一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法

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一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法
申请号	CN202010505417.9	申请日	2020-06-05	公开(公告)号	CN111675743A	公开(公告)日	2020-09-18
申请人	宁夏泰益欣生物科技有限公司;			发明人	张萍; 陈德刚;
摘要	本发明涉及一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其工艺步骤包括对多杀菌素发酵液采用内肽酶和尿素的预处理以及之后采用四氢吡喃的提取、固液分离、水洗、溶解、卷式超滤膜过滤、结晶、干燥等过程。本发明采用膜过滤工艺代替现有技术中的萃取、大孔树脂吸附或层析或离子交换工艺，取消了菌渣干燥、萃取和重结晶等工艺，在提取过程中只使用了单一的有机溶剂，同目前国内常规工艺相比，具有提取收率高，产品质量优，提取工艺简捷，生产成本低等优势，有利于增强产品的国内外市场竞争力。
权利要求	1.一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于其工艺步骤为：（1）预处理将多杀菌素发酵液加水稀释，后加入内肽酶和尿素，充分搅拌后静置处理，再加入氧化钙调节pH至8～10，充分搅拌后用磷酸调节pH至3～5；（2）提取在预处理后的多杀菌素发酵液中加入四氢吡喃，充分搅拌后静置处理，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液；（3）固液分离用氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至8～10，固液分离得到多杀菌素粗品；（4）水洗、溶解将多杀菌素粗品用氢氧化钠溶液水洗，之后再加入纯化水溶解，用磷酸调节pH至3～5；（5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤，得到多杀菌素溶液；（6）结晶、干燥向多杀菌素溶液中加入氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种多杀菌素成品，调节pH至9～10，静置处理，后过滤、干燥得到多杀菌素。 2.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述稀释用水量为多杀菌素发酵液体积的10～20%，所述内肽酶用量为0.1～0.3kg/m3，所述尿素用量为5～10 kg/m3；所述搅拌时间20～40min，静置处理时间150～190min。 3.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述四氢吡喃用量为多杀菌素发酵液体积40～60%；所述搅拌时间20～40min，静置处理时间120～160min。 4.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述水洗时间20～30min；所述溶解是指加入纯化水溶解至溶液浓度20～40%。 5.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述超滤采用错流超滤，期间控制压力0.3～0.6MPa，膜通量80～100L/m2.h，其中所用卷式超滤膜的截留物质分子量为1000以上，膜材质是聚苯乙烯塑料。 6.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述晶种多杀菌素成品的加量为多杀菌素粗品质量的0.1～0.5%。 7.按照权利要求1所述的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于所述磷酸质量浓度为20～30%；所述氢氧化钠溶液的质量浓度控制在20～30%。
说明书全文	一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法技术领域 [0001] 本发明属于抗生素提取技术领域，特别是涉及一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法。背景技术 [0002] 多杀菌素是放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯类抗生素，分子结构中含有一个二十二元内酯环、一个鼠李糖及一个福乐糖胺，在水中溶解度很小，易溶于醇类、酯类等多种极性、非极性有机溶剂。经有氧发酵后刺糖多孢菌发酵液中主要含有多杀菌素A(85～90%)和多杀菌素D(10～15%)两种活性成分，同时还含有少量B、C、E、F、H、J、K、L等多种结构类似组分。多杀菌素是一种广谱的生物农药，杀虫活性远远超过有机磷、氨基甲酸酯、环戊二烯和其它杀虫剂。 [0003] 目前，国内外相关文献公开了多杀菌素提取纯化工艺，主要步骤是将多杀菌素发酵液经预处理、板框过滤得到湿菌渣，再经干燥、萃取或吸附剂吸附或大孔树脂吸附或层析或离子交换、重结晶等工艺提取得到纯化的多杀菌素，上述工艺存在的问题是：1、以膨润土、活性炭、壳聚糖等吸附剂吸附提取，缺点是收率低，同时还会增加环保处理吸附剂的成本。 [0004] 2、采用萃取方法提取，缺点是萃取周期长，萃取的收率较低，同时由于使用了较多的有机溶剂，增加了环保处理成本。 [0005] 3、采用大孔树脂吸附或层析或离子交换技术提取纯化多杀菌素，存在的问题是：生产周期较长，过程中采用了大量的有机溶剂，增加了废水处理成本，提取收率不高。 [0006] 4、采用重结晶工艺纯化多杀菌素，存在的问题是生产周期长，降低了收率，增加了废水处理成本。 [0007] 5、产品总收率低。经试验验证，采用以上方法提取多杀菌素，收率不超过85%。发明内容 [0008] 本发明的目的在于克服上述现有技术中的缺陷，提供一种有效提高多杀菌素提取收率，降低生产成本，且提取工艺简单的从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法。 [0009] 为实现上述目的所采取的技术方案为：一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，其特征在于其工艺步骤为：（1）预处理将多杀菌素发酵液加水稀释，后加入内肽酶和尿素，充分搅拌后静置处理，再加入氧化钙调节pH至8～10，充分搅拌后用磷酸调节pH至3～5；（2）提取在预处理后的多杀菌素发酵液中加入四氢吡喃，充分搅拌后静置处理，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液；（3）固液分离用氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至8～10，固液分离得到多杀菌素粗品；（4）水洗、溶解将多杀菌素粗品用氢氧化钠溶液水洗，之后再加入纯化水溶解，用磷酸调节pH至3～5；（5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤，得到多杀菌素溶液；（6）结晶、干燥向多杀菌素溶液中加入氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种多杀菌素成品，调节pH至9～10，静置处理，后过滤、干燥得到多杀菌素。 [0010] 步骤（1）中，所述稀释用水量为多杀菌素发酵液体积的10～20%，所述内肽酶用量为0.1～0.3kg/m3，所述尿素用量为5～10 kg/m3；所述搅拌时间20～40min，静置处理时间150～190min。 [0011] 步骤（2）中，所述四氢吡喃用量为多杀菌素发酵液体积40～60%；所述搅拌时间20～40min，静置处理时间120～160min。 [0012] 步骤（4）中，所述水洗时间20～30min；所述溶解是指加入纯化水溶解至溶液浓度20～40%。 [0013] 步骤（5）中，所述超滤采用错流超滤，期间控制压力0.3～0.6MPa，膜通量80～100L/m2.h，其中所用卷式超滤膜的截留物质分子量为1000以上，膜材质是聚苯乙烯塑料。 [0014] 步骤（6）中，所述晶种多杀菌素成品的加量为多杀菌素粗品质量的0.1～0.5%。 [0015] 所述磷酸质量浓度为20～30%；所述氢氧化钠溶液的质量浓度控制在20～30%。 [0016] 多杀菌素属于胞内产物，但是在发酵液中也存在大约3%的多杀菌素。现有技术中，是将发酵液进行预处理后得到的菌渣进行提取纯化，而发酵液中的多杀菌素没有进行处理，这是多杀菌素提取率相对较低的主要原因。本发明将多杀菌素发酵液作为提取对象，发酵液经预处理后加入有机溶剂（尿素）和内肽酶，使得胞内产物多杀菌素进入发酵液中，再将发酵液经固液分离、水洗、膜过滤、结晶干燥得到纯品多杀菌素。同国内常规生产工艺比较，优势是产品收率高，质量稳定，经测算，采用本发明工艺，多杀菌素提取纯化收率在90%以上，多杀菌素（多杀菌素A和D总含量）纯度达到了98%以上。 [0017] 同时本发明的技术优势还体现在：1、本发明采用膜过滤工艺代替现有技术中的萃取、大孔树脂吸附或层析或离子交换工艺，可大大简化提取工艺步骤，并且替代传统的活性炭脱色、树脂除杂、结晶萃取等纯化过程，达到脱色、除杂及产品分级的目的。 [0018] 2、本发明在提取过程中，只使用了单一的有机溶剂，便于回收和再次利用，降低了环保成本。 [0019] 3、本发明同时取消了菌渣干燥、萃取和重结晶等工艺，进一步简化了工艺步骤，降低了生产成本。 [0020] 综上所述，本发明同目前国内常规工艺相比，具有提取收率高，产品质量优，提取工艺简捷，生产成本低等优势，且提取过程中，仅使用了单一有机溶剂，便于回收和再次利用，有利于环保。具体实施方式 [0021] 下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。 [0022] 本发明所用的多杀菌素发酵液是目前国内常规技术生产的，即利用刺糖多孢菌，采用三级发酵模式生产，其培养基中的氮源主要是黄豆粉、酵母粉、蛋白胨和玉米浆，碳源主要是葡萄糖及淀粉。 [0023] 下述实施例中，超滤采用错流超滤方式，期间压力控制在0.3～0.6MPa，膜通量控2 制在80～100L/m .h，其中所用卷式超滤膜的截留物质分子量为1000以上，膜材质是聚苯乙烯塑料（PS）。 [0024] 实施例1多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.4g/L。 [0025] 多杀菌素发酵液中固形物1.1吨，效价52.7g/kg。 [0026] （1）发酵液预处理在多杀菌素发酵液中加入饮用水0.5m3进行稀释。 [0027] 然后加入内肽酶0.5kg和尿素25kg，搅拌20min，静置150min。 [0028] 再加入氧化钙调节pH至8，搅拌20min，然后加入质量浓度为20%的磷酸，调节pH至5。 [0029] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃2m3，搅拌20min，静置120min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0030] （3）固液分离、减压蒸馏采用20%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至8，固液分离后得到多杀菌素粗品 58.6kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0031] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用20%氢氧化钠溶液水洗20min，之后加入纯化水溶解，用质量浓度为20%磷酸调节pH至5，浓度23.5%。 [0032] （5）膜过滤采用卷式超滤膜超滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液249L。 [0033] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度20%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）6g，调节pH至9，静置120min，过滤后干燥得到多杀菌素54.3kg。 [0034] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.2%，其中多杀菌素A含量为86.4%，多杀菌素D含量为11.8%。 [0035] 收率：90.5%多杀菌素成品数量/（发酵液体积效价+固形物数量效价）。 [0036] 实施例23 多杀菌素发酵液5m ，其中发酵液效价0.3g/L。 [0037] 多杀菌素发酵液中固形物1.2吨，效价49.8g/kg。 [0038] （1）发酵液预处理在多杀菌素发酵液中加入饮用水0.6m3进行稀释。 [0039] 然后加入内肽酶1.2kg和尿素45kg，搅拌30min，静置180min。 [0040] 再加入氧化钙1.4kg，调节pH至8.4，搅拌22min，然后加入质量浓度为23%的磷酸，调节pH至4.5。 [0041] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃3m3，搅拌40min，静置160min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0042] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度23%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至8.5，固液分离后得到多杀菌素粗品60.3kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0043] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用质量浓度23%氢氧化钠溶液水洗25min，之后加入纯化水溶解，用23%磷酸调节pH至4.5，浓度22.8%。 [0044] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液264L。 [0045] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度23%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）12g，调节pH至9.2，静置130min，过滤后干燥得到多杀菌素55.9kg。 [0046] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.6%，其中多杀菌素A含量为85.9%，多杀菌素D含量为12.7%。 [0047] 收率：91.3%。 [0048] 实施例3多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.32g/L。 [0049] 多杀菌素发酵液中固形物1.1吨，效价49.8g/kg。 [0050] （1）发酵液预处理多杀菌素发酵液中加入饮用水0.7m3。 [0051] 然后加入内肽酶0.7kg和尿素27kg，搅拌25min，静置160min。 [0052] 再加入氧化钙1.6kg，调节pH至9，搅拌25min，其次加入质量浓度25%磷酸，调节pH至4。 [0053] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃2.2m3，搅拌25min，静置130min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0054] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度25%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至9，固液分离后得到多杀菌素粗品54.5kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0055] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用25%氢氧化钠溶液水洗30min，之后加入纯化水溶解，用25%磷酸调节pH至4，浓度24.6%。 [0056] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液220L。 [0057] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度25%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）16g，调节pH至9.5，静置140min，过滤后干燥得到多杀菌素52.6kg。 [0058] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.9%，其中多杀菌素A含量为88.7%，多杀菌素D含量为10.1%。 [0059] 收率：93.4%。 [0060] 实施例4多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.35g/L。 [0061] 多杀菌素发酵液中固形物1.2吨，效价48.4g/kg。 [0062] （1）发酵液预处理多杀菌素发酵液中加入饮用水0.8m3。 [0063] 然后加入内肽酶1kg和尿素35kg，搅拌30min，静置170min。 [0064] 再加入氧化钙1.7kg，调节pH至9.4，搅拌27min，之后加入质量浓度28%磷酸，调节pH至3.5。 [0065] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃2.5m3，搅拌30min，静置140min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0066] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度27%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至9.5，固液分离后得到多杀菌素粗品58.6kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0067] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用27%氢氧化钠溶液水洗35min。 [0068] 多杀菌素粗品加入纯化水，用28%磷酸调节pH至3.5，浓度25.1%。 [0069] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液233L。 [0070] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度27%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）23g，调节pH至9.5，静置150min，过滤后干燥得到多杀菌素55.5kg。 [0071] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.9%，其中多杀菌素A含量为87.8%，多杀菌素D含量为11.1%。 [0072] 收率：92.5%。 [0073] 实施例53 多杀菌素发酵液5m ，其中发酵液效价0.33g/L。 [0074] 多杀菌素发酵液中固形物1吨，效价58.2g/kg。 [0075] （1）发酵液预处理多杀菌素发酵液中加入饮用水1m3稀释。 [0076] 然后加入内肽酶1.5kg和尿素50kg，搅拌40min，静置190min。 [0077] 再加入氧化钙1.8kg，调节pH至10.0，搅拌30min，之后加入30%磷酸，调节pH至3.0。 [0078] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃2.8m3，搅拌35min，静置150min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0079] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度30%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至9.5，固液分离后得到多杀菌素粗品58.1kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0080] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用质量浓度30%氢氧化钠溶液水洗40min，之后加入纯化水，用30%磷酸调节pH至3.0，浓度28.1%。 [0081] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液205L。 [0082] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度30%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种 29g，调节pH至10，静置160min，过滤后干燥得到多杀菌素54.9kg。 [0083] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.9%，其中多杀菌素A含量为87.5%，多杀菌素D含量为11.4%。 [0084] 收率：91.9%。 [0085] 实施例6多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.37g/L。 [0086] 多杀菌素发酵液中固形物1.1吨，效价52.7g/kg。 [0087] （1）发酵液预处理多杀菌素发酵液中加入饮用水0.5m3。 [0088] 然后加入内肽酶0.5kg和尿素50kg，搅拌20min，静置190min。 [0089] 再加入氧化钙1.4kg，调节pH至8.1，搅拌20min，之后加入质量浓度20%磷酸，调节pH至3。 [0090] （2）提取在预处理后的发酵液中加入四氢吡喃2.1m3，搅拌20min，静置160min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0091] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度20%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至8.1，固液分离后得到多杀菌素粗品57.6kg。水和四氢呋喃减压蒸馏（控制溶液温度65～70℃，压力-0.1～0.05MPa），回收四氢呋喃。 [0092] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用质量浓度20%氢氧化钠溶液水洗20min。 [0093] 多杀菌素粗品加入纯化水，用20%磷酸调节pH至4.8，浓度26.4%。 [0094] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液247L。 [0095] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度20%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）7g，调节pH至8.2，静置120min，过滤后干燥得到多杀菌素54.3kg。 [0096] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.3%，其中多杀菌素A含量为86.0%，多杀菌素D含量为12.3%。 [0097] 收率：90.5%。 [0098] 实施例7多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.34g/L。 [0099] 多杀菌素发酵液中固形物1.3吨，效价44.7g/kg。 [0100] （1）发酵液预处理多杀菌素发酵液中加入饮用水0.8m3稀释。 [0101] 然后加入内肽酶1.4kg和尿素26kg，搅拌35min，静置180min。 [0102] 再加入氧化钙1.7kg，调节pH至9.7，搅拌27min，之后加入质量浓度28%磷酸，调节pH至4.6。 [0103] （2）提取在预处理后的发酵液中357951 加入四氢吡喃2.8m3，搅拌36min，静置150min，然后板框过滤，得到多杀菌素混合溶液。 [0104] （3）固液分离、减压蒸馏采用质量浓度27%氢氧化钠溶液调节多杀菌素混合溶液pH至9.5，固液分离后得到多杀菌素粗品58.4kg。水和四氢呋喃减压蒸馏，回收四氢呋喃。 [0105] （4）水洗、溶解多杀菌素粗品用质量浓度27%氢氧化钠溶液水洗30min，之后加入纯化水溶解，用质量浓度28%磷酸调节pH至3.2，浓度24.7%。 [0106] （5）膜过滤采用卷式超滤膜过滤。经膜过滤，得到多杀菌素溶液236L。 [0107] （6）结晶、干燥多杀菌素溶液中加入质量浓度27%氢氧化钠溶液，当溶液出现浑浊现象时加入晶种（多杀菌素成品）23g，调节pH至9.4，静置145min，过滤后干燥得到多杀菌素54.7kg。 [0108] 经检测，多杀菌素A和D总含量为98.4%，其中多杀菌素A含量为87.3%，多杀菌素D含量为11.1%。 [0109] 收率：91.1%。 [0110] 对比实施例1多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.38g/L。 [0111] 多杀菌素发酵液中固形物1.3吨，效价52.7g/kg。 [0112] （1）发酵液预处理：多杀菌素发酵液用质量浓度30％的NaOH水溶液调节发酵液pH至8.0，加入预处理剂 30％甲醇2.5m3，搅拌混匀，30℃静置3h，6000rpm/min固液离心分离，分别收集沉淀物1.3吨和上清液4m3。 [0113] （2）浸提：向步骤(1)收集的沉淀物中加入甲醇溶剂4m3，搅拌混匀，30℃静置5h，6000rpm/min固液离心分离，收集上清液，与步骤(1)收集的上清液混合，重复浸提3次，得到多杀菌素溶液 16.5m3。 [0114] (3)大孔树脂吸附：取HDP100型大孔树脂，装入层析柱中，用质量百分含量为30％的NaOH水溶液调节浸提液pH至10，洗脱流速为40mL/h过大孔树脂，先用去离子水洗至流出液无色，再用洗脱液洗脱，洗脱剂由90％甲醇水溶液和50％丙酮水溶液按照1:1.5的体积比配制而成，收集洗脱液，5000rpm/min离心，取上清液。 [0115] (4) 纳滤浓缩：将步骤(3)得到的上清液用截留相对分子质量为600Da的聚酰胺纳滤膜进行纳滤，操作温度48℃，操作压力0.7Mpa，得到浓缩液。 [0116] (5) 结晶：在步骤(4)得到的浓缩液中加入结晶剂，浓缩液与结晶剂的体积比为1:3，结晶剂包括乙醇和丁酮体积比为2:1，48℃搅拌25min，真空烘干，结晶，加入80％乙醇重结晶，真空干燥，得到浅灰白色固体结晶，即为纯化的多杀菌素。 [0117] 经检测，多杀菌素A和D总含量为97.5%，其中多杀菌素A含量为86.3%，多杀菌素D含量为11.2%。 [0118] 收率：81.3%。 [0119] 对比实施例2多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.38g/L。 [0120] 多杀菌素发酵液中固形物1.3吨，效价52.7g/kg。 [0121] (1) 分离、纯化：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至9并搅拌30min，离心得到固体A和清液4m3。 [0122] 吸附剂吸附：清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为清液体积的5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B。 [0123] 混合干燥：将得到的固体A与固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为30℃，干燥时间为1h，得到干燥后的混合物。 [0124] 索氏提取：将干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为混合物质量的1倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为2次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为2h，水浴温度为80℃，蒸发得到浓缩液。 [0125] 析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤浓缩液的pH至9，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。 [0126] 经检测，多杀菌素A和D总含量为93.5%，其中多杀菌素A含量为80.9%，多杀菌素D含量为12.6%。 [0127] 收率：83.5%。 [0128] 对比实施例3多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.38g/L。 [0129] 多杀菌素发酵液中固形物1.3吨，效价52.7g/kg。 [0130] (1)分离、纯化：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至9并搅拌30min，离心得到固体A和清液4m3。 [0131] 吸附剂吸附：清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为清液体积的5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B。 [0132] 混合干燥：将得到的固体A与固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为30℃，干燥时间为1h，得到干燥后的混合物。 [0133] 索氏提取：将干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为混合物质量的1倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为2次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为2h，水浴温度为80℃，蒸发得到浓缩液。 [0134] 析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤浓缩液的pH至9，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。 [0135] 经检测，多杀菌素A和D总含量为93.5%，其中多杀菌素A含量为80.9%，多杀菌素D含量为12.6%。 [0136] 收率：83.5%。 [0137] 对比实施例4多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.39g/L。 [0138] 多杀菌素发酵液中固形物1.2吨，效价48.4g/kg。 [0139] （1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用20%的氢氧化钠溶液调节发酵液pH=11.5，然后将发酵液加热升温至45°C，保温并以450r/min速度搅拌处理12小时。 [0140] （2）将发酵罐降温至30°C，用板框压滤机将发酵液压滤，进行固液分离，收集不溶物菌丝体，收集菌丝体用90%丙酮溶剂进行充分溶解并用HCL溶液调节pH值至3.5搅拌运行，抽提菌丝体中的多杀菌素；用板框压滤机进行压滤，再次进行固液分离，收集浸提清液。 [0141] （3）用纯水稀释收集浸提清液至丙酮溶度在60%，通过1001000mm层析柱用大孔吸附树脂进行多杀菌素吸附，用65%-75%%的丙酮将大孔树脂中吸附的多糖蛋白等系列杂质进行梯度洗脱脱除，用90%的丙酮将大孔树脂中吸附的多杀菌素产物进行解析，解析液在45°C条件下真空浓缩，挥发除去丙酮，得到多杀菌素浓缩液。 [0142] （4）用20%NaOH溶液调节pH值=11并搅拌1小时然后静置12小时使多杀菌素沉淀，过滤，用20%的稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤2次，在45°C下真空干燥24小时，即得到多杀菌素粉剂粗品。 [0143] （5）用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1丙酮与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上1001000mm层析柱进行等度洗脱，收集多杀菌素纯品，用旋转蒸发器在45°C真空下脱除丙酮，用乙酸丁酯进行萃取，得到负载多杀菌素乙酸丁酯相，萃取条件为：乙酸丁酯溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:3，温度35°C，pH=7，萃取时间10min；萃取完成分层后，收集乙酸丁酯相。 [0144] （6）将乙酸丁酯相中加入纯水进行反向萃取，反萃取条件为：乙酸丁酯相与纯水体积比=1:1，纯水PH=6.0，温度30°C，反萃取时间8 min，反萃取级数为2；反萃取分层完成后收集水相；将含有多杀菌素收集的水相进行45°C真空旋蒸，脱除多余水分，形成结晶。将脱除多余水分的多杀菌素晶体放置-86°C冻干机进行冷冻干燥即得到多杀菌素纯品。 [0145] 经检测，多杀菌素A和D总含量为97.8%，其中多杀菌素A含量为87.5%，多杀菌素D含量为10.3%。 [0146] 收率：74.5%。 [0147] 对比实施例5多杀菌素发酵液5m3，其中发酵液效价0.41g/L。 [0148] 多杀菌素发酵液中固形物1.1吨，效价52.9g/kg。 [0149] 用30％NaOH溶液调节发酵液pH＝9，室温搅拌30min后离心得固体1.1吨；在一次离心后的水相中加入10%膨润土，室温搅拌30min后离心得固体0.4吨，二次离心液送废水处理；③合并一次和二次离心分离后的固体，50℃下真空(1.33kPa)干燥5h得1.2吨干燥固体；④采用索氏提取法，加入3m3正戊烷，回流3h；⑤减压(1.33kPa)脱溶，加入2m3正戊烷重结晶，得多杀菌素产品。 [0150] 经检测，多杀菌素A和D总含量为97.8%，其中多杀菌素A含量为83.2%，多杀菌素D含量为7.5%。 [0151] 收率：78.3%。