一种肿瘤细胞疫苗及其制备方法

摘要

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法。本发明要解决的技术问题是为本领域治疗肿瘤提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种新型的肿瘤细胞疫苗的制备方法。该方法是由脂多糖刺激肿瘤细胞得到肿瘤细胞疫苗。本发明制备肿瘤细胞疫苗的方法能够有效地制备出各种来源的肿瘤细胞疫苗，且制得的肿瘤细胞疫苗注射入机体后可诱导有效的免疫反应，特别是促进CD8阳性T细胞的激活和增殖，特异杀伤肿瘤细胞，从而起到预防和治疗肿瘤的目的。此外本发明方法简便，重复性强，成本低，具有很好的应用前景。

权利要求

1.肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)、在含有脂多糖的培养基中刺激培养肿瘤细胞，使肿瘤细胞达到对数生长期，所述含有脂多糖的培养基中的脂多糖的浓度1μg/ml；

2)、收集步骤1)处理后的肿瘤细胞，清洗去除LPS；

3)、在辐照灭活肿瘤细胞前，将清洗后的细胞用培养基重悬，调整至肿瘤细胞浓度为1×106～1×107/100μl；在无菌条件下辐照灭活肿瘤细胞，得到肿瘤细胞疫苗；所述辐照灭活的辐照剂量为50～100Gy。

2.根据利要求1所述的制备方法，其特征在于用含有脂多糖的培养基刺激培养肿瘤细胞的时间为2～96h。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述的肿瘤为：淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌。

4.肿瘤细胞疫苗，其特征在于由权利要求1～3任一项所述的方法制备而成。

5.权利要求4所述的肿瘤细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的抗肿瘤药物的剂型为注射剂。

说明书

一种肿瘤细胞疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于疫苗领域，具体涉及一种抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法。技术背景

[0002] 肿瘤作为一种严重威胁人类健康和生命的疾病，其治疗方法包括手术，化疗，放疗等多种方法，但是其治疗效果往往不甚理想。近年来，肿瘤细胞疫苗作为一种有潜力的新型的针对肿瘤治疗及预防的手段已经引起了越来越多的关注。

[0003] 肿瘤细胞自身含有多种已知和未知的抗原，虽然可以引起机体的免疫反应，但是由于肿瘤细胞的免疫原性低，通常情况下所引起的免疫反应都不足以抵抗肿瘤细胞的侵袭。因此，增强肿瘤细胞的免疫原性成为肿瘤疫细胞苗的亟待解决的关键问题。现在，增强肿瘤细胞的免疫原性的方法主要有以下几种：(1)通过基因工程修饰肿瘤细胞，如向肿瘤细胞中导入相关细胞因子的基因或与抗原提成有关的分子基因；(2)将肿瘤细胞与相关细胞因子共同培养，如GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-12等；(3)添加免疫佐剂等。

[0004] 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，是内毒素，在革兰氏阴性菌感染及疾病演化中起重要作用。LPS具有复杂的生物活性，可以引起机体强烈的免疫反应，LPS刺激细胞可以启动细胞内的信号转导链，激活NF-κB、MAPK、p38等信号通路，启动基因转录因子，表达和释放多种细胞因子，如CCL3、CCL5、CXCL8、CXCL10等。而射线辐照是一种常用的灭活细胞的方法，在制备肿瘤疫苗中经常被使用。

[0005] 目前还没有使用辐射照射灭活经LPS刺激的肿瘤细胞制备成肿瘤细胞疫苗的报道，而本领域也需要提供新的有效的肿瘤疫苗以供选择。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是为本领域治疗肿瘤提供一种新的有效选择。

[0007] 本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种新型的肿瘤细胞疫苗的制备方法。该方法是由脂多糖刺激肿瘤细胞得到肿瘤细胞疫苗。

[0008] 进一步的，该方法包括以下步骤：

[0009] 1)、在含有脂多糖的培养基中刺激培养肿瘤细胞，使肿瘤细胞达到对数生长期；

[0010] 2)、收集步骤1)处理后的肿瘤细胞，清洗去除LPS；

[0011] 3)、在无菌条件下辐照灭活肿瘤细胞，得到肿瘤细胞疫苗。

[0012] 其中，上述方法中所述的含有脂多糖的培养基中的脂多糖的浓度为0.01～10μg/ml。优选的，所述含有脂多糖的培养基中的脂多糖的浓度为1μg/ml。

[0013] 进一步的，上述方法在辐照灭活肿瘤细胞前，将清洗后的细胞重悬，按疫苗的最终使用浓度要求调整浓度。优选的，调整肿瘤细胞浓度至1×106～1×107/100μl。

[0014] 其中，上述方法中辐照灭活的辐照剂量为50～100Gy。

[0015] 其中，上述上述方法中用含有脂多糖的培养基刺激培养肿瘤细胞的时间为6～96h。优选的，刺激培养肿瘤细胞的时间为48h。

[0016] 其中，上述方法中所述的肿瘤为：血液肿瘤、黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等。所述血液肿瘤主要包括白血病、多发性骨髓瘤以及淋巴瘤。

[0017] 本发明还提供了一种肿瘤细胞疫苗。该肿瘤细胞疫苗是上述的肿瘤细胞疫苗制备方法所制备而成。

[0018] 本发明还同时提供了上述的肿瘤细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步的，所述的抗肿瘤药物的剂型为注射剂。

[0019] 为了研制一种新型的更为有效的肿瘤细胞疫苗，本发明使用LPS刺激体外培养的肿瘤细胞，然后经过射线辐照灭活。分别通过预防性免疫和治疗性免疫实验证明，本发明方法可以有效提高肿瘤细胞的免疫原性，诱导机体产生有效的免疫应答反应，对肿瘤有预防和治疗效果。提供一种有前景的肿瘤预防和治疗的手段。本发明中的脂多糖可选用各种来源的脂多糖，一般的是革兰氏阴性菌来源的脂多糖。在本发明后附的实例中，优选使用的是大肠杆菌来源的脂多糖。

[0020] 根据本发明的第一个方面，本发明肿瘤细胞疫苗的制备方法可用于各种肿瘤细胞进行疫苗的制备，包括但不限于商品化的细胞株、实验室改造的细胞株、肿瘤裂解物、实体瘤分离的单个细胞等。同时，本发明方法可以适用于各种肿瘤细胞疫苗的制备，并不只限于本发明实施案例中使用的细胞类型和种类。

[0021] 本发明方法制备得到的肿瘤疫苗，可马上使用，也可在-80℃保存备用。推荐现制备现使用。

[0022] 使用的辐照所采用的放射线种类可包括X射线，γ射线，同位素放射源射线Co60等；只要达到规定的剂量，灭活肿瘤细胞即可。辐照可在细胞计数前，也可在细胞计数后。辐照时，按要求是要将细胞放置于非金属容器中。

[0023] 更具体的，本发明肿瘤疫苗制备方法包括以下步骤：①在培养基中加入LPS，体外培养细胞，使细胞处于对数增长期；所述LPS浓度推荐1μg/ml；②离心收集步骤①所述的肿瘤细胞，至少清洗3遍，清洗干净即可；主要为了避免残存LPS的影响；③将步骤②净化处理的肿瘤细胞重悬，细胞计数，调整细胞浓度为最终使用浓度；细胞终浓度推荐为1×106～1×107/100μl；④将步骤③所述的肿瘤细胞移至非金属容器中，放射线辐照，得到的即为该肿瘤疫苗；辐照剂量推荐50～100Gy得到本发明肿瘤细胞疫苗。

[0024] 本领域技术人员容易理解，上述步骤①中所述的培养是指含有满足正常细胞生长所需物质的培养基(如1640培养基等常规的肿瘤细胞培养基)对细胞进行培养，加入LPS共同培养时间推荐为48h。培养基只要是适合细胞生长，并不只限于本发明所涉及的培养基种类。

[0025] 步骤②要对细胞进行清洗，推荐使用无菌生理盐水或者PBS，但并不只限于这些溶剂，可以使用各种不引起机体过敏反应的具有缓冲能力的溶剂；清洗收集细胞离心推荐转速为1000rpm/min，3～5min。

[0026] 辐照时优选的的方式是由金属铜片至于辐射源和肿瘤细胞之间隔绝产热的低能射线，且低剂量长时间照射以达到灭活至无增殖能力的效果，不破坏肿瘤细胞为佳。最好能保持细胞的完整性和免疫原性。

[0027] 根据本发明的第二个方面，本发明提供了有上述的方法制备得到的肿瘤细胞疫苗。

[0028] 本发明肿瘤细胞疫苗可放在-80℃保存备用，在需要用的时候融化使用，也可制备后立即使用。本发明所提供肿瘤疫苗可以通过皮下、腹腔或肌肉等方式注射给药，对个体进行免疫，以抑制肿瘤的生成与生长。当然也可以采用本领域的其他可用方式进行免疫，或者是多种方式的组合。

[0029] 本发明肿瘤细胞疫苗制剂，可以有不同的免疫时间间隔。可以给药一次，也可以多次。具体实施过程中可以根据实际情况改变或者调整免疫次数和免疫时间点。比如在预防性免疫时，采用第0，14，28天共3次的免疫时间间隔的给药方式。比如在治疗性免疫时，采用每周一次的免疫时间间隔。

[0030] 实现本发明的目的之三的技术方案是：上述所述肿瘤疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。在作为抗肿瘤药物使用时，本发明肿瘤细胞疫苗可单独使用或与其它抗肿瘤药物、抗体、疫苗或方法等联合使用，如放疗、热疗等，但不仅限于这些方法。

[0031] 本发明方法的有益效果在于：本发明制备肿瘤细胞疫苗的方法能够有效地制备出各种来源的肿瘤细胞疫苗，且制得的肿瘤细胞疫苗注射入机体后可诱导有效的免疫反应，特别是促进CD8阳性T细胞的激活和增殖，特异杀伤肿瘤细胞，从而起到预防和治疗肿瘤的目的。实验证明本发明方法制得的多种肿瘤细胞疫苗都表现出了很好的预防和治疗效果，并且具有较好的安全性。此外本发明方法简便，重复性强，成本低，具有很好的应用前景。

附图说明

[0032] 图1是本发明的肿瘤细胞疫苗的制备工艺中的一个较为详细的流程示意图。

[0033] 图2显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗在小鼠淋巴瘤E.G7移植瘤模型中具有显著的抗肿瘤作用。

[0034] 图3显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗可以诱导针对肿瘤细胞的特异性CTL反应。

[0035] 图4显示了经LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗免疫后，分离小鼠脾脏中的T淋巴细胞用于细胞过继治疗，也表现出很好地抗肿瘤效果。

[0036] 图5显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗可以显著延长E.G7荷瘤小鼠的存活时间。

[0037] 图6显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗可以显著降低小鼠E.G7移植瘤的成瘤率。

[0038] 图7显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗在小鼠黑色素瘤B16-F10移植瘤模型中具有明显的抗肿瘤作用。

[0039] 图8显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗可以显著延长B16-F10荷瘤小鼠的存活时间。

[0040] 图9显示了LPS刺激后的肿瘤细胞疫苗可以显著减少小鼠结肠癌CT26腹腔瘤模型中腹腔肿瘤结节，具有很好的抗肿瘤作用。

具体实施方式

[0041] 下面结合附图对本发明作进一步的描述说明。以下实施中将进一步说明该肿瘤细胞疫苗的制备和使用方法，本发明包括但不限于以下实施中所列举的具体方法步骤。

[0042] 实施例1：LPS刺激的淋巴瘤细胞疫苗的制备

[0043] 1、实验材料和试剂

[0044] 小鼠肿瘤细胞—EG.7淋巴瘤细胞(购自American Type Culture Collection，ATCC，

[0045] CRL-2113)，1640培养基(购自Gibco公司,A10491-01)，LPS(购自Sigma公司，L4005-100MG)。

[0046] 2、实验步骤

[0047] 体外培养(本实例中为1640+10％FBS)小鼠肿瘤细胞(本实例中的肿瘤细胞为小鼠淋巴瘤细胞EG.7)，将培养的细胞分为两组：一组加入1μg/ml LPS刺激培养；一组使用正常培养基培养。48h后，用无血清和无抗生素的双无培养基清洗细胞3遍，收集细胞与离心管中，以双无的培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至1×107/ml，75Gy辐照灭活。其中加入了LPS的培养基培养的为实验组(EG.7/LPS)，使用正常培养基培养的为对照组(EG.7)；另外设置生理盐水同为对照组(saline)。

[0048] 实施例2：淋巴瘤细胞疫苗预防小鼠移植瘤的生存与生长

[0049] 1、实验材料和试剂

[0050] 小鼠肿瘤细胞同实施例1，6-8周龄雌性SPF级C57小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)

[0051] 2、实验步骤

[0052] C57小鼠随机分为3组(saline，EG.7，EG.7/LPS)，每组10只，saline：对照组；EG.7：未刺激的肿瘤细胞疫苗；EG.7/LPS：LPS刺激的肿瘤细胞疫苗；分别在各组小鼠的左背侧皮下注射疫苗，分为3点注射，以开始第一次免疫的时间为第0天，然后分别在第14天、21天免疫第2次和第3次，第28天时在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋巴瘤细胞3×106/只，建立小鼠移植瘤模型，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。实验结果显示，见图2，与对照组(salline)和未经LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(EG.7)相比，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(EG.7/LPS)的肿瘤生长明显得到抑制，其中有半数左右未成瘤。

[0053] 实施例3：淋巴瘤细胞疫苗刺激肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能[0054] 1、实验材料和试剂

[0055] 小鼠同实施例2，小鼠肿瘤细胞同实施例1，淋巴细胞分离液(购自达科为生物技术有限公司，DKW33-R0100)，Na251CrO4(购自四川大学同位素实验室)，70μm尼龙网过滤器(购自BD Falcon公司，352350)，圆底96孔板(购自康宁公司，costar3599)

[0056] 2、实验步骤

[0057] 细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能检测采用51Cr释放试验检测

[0058] 小鼠免疫同实施例2中所述，第28天时每组随机取3只小鼠。无菌条件下解剖小鼠，分离脾脏，使用70μm尼龙网过滤器碾磨分散脾脏细胞，加入淋巴细胞分离液分离制备单个脾脏淋巴细胞。将分离的脾脏淋巴细胞用培养基清洗3遍，离心后重悬，细胞计数，调整细胞浓度至1×107/ml,获得的淋巴细胞即为效应细胞。

[0059] 收集体外培养的肿瘤细胞E.G7，细胞计数，用培养基将肿瘤细胞的浓度调整至1×107/ml，取200μl细胞，加入100μciNa251CrO4，37℃孵育2h进行标记，清洗3次后，细胞计数，将
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细胞浓度调整至1×10/ml，获得的 Cr标记的肿瘤细胞即为靶细胞。

[0060] 将靶细胞悬液加入圆底96孔板中，每孔100μl，设3个副孔，按照表1的不同比例加入效应细胞：

[0061] 表1

[0062]

[0063] 每孔加入100μl的51Cr标记的肿瘤细胞，自然释放组加入100μl培养基，最大释放组加入100μl1％Triton X-100。96孔板水平砖头500rpm/min离心5min，37℃，5％CO2孵箱中培养，4～6小时后，96孔板水平砖头1000rpm/min离心5min，每孔吸取100μl上清，Backmen550B型γ计数仪检测cpm值。

[0064] CTL杀伤率计算公式为：杀伤率％＝〔(实验组cpm-自然释放组cpm)/(对照组cpm-自然释放组cpm)〕×100％。

[0065] 实验结果显示，见图3，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(EG.7/LPS)能有效地诱导的针对肿瘤细胞的特异性CTL反应，并且作用明显优于对照组(saline)和未刺激的肿瘤细胞疫苗组(EG.7)。

[0066] 实施例4：淋巴瘤细胞疫苗免疫诱导的小鼠T淋巴细胞过继治疗移植瘤

[0067] 1、实验材料和试剂

[0068] 小鼠同实施例2，小鼠肿瘤细胞同实施例1，淋巴细胞分离液同实施例3，70μm尼龙网过滤器同实施例3

[0069] 2、实验步骤

[0070] 小鼠右后方注射EG.7细胞3×106/只，建立小鼠移植瘤模型，随机分为3组，每组5只，其中：saline为生理盐水对照组；E.G7为未刺激的肿瘤细胞疫苗组；E.G7/LPS为LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组。在建立小鼠移植瘤模型前一天，经尾静脉注射实施例3中所述获取的脾脏淋巴细胞，建立移植瘤后3天再次经尾静脉注射实施例3中所述获取的脾脏淋巴细胞，每周两次，连续3周，每3天观察小鼠肿瘤体积的变化。

[0071] 实验结果显示，见图4，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7/LPS)的治疗效果优于对照组(saline)和未刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7)，比较各组的肿瘤体积LPS刺激组的淋巴细胞具有显著的抗肿瘤作用。

[0072] 实施例5：延长荷瘤小鼠的生存期和抑制小鼠成瘤率的试验结果

[0073] 处理C57小鼠同实施例2所述，建立小鼠移植瘤模型后观察小鼠的成瘤率与小鼠的生存状况。

[0074] 实验结果分别见图5和图6，结果显示LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7/LPS)的生存期明显长于对照组(salline)和未刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7)；且LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7/LPS)的小鼠肿瘤发生率(％)明显低于于对照组(salline)和未刺激的肿瘤细胞疫苗组(E.G7)。

[0075] 实施例6：黑色素瘤细胞疫苗的制备

[0076] 1、实验材料和试剂

[0077] 小鼠黑色素瘤细胞B16-F10(购自American Type Culture Collection，ATCC，CRL-6475)，1640培养基(购自Gibco公司,A10491-01)，LPS(购自Sigma公司，L4005-100MG)。

[0078] 2、实验步骤

[0079] 体外培养(本实例中培养基为1640+10％FBS)小鼠肿瘤细胞(本实例中的肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16-F10)，将培养的细胞分为两组：一组加入1μg/ml LPS刺激培养；一组使用正常培养基培养。48h后，分别以双无培养基清洗细胞3遍，收集细胞与离心管中，以7
双无的培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至1×10/ml，100Gy辐照灭活。其中加入了LPS的培养基培养的为实验组(B16-F10/LPS)，使用正常培养基培养的为对照组(B16-F10)；另外设置生理盐水组同为对照组(saline)。

[0080] 实施例7：黑色素瘤细胞疫苗预防小鼠移植瘤的生存与生长

[0081] 1、实验材料和试剂

[0082] 小鼠肿瘤细胞及细胞疫苗同实施例7，6-8周龄雌性SPF级C57小鼠

[0083] 2、实验步骤

[0084] C57小鼠随机分为3组(saline，B16-F10，B16-F10/LPS)，每组10只，saline：对照组；B16-F10：未刺激的肿瘤细胞疫苗；B16-F10/LPS：LPS刺激的肿瘤细胞疫苗；分别在各组小鼠的左背侧皮下注射疫苗，分为3点注射，以开始第一次免疫的时间为第0天，然后分别在第14天、21天免疫第2次和第3次，第28天时在小鼠的右侧皮下注射小鼠淋巴瘤细胞106/只，建立小鼠移植瘤模型，每3天观察小鼠肿瘤体积的变化。

[0085] 实验结果显示，见图7，与对照组(salline)和未经LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(B16-F10)相比，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(B16-F10/LPS)的肿瘤生长明显得到抑制。

[0086] 实施例8：黑色素瘤细胞疫苗预防小鼠移植瘤，延长小鼠的生存期

[0087] 处理C57小鼠同实施例7所述，建立B16-F10小鼠移植瘤模型后观察小鼠的生存状况。

[0088] 实验结果显示，见图8，与对照组相比，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(B16-F10/LPS)小数的生存期明显得到延长。

[0089] 实施例9：结肠癌肿瘤细胞疫苗的制备

[0090] 1、实验材料和试剂

[0091] 小鼠结肠癌细胞CT26，1640培养基(购自Gibco公司,A10491-01)，LPS(购自Sigma公司，L4005-100MG)。

[0092] 2、实验步骤

[0093] 体外培养(本实例中为1640+10％FBS)小鼠肿瘤细胞(本实例中的肿瘤细胞为结肠瘤细胞CT26)，将培养的细胞分为两组：一组加入1μg/ml LPS刺激培养；一组使用正常培养基培养。48h后，分别以双无培养基清洗细胞3遍，收集细胞与离心管中，以双无的培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度至1×107/ml，50Gy辐照灭活。其中加入了LPS的培养基培养的为实验组(CT26/LPS)，使用正常培养基培养的为对照组(CT26)；另外设置生理盐水同为对照组(saline)。

[0094] 实施例10：结肠癌肿瘤细胞疫苗治疗小鼠结肠癌腹腔瘤

[0095] 1、实验材料和试剂

[0096] 小鼠肿瘤细胞同实施例10，6-8周龄雌性SPF级Balb/c小鼠

[0097] 2、实验步骤

[0098] Balb/c小鼠随机分为3组(saline，CT26，CT26/LPS)，每组10只，saline：对照组；CT26：未刺激LPS的肿瘤细胞疫苗；CT26/LPS：LPS刺激的肿瘤细胞疫苗；分别在各组小鼠的背部皮下注射疫苗，分为3点注射，以开始第一次免疫的时间为第0天，然后分别在第14天、
21天免疫第2次和第3次，第28天时在小鼠的腹腔注射小鼠结肠瘤细胞5×105/只，建立小鼠腹腔瘤模型，26天后处死小鼠，计数各组小鼠腹腔内肿瘤结节数以及大于3mm的肿瘤结节数。

[0099] 实验结果显示，见图9，与对照组相比，LPS刺激的肿瘤细胞疫苗组(CT26/LPS)小鼠腹腔内总的结节数以及大于3mm的肿瘤结节数都明显少于对照组(salline)和未刺激的肿瘤细胞疫苗组(CT26)。

[0100] 通过上述实验表明。本发明肿瘤细胞疫苗的方法能够有效地制备出各种来源的肿瘤细胞疫苗，且制得的肿瘤细胞疫苗都表现出了很好的预防和治疗效果，并且具有较好的安全性。本发明方法简便，重复性强，成本低，具有很好的应用前景。