.05%的三氟乙酸水溶液；流动相B∶0.05%三氟乙酸乙腈溶液；梯度∶经10分钟5%至95%B；流速∶1.2ml/分钟)。
[0101] 实施例2
[0102] (3S)-3-氨基-1-羟基-7-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基]-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，HCl盐(2)
[0103]
[0104] 步骤1.4-溴-3-硝基苯酚（C3）的合成。在装有温度计、均压滴液漏斗和废气洗涤器(1M氢氧化钠水溶液)的5-升、3-颈平底烧瓶中，将1-溴-4-甲氧基-2-硝基苯(170g，0.73mol)溶于二氯甲烷(1.5L)中。将该溶液在氩气下冷却至-78℃。将三溴化硼(176ml，
1.86mol)溶于冷的二氯甲烷(1.6L，0℃)中；经2小时，经滴液漏斗将其加入到冷却的反应物中。放热使温度达到-55℃。在加入完成时，除去冷却浴，并使反应升温至RT且搅拌48小时。
1.86mol)溶于冷的二氯甲烷(1.6L，0℃)中；经2小时，经滴液漏斗将其加入到冷却的反应物中。放热使温度达到-55℃。在加入完成时，除去冷却浴，并使反应升温至RT且搅拌48小时。
[0105] 经4小时，经由滴液漏斗将反应混合物加入到冷水(2.0L，冰/水浴)中，保持内部温度低于20℃。使用洗涤器(1M氢氧化钠水溶液)以防止形式的HBr气体释放。将猝灭的混合物在室温下再搅拌1小时，此时相分离，且用EtOAc(2.0L)萃取水层；将合并的有机层(二氯甲烷和EtOAc)用饱和的碳酸氢钠水溶液(2×1.2L；下层相为有机层)洗涤合并的有机层(二氯甲烷和EtOAc)，然后用盐水(1L,下层相为水层)洗涤，经硫酸镁干燥和真空浓缩。将残余物悬浮在二氯甲烷(320mL)中，浆液化过夜，并且过滤收集固体。将固体溶于氢氧化钠水溶液(2.0M,500mL)，并且用二氯甲烷(500mL)萃取。然后，用氢氧化钠水溶液(250mL)萃取二氯甲烷层，并且用HCl水溶液(1.0M,790mL)将合并的水层酸化至pH2。过滤沉淀的苯酚，且在40℃下真空干燥18小时，得到呈固体的C3。产率∶125.5g，0.5757mol，1
79%。H NMR(400MHz,CD3OD)δ6.95(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),7.24(d,J=2.9Hz,1H),7.57(d,J=8.8Hz,1H)。
79%。H NMR(400MHz,CD3OD)δ6.95(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),7.24(d,J=2.9Hz,1H),7.57(d,J=8.8Hz,1H)。
[0106] 步骤2.(4-溴-3-硝基苯氧基)(三异丙基)硅烷(C4)的合成。将三异丙基甲硅烷基氯化物(182mL,0.850mol)一次性加入到C3(169g，0.775mol)和咪唑(105g，1.54mol)在N,N-二甲基甲酰胺(845mL)中的溶液中。将该反应在室温下搅拌18小时，然后倾倒入水(2L)中。在用叔丁基甲基醚(1L)萃取之后，用水(3×2L)洗涤有机相，然后用盐水(1L)洗涤，经硫酸镁干燥，且真空浓缩至油状物。将其通过硅胶色谱(梯度∶在庚烷中0%至1
5%EtOAc)纯化，得到C4。产率∶279g,0.745mol,96%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.11(d,J=
7.1Hz,18H),1.22-1.33(m,3H),6.95(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),7.35(d,J=2.9Hz,1H),7.55(d,J=8.7Hz,1H)。
5%EtOAc)纯化，得到C4。产率∶279g,0.745mol,96%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.11(d,J=
7.1Hz,18H),1.22-1.33(m,3H),6.95(dd,J=8.8,2.9Hz,1H),7.35(d,J=2.9Hz,1H),7.55(d,J=8.7Hz,1H)。
[0107] 步骤3.N-(叔丁氧基羰基)-2-硝基-O-(三异丙基甲硅烷基)-L-酪氨酸甲酯(C5)的合成。由于在该反应期间观察到放热，因此分两批进行下述锌酸盐形成。在氩气下，将无水脱气的N,N-二甲基甲酰胺(32mL)加入到在直边（straight-sided）管中的锌(10.5g，0.161mol)中。加入三甲基甲硅烷基氯化物(4.05mL,31.9mmol)，并且强力搅拌该混合物30分钟，此时停止搅拌，并使锌沉降。在氩气气流下倾析出上清液，并且将N,N-二甲基甲酰胺(20mL)加入到锌中。搅拌该混合物30秒，使锌沉降，且如前所述除去上清液。再重复该过程两次。将N-(叔丁氧基羰基)-3-碘代-L-丙氨酸甲酯(其可以根据S.van Zutphen et al.,Tetrahedron Lett.2007，48，2857-2859制备)(22.86g，69.46mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(55mL)中的溶液加入到活化锌中，并强力搅拌该混合物。在放热减少(用冰浴控制)之后，将反应再搅拌30分钟，此时停止搅拌，并且使锌沉降。在氩气气流下，将来自两次锌酸盐形成的上清液倾析到干净的反应烧瓶中。将C4(40.0g，106.9mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)、乙酸钯(II)(1.20g，5.34mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯基(XPhos)(5.10g,10.70mmol)中的溶液顺次加入到锌酸盐中。将该反应在40℃下加热
18小时，然后倾倒入水(400mL)中；加入EtOAc(400mL)，并使得到的混合物过滤穿过硅藻土垫，用EtOAc(2×100mL)洗涤滤饼。分离层，并且用EtOAc(100mL)萃取水层；将合并的有机层用盐水(5×400mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤且真空浓缩。使用硅胶色谱(梯度∶在庚烷中2%至10%EtOAc)纯化，得到呈灰橙色油状物的C5，其静置时固化。产率∶44.3g，
1
89.2mmol，83%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.10(d,J=7.2Hz,18H),1.23-1.31(m,3H),1.37(s,9H),3.19(dd,J=13.5,8.2Hz,1H),3.41(dd,J=13.7,5.8Hz,1H),3.71(s,3H),4.56-4.66(m,1H),5.18(brd,J=8Hz,1H),7.05(dd,J=8.4,2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.5Hz,1H),7.43-7.47(m,1H)。
18小时，然后倾倒入水(400mL)中；加入EtOAc(400mL)，并使得到的混合物过滤穿过硅藻土垫，用EtOAc(2×100mL)洗涤滤饼。分离层，并且用EtOAc(100mL)萃取水层；将合并的有机层用盐水(5×400mL)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤且真空浓缩。使用硅胶色谱(梯度∶在庚烷中2%至10%EtOAc)纯化，得到呈灰橙色油状物的C5，其静置时固化。产率∶44.3g，
1
89.2mmol，83%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.10(d,J=7.2Hz,18H),1.23-1.31(m,3H),1.37(s,9H),3.19(dd,J=13.5,8.2Hz,1H),3.41(dd,J=13.7,5.8Hz,1H),3.71(s,3H),4.56-4.66(m,1H),5.18(brd,J=8Hz,1H),7.05(dd,J=8.4,2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.5Hz,1H),7.43-7.47(m,1H)。
[0108] 步骤4.N-(叔丁氧基羰基)-2-硝基-L-酪氨酸甲酯(C6)的合成。在氩气下，将四丁基氟化铵(在四氢呋喃中1M溶液，228.1mL,228.1mmol)加入到C5(103g，207mmol)在四氢呋喃(1.0L)中的溶液中。将该反应搅拌15分钟。将反应混合物真空浓缩，然后分配到EtOAc(400mL)和10%柠檬酸水溶液(400mL)之间。分离层，并且用EtOAc(200mL)萃取水层。将合并的有机层用10%柠檬酸水溶液(300mL)洗涤，然后用水(300mL)和盐水(300mL mL)洗涤，经硫酸镁干燥，且在减压下浓缩，得到褐色油状物，将其用庚烷研磨。过滤收集得到的固体，用庚烷洗涤，并且在70℃下真空干燥，得到呈浅褐色固体的C6。产率∶50.6g，1
149mmol，72%产率。LCMS m/z339.1(M-1)。H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.35(s,9H),2.99(dd,J=13.7,9.6Hz,1H),3.43(dd,J=13.7,5.6Hz,1H),3.69(s,3H),4.46-4.53(m,1H),6.98-7.0(m,1H),7.01(dd,J=8.4,2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.5Hz,1H),7.37(d,J=2.5Hz,1H)。
149mmol，72%产率。LCMS m/z339.1(M-1)。H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.35(s,9H),2.99(dd,J=13.7,9.6Hz,1H),3.43(dd,J=13.7,5.6Hz,1H),3.69(s,3H),4.46-4.53(m,1H),6.98-7.0(m,1H),7.01(dd,J=8.4,2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.5Hz,1H),7.37(d,J=2.5Hz,1H)。
[0109] 步骤5.N-(叔丁氧基羰基)-O-[(1S)-2-甲氧基-1-甲基乙基]-2-硝基-L-酪氨酸甲酯(C7)的合成。经30分钟，将偶氮二羧酸二异丙酯(92mL,0.467mol)在四氢呋喃(500mL)中的溶液加入到冷却(冰/水浴)的C6(108g，0.317mol)、三苯基膦(123g，0.469mol)和(2R)-1-甲氧基丙-2-醇(42.1g，0.467mol)的溶液中。观察到放热，其使反应温度从0升高至25℃。将该反应在室温下搅拌18小时，然后分配到EtOAc(500mL)和水(500mL)之间。用EtOAc(250mL)萃取水层，用盐水(250mL)洗涤合并的有机层，经硫酸镁干燥和真空浓缩。将残余物悬浮在二乙醚和庚烷(1:1，750mL)的混合物中，并使其静置18小时。过滤除去固体(三苯基氧化膦和还原的偶氮二羧酸二异丙酯的混合物)，并且真空浓缩滤液。经由硅胶色谱(梯度∶在庚烷中0%至40%EtOAc)纯化，得到被还原的偶氮二羧酸二异丙酯污染的C7(144g)。在下述步骤中使用该混合物，而对反应没有
1
任何不利影响。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.32(d,J=6.3Hz,3H),1.37(br s,9H),3.17(dd,J=13.7,8.2Hz,1H),3.41(s,3H),3.44(dd,J=13.7,5.5Hz,1H),3.51(dd,ABX图 案 的 一半,J=10.3,4.0Hz,1H),3.58(dd,ABX图案的一半,J=10.3,6.2Hz,1H),3.73(s,3H),4.54-4.66(m,2H),5.19(br d,J=8.4Hz,1H),7.12(dd,J=8.6,2.6Hz,1H),7.25(d,J=8.5Hz,1H),7.
50-7.53(m,1H)。
1
任何不利影响。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.32(d,J=6.3Hz,3H),1.37(br s,9H),3.17(dd,J=13.7,8.2Hz,1H),3.41(s,3H),3.44(dd,J=13.7,5.5Hz,1H),3.51(dd,ABX图 案 的 一半,J=10.3,4.0Hz,1H),3.58(dd,ABX图案的一半,J=10.3,6.2Hz,1H),3.73(s,3H),4.54-4.66(m,2H),5.19(br d,J=8.4Hz,1H),7.12(dd,J=8.6,2.6Hz,1H),7.25(d,J=8.5Hz,1H),7.
50-7.53(m,1H)。
[0110] 步 骤6.{(3S)-1- 羟 基 -7-[(1S)-2-甲 氧 基 -1- 甲 基 乙 氧 基 ]-2- 氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-3-基}氨基甲酸叔丁酯(C8)的合成。将C7(154g,373mmol)溶于吡啶(770mL)中，且均分到两个1-升高压釜中。向各个反应物中加入呈水(20mL)中糊状物的铂碳(3%，7.28g，1.13mmol)。向各个高压釜中装入16bar的氢，且将反应在室温下搅拌6小时；放热使温度升高至27℃。薄层色谱(洗脱液∶1:1EtOAc/庚烷)表明存在起始原料，因此向两个高压釜中再装入16bar的氢，且在室温下搅拌18小时。过滤穿过硅藻土除去催化剂，用EtOAc(250mL)洗涤过滤垫，将滤液减压浓缩。将残余物溶于EtOAc(1L)中，并且用10%柠檬酸水溶液(2×1L)洗涤，然后用水(500mL)和盐水(500mL)洗涤，经硫酸镁干燥和真空浓缩。将残余物用二乙醚和庚烷研磨，得到C8(88.11g)。从滤液中分离C8的第二次收
1
获物。联合产率∶99.83g，272.5mmol，73%。H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.32(d,J=6.3Hz,3H),
1.47(s,9H),2.79(br dd,J=14,14Hz,1H),3.26-3.38(br m,1H),3.43(s,3H),3.50(dd,ABX图案的一半,J=10.2,4.2Hz,1H),3.60(dd,ABX图案的一半,J=10.2,6.0Hz,1H),4.41-4.62(m,2H),5.45(brd,J=5Hz,1H),6.64(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.97(d,J=2.5Hz,1H),7.07(d,J=8.2Hz,1H),8.79(br s,1H)。
1
获物。联合产率∶99.83g，272.5mmol，73%。H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.32(d,J=6.3Hz,3H),
1.47(s,9H),2.79(br dd,J=14,14Hz,1H),3.26-3.38(br m,1H),3.43(s,3H),3.50(dd,ABX图案的一半,J=10.2,4.2Hz,1H),3.60(dd,ABX图案的一半,J=10.2,6.0Hz,1H),4.41-4.62(m,2H),5.45(brd,J=5Hz,1H),6.64(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.97(d,J=2.5Hz,1H),7.07(d,J=8.2Hz,1H),8.79(br s,1H)。
[0111] 经过硅胶色谱(梯度∶在庚烷中0%到50%EtOAc)从最终滤液分离出另外的C8，接着用2-丙醇/庚烷研磨。
[0112] 步骤7.实施例2的合成。将C8(152g，415mmol)溶于HCl在二乙醚(2M,2.5L,5mol)中的溶液中，且搅拌18小时，直到气体逸出停止。过滤该混合物，得到固体，将其在二乙醚(4L)中浆液化，过滤，然后在50℃下真空干燥过液。使用研钵和研杵研磨固体，然后在50℃下进一步真空干燥18小时，得到实施例2。产率：121.65g，401.8mmol，97%。LCMS1
m/z267.2(M+1)。H NMR(400MHz,D2O)δ1.21(d,J=6.3Hz,3H),3.12(dd,ABX图案的一半，J=14.5,14.5Hz,1H),3.24(dd,ABX图案的一半，J=14.8,6.6Hz,1H),3.35(s,3H),3.57(dd,ABX图案的一半，J=11.1,6.5Hz,1H),3.61(dd,ABX图案的一半，J=11.1,3.3Hz,1H),4.37(dd,J=14.5,6.6Hz,1H),4.63-4.71(m,1H),6.76(dd,J=8.4,2.4Hz,1H),6.98(d,J=2.4Hz,1H),
7.21(d,J=8.4Hz,1H)。
m/z267.2(M+1)。H NMR(400MHz,D2O)δ1.21(d,J=6.3Hz,3H),3.12(dd,ABX图案的一半，J=14.5,14.5Hz,1H),3.24(dd,ABX图案的一半，J=14.8,6.6Hz,1H),3.35(s,3H),3.57(dd,ABX图案的一半，J=11.1,6.5Hz,1H),3.61(dd,ABX图案的一半，J=11.1,3.3Hz,1H),4.37(dd,J=14.5,6.6Hz,1H),4.63-4.71(m,1H),6.76(dd,J=8.4,2.4Hz,1H),6.98(d,J=2.4Hz,1H),
7.21(d,J=8.4Hz,1H)。
[0113] 实施例3
[0114] (3S)-3-氨基-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，HCl盐(3)
[0115]
[0116] 步骤1.N-(叔丁氧基羰基)-O-(2-甲氧基乙基)-2-硝基-L-酪氨酸甲酯(C9)的合成。将1-溴-2-甲氧基乙烷(29g，209mmol)加入到C6(48g，141mmol)和碳酸铯(115g，353mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(240mL)中的混合物中。将该反应加热至40℃5小时，在室温下搅拌18小时，并且用水(300mL)稀释。在用叔丁基甲基醚(150mL)萃取之后，将有机层用水(3×300mL)、盐水(150mL)洗涤，经硫酸镁干燥且真空浓缩成橙色油状物，其静置时固化。用庚烷(100mL)和EtOAc(5mL)研磨，得到呈固体的C9。从滤液中分离出C9的第二次收获物。减压浓缩母液，且用2-丙醇/庚烷研磨，得到C9的第三次收获物。总产
1
率∶41.5g104mmol，74%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(s,9H),3.20(dd,J=13.7,8.2Hz,1H),3.41-3.47(m,1H),3.46(s,3H),3.73(s,3H),3.76-3.79(m,2H),4.15-4.19(m,2H),4.58-
4.67(m,1H),5.17(br d,J=8Hz,1H),7.14(dd,J=8.6,2.8Hz,1H),7.27(d,J=8.5Hz,1H),7.5
0-7.54(m,1H)。
1
率∶41.5g104mmol，74%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(s,9H),3.20(dd,J=13.7,8.2Hz,1H),3.41-3.47(m,1H),3.46(s,3H),3.73(s,3H),3.76-3.79(m,2H),4.15-4.19(m,2H),4.58-
4.67(m,1H),5.17(br d,J=8Hz,1H),7.14(dd,J=8.6,2.8Hz,1H),7.27(d,J=8.5Hz,1H),7.5
0-7.54(m,1H)。
[0117] 步骤2.[(3S)-1-羟基-7-(2-甲氧基乙氧基)-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉基-3-基]氨基甲酸叔丁酯(C10)的合成。将铂碳(5%，4.50g，1.15mmol)在水中的糊状物加入到C9(45g，113mmol)在吡啶(225mL)中的溶液中，并且在室温下，以150psi氢化该反应18小时。过滤穿过硅藻土除去催化剂，用EtOAc(250mL)洗涤过滤垫，并且真空浓缩滤液，得到油状物。加入庚烷(3×200mL)，接着减压除去溶剂，以分馏出其余吡啶。将得到的固体用5%2-丙醇在庚烷中的溶液研磨；过滤，得到呈黄白色固体的C10。将滤液用EtOAc(50mL)稀释，用10%柠檬酸水溶液(50mL)、水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经硫酸镁干燥，且真空浓缩，得到淡褐色固体。从EtOAc/庚烷中研磨，得到C10的另一次收
1
获物。总产率：27.52g，78.10mmol，69%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.45(s,9H),2.79(br dd,J=14,14Hz,1H),3.25-3.36(br m,1H),3.47(s,3H),3.74-3.78(m,2H),4.11-4.16(m,2H),4.41-4.51(br m,1H),5.48(d,J=6.0Hz,1H),6.63(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.98(d,J=2.4Hz,1H),7.06(d,J=8.4Hz,1H),9.10(br s,1H)。
1
获物。总产率：27.52g，78.10mmol，69%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.45(s,9H),2.79(br dd,J=14,14Hz,1H),3.25-3.36(br m,1H),3.47(s,3H),3.74-3.78(m,2H),4.11-4.16(m,2H),4.41-4.51(br m,1H),5.48(d,J=6.0Hz,1H),6.63(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.98(d,J=2.4Hz,1H),7.06(d,J=8.4Hz,1H),9.10(br s,1H)。
[0118] 步 骤3.实 施 例3的 合 成。将 C10(29g，82mmol)与HCl 在1,4-二 噁 烷(4M,310mL,1.24mol)中的溶液混合，且搅拌直到形成细沉淀物和气体逸出停止(约3小时)。过滤收集固体，在二乙醚(150mL)中浆液化，过滤和在50℃下真空干燥18小时。将得到的固体在回流甲醇(300mL)中浆液化1小时和过滤，并且用二乙醚洗涤滤饼。将固体在50℃1
下真空干燥18小时，得到实施例3。产率∶23.3g，80.7mmol，98%。LCMS m/z253.1(M+1).H NMR(400MHz,D2O)δ3.10(br dd,ABX图案的一半，J=14.7,14.7Hz,1H),3.22(br dd,ABX图案的一半，J=15,6.5Hz,1H),3.37(s,3H),3.74-3.79(m,2H),4.13-4.18(m,2H),4.31-4.38(m,1H),6.73(dd,J=8.4,2.5Hz,1H),6.97(d,J=2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.4Hz,1H)。
下真空干燥18小时，得到实施例3。产率∶23.3g，80.7mmol，98%。LCMS m/z253.1(M+1).H NMR(400MHz,D2O)δ3.10(br dd,ABX图案的一半，J=14.7,14.7Hz,1H),3.22(br dd,ABX图案的一半，J=15,6.5Hz,1H),3.37(s,3H),3.74-3.79(m,2H),4.13-4.18(m,2H),4.31-4.38(m,1H),6.73(dd,J=8.4,2.5Hz,1H),6.97(d,J=2.6Hz,1H),7.21(d,J=8.4Hz,1H)。
[0119] 实施例4
[0120] (3S)-3-氨基-1-羟基-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮(4)
[0121]
[0122] 将L-2-硝基苯基丙氨酸(C11)(419.6mg,2.0mmol)溶于甲醇(23.8mL)和水(240μL)中。加入浓HCl水溶液(2-4滴)以帮助溶解。加入铂碳(42mg)，并且在Parr振荡器中以10psi氢化反应1小时，之后将反应物过滤穿过硅藻土。先用氢氧化铵在甲醇中的1N溶液洗涤催化剂，然后用甲醇洗涤。浓缩滤液，得到粗产物，接着将其用最少量的二氧化硅无水包装，使用甲醇/二氯甲烷溶液溶解该物质。使用硅胶色谱(梯度∶在二氯甲烷中0%至20%甲醇(包含1%氢氧化铵))纯化，得到呈固体的实施例4(207mg，58%)。
APCI m/z179.1(M+1)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.88(dd,J=14,15Hz,1H),3.09(dd,J=1
5.3,6.2Hz,1H),3.67(dd,J=13.6,6.1Hz,1H,)7.06(ddd,J=7.2,7.2,1.7Hz,1H),7.23(br d,J=7.5Hz,1H),7.27-7.34(m,2H)。
APCI m/z179.1(M+1)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ2.88(dd,J=14,15Hz,1H),3.09(dd,J=1
5.3,6.2Hz,1H),3.67(dd,J=13.6,6.1Hz,1H,)7.06(ddd,J=7.2,7.2,1.7Hz,1H),7.23(br d,J=7.5Hz,1H),7.27-7.34(m,2H)。
[0123] 实施例5
[0124] (3S)-3-氨基-1-羟基-7-异丙氧基-3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮，HCl盐(5)
[0125]
[0126]
[0127] 步骤1.4-异丙氧基-2-硝基苯甲酸乙酯(C12)的合成。将4-羟基-2-硝基苯甲酸乙酯(1.02g，4.83mmol)和碳酸钾(1.3g，9.4mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中的混合物用2-碘丙烷(0.54mL,5.4mmol)处理，并且将该反应混合物搅拌18小时。将反应物倾倒入水中，并且用1N HCl水溶液酸化。在用EtOAc萃取之后，将合并的有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩，得到呈油状物的C12。产1
率∶1.17g,4.62mmol,96%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.34(t,J=7.1Hz,3H),1.38(d,J=6.0Hz,6H),4.34(q,J=7.1Hz,2H),4.64(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.06(dd,J=8.7,2.5Hz,1H),7.20(d,J=2.4Hz,1H),7.77(d,J=8.7Hz,1H)。
率∶1.17g,4.62mmol,96%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.34(t,J=7.1Hz,3H),1.38(d,J=6.0Hz,6H),4.34(q,J=7.1Hz,2H),4.64(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.06(dd,J=8.7,2.5Hz,1H),7.20(d,J=2.4Hz,1H),7.77(d,J=8.7Hz,1H)。
[0128] 步骤2.4-异丙氧基-2-硝基苯甲酸(C13)的合成。将氢氧化锂水溶液(1M,6.93mL,6.93mmol)加入到C12(1.17g，4.62mmol)在四氢呋喃(10mL)和甲醇(10mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌该反应3小时。然后，将反应物倾倒入1N HCl水溶液中，用二乙醚萃取。将合并的有机层用水洗涤，然后用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并
1
真空浓缩，得到呈橙色固体的C13。产率∶847mg,3.76mmol,81%.H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.40(d,J=6.0Hz,6H),4.67(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.07(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),7.12(d,J=2.4Hz,1H),7.94(d,J=8.8Hz,1H)。
1
真空浓缩，得到呈橙色固体的C13。产率∶847mg,3.76mmol,81%.H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.40(d,J=6.0Hz,6H),4.67(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.07(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),7.12(d,J=2.4Hz,1H),7.94(d,J=8.8Hz,1H)。
[0129] 步骤3.(4-异丙氧基-2-硝基苯基)甲醇(C14)的合成。向C13(845mg，3.75mmol)在四氢呋喃(15mL)中的溶液中加入硼烷-四氢呋喃复合物(在四氢呋喃中1M溶液，15.0mL,15.0mmol)，并且将该反应在50℃下加热18小时。将反应物慢慢地加入到水(75mL)中，然后用EtOAc萃取。将合并的有机层用0.5N HCl水溶液、水和盐水洗涤，之后经硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。得到呈黄色油状物的C14。产率∶550mg，2.60mmol，69%。LCMS m/z2
1
10.1(M-1).HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(d,J=6.0Hz,6H),2.59(br t,J=6Hz,1H),4.63( 七重峰，J=6.0Hz,1H),4.85(br d,J=5.9Hz,2H),7.16(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.56(brd,J=8.5Hz,1H),7.59(d,J=2.6Hz,1H)。
1
10.1(M-1).HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(d,J=6.0Hz,6H),2.59(br t,J=6Hz,1H),4.63( 七重峰，J=6.0Hz,1H),4.85(br d,J=5.9Hz,2H),7.16(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.56(brd,J=8.5Hz,1H),7.59(d,J=2.6Hz,1H)。
[0130] 步骤4.1-(溴乙基)-4-异丙氧基-2-硝基苯(C15)的合成。将C14(550mg，2.60mmol)在二乙醚(50mL)中的溶液冷却至0℃，并且滴加三溴化磷(0.245mL,2.61mmol)处理。将反应在0℃下搅拌2.5小时，然后在室温下搅拌3小时。从烧瓶底部的不溶性油状物倾析出上清液，并且将上清液用另外的二乙醚稀释，且先用水、之后用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。经由硅胶色谱(梯度∶在庚烷中10%至20%EtOAc)纯化残
1
余物，得到呈无色油状物的C15。产率∶245mg,0.894mmol,34%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(d,J=6.0Hz,6H),4.62(七重峰，J=6.0Hz,1H),4.80(s,2H),7.09(dd,J=8.5,2.6Hz,1H),7.44(d,J=8.6Hz,1H),7.54(d,J=2.6Hz,1H)。
1
余物，得到呈无色油状物的C15。产率∶245mg,0.894mmol,34%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.38(d,J=6.0Hz,6H),4.62(七重峰，J=6.0Hz,1H),4.80(s,2H),7.09(dd,J=8.5,2.6Hz,1H),7.44(d,J=8.6Hz,1H),7.54(d,J=2.6Hz,1H)。
[0131] 步骤5.N-(二苯亚甲基)-O-异丙基-2-硝基-L-酪氨酸叔丁酯(C16)的合成。将C15(245mg，0.894mmol)、N-(二苯亚甲基)甘氨酸叔丁酯(290mg，0.982mmol)和O-烯丙基-N-(9-蒽基甲基)溴化辛可宁丁(cinchonidinium bromide)(53.9mg,0.089mmol)在二氯甲烷(5mL)中混合，且冷却至-30℃(参见E.J.Corey et al.,J.Am.Chem.
Soc.1997,119,12414-12415)。加入氢氧化铯(225mg，1.34mmol)，并且将反应在-30℃下搅拌18小时，此时用饱和的氯化铵水溶液猝灭，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，并且经硫酸镁干燥。在过滤之后，真空浓缩有机溶液，且通过硅胶色谱(梯度∶在庚烷中10%至20%EtOAc)纯化，得到呈浅黄色油状物的C16。产率∶252mg,0.516mmol,58%。
1
H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.33(d,J=6.0Hz,3H),1.34(d,J=6.0Hz,3H),1.44(s,9H),3.32(dd,J=13.5,9.2Hz,1H),3.61(dd,J=13.6,4.1Hz,1H),4.30(dd,J=9.2,4.1Hz,1H),4.55(七重峰，J=6.0Hz,1H),6.67(br d,J=6.9Hz,2H),6.96(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.24-7.40(m,8H),
7.57-7.60(m,2H)。
Soc.1997,119,12414-12415)。加入氢氧化铯(225mg，1.34mmol)，并且将反应在-30℃下搅拌18小时，此时用饱和的氯化铵水溶液猝灭，并用二氯甲烷萃取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，并且经硫酸镁干燥。在过滤之后，真空浓缩有机溶液，且通过硅胶色谱(梯度∶在庚烷中10%至20%EtOAc)纯化，得到呈浅黄色油状物的C16。产率∶252mg,0.516mmol,58%。
1
H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.33(d,J=6.0Hz,3H),1.34(d,J=6.0Hz,3H),1.44(s,9H),3.32(dd,J=13.5,9.2Hz,1H),3.61(dd,J=13.6,4.1Hz,1H),4.30(dd,J=9.2,4.1Hz,1H),4.55(七重峰，J=6.0Hz,1H),6.67(br d,J=6.9Hz,2H),6.96(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.24-7.40(m,8H),
7.57-7.60(m,2H)。
[0132] 步骤6.O-异丙基-2-硝基-L-酪氨酸，HCl盐(C17)的合成。用HCl水溶液(6M,1.83mL,11.0mmol)处理C16(252mg,0.516mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液。在搅拌
18小时之后，真空浓缩反应物。将残余物用二乙醚浆液化，且过滤，得到呈无色固体的C17。
1
产率∶150mg,0.492mmol,95%。LCMS m/z269.2(M+1).H NMR(400MHz,CD3OD),特征峰:δ
1.35(d,J=6.0Hz,6H),3.57(dd,J=14.1,7.0Hz,1H),4.29(dd,J=7.8,7.1Hz,1H),4.71(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.25(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.40(d,J=8.6Hz,1H),7.60(d,J=2.6Hz,1H)。
18小时之后，真空浓缩反应物。将残余物用二乙醚浆液化，且过滤，得到呈无色固体的C17。
1
产率∶150mg,0.492mmol,95%。LCMS m/z269.2(M+1).H NMR(400MHz,CD3OD),特征峰:δ
1.35(d,J=6.0Hz,6H),3.57(dd,J=14.1,7.0Hz,1H),4.29(dd,J=7.8,7.1Hz,1H),4.71(七重峰，J=6.0Hz,1H),7.25(dd,J=8.5,2.7Hz,1H),7.40(d,J=8.6Hz,1H),7.60(d,J=2.6Hz,1H)。
[0133] 步骤7.{(3S)-1-[(叔丁氧基羰基)氧基]-7-异丙氧基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉基-3-基}氨基甲酸叔丁酯(C18)的合成。将C17(150mg，0.492mmol)与THF(10mL)和MeOH(10mL)混合，并且将得到的溶液冷却至0℃。向其中加入氯化亚锡(II)(97%，494mg，2.53mmol)和三水合乙酸钠(99%，694mg，5.05mmol)，并且使该反应物在0℃下搅拌5小时。
此时，加入三乙胺(0.704mL,5.05mmol)和二叔丁基碳酸氢钠(220mg，1.01mmol)，并且在室温下搅拌该混合物18小时。真空除去溶剂，并且将残余物与EtOAc浆液化。过滤混合物，用EtOAc洗涤不溶性固体。将合并的滤液用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。使用硅胶色谱(梯度∶在庚烷中10%至30%EtOAc，加入1%三乙胺)纯化残余物，得到呈无色
1
油状物的C18。产率∶92mg,0.21mmol,43%。LCMS m/z437.2(M+1)。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.33(d,J=6Hz,6H),1.47(s,9H),1.56(s,9H),2.81-2.95(m,1H),3.32-3.44(m,1H),4.46-4.57(m,2H),5.55(br s,1H),6.60(d,J=8Hz,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),7.27(s,1H)。
此时，加入三乙胺(0.704mL,5.05mmol)和二叔丁基碳酸氢钠(220mg，1.01mmol)，并且在室温下搅拌该混合物18小时。真空除去溶剂，并且将残余物与EtOAc浆液化。过滤混合物，用EtOAc洗涤不溶性固体。将合并的滤液用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。使用硅胶色谱(梯度∶在庚烷中10%至30%EtOAc，加入1%三乙胺)纯化残余物，得到呈无色
1
油状物的C18。产率∶92mg,0.21mmol,43%。LCMS m/z437.2(M+1)。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.33(d,J=6Hz,6H),1.47(s,9H),1.56(s,9H),2.81-2.95(m,1H),3.32-3.44(m,1H),4.46-4.57(m,2H),5.55(br s,1H),6.60(d,J=8Hz,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),7.27(s,1H)。
[0134] 步骤8.实施例5的合成。将C18(92mg,0.21mmol)在甲醇(5mL)中的溶液用浓HCl水溶液(12M,0.158mL,1.90mmol)处理，且加热到50℃1小时。真空浓缩反应混合物，并且将得到的固体在二乙醚中浆液化，之后经由过滤收集。用二乙醚洗涤固体，得到实施例1
5。产率∶49mg,0.18mmol,86%。LCMS m/z237.2(M+1)。H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.32(d,J=6.0Hz,6H),3.06(ddd,J=14.6,14.6,1.1Hz,1H),3.19(dd,J=14.6,6.5Hz,1H),4.29(dd,J=
14.6,6.5Hz,1H),4.61(七重峰，J=6.0Hz,1H),6.67(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.93(d,J=2.4Hz,1H),7.18(br d,J=8.3Hz,1H)。
5。产率∶49mg,0.18mmol,86%。LCMS m/z237.2(M+1)。H NMR(400MHz,CD3OD)δ1.32(d,J=6.0Hz,6H),3.06(ddd,J=14.6,14.6,1.1Hz,1H),3.19(dd,J=14.6,6.5Hz,1H),4.29(dd,J=
14.6,6.5Hz,1H),4.61(七重峰，J=6.0Hz,1H),6.67(dd,J=8.3,2.5Hz,1H),6.93(d,J=2.4Hz,1H),7.18(br d,J=8.3Hz,1H)。
[0135] 实施例6
[0136] 3-氨基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉-8-甲腈,HCl盐(6)
[0137]
[0138]
[0139] 步骤1.3-甲基-2-硝基苯甲酰胺(C19)的合成。将3-甲基-2-硝基苯甲酸(50.00g，276mmol)在二氯甲烷(500mL)和三乙胺(41.83g，414mmol)中的溶液冷却至0℃。
滴加氯甲酸异丙酯(50.74g，414mmol)，并且在0℃下搅拌反应1小时。然后，向反应中加入浓氢氧化铵水溶液(300mL)，在0℃下再搅拌30分钟。过滤得到呈白色固体的C19。产
1
率∶41.6g,231mmol,84%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.28(s,3H),7.53-7.61(m,3H),7.71(br s,1H),8.21(br s,1H)。
滴加氯甲酸异丙酯(50.74g，414mmol)，并且在0℃下搅拌反应1小时。然后，向反应中加入浓氢氧化铵水溶液(300mL)，在0℃下再搅拌30分钟。过滤得到呈白色固体的C19。产
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率∶41.6g,231mmol,84%。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.28(s,3H),7.53-7.61(m,3H),7.71(br s,1H),8.21(br s,1H)。
[0140] 步骤2.3-甲基-2-硝基苯甲腈(C20)的合成。将C19(41.60g，231mmol)在二氯甲烷(400mL)中的溶液冷却至0℃。滴加三氟乙酸酐(96.6g，460mmol)，并将得到的混合物在0℃下搅拌1小时，然后用水(400mL)洗涤。将有机层经无水硫酸镁干燥，过滤并真空浓缩。经由硅胶色谱(洗脱液∶8:1，之后4:1的石油醚/乙酸乙酯)纯化残余物，得到呈黄1
色固体的C20。产率∶25g,150mmol,65%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.42(s,3H),7.49-7.5
6(m,2H),7.61-7.63(m,1H)。
色固体的C20。产率∶25g,150mmol,65%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.42(s,3H),7.49-7.5
6(m,2H),7.61-7.63(m,1H)。
[0141] 步骤3.3-(溴乙基)-2硝基苯甲腈(C21)的合成。将C20(15.00g，92.51mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(32.93g，185.0mmol)和过氧化苯甲酰(3.36g,13.9mmol)在四氯化碳(200mL)中的混合物加热回流48小时。用水(100mL)洗涤该混合物，并且将有机层干燥，过滤且在硅胶柱(洗脱液∶2:1至1:1石油醚/二氯甲烷)上纯化，得到呈黄白色固体的1
C21。产率∶6.26g,26.0mmol,28%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.60(s,2H),7.67-7.71(m,1H),7.80-7.85(m,2H)。
C21。产率∶6.26g,26.0mmol,28%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.60(s,2H),7.67-7.71(m,1H),7.80-7.85(m,2H)。
[0142] 步骤4.3-氰基-N-(二苯亚甲基)-2-硝基苯基丙氨酸乙酯(C22)的合成。在0℃下，向N-(二苯亚甲基)甘氨酸乙酯(5.00，18.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中的溶液中小心地加入氢化钠(60%的油溶液，900mg，22.4mmol)，并且将该混合物在0℃下搅拌1小时。向冷的混合物中一次性加入C21(4.51g，18.7mmol)，并且将反应在0℃下搅拌30分钟。用水(100mL)猝灭反应，并且用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2×50mL)洗涤，干燥，过滤并真空浓缩。经由硅胶色谱(洗脱液∶6:1至4:1石油醚/乙酸
1
乙酯)纯化，得到呈褐色油状物的C22。产率∶4.5g,10.5mmol,56%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.16-1.20(t,3H),3.24-3.44(m,2H),4.02-4.19(m,2H),4.31-4.37(m,1H),6.59-6.69(m,2H),7.24-7.38(m,6H),7.39-7.42(m,1H),7.49-7.51(d,2H),7.56-7.71(m,2H)。
1
乙酯)纯化，得到呈褐色油状物的C22。产率∶4.5g,10.5mmol,56%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.16-1.20(t,3H),3.24-3.44(m,2H),4.02-4.19(m,2H),4.31-4.37(m,1H),6.59-6.69(m,2H),7.24-7.38(m,6H),7.39-7.42(m,1H),7.49-7.51(d,2H),7.56-7.71(m,2H)。
[0143] 步骤5.3-氰基-2-硝基苯基丙氨酸，HCl盐(C23)的合成。在室温下，向C22(2.00g，4.68mmol)中加入浓HCl水溶液(20mL)，并且将该反应在50℃下加热42小时。
真空浓缩得到的混合物，并且将残余物用乙酸乙酯(25mL)洗涤且过滤，得到呈黄色固体的C23。产率∶1.08g,3.98mmol,85%。
真空浓缩得到的混合物，并且将残余物用乙酸乙酯(25mL)洗涤且过滤，得到呈黄色固体的C23。产率∶1.08g,3.98mmol,85%。
[0144] 步骤6.{1-[(叔丁氧基羰基)氧基]-8-氰基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉基-3-基}氨基甲酸叔丁酯(C24)的合成。根据在实施例5中将C17转化成C18的一般
方法，将化合物C23转化成C24。获得呈黄色固体的C24。产率∶300mg,0.744mmol,19%。
1
H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.39-1.40(m,9H),1.49-1.55(m,9H),2.87-2.98(br
m,1H),3.30-3.51(br m,1H),4.40-4.60(br m,1H),5.55(br m,1H),7.09-7.14(m,1H),7.37-7.39(m,1H),7.52-7.54(d,1H)。
方法，将化合物C23转化成C24。获得呈黄色固体的C24。产率∶300mg,0.744mmol,19%。
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H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.39-1.40(m,9H),1.49-1.55(m,9H),2.87-2.98(br
m,1H),3.30-3.51(br m,1H),4.40-4.60(br m,1H),5.55(br m,1H),7.09-7.14(m,1H),7.37-7.39(m,1H),7.52-7.54(d,1H)。
[0145] 步骤7.(8-氰基-1-羟基-2-氧代-1,2,3,4-四氢喹啉基-3-基)氨基甲酸叔丁酯(C25)的合成。将乙酸(0.2mL)加入到C24(210mg,0.52mmol)在四氢呋喃(5mL)和水(5mL)中的溶液中，并且将该反应在50℃下搅拌5小时。在真空浓缩之后，用乙酸乙酯(10mL)萃取含水残余物。将有机层干燥，过滤且通过制备性薄层色谱纯化，得到呈黄色固体
1
的C25。产率∶140mg,0.46mmol,88%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.39(s,9H),2.82-2.89(m,1H),3.30-3.38(br m,1H),4.44-4.47(brm,1H),5.43(m,1H),7.05-7.12(m,1H),7.34-7.3
6(d,1H),7.54-7.56(d,1H)。
1
的C25。产率∶140mg,0.46mmol,88%。H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.39(s,9H),2.82-2.89(m,1H),3.30-3.38(br m,1H),4.44-4.47(brm,1H),5.43(m,1H),7.05-7.12(m,1H),7.34-7.3
6(d,1H),7.54-7.56(d,1H)。
[0146] 步骤8.实施例6的合成。将C25(140mg,0.46mmol)用HCl在1,4-二噁烷(6N,15mL)中的溶液处理，并且在室温下搅拌反应混合物6小时。慢慢地加入二乙醚(30mL)，搅拌该混合物30分钟，然后使其静置1小时。过滤收集沉淀，得到呈黄白色固体的
1
实施例6。产率∶48mg,0.20mmol,43%。LCMS m/z204.4(M+1)。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.16(dd,J=15,15Hz,1H),3.27(dd,J=15,6Hz,1H),4.47(dd,J=14.6,6.3Hz,1H),7.23(dd,J=7.6,7.6Hz,1H),7.65(d,J=7.3Hz,1H),7.74(d,J=7.7Hz,1H),8.76(br s,3H),11.5(v br s,1H)。
1
实施例6。产率∶48mg,0.20mmol,43%。LCMS m/z204.4(M+1)。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.16(dd,J=15,15Hz,1H),3.27(dd,J=15,6Hz,1H),4.47(dd,J=14.6,6.3Hz,1H),7.23(dd,J=7.6,7.6Hz,1H),7.65(d,J=7.3Hz,1H),7.74(d,J=7.7Hz,1H),8.76(br s,3H),11.5(v br s,1H)。
[0147] 人类KAT II抑制范围测定
[0148] 当L-犬尿氨酸(KYN)底物通过人KAT II(hKAT II)酶转化为KYNA时，通过370nm下吸光度(OD370)减小间接评价犬尿喹啉酸(KYNA)的形成。抑制剂因此将抑制OD370的减小。
[0149] 通过将下述试剂置于Costar384孔黑板(30μL总测定体积/孔)中进行所述方案：
[0150] ■10μL的3x浓缩化合物；
[0151] ■10μL的3x浓缩底物混合物(BGG(Sigma G-5009)；3mM L-犬尿氨酸，在150mM Tris乙酸盐中(Sigma K3750)；3mMα-酮戊二酸，在150mM Tris乙酸盐中(Sigma K2010)；和210μM5-磷酸吡哆醛(PLP)，在150mM Tris乙酸盐中(Sigma9255));和
[0152] ■10μL的3x浓缩酶(15nM酶，在含0.3％牛血清的150mM Tris乙酸盐中)。
[0153] 在从SpectraMax Plus板读数器上读取OD370之前，将板密封，使其在37℃下培养15-20h。通过比较化合物在抑制OD370值降低的浓度范围内相对于加入DMSO代替浓缩化合物的测定板的功效，产生IC50。实施例的生物学数据可见于表1和2。
[0154] 本发明的化合物是KATII的不可逆抑制剂。不可逆抑制剂的效价由kinact/KI最好地表征(See Copeland,R.A.;“Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery,”Wiley,2005)。
[0155] KATII动力学测定
[0156] 将试验化合物溶于100%DMSO中，并在100%DMSO中稀释至所需浓度。制备另外的水性稀释液，使得3x最终浓度的化合物在测定特定缓冲液中为1.0%DMSO。测试11个浓度的化合物。在测定板中的最终DMSO浓度等于0.33%。
[0157] 测定方法
[0158] 通过测定L-KYN底物在370nm的吸光度波长下的吸光度损失确定KATII酶活性。使用150mM Tris乙酸盐缓冲液(pH7.0)、1mM L-KYN、1mMα-酮戊二酸、70μM PLP、0.1%BGG、和30nM人KATII酶或5nM大鼠KATII酶KATII酶中任一种，以最终体积30μL和384孔格式进行KATII测定。将化合物稀释在100%DMSO中，并且在加入其它试剂之前点样。酶总是在最后加入。用胶带密封测定板的边缘周围，且立即采用SpectraMax平板读数器在370nm的吸光度波长下读数。将SpectraMax平板读数器设置为每5分钟读数一次，共读数16小时。
[0159] 进行下述步骤，以确保一致地产生动力学读出数据∶
[0160] 1.将10μL的化合物稀释液(在上述化合物制备中描述的)等分试样人工加入到测定板，接着快速旋转，以确保化合物收集在孔底部。
[0161] 2.然后，经由Multidrop仪器将10μL底物混合物(包含L-KYN、α-酮戊二酸和PLP)的等分试样加入到测定板。
[0162] 3.最终，最后加入10μL3x浓度的酶储液的等分试样以引发经由Multidrop仪器的反应。
[0163] 4.将微量培养板盖放置在测定板上，在湿度下用胶袋密封，且将测定板放置于SpectraMax读数器中。进行在板平台上的快速振动以确保混合，在室温下每5分中读取(370nm波长)吸光度，共读取16小时。
[0164] 效价测定(kinact/KI值)
[0165] 进行上述的直接底物吸光度损失测定以确定效价(kinact/KI值)。
[0166] 使用M.Mileni et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2008,10512820-12824and K.Ahn et al.Chem.Biol.2009,16,411-420描述的一般方法测定整体效价kinact/KI。在十一种浓度的抑制剂（最高剂量1mM和以两倍稀释至1nM）存在下，获得反应进程曲线(在A370nm随时间减少)。总是包括零抑制剂对照。以5分钟间隔收集16小时的吸光度读出数据。使用GraphPad Prism version5.01for Windows,GraphPad Software,San Diego,California USA进行数据分析。将各个进程曲线拟合为单相指数式衰减模型(方程式1)，以测定各个抑制剂浓度下的kobserved(kobs)值，其中At为在时间t的吸光度，A0为在t= 无限的吸光度，A1为全部吸光度变化(t=0和t=无限大之间的吸光度差异)，且kobs为酶失活的一级速率常数。对于人类KATII酶，使用6小时时间窗(5分钟至360分钟)获得所有抑制剂浓度的kobs值。然后，通过拟合kobs相对于[I]方程式2的曲线获得抑制剂电离常数(KI)和在无限大抑制剂浓度下酶失活的一级速率常数(kinact)。当[I]<
[0167]
[0168]
[0169]
[0170] 反应性代谢物测定方案
[0171] 使用如在Reactive Metabolite assay protocol参见J.R.Soglia et al.,J.Pharm.Biomed.Anal.2004,36,105-116中描述的反应性代谢物测定方案测量表2的代谢物活性。
[0172] 人类肝细胞测定(HHEP)
[0173] 人类肝细胞测定(HHEP)是一种用于监测肝脏代谢的体外系统，因为这些完整细胞包含所有体内存在的肝脏酶，包括I期酶(比如CYP，醛氧化酶和MAO)和II期酶(比如UDP-葡糖醛酸转移酶和磺基转移酶)。该测定的目的是基于表观体外固有清除率(CLint,app)对化合物分级。
[0174] 所述方案通过使用任一种下述介质进行：
[0175] a.Invitrogen custom粉末，其补充有292mg/mL L-谷氨酰胺，不含酚红。在使用之前，必须加入2.2 g/l的NaHCO3。向该介质充气95/5O2/CO2(或者空气/CO2)20-30分钟。调节pH至7.4，且温热至37℃。可选地，如果不在CO2培养箱中进行培养，则省去介质充气，且将HEPES加入到37℃介质中至最终浓度50mM，调节pH至7.4。然后，使介质过滤灭菌。
[0176] b.Invitrogen custom1x液体，其补充有24mM NaHCO3和50mM HEPES，不含酚红。在使用之前，必须加入292mg/mLL-谷氨酰胺。将介质温热至37℃。
[0177] c.Invitrogen custom1x液体，其补充有24mM NaHCO3，且不含酚红。在使用之前，必须加入292mg/mL L-谷氨酰胺。向该介质充气95/5O2/CO2(或者空气/CO2)20-30分钟，且调节pH至7.4。将介质且温热至37℃。
[0178] 将CO2培养箱装置设定为95/5空气/CO2，37℃和95%湿度。在96-孔或384-孔平底板中进行培养。
[0179] a.试验化合物(底物)的制备
[0180] 将试验化合物储液稀释在DMSO中，使得在肝细胞培养物中的最终DMSO浓度为≤0.1%。最终实验化合物浓度为1μM。三种需要的阳性对照的培养浓度(最初溶于DMSO中)∶0.1μM普萘洛尔、1.0μM咪达唑仑、1.0μM纳洛酮。
[0181] b.IVT冷藏保存的肝细胞的解冻方法
[0182] 制备多份5个捐赠者的冷藏保存的肝细胞。将小瓶在37-40℃的水浴中解冻直到75-90秒冰几乎全部熔融。将小瓶内含物倒入锥形管或烧瓶中。通过轻轻倒转再悬浮细胞。
将细胞在室温下以50-90g离心5分钟。弃去上清液。加入WEM，并将管轻轻地倒转以再悬浮肝细胞。通过使用锥虫蓝（Trypan Blue）排除法测定总细胞数和活细胞数量。将细胞颗粒物再悬浮在WEM中，以获得期望的细胞密度，之后将细胞分配到板中。
将细胞在室温下以50-90g离心5分钟。弃去上清液。加入WEM，并将管轻轻地倒转以再悬浮肝细胞。通过使用锥虫蓝（Trypan Blue）排除法测定总细胞数和活细胞数量。将细胞颗粒物再悬浮在WEM中，以获得期望的细胞密度，之后将细胞分配到板中。
[0183] c.培养条件
[0184] 使用96或384孔板。温度设定为37℃，CO2培养箱设定为95/5空气∶CO2，湿度95%。肝细胞密度为0.5百万活细胞/mL。最低初始肝细胞生存力(基于TBE)为70%。如果期望可以通过Percoll离心升高初始生存力。对于96-孔板，最终培养体积为小于或等于50μL，对于384-孔板，最终培养体积为小于或等于20μL。培养物的最终DMSO浓度不能大于0.1%。
[0185] d.测定标准和计算
[0186] 必须采取至少5个采样时间点，包括30、60、90和120分钟，但不应当超过240分2
钟。可报告数据的标准为回归线必须具有r大于或等于0.85，以便报道体外CLint。
钟。可报告数据的标准为回归线必须具有r大于或等于0.85，以便报道体外CLint。
[0187] e.方程式
[0188] a.CLint,app=[-斜率/0.5M细胞/mL]·1000μL/mL=μL/min/M细胞
[0189] 结果在表1和2中给出。
[0190] 表1
[0191]
[0192] 表2
[0193]
[0194] 狗的药代动力学研究
[0195] 通过向各组两只狗口服管饲法或IV施用来给药试验物质(实施例2-3)。两只雄性狗为来自Marshal Farms的比格犬，在开始处理时体重为约9至约12kg，年龄范围为约4至约6岁。
[0196] 血样的采集时间为给药之后0.25、0.5、1、2、4、7和24小时，且使用LC-MS-MS测定提供药物物质分析。使用Watson7.2.003测定源于血浆分析数据的药代动力学参数。结果在表3和表4中给出。