植物病害通常会严重限制农业生产力并因此影响农业实践的历 史和发展。许多病原体可引起植物病害，包括真菌、细菌、病毒和线 虫。然而，在这些农作物感染性疾病的病原体中真菌是经济上最重要 的一类植物病原体并导致可销售的食物、纤维和饲料的巨大年度损 失。
通常通过农学实践控制植物发病率，其包括轮作、使用农药和传 统的育种技术。但是使用化学品控制植物病原体增加了农民的成本并 对生态系统产生有害影响。消费者和政府人员同样日益关注与生产和 使用合成农药以保护植物免受病原体攻击相关的环境危害。出于这些 担忧，政府人员已取消或限制使用一些危害性最强的农药。真菌病害 的发病率在某些程度上已通过选育抗性作物得到控制。但是传统的育 种方法耗费时间并且由于病原体的演化需要长期努力以维持病害抗 性。参见，例如，Grover和Gowthaman(2003)Curr.Sci.84：330-340。 因此非常需要新颖的替代方法以控制植物病原体，所述方法的污染风 险和环境危害低于以这些危害为特征的基于农药的传统方法并且没 有传统育种技术那么复杂。
许多植物病害(包括但不限于玉米茎腐病和穗霉菌病(ear mold)) 均可由各种病原体引起。例如，茎腐病是破坏性最强、传播最广的玉 米病害之一。该病害由真菌和细菌的复合体引起，其可攻击并降解接 近植物成熟期的茎。衰弱茎的倒伏以及未成熟植物死亡可引起产量显 著损失。玉米茎腐病通常由多于一种真菌引起，但是由玉蜀黍赤霉 (Gibberella zeae)引起的赤霉茎腐病，由轮状镰刀霉(Fusarium verticillioides)、增生镰刀霉(F.proliferatum)或半粘镰刀霉(F. subglutinans)引起的镰孢茎腐病(Fusarium stalk rot)以及由禾生刺盘孢 (Colletotrichum graminicola)引起的炭疽茎腐病(Anthracnose stalk rot) 最常见于报导(Smith和White(1988)；“玉米的疾病”(Diseases of corn)， 701-766页，Cornand Corn Improvement，Agronomy Series #18(第三版)， Sprague，C.F.和Dudley，J.W编辑，Madison，WI)。由于植物病害由 病原体复合体引起，所以需要广谱抗性以有效介导对病害的控制。因 此，急需针对于多种引起茎腐病和穗霉菌病病原体的抗真菌组合物。
农业科学家最近研发了通过基因工程改造植物以表达抗病原体 蛋白质从而使病原体抗性增强的农作物。举例而言，对马铃薯和烟草 进行基因改造以生产抗真菌内切几丁质酶蛋白可呈现对叶和土壤真 菌病原体的抗性增强。参见Lorito等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci. 95：7860-7865。而且，也开发了对茎腐病真菌具有抗性的转基因大麦。 参见Horvath等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：364-369。人们正在 不断努力以鉴定抗病原体试剂和基因改造病害抗性植物。
因此，考虑到植物病原体尤其是真菌病原体对作物产量和质量的 显著冲击，需要保护植物免受病原体攻击的新组合物和方法。控制多 种真菌病原体的方法和组合物尤其受人关注。
发明概述
本发明提供保护植物免受病原体攻击的组合物和方法。该组合物 包括核苷酸和氨基酸的序列(抗病原体，尤其是抗真菌)、多肽。本发明 的多肽呈现对植物真菌病原体的抗病原体活性。更具体而言，本发明 组合物包含SEQ ID NO：1和3阐明的抗病原体多肽及其变异体和片 段。进一步提供了包含编码本发明抗病原体多肽的核苷酸序列的核酸 分子。组合物也包括表达盒，其包含与编码本发明抗病原体多肽的核 苷酸序列可操作地连接的启动子。进一步提供了包含本发明表达盒的 经转化的植物、植物细胞、种子和微生物。
本发明组合物可用于诱导植物的病原体抗性、尤其是真菌抗性的 方法中。在具体的实施方案中，该方法包括将至少一个表达盒导入植 物中，该包含与编码本发明抗病原体多肽的核苷酸序列可操作地连接 的启动子。因此，该抗病原体多肽在植物中表达，且在病原体攻击部 位该病原体与该蛋白质接触，藉此导致病原体抗性增强。组织-优选 启动子可用于驱动抗病原体蛋白质在对病原体攻击特别敏感的特异 植物组织(例如，根、叶、茎、脉管组织和种子)中的表达。病原体诱 导型启动子也可用于驱动本发明抗病原体蛋白质在病原体感染部位 或其附近表达。
本发明进一步提供抗病原体组合物和配方以及使用它们保护植 物免受病原体、尤其是真菌病原体攻击的方法。在一些实施方案中， 组合物包含与载体组合的抗病原体多肽或转化微生物，该微生物包含 编码本发明抗病原体多肽的核苷酸序列。使用这些组合物保护植物免 受病原体攻击的方法包括通过例如喷雾、喷粉、撒施或种子包衣向植 物病原体的环境中施用该抗病原体组合物。本发明的方法和组合物可 用于保护植物免受病原体(包括真菌病原体、病毒、线虫等)的攻击。
附图简述
图1显示了LB-09812(SEQ ID NO：1)和LB-12922(SEQ ID NO：3) 多肽与SEQ ID NO：5、7、9、10和12阐明的推定同源物的氨基酸序 列的序列比对。这些推定同源物的详细描述见下文。
图2显示了实施例2描述的抗真菌平板检测法中与每个数字评分 相关的抑制水平的照片实例。
图3提供了使用SEQ ID NO：1所阐明多肽进行的抗真菌活性检测 结果，如实施例3所述。两种多肽均显示出对禾生刺盘孢、玉米壳色 单隔孢(Diplodia maydis)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)和轮状 镰刀霉的抗真菌活性。
发明详述
本发明提供了诱导植物中病原体抗性、尤其是真菌抗性的组合物 和方法。该组合物为用于抗病原体多肽的核苷酸和氨基酸序列。具体 而言，本发明提供了具有SEQ ID NO：1和3阐明的氨基酸序列的抗病 原体多肽及其变异体和片段，其分离自Penicillium glandicola和 Penicillium citreonigrum的真菌发酵液萃取物并分别标注为LB-09812 和LB-12922。LB-09812真菌菌株分离自乌克兰基辅含有Populus trenola L.的腐烂木材的森林土壤。LB-12922真菌菌株分离自乌克兰 Ternapol地区的耕作过的土壤。SEQ ID NO：1和3阐明的氨基酸序列 代表了下文定义的相应未经加工的全长多肽的成熟肽形式。具有与 SEQ ID NO：1相同的N-端氨基酸序列的抗真菌多肽也纯化自 Penicillium glandicola真菌发酵液，后者分离自基辅的含有心叶椴(tilia cordata L.)腐烂木材的森林土壤。进一步提供了包含分别编码SEQ ID NO：1和3所示氨基酸序列的核苷酸序列的分离的核酸分子(例如SEQ ID NO：2和4)及其变异体和片段。
可使用本领域已知的标准方法产生被优化用于在植物、尤其是玉 米中表达并且编码SEQ ID NO：1或3多肽的核苷酸序列。本发明进一 步涵盖这些植物优化核苷酸序列。含有编码本发明抗病原体多肽的核 苷酸序列的植物、植物细胞、种子和微生物也公开于本文。进一步提 供包含与载体组合的分离的抗病原体多肽、尤其是抗真菌多肽或表达 本发明多肽的微生物抗病原体组合物。本发明组合物可用于产生病原 体抗性植物和保护植物免受病原体、尤其是真菌病原体的攻击。
本文中公开的如SEQ ID NO：1和3的多肽呈现对真菌植物病原体 例如禾生刺盘孢、玉米壳色单隔孢、禾本科镰孢和轮状镰刀霉的抗真 菌活性。已确定SEQ ID NO：1和3多肽的抗真菌活性的物种来源为真 菌。具体而言，SEQ ID NO：1多肽的真菌来源为Penicillium glandicola。 SEQ ID NO：3阐明的多肽的真菌来源为Penicillium citreonigrum。
在其它真菌来源中鉴定出与SEQ ID NO：1和3抗真菌多肽具有序 列相似性的推定同源物。数据库检索发现SEQ ID NO：1和3与分离自 黄曲霉(Aspergillus flavus)标准化cDNA表达文库的核苷酸序列(氨基 酸序列阐明于SEQ ID NO：5，核苷酸序列阐明于SEQ ID NO：6(登录号 CO133987))和分离自黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA文库的核苷酸序 列(氨基酸序列阐明于SEQ ID NO：7，核苷酸序列阐明于SEQ ID NO：8(登录号DR698208))(DR698208cDNA的互补序列)的核苷酸序 列的预测转录产物以及阐明于SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有序列 相似性。SEQ ID NO：1和3的抗真菌多肽还与分离自烟曲霉 (Aspergillus fumigatus)(氨基酸序列阐明于SEQ ID NO：10(衍生自登 录号EAL92121(已修正))；核苷酸序列阐明于SEQ ID NO：11(登录号 AAHF01000002)具有已知功能的假定蛋白(hypothetical protein)具有 同源性。也分离了来自禾本科镰孢的编码LB-09812/LB-12922同源物 的基因组DNA。本文也公开了分离自禾本科镰孢的该基因组序列的 预测转录产物(氨基酸序列阐述于于SEQ ID NO：12；核苷酸序列阐 述于SEQ ID NO：13(登录号AACM01000196.1))。上述SEQ ID NO：1 和3的推定同源物均未被文献报导具有抗真菌活性。本发明多肽与这 些推定同源物的比对提供于图1。SEQ ID NO：1、3、5、7、9、10和 12阐明的氨基酸序列和SEQ ID NO：2、4、6、8、11和13阐明的核 苷酸序列可用于本发明的抗病原体组合物和方法。
本发明核酸和多肽可用于诱导植物中病原体抗性的方法。因此， 本文公开的组合物和方法可用于保护植物免受真菌病原体、病毒、线 虫等的攻击。“病原体抗性”或“病害抗性”意指该植物可避免植物-病原 体相互作用引起的病害症状。即，可防止病原体引起植物病害和相关 病害症状，或者最小化或减少该病原体引起的病害症状，例如减少应 激和相关的产量损失。本领域技术人员应理解本文公开的组合物和方 法可与本技术领域的其它组合物和方法一起使用保护植物免受昆虫 和病原体的攻击。
“抗病原体组合物”或“抗病原体多肽”意指本发明组合物具有抗 病原体活性并因此可抑制、控制和/或杀灭入侵病原生物体。本发明 的抗病原体多肽可将病原体攻击引起的病害症状降低至少约5％至约 50％、至少约10％至约60％、至少约30％至70％、至少约40％至约 80％、或至少约50％至约90％或更多。因此，本发明方法可用于保护 植物免受病害、尤其是由植物病原体引起的病害。在具体的实施方案 中，本发明多肽表现的抗病原体活性为抗真菌活性。如本文所使用的 “抗真菌活性”指抑制、控制和/或杀灭入侵真菌病原体的能力。同样， “真菌抗性”指与未处理的或野生型植物相比，对真菌病原体的耐受性 增强。抗性可从对真菌病原体作用的耐受性的轻微增加(例如，部分 抑制)至令该植物不受真菌病原体存在影响的完全的抗性之间变化。 对具体真菌病原体或更广谱的真菌病原体的增加的抗性水平可构成 抗真菌活性或增强的真菌抗性这二者。
测定抗病原体活性的检测法为本领域已知，如在病原体感染后定 量植物中病害抗性的方法。参见，例如美国专利第5614395号，其以 参考形式并于本文。这些技术包括测定一段时间内的平均损伤直径、 病原体生物量和腐败植物组织的总体百分比。例如，可表达抗病原体 多肽或在表面施用有抗病原体组合物的植物与对照植物或未暴露于 抗病原体组合物的植物相比，呈现组织坏死(即，损伤直径)的减少或 病原体攻击后植物死亡的减少。或者可通过病原体生物量的减少测定 抗病原体活性。例如，用目标病原体攻击表达抗病原体多肽或暴露于 抗病原体组合物的植物。一段时间之后，取得来自病原体-温育组织 的样品并提取RNA。特异病原体RNA转录物相对于植物特异性转录 物水平的百分比可测定病原体生物量水平。参见，例如，Thomma等， (1998)Plant Biology 95：15107-15111，以参考形式并于本文。
此外，体外抗病原体检测包括，例如，将不同浓度的抗病原体组 合物加入纸片中并将所述纸片置于含有目标病原体悬液的琼脂上。温 育后，在含有有效浓度的抗病原体多肽的纸片周围出现洁净的抑菌圈 (Liu等，(1994)Plant Biology 91：1888-1892，以参考形式并于本文)。 此外，可用显微分光光度检测法测定组合物的体外抗病原体性质(Hu 等(1997)Plant Mol.Biol.34：949-959和Cammue等(1992)J.Biol. Chem.267：2228-2233，二者均以参考形式并于本文)。特异性测定抗 真菌活性的检测法也为本领域所知。参见，例如，Duvick等(1992)J. Biol.Chem.267：18814-18820；Lacadena等(1995)Arch.Biochem. Biophys.324：273-281；Xu等，(1997)Plant Mol.Biol.34：949-959；Lee 等，(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.263：646-651；Vila等，(2001) Mol.Plant Microbe Interact.14：1327-1331；Moreno等，(2003) Phytpathol.93：1344-1353；Kaiserer等，(2003)Arch.Microbiol. 180：204-210和美国专利第6,015,941号。
本文公开的组合物包含分离的编码抗病原体多肽的核酸、包含本 发明核苷酸序列的表达盒和分离的抗病原体多肽。也提供了包含与载 体组合的本发明多肽的抗病原体组合物。本发明进一步公开用编码抗 病原体蛋白质的核酸转化的植物和微生物。该组合物可用于诱导植物 的病原体抗性和保护植物免受病原体、尤其是真菌病原体的攻击。
在具体方面，在植物中诱导病原体抗性的方法包括向植物中导入 至少一个表达盒，其中该表达盒包含与在该植物中驱动表达的启动子 可操作地连接的编码本发明抗病原体多肽的核苷酸序列。该植物表达 该抗病原体多肽，籍此在病原体攻击位点将该病原体暴露于多肽。在 具体的实施方案中，所述多肽具有抗真菌活性，所述病原体为真菌， 例如禾生刺盘孢、玉米壳色单隔孢、禾本科镰孢或轮状镰刀霉。本发 明抗病原体多肽的表达可靶向于特定植物组织，例如，叶、根、茎或 脉管组织，在所述组织中病原体抗性尤其重要。可通过根-优选、叶- 优选、脉管组织-优选、茎-优选或种子-优选启动子实现组织-优选表 达。此外，本发明多肽也可靶向于植物细胞内的特异亚细胞位点或者 如下文所述分泌至细胞外。
正如通过使用适当的启动子可将本发明的抗病原体多肽的表达 靶向于特异植物组织或细胞类型，通过使用靶向信息或“靶向标签”也 可将其靶向于细胞内的不同位点。与启动子(其作用于转录水平)不同， 该类靶向信息为起始转录产物的一部分。根据病原体感染的方式或组 织的代谢功能或细胞类型，蛋白质在细胞不同区室的定位可使其更有 效地对抗给定病原体或使其对细胞功能的干扰更小。例如，通过包含 编码信号肽(该类序列也被称作“信号序列”)的构建体(即表达盒)序列 可生产前面有信号肽的蛋白质，所述信号肽可将翻译产物定位于内质 网。所使用的信号序列可以是例如与编码该多肽的基因相关者，或者 其可来自于另一个基因。文献中描述了许多信号肽，它们大部分可以 互换(Raikhel和Chrispeels，“Protein sorting and vesicle traffic”， Buchanan等编辑，(2000)Biochemistry and Molecular Biology of Plants (American Society of Plant Physiologists，Rockville，MD)，以参考形式 并于本文)。加入信号肽可使翻译产物进入内质网(在信号肽自身从多 肽移除的过程中)，但是该蛋白质的最终胞内定位取决于其它因素， 可对所述因素进行操作以得到最适合病原体和细胞类型的定位。默认 途径，即如果不包含其它靶向标签该多肽所采取的途径，可使该多肽 分泌穿过细胞膜(Raikhel和Chrispeels，同上)至质外体。质外体是质 膜体系外的区域，包括细胞壁、细胞间隙和木质脉管，所述脉管形成 水分和溶质可移动的连续、可渗透体系。这常常是一个适当的定位。 在具体实施方案中，编码大麦α-淀粉酶(BAA)信号肽的核苷酸序列与 本发明多聚核苷酸在框内连接。编码BBA信号肽的核苷酸序列和 BBA信号肽的氨基酸序列分别阐明于SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。与编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列相连的编码BBA信号肽 的示例性核苷酸序列和BAA-SEQ ID NO：1的氨基酸序列分别提供于 SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。与编码SEQ ID NO：3的核苷酸序 列相连的编码BBA信号肽的示例性核苷酸序列和BAA-SEQ ID NO：3 的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
通过将肽定位于细胞内而不是细胞膜外可更有效的对抗其它病 原体。这可通过例如在该基因序列中加入内质网滞留信号编码序列实 现。上文中Raikhel和Chrispeels阐述了达到这一目的的方法和序列； 例如在所述多肽的蛋白质编码区末尾加入按如下顺序编码氨基酸K、 D、E和L的序列或其文献中描述的变异体可达到这一目的。ER滞 留序列为本领域所熟知，包括，例如，KDEL(SEQ ID NO：20)、SEKDEL (SEQ ID NO：21)、HDEL(SEQ ID NO：22)和HDEF(SEQ ID NO：23)。 参见，例如，Denecke等，(1992).EMBO J.11：2345-2355；Wandelt等， (1992)Plant J.2：181-192；Denecke等，(1993)J.Exp.Bot.44：213-221； Vitale等，(1993)J.Exp.Bot.44：1417-1444；Gomord等，(1996)Plant Physiol.Biochem.34：165-181；Lehmann等(2001)Plant Physiol.127(2)： 436-449。
或者，使用如上文Raikhel和Chrispeels所述的空泡靶向标记加 上信号肽可将肽定位于空泡结构内。如上文Raikhel和Chrispeels所 述，可将该空泡靶向标记置于构建体的不同位置。使用质体转运肽编 码序列而不是信号肽编码序列可将所述多肽定位于所选细胞类型的 质体中(Raikhel和Chrispeels，如上文所述)。该类转运肽为本领域所 知。参见，例如，Von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126； Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等， (1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys. Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等，(1986)Science 233：478-481。 编码该类转运肽的叶绿体靶向序列为本领域所知并包括核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等， (1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等，(1991)J.Biol.Chem. 266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer 等，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao 等，(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等， (1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等， (1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和捕光叶绿体a/b结合蛋 白(LHBP)(Lamppa等(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。本领域 技术人员也可设想产生转基因植物，所述植物中叶绿体被转化以过度 表达抗病原体肽的基因。参见，例如，Daniell(1999)Nature Biotech 17：855-856；和美国专利第6,338,168号。
技术人员也可设想通过加入适当的靶向信息将所述抗病原体多 肽定位于其他细胞区室。(Raikhel和Chrispeels，如上文所述)。可于 万维网上获得的提供与识别各种靶向序列相关的信息和参考的可用 网站为：psort.nibb.ac.jp/mit。关于蛋白靶向现状的其他参考文献包括： Silva-Filho(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：589-595；Nicchitta(2002) Curr.Opin.Cell Biol.14：412-416；Bruce(2001)Biochim Biophys Acta 1541：2-21；Hadlington & Denecke(2000)Curr.Opin.Plant Biol.3： 461-468；Emanuelsson等，(2000)J Mol.Biol.300：1005-1016； Emanuelsson & von Heijne(2001)Biochim Biophys Acta 1541：114-119， 均以参考形式并于本文。
本发明组合物可进一步用于保护植物免受病原体攻击的方法中。 “保护植物免受病原体攻击”意指杀灭该病原体或阻止或限制植物病 害的形成。在一些实施方案中，将包含抗病原体多肽和载体的抗病原 体组合物直接应用于植物病原体的环境中，例如，用于植物上或土壤 中或植物根周围的其他生长培养基中，以保护植物免受病原体的攻 击。本文进一步提供了包含编码本发明抗病原体蛋白质的核苷酸序列 的转化微生物和使用他们保护植物免受病原体攻击的方法。在一些实 施方案中，将该转化微生物直接应用于植物或植物生长的土壤中。
如本文所使用，“核酸”包括单或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸聚合物，除非另外限定，其包含具有天然核苷酸基本性质即 以与天然存在的核苷酸相似的方式与单链核酸杂交的已知类似物 (如，肽核酸)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可替换使用，以指氨基酸 残基的聚合物。该术语可应用于一个或多个氨基酸残基为对应于天然 氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物。可 从本文公开的核酸或通过使用标准分子生物学技术生产本发明多肽。 例如，可通过在合适的宿主细胞中表达本发明重组核酸或通过体外方 法(例如，蛋白酶消化和纯化)组合生产本发明的截短蛋白质。
如本文所使用，术语“编码”或“被编码”当用于关于特定核酸的语 境时意指包含引导核苷酸序列翻译成特定蛋白质所必须的信息的核 酸。蛋白质据以编码的信息由密码子的使用详细说明。编码蛋白质的 核酸包含该核酸翻译区内的非翻译序列(即，内含子)或可能缺少该类 插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。
本发明包含分离的或基本纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分 离的”或“纯化的”多肽或蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不 含自然环境中通常与该多肽或蛋白质伴随或相互作用的组分。因此， 分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质实质上不含有细胞物质，或如果通 过重组技术生产则不含培养基，或者如果经化学合成则基本不含化学 前体或其他化合物。最佳条件下，“分离的”多聚核苷酸不含该多聚核 苷酸所衍生自的生物体基因组DNA中天然侧接该多聚核苷酸的序列 (最佳地，蛋白编码序列)(即，位于该多聚核苷酸5′和3′端的序列)。 例如，在各种实施方案中，分离的多聚核苷酸可包含小于5kb、4kb、 3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的该多聚核苷酸所衍生自的细胞基 因组DNA中天然侧接该多聚核苷酸的序列。基本不含细胞物质的蛋 白质包括污染蛋白质小于约30％、20％、10％、5％或1％(干重比)的 制备产物。当本发明蛋白质或其生物活性部分为重组生产时，培养基 最好含有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重比)的化学前体或 非目标蛋白的化学物质。
本文公开的核苷酸序列及其编码的蛋白质的片段和变异体也包 含于本发明。“片段”意指该核苷酸序列的一部分或该氨基酸序列的一 部分和籍此编码的蛋白质。核苷酸序列片段可编码保留了天然蛋白质 生物活性并因此具有抗病原体活性、更具体而言具有抗真菌活性的蛋 白质片段。或者，可用作杂交探针的核苷酸序列片段通常不编码保留 生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列片段可在编码本发明多肽 的至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸和至多全长 的核苷酸序列的范围内变化。
编码本发明抗真菌多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段可编 码本发明抗真菌多肽的至少15、25、30、40或50个连续氨基酸、或 至多全部数量的氨基酸(例如，SEQ ID NO：1的33个氨基酸)。可用作 杂交探针或PCR引物的核苷酸序列的片段通常不需要编码抗病原体 蛋白质的生物活性部分。
如本文所使用，当指特定多聚核苷酸时“全长序列”指具有天然序 列的完整核酸序列。“天然序列”意指内源性序列，即，生物体基因组 中存在的非工程序列。
因此，本发明核苷酸序列片段可编码抗病原体多肽的生物活性部 分，或者其为可用作使用下述方法时的杂交探针或PCR引物的片段。 可通过分离本发明核苷酸序列之一的一部分、表达被编码的抗病原体 蛋白质部分(例如，通过体内重组表达)、并评价该抗真菌蛋白质被编 码部分的活性以制备抗病原体多肽的生物活性部分。作为本发明核苷 酸序列片段的核酸分子包含至少15、20、50、75、100或150个连续 核苷酸或至多本文所公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数量。
“变异体”意指实质上相似的序列。对于多聚核苷酸而言，变异体 包含在天然多聚核苷酸的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或 多个核苷酸和/或在天然多聚核苷酸中的一个或多个位点替换一个或 多个核苷酸。如本文所使用，“天然”多聚核苷酸或多肽分别包含天然 存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域技术人员应理解本发明核酸 的变异体将被构建为保持开放阅读框。对于多聚核苷酸而言，保守变 异体包括由于遗传密码的简并性而编码1个本发明抗病原体多肽的 氨基酸序列的那些序列。这些天然存在的等位基因变异体可使用熟知 的分子生物学技术(例如使用下文列出的聚合酶链式反应(PCR)和杂 交技术)鉴定。变异体多聚核苷酸也包括合成衍生多聚核苷酸，例如 通过使用定位突变产生但仍可编码本发明抗病原体蛋白质的那些。通 常，经本文其他部分所述的序列比对程序和参数测定，本发明的特定 多聚核苷酸的变异体与的特定多聚核苷酸具有至少约40％、45％、 50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。
也可通过比较变异体多聚核苷酸编码的多肽和参比多聚核苷酸 编码的多肽的序列同一性评价本发明的特定多聚核苷酸(即，参比多 聚核苷酸)的变异体。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3多肽具有特定序列同一性的多肽的分离的多聚核苷酸。可使 用本文其他部分描述的序列比对程序和参数计算任何两个多肽之间 的序列同一性百分比。当通过比较所编码的两个多肽共有的序列同一 性百分比来评价任何一对多聚核苷酸时，这两个被编码多肽之间的序 列同一性百分比应至少为约40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更大的序列同一性。
“变异体”蛋白质意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位 点缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质中的一个或多个 位点替换一个或多个氨基酸衍生得到的蛋白质。本发明涵盖的变异体 蛋白质具有生物活性，即它们仍然保持了所需的天然蛋白质生物活 性，即本文描述的抗病原体、尤其是抗真菌活性。该类变异体可通过 例如遗传多态性或从人工操作获得。经本文其他部分描述的序列比对 程序和参数测定，本发明天然抗病原体蛋白质的生物活性变异体与天 然蛋白质氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明蛋白质的生物活性变 异体与该蛋白质的不同之处可少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个、 例如6-10个，少至5个，少至4、3、2或1个氨基酸残基。
可通过多种途径包括氨基酸替换、缺失、截短和插入改变本发明 蛋白质。该类操作的方法为本领域所周知。例如，可通过DNA的突 变制备抗病原体蛋白质的氨基酸序列变异体和片段。突变和多聚核苷 酸改变的方法为本领域所熟知。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等，(1987)Methods in Enzymol. 154：367-382；美国专利第4,873,192号；Walker和Gaastra编辑(1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)及其中引用的参考文献。不影响目标蛋白质生物活性的适当氨 基酸替换的指导见Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型，以参考 形式并于本文。保守替换，例如用具有类似性质的另一氨基酸替换某 一氨基酸，可为最佳。
因此，本发明的基因和多聚核苷酸包括天然存在的序列和突变形 式这二者。类似的，本发明蛋白质涵盖天然存在的蛋白质和其变异体 和经修饰的形式。该类变异体仍然具有预期的抗病原体、尤其是抗真 菌活性。明显地，在编码该变异体的DNA中进行的突变不得将该序 列置于阅读框之外，而且最好不形成可产生二级mRNA结构的互补 区域。参见，欧洲专利第0075444号。
事实上，除了本申请其他部分讨论的靶向标记例如信号肽之外， 一些多聚核苷酸作为复合前体产生，所述核苷酸还包含在蛋白质成熟 过程中的某些阶段被移除(加工)的其他肽片段，得到与原始翻译产物 不同的该多肽的成熟形式(信号肽移除除外)。“成熟蛋白质”指翻译后 经加工的多肽；即，从移除原始翻译产物中存在的任何前导肽或前肽 (pre-or propeptide)而得到的多肽。“前体蛋白质”或“前肽原”或“前蛋白 原”均指mRNA的原始翻译产物；即，仍然存在前导肽和前肽(pre-and propeptide)。前导肽和前肽包括但是不限于胞内定位信号。这一命名 法中的“前导”通常指信号肽。仅移除了信号肽但是并未进一步加工的 翻译产物形式被称作“前肽”或“前蛋白”。将被移除的片段或区段本身 也可被称作“前肽”。因此前蛋白或前肽的信号肽已被移除，但是包含 组成成熟蛋白质的前肽(本文指前肽区段)和部分。根据表达蛋白质的 物种和期望的胞内定位，技术人员可确定是否可以通过使用仅编码该 蛋白质的成熟形式、具有信号肽的成熟形式与、或具有信号肽的前蛋 白(即包括前肽的形式)的基因构建体得到更高水平表达。为了在植物 或真菌中最佳表达，可需要所述前体和前肽。所述前肽区段可在辅助 肽折叠中发挥作用。
SEQ ID NO：24提供了编码全长LB-09812多肽的基因组序列。 SEQ ID NO：25阐明了全长LB-09812多肽。SEQ ID NO：26提供了编 码全长LB-12922多肽的基因组序列。SEQ ID NO：27阐明了预测的全 长LB-12922多肽。关于分离LB-09812和LB-12922基因的试验细节 见下文的实施例4。
本文涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和替换并不预期产生蛋白质 特性的根本改变。然而，当难以提前预测该替换、缺失或插入的确切 作用时，本领域技术人员应理解可通过常规筛选检测评价该作用。即， 可通过测定抗病原体活性检测法、例如抗真菌平板检测法评价活性。 参见，例如，Duvick等，(1992)J.Biol.Chem.267：18841-18820，以参 考形式并于本文。
变异体多聚核苷酸和蛋白质也涵盖衍生自突变和重组基因方法 (例如DNA改组)的序列和蛋白质。通过这一方法可对一个或多个不 同的抗病原体蛋白质编码序列进行操作，以产生具有所期望性质的新 的抗病原体蛋白质。在这一方式中，从包含具有实质序列同一性并可 在体内或体外同源重组的序列区的相关序列多聚核苷酸群(population of related sequence polynucleotide)产生重组多聚核苷酸文库。例如， 使用该方法，编码目的结构域的基序会在本发明抗病原体蛋白质基因 和其他已知的抗病原体蛋白质基因之间改组得到编码具有目的改良 性质(例如提高的抗真菌活性)的蛋白质的新基因。该DNA改组策略 为本领域已知。例如，参见，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等， (1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等，(1997)J.Mol.Biol. 272：336-347；Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.US A94：4504-4509； Crameri等，(1998)Nature 391：288-291；和美国专利第5,605,793和 5,837,458号。
本发明多聚核苷酸可用于分离来自其它生物体、尤其是其它微生 物、更尤其是其它真菌的对应序列。在这一方式中，可使用例如PCR、 杂交等基于该类序列与本文所阐明序列的序列同一性的方法鉴定所 述序列。基于与本文所阐明的完整序列或其变异体和片段的序列同一 性，将分离的序列涵盖于本发明中。该类序列包括公开序列的垂直同 源基因。“垂直同源基因”意指衍生自共同的祖先基因并由于物种形成 而存在于不同物种的基因。当这些存在于不同物种的基因的核苷酸序 列和/或其编码蛋白质序列共享至少60％、70％、75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者 更大的序列同一性时被认为是垂直同源基因。垂直同源基因的功能通 常在物种间高度保守。因此，本发明涵盖编码抗病原体、尤其是抗真 菌的蛋白质并且在严格条件下与本文公开的序列或其变异体或片段 杂交的分离的多聚核苷酸。
在PCR方法中，可设计寡聚核苷酸引物用于PCR反应，以扩增 对应的DNA序列，所述DNA序列源自从任何目的生物体提取的 cDNA或基因组DNA。设计PCR引物和PCR克隆的方法为本领域所 周知，并公开于Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。也可参见Innis等编辑，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand 编辑，(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis 和Gelfand编辑，(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、嵌套引物、单 特异性引物、简并引物、基因-特异性引物、载体-特异性引物、部分 错配引物等的方法。
在杂交技术中，使用全部或部分已知多聚核苷酸作为探针，所述 探针可与存在于源自所选生物体的已克隆基因组DNA片段群或 cDNA片段群(即，基因组或cDNA文库)中的其它对应的多聚核苷酸 选择性杂交。该杂交探针可为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA 片段或其他寡聚核苷酸，且可用可检测基团例如32P或其他可检测标 记进行标记。因此，例如，可通过标记以本发明多聚核苷酸为基础的 合成多聚核苷酸得到用于杂交的探针。制备杂交探针和用于构建 cDNA和基因组文库的方法为本领域所周知，并公开于Sambrook等， (1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
举例而言，本文公开的完整多聚核苷酸或其一个或多个部分可用 作能与对应的多聚核苷酸和信使RNAs特异杂交的探针。为了在各种 条件下达到特异性杂交，该类探针包括在抗病原体多肽序列中独特的 序列，并且其长度最佳为至少约10个核苷酸，极其最佳为至少约20 个核苷酸。该类探针可用于通过PCR从所选生物体扩增对应的多聚 核苷酸。该技术可用于从期望生物体分离其他编码序列，或作为诊断 检测以确定生物体中编码序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库 (plated DNA libraries)的杂交筛选(噬菌斑或菌落；参见，例如， Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
可在严格条件下进行该类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交 条件”意指探针与其目标序列杂交的程度可检测地高于与其它序列的 杂交的条件(例如，至少比背景高两倍)。严格条件依赖于序列，并随 环境不同而不同。通过调控杂交和/或洗涤条件的严格度，可鉴定与 探针100％互补的目标序列(同源探针)。或者，可调节严格条件允许 序列中存在一些错配，以检测较低相似度(异源探针)。通常，探针的 长度小于约1000个核苷酸，最佳为小于500个核苷酸。
通常，严格条件为盐浓度小于约1.5M钠离子的条件，通常在pH 为7.0-8.3下为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，，对于短探针 (例如，10到50个核苷酸)而言，温度至少为30℃，对于长探针(例 如，大于50个核苷酸)而言，温度至少为约60℃。也可通过加入去稳 定剂(例如甲酰胺)以达到严格条件。示例性低严格条件包括于37℃、 在含30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液 中杂交，于50-55℃、用1×-2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸 钠)洗涤。示例性中等严格条件包括于37℃、在40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中杂交，并于55-60℃、用0.5×-1×SSC洗涤。示例性 高严格条件包括于37℃、在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中杂交， 并于60-65℃、用0.1×SSC洗涤。洗涤缓冲液可任选包含约0.1％-约 1％SDS。杂交时间通常小于约24小时，经常为约4-约12小时。洗 涤时间为至少足以达到平衡的时间。
特异性通常为杂交后洗涤的函数，关键因素为终洗涤溶液的离子 强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可通过Meinkoth和Wahl(1984) Anal.Biochem.138：267-84的方程计算Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M) +0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中，M为一价阳离子的摩 尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸百分比，％甲 酰胺为杂交溶液中甲酰胺百分比，L为杂交体的碱基对长度。Tm为 在给定离子强度和pH下50％互补目标序列与完全匹配的探针杂交时 的温度。每1％的错配会使Tm下降约1℃；因此，可调节Tm、杂交 条件和/或洗涤条件，以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果 要找寻同一性≥90％的序列，可将Tm降低10℃。通常，所选严格条 件比给定离子强度和pH下特异序列和其互补序列的热溶点(Tm)约低 5℃。但是，非常严格条件可使用低于热溶点(Tm)1、2、3或4℃的杂 交和/或洗涤；中等严格条件可使用低于热溶点(Tm)6、7、8、9或10℃ 的杂交和/或洗涤；低严格条件可使用低于热溶点(Tm)11、12、13、 14、15或20℃的杂交和/或洗涤。通过使用该方程、杂交和洗涤组合 物以及期望Tm，一般专业人员即可理解杂交严格度和/或洗涤溶液的 变化已阐述在内。如果所期望的错配程度产生自低于45℃(水溶液) 或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，那么最好提高SSC浓度以使用更高的温 度。核酸杂交的详尽指导参见Tijssen，生物化学和分子生物学实验室 技术—核酸探针杂交(LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES)，第I部分，第2章，(Elsevier，New York)；和Ausubel等编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology， 第章2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。参见 Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。
以下术语用于描述两个或多个多聚核苷酸或多肽之间的序列关 系：(a)“参比序列”、(b)“对比窗口”、(c)“序列同一性”和(d)“序列同一 性百分比”。
(a)如本文所使用，“参比序列”为用作序列对比基准的已定义序 列。参比序列可以是特定序列的子序列或全部；例如，为全长cDNA 或基因序列的区段、或完整cDNA或基因序列。
(b)如本文所使用，“对比窗口”指多聚核苷酸序列的连续和特定片 段，其中对比窗口中的多聚核苷酸序列可包含相对于参比序列(不含 添加或缺失)用于优化两个多聚核苷酸比对的添加或缺失(即裂隙)。通 常，对比窗口长度至少为20个连续核苷酸，任选可为30个、40个、 50个、100个或更长。本领域技术人员应理解通常引入间隔罚分(gap penalty)并将其从配对数值中减去以避免由于在多聚核苷酸序列中包 含间隔所引起的与参比序列的高度相似。
用于对比的序列比对方法为本领域人员熟知。因此，可通过使用 数学算法测定任何两个序列之间的序列同一性百分比。该类数学算法 的非限制性实例为Myers和Miller的算法(1988)CABIOS 4：11-17； Smith等的局部比对算法(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman和 Wunsch的全局比对算法(1970)J.Mol.Biol.48：443-453；Pearson和 Lipman的领域搜寻比对方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. 85：2444-2448；Karlin和Altschul的算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 872264，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中进行了修改。
这些数学算法的计算机实施可用于序列比对测定序列同一性。该 类实施包括但不限于PC/Gene program中的CLUSTAL(可购自 Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(2.0版)和GCG Wisconsin基因软件包第10版(可购自Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对进行可使用缺省参数。 CLUSTAL程序详细阐述于Higgins等，(1988)Gene 73：237-244(1988)； Higgins等，(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等，(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等， (1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。ALIGN程序基于上文中Myers和 Miller(1988)的算法。当对比氨基酸序列时可将PAM120加权残基表 格、间隔长度罚分12(gap length penalty)和间隔罚分4与ALIGN程序 一起使用。Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基 于上文中Karlin和Altschul(1990)的算法。可使用SLASTN程序、分 值＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸检索，以得到与编码本发明 蛋白质同源的核苷酸序列。可使用BLASTX程序、分值＝50、字长 ＝3进行BLAST蛋白质检索，以得到与本发明蛋白质多肽同源的氨 基酸序列。为了获得对比目的的间隔比对(gapped alignment)，可使用 Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389描述的Gapped BLAST (BLAST 2.0)。或者，可使用PSI-BLAST(BLAST 2.0)进行检测分子间 远缘关系的迭代检索。参见，上文中Altschul等(1997)。当使用 BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各自程序(例如， BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质序列)的缺省参数。 参见www.ncbi.nlm.nih.gov。可通过人工检杏进行比对
除非另外说明，本文提供的序列同一性/相似性数值指使用GAP 第10版使用以下参数获得的数值：对于核苷酸序列的％同一性和％ 相似性使用50作为GAP加权和3作为长度加权以及nwsgapdna.cmp 评分矩阵；对于氨基酸序列的％同源性和％相似性使用8作为GAP 加权和2作为长度加权以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等效程 序。“等效程序”意指对于任何两个可疑序列而言，当与GAP第10版 产生的相应比对相比较时，可以产生具有相同核苷酸或氨基酸残基配 对以及相同序列同源性百分比的序列对比程序。
GAP使用了Needleman和Wunsch的算法(1970)J.Mol.Biol. 48：443-453，以寻找既能最大化配对数值又能最小化间隔数量的两个 完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对及间隔位置，并创建具 有最大配对碱基数值和最少间隔的比对。这使得能够在匹配碱基中 提供间隔生成罚分(gap creation penalty)和间隔延伸罚分(gap extension penalty)。GAP为了每一个它所插入的间隔，必须利用配对 的间隔生成罚分数量。如果选择间隔延伸罚分大0，GAP必须额外 为每个被插入的间隔利用间隔长度与间隔罚分的乘积。 GCGWisconsin基因软件包第10版中蛋白质序列的默认间隔生成罚 分值和间隔延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，缺省间隔 生成罚分为50而缺省间隔延伸罚分为3。间隔生成和间隔延伸罚分 可表示为选自0至200之间的整数。因此，例如，间隔生成和间隔 延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、 30、35、40、45、5055、60、65或更多。
GAP代表最佳比对家族的一员。虽然这一家族中有很多成员， 但是其它成员均没有更好的质量。GAP显示四个比对优值：质量、 比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的度量。比率 是将质量除以较短片段的碱基数目。同一性百分比是实际配对标示符 (symbol)的百分比。相似性百分比是相似标示符的百分比。忽略间隔 所对应的标示符。当一对标示符的评分矩阵数值大于或等于0.50(相 似性阈值)时会给出相似性评分。Wisconsin Genetics Software Package 第10版本中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见，Henikoff和 Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
(c)如本文所使用，在两个多聚核苷酸或多肽序列的语境中，“序 列同一性”或“同一性”指在特定对比窗口下比对最大一致性时两个序 列中的残基相同。当序列同一性百分比用于指蛋白质时，应认识到不 相同的残基位置通常由于保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被 其它具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基替换，并 因此不改变该分子的功能性质。当序列因保守替换不同时，可上调序 列同一性百分比以修正该替换的保守性质。由于这些保守替换而不同 的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这一调整的方法为 本领域技术人员所熟知。通常，所述方法涉及将保守替换作为部分错 配而非完全错配进行评分，藉此提高序列同一性百分比。因此，例如， 当同一性氨基酸评分为1且非保守替换评分为0时，保守替换评分介 于0和1之间。保守序列的评分计算，例如，如通过程序PC/GENE 实施(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)。
(d)如本文所使用，“序列同一性百分比”指通过在对比窗口下比较 两个最优比对序列得到的数值，其中对比窗口中的多聚核苷酸序列部 分可包含与参比序列(其不包含增加或缺失)相比用于两个序列最佳比 对的增加或缺失(即，间隔)。通过测定两序列中出现的相同核酸碱基 或氨基酸残基的位置数量以得到配对位置的数量，将配对位置的数量 除以对比窗口中总位置数量并将该结果乘以100即得到序列同一性 百分比。
术语“多聚核苷酸”的使用并不将本发明限制于包含DNA的多聚 核苷酸。本领域普通技术人员应理解多聚核苷酸可包含核糖核酸、核 糖核酸和脱氧核糖核酸的组合物。该类脱氧核糖核酸和核糖核酸包括 天然存在的分子和合成类似物这二者。本发明的多聚核苷酸也涵盖所 有形式的序列包括但是不限于单链形式、双链形式等。
在一些实施方案中，进一步提供了包含与编码抗病原体多肽的本 发明异源核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达盒。本发明表达盒 可用于产生转化植物、植物细胞和微生物和用于实施诱导本发明所公 开的病原体抗性的方法。该表达盒包括与本发明多肽可操作地连接的 5′和3′调控序列。“可操作的连接”意指两个或更多元件之间的功能连 接。举例而言，目的多聚核苷酸和调控序列(即，启动子)之间的可操 作的连接为允许目的多聚核苷酸表达的功能连接。可操作地连接的元 件可为连续的或非连续的。当可操作地连接用于指两个蛋白质编码区 的连接时，“通过可操作地连接”意指所述编码区在相同的阅读框中。 该表达盒可另外包含至少一个额外的基因用于共转化至生物体。或者 所述额外的基因可提供于多个表达盒上。向该类表达盒提供多个限制 性酶切位点和/或重组位点用于插入编码抗病原体多肽的多聚核苷 酸，以使其受该调控区的转录调控。该表达盒可另外包含选择性标记 基因。
该表达盒将包括5′-3′方向的转录、在宿主生物体中具有功能的转 录起始区(即，启动子)、翻译起始区、本发明多聚核苷酸、转录终止 区和任选的翻译终止区。所述调控区(即，启动子、转录调控区和翻 译终止区)和/或本发明的多聚核苷酸对宿主细胞而言可为天然的/类 似的，或者所述调控区和/或多聚核苷酸相互之间可为天然的/类似的。 或者，该调控区和/或本发明的多聚核苷酸对宿主细胞而言或者其相 互之间为异源的。如本文所使用，“异源的”指序列为源自外来物种的 序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或 基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。例如，与外源多聚核 苷酸可操作地连接的启动子所源自的物种与该多聚核苷酸所源自的 物种不同，或者，如果源自相同/类似的物种，其一或二者均从它们 的原始形式和/或基因组位点进行了实质性修饰，或该启动子并不是 可操作地连接多聚核苷酸的天然启动子。
任选含有的终止区可与该转录起始区同源，与可操作地连接的目 的多聚核苷酸同源，与植物宿主同源，或可衍生自该启动子、该相关 多聚核苷酸、该宿主或其任意组合物的另一来源(即，外源或异源)。 适当的终止区可来自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章 鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也可参见Guerineau等，(1991)Mol. Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon 等，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等，(1989) Nucleic Acids Res.17：7891-7903；以及Joshi等，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。在具体实施方案中，使用了马铃薯蛋白酶抑制因 子II基因(PinII)终止子。参见，例如，Keil等，(1986)Nucl.Acids Res. 14：5641-5650；和An等(1989)Plant Cell 1：115-122，其完整内容以参 考形式并于本文。
适当情况下，可优化所述多聚核苷酸用于增加在经转化的生物体 中的表达。例如，可使用植物-优选密码子合成该多聚核苷酸用于提 高表达。参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11 中关于宿主-优选密码子使用的讨论。用于合成植物-优选基因的方法 可从本领域获得。参见，例如，美国专利第5,380,831和5,436,391号 以及Murray等，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，以参考形式并 于本文。
已知其它的序列修饰用于增强在细胞宿主中的基因表达。这而包 括去除编码假多腺苷酸化信号(spurious polyadenylation signals)、外显 子-内含子剪接位点信号、转座子样重复区的序列和其它可能不利于 基因表达的特征明显的序列。可将序列的G-C含量调节至给定细胞 宿主的平均水平(通过参考该宿主细胞中表达的已知基因计算)。如果 可能的话，修饰该基因以避免预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可另外包含5′引导序列。该引导序列可增强翻译。翻译引 导子为本领域已知并包括微小RNA病毒引导子，例如EMCV引导子 (脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒引导子，例如，TEV引导子(烟草 蚀纹病毒)(Gallie等，(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV引导子(玉 米矮花叶病毒)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等(1991) Nature 353：90-94)；苜蓿花叶病毒(AMV RNA 4)包衣蛋白mRNA的非 翻译引导子(Jobling等(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒引导 子(TMV)(Gallie等(1989)，Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss， New York)，237-256页)；和玉米枯黄斑点病毒引导子(MCMV) (Lommel等，(1991)Virology 81：382-385)。也可参见，Della-Cioppa等， (1987)Plant Physiol.84：965-968。
在制备表达盒时，可操作多种DNA片段以适当地提供在适当取 向和位于适当阅读框的DNA序列。为达到这一目的，可应用衔接头 或联结子连接DNA片段或可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位 点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可 进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换 和颠换。
表达盒所述也可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选 择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生 素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转 移酶(HPT)的基因以及提供除草剂化合物例如草铵膦、溴草腈、咪唑 啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯(2，4-D)抗性的基因。其它选择性标记包 括表型标记例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP) (Su等，(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等，(2004)Plant Cell 16：215-28)、蓝色荧光蛋白(CYP)(Bolte等，(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等，(2002)Plant Physiol 129：913-42)以及黄色荧光 蛋白(Evrogen的PhiYFPTM，参见，Bolte等，(2004)J.Cell Science 117：943-54)。其它选择性标记可参见，Yarranton(1992)Curr.Opin. Biotech.3：506-511；Christopherson等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol. Microbiol.6：2419-2422；Barkley等，(1980)The Operon，177-220页；Hu 等，(1987)Cell 48：555-566；Brown等，(1987)Cell 49：603-612；Figge 等，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci. USA 86：5400-5404；Fuerst等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等，(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993) Heidelberg大学博士论文；Reines等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356； Zambretti等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等， (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等，(1991) Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol. Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Heidelberg大学博士论文；Gossen等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等，(1992)Antimicrob. Agents Chemother.36；913-919；Hlavka等，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等， (1988)Nature 334：721-724。该类公开物均以参考形式并于本文。
以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性 标记基因。
本发明的实施中可使用多种启动子，包括与目的多聚核苷酸序列 同源的启动子。可基于所期望的结果选择启动子。在Potenza等近期 的综述(2004)In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40：1-22中讨论了许多植物 启动子，将其以参考形式并于本文。例如，该核酸可与组成型、组织 -优选型、病原体-诱导型或其它启动子结合以在植物中表达。该类组 成型启动子包括，例如，在WO99/43838和美国专利第6,072,050号 中公开的Rsyn7启动子的核心启动子和其它组成型启动子；核心 CaMV 35S启动子(Odell等，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋 白(McElroy等，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等， (1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等，(1992)Plant Mol. Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet. 81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动 子(美国专利第5,659,026号)等。其它组成型启动子包括例如美国专利 第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、 5,268,463、5,608,142和6,177,611号。在具体的实施方案中使用了 E35S-Ubi启动子以达到强组成型表达。
通常使用诱导型启动子、尤其是病原体-诱导型启动子表达基因 是有利的。该类启动子包括来自致病-相关蛋白质(PR蛋白质)的那些， 其在病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3- 葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi等，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等，(1992)Plant Cell 4：645-656；和Van Loon (1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。也可参见WO 99/43819，将其以参 考形式并于本文。
感兴趣的是使蛋白质在病原体感染位点或在其附近局部表达的 启动子。参见，例如，Marineau等，(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342； Matton等，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331； Somsisch等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch 等，(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 93：14972-14977。也可参见，Chen等，(1996)Plant J. 10：955-966；Zhang等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511； Warner等，(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等，(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利第5,750,386号(线虫-诱导型)；及其中引用的参 考文献。尤其感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达被 病原体轮状镰刀霉诱导(参见，例如，Cordero等(1992)Physiol.Mol. Plant Path.41：189-200)和美国专利第6,429,362号中描述的诱导型玉 米启动子(例如，Zm-PR1-81和Zm-PR1-83启动子)，它们的完整内容 均以参考形式并于本文。本发明的实施中也可使用美国专利第 6,720,480号描述的启动子，例如Zm-BBl1启动子。
此外，由于病原体通过伤口或昆虫损害进入植物，所以可在本发 明的构建体中使用伤口-诱导型启动子。该类伤口-诱导型启动子包括 马铃薯蛋白酶抑制因子(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath. 28：425-449；Duan等，(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1 和wun2，美国专利第5,428,148号；win1和win2(Stanford等，(1989) Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(McGurl等，(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等，(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792； Eckelkamp等，(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok 等(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等等，将所述文献以参考形式并于本 文。
可通过应用外源化学品调节剂，可将化学品-调控启动子用于调 节植物中基因的表达。根据目的不同，所述启动子可为化学品-诱导 型启动子，其中应用该化学品诱导基因表达，或化学品-抑制型启动 子，其中应用该化学品抑制基因表达。化学品-诱导型启动子为本领 域已知并包括，但不限于玉米In2-2启动子(其可被苯磺酰胺基除草剂 安全剂激活)、玉米GST启动子(其可被用作萌前型除草剂 (pre-emergent herbicide)的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a 启动子(其可被水杨酸激活)。其它感兴趣化学品-调控启动子包括类固 醇-反应型启动子(参见，例如，Schena等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88：10421-10425和McNellis等，(1998)Plant J.14(2)：247-257中 的糖皮质激素-诱导型启动子)和四环素-诱导型和四环素-抑制型启动 子(参见，例如，Gatz等(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国 专利第5,814,618号和5,789,156号)，将其以参考形式并于本文。
可使用组织-优选启动子将本发明抗病原体多肽的增强表达定位 于具体的植物组织中。例如，组织-优选启动子可用于在病害抗性尤 其重要的植物组织、例如根或叶中表达抗真菌多肽。组织优选启动子 包括Yamamoto等，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等，(1997) Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等，(1997)Mol.Gen Genet. 254(3)：337-343；Russell等，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168； Rinehart等，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等， (1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等，(1994)Plant Cell Physiol. 35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196； Orozco等，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuok等，(1993) Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等， (1993)Plant J.4(3)：495-505。需要时，可将该类启动子修饰以达到弱 表达。
脉管组织-优选启动子为本领域已知并包括那些可选择性驱动在 例如木质和韧皮组织中的蛋白质表达的启动子。脉管组织-优选启动 子包括，但不限于野樱(Prunus serotina)野黑樱苷水解酶基因启动子 (参见，例如，国际公开编号WO 03/006651)，也包括美国专利申请序 列号10/109,488中的那些。
茎-优选启动子可用于驱动本发明抗病原体多肽的表达。示例性 茎-优选启动子包括玉米MS8-15基因启动子(参见，例如，美国专利 第5,986,174号和国际公开编号WO 98/00533)和Graham等，(1997) Plant Mol Biol 33(4)：729-735中的那些。在本发明的某些实施方案中， Zm-419启动子可用做在玉米茎组织中表达的组织优选启动子。参见， 例如，美国临时申请案号60/729,772，标题为“茎、茎节、根和叶鞘 中高水平活性启动子(Promoter Active at High Levels in Stalks，Stalk Nodes，Roots and Leaf Sheaths)”，2005年10月24日申请，其完整内 容以参考形式并于本文。
叶-优选启动子为本领域已知。参见，例如，Yamamoto等，(1997) Plant J.12(2)：255-265；Kwon等，(1994)Plant Physiol.105：357-67； Yamamoto等，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等，(1993) Plant J.3：509-18；Orozco等，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138； 和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
根-优选启动子为已知，并可选自文献中许多可用的启动子或从 多种相容性物种从头分离。参见，例如，Hire等，(1992)Plant Mol.Biol. 20(2)：207-218(大豆根-特异性谷氨酰胺合酶基因)；Keller和 Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(菜豆GRP 1.8基因的 根特异性控制元件)；Sanger等，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443 (根癌土壤杆菌甘露碱合酶(MAS)基因的根-特异性启动子)；以及 Miao等，(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合酶(GS)的 全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也可参见Bogusz等， (1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了分离自固氮非豆类 Parasponia andersonii(nonlegume Parasponia andersonii)和相关的非 固氮非豆类Trema tomentosa(nonlegume Trema tomentosa)的血红素基 因的两个根-特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖苷酸酶报告 基因相连并被导入非豆类Nicotiana tabacum(nonlegume Nicotiana tabacum)和豆类Lotus corniculatus(legume Lotus corniculatus)这二者， 在两种情况下均保留了根-特异性启动子的活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他们对发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度 表达rolC和rolD根-诱导型基因的启动子的分析(参见Plant Science (Limerick)79(1)：69-76)。他们推断在这些启动子中增强子与组织-优选 DNA决定子分离。Teeri等，(1989)使用对lacZ的基因融合以显示编 码章鱼碱合酶的土壤杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中尤其活跃，并 且TR2′在完整植物中为根-特异性并可被叶组织损伤激活，这是用于 与杀虫或杀幼虫基因一起使用的非常期望的特性的组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶)融合的TR1′基因呈现相 似的特性。其它根-优选启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子 (Kuster等，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；和rolB启动子 Capana等，(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。也可参见美国专利 第5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732 和5,023,179号。
“种子-优先”启动子包括“种子-特异性”启动子(在种子发育过程 中具有活性的启动子，例如种子储存蛋白启动子)以及“种子萌芽”启 动子(在种子萌芽过程中具有活性的启动子)。参见，Thompson等， (1989)BioEssays 10：108，将其以参考形式并于本文。该类种子-优选 启动子包括，但不限于Cim1(细胞分裂素-诱导信号)；cZ19B1(玉米 19kDa玉米朊)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国 专利第6,225,529号；将其以参考形式并于本文)。γ-玉米朊为内皮-特 异性启动子。球蛋白-1(G1b-1)为代表性胚-特异性启动子。对于双子 叶植物而言，种子-特异性启动子包括，但不限于大豆β-菜豆蛋白、 油菜籽蛋白、β-伴豆球蛋白(conglycinin)、大豆植物凝集素、十字花 科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物而言，种子-特异性启动子包括， 但不限于玉米15kDa玉米朊、22kDa玉米朊、27kDa玉米朊、γ-玉 米朊、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等。也可参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子-优先启动子； 将其以参考形式并于本文。
在某些实施方案中，本发明的核酸序列可与目的多聚核苷酸序列 的任何组合叠加以产生具有期望表型的植物。例如，本发明的多聚核 苷酸可与其它抗真菌基因等叠加。所产生的组合可包括任一所述目的 多聚核苷酸的多拷贝。本发明多聚核苷酸可与任何其它基因或基因组 合叠加，以生产具有多种期望性状组合的植物，所述状组合包括但不 限于动物饲料所需要的性状例如高油基因(例如，美国专利第 6,232,529号)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利第 5,990,389号、5,885,801号、5,885,802号和5,703,409号)；大麦高赖 氨酸(Williamson等，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem. 261：6279；Kirihara等，(1988)Gene 71：359；Musumura等，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；消化性增强(例如，被修饰的贮存蛋白(美国专利 第6,858,778号，2001年11月7日申请)；硫氧还蛋白(美国专利第 7,009,087号，2001年11月3日申请))，其公开内容均以参考方式并于 本文。本发明的多聚核苷酸也可叠加有利于昆虫、疾病或除草剂抗性 的性状(例如，苏芸金杆菌毒性蛋白(美国专利第5,366,892号； 5,747,450号；5,737,514号；5,723,756号；5,593,881号；Geiser等，(1986) Gene 48：109)；外源凝集素(Van Damme等，(1994)Plant Mol.Biol. 24：825)；烟曲霉毒素解毒基因(美国专利第5,792,931号)；无毒或疾 病抗性基因(Jones等，(1994)Science 266：789；Martin等，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等，(1994)Cell 78：1089)；可产生除草剂抗性，例 如S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体；谷氨酰胺合酶抑 制剂，例如草胺膦或草丁膦(phosphinothriein or basta)(例如，bar基因)； 草甘磷抗性(例如美国专利申请出版物US2004/0082770及 WO02/36782和WO03/092360公开的EPSPS基因、GAT基因))；和 有利于加工处理或加工产品的性状，例如高油(例如，美国专利第 6,232,529号)；经改良的油类(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第 5,952,544号；WO 94/11516))；经改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶 (AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分枝酶(SBE)和淀粉脱枝酶(SDBE))；和 聚合物或生物塑料(例如美国专利第5,602,321号；β-酮硫解酶、聚羟 基丁酸酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等，(1988)J. Bacteriol.170：5837-5847)促进多羟基链烷酸酯(polyhydroalkanoate)的 表达(PHAs))，其公开以参考形式并于本文。也应将本发明的多聚核苷 酸与提供如下性状的多聚核苷酸组合：农艺性状例如雄株不育(例如 参见美国专利第5,583,210号)、茎强度、开花时间，或转化技术性状 例如细胞周期调节或基因打靶(例如，WO99/61619；WO00/17364； WO99/25821)，将所述公开以参考形式并于本文。
可通过任何方法产生这些叠加组合物，所述方法包括但不限于通 过任何传统方法学或方法学对作物杂交育种、或基因转化。 如果通过基因转化植物将这些性状叠加，可在任何时间以任何顺序组 合目的多聚核苷酸序列。举例而言，包含一种或多种期望性状的转基 因植物可用作通过后续转化导入其它性状的靶标。所述性质可在共转 化方案中与由转化盒任意的组合提供的目的多聚核苷酸同时导入。例 如，如果导入两个序列，可将这两个序列包含于独立的转化盒中(反 式)或包含于相同的转化盒(顺式)中。该序列的表达可被相同的启动子 或不同的启动子启动。在某些情况下，可能需要导入可抑制目的多聚 核苷酸表达的转化盒。这可与其它抑制表达盒或过度表达盒的任意组 合组合以在该植物中产生目的性状组合。应进一步认识到可使用位点 -特异性重组系统将该多聚核苷酸序列叠加于目的基因组位置。参见， 例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和 WO99/25853，所述文献均以参考形式并于本文。
本发明方法涉及将多肽或多聚核苷酸导入植物。“导入”意指向植 物呈递所述多聚核苷酸。在一些实施方案中，可通过使序列可进入植 物细胞内部的方式提供所述多聚核苷酸，包括其对植物基因组的可能 的插入。本发明方法不依赖于向植物中导入序列的具体方法，仅依赖 于所述多聚核苷酸可进入至少一个植物细胞的内部。向植物中导入多 聚核苷酸的方法为本领域已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转 化方法和病毒-介导方法。也可将多肽通过如下方式导入植物：它们 可以进入植物细胞内部，或仍其在细胞外部但与它紧密接触。
“稳定转化”指导入植物中的核苷酸构建体被整合入植物的基因 组中并可被遗传至其后代。“瞬时转化”或“瞬时表达”意指将多聚核苷 酸导入植物中但是并未被整合入植物的基因组、或向植物中导入多 肽。
转化方案以及向植物导入多肽或多聚核苷酸序列的方案非常依 赖于作为转化靶标的植物或植物细胞的类型，即单子叶或双子叶植 物。向植物中导入多肽或多聚核苷酸的适当方法包括显微注射 (Crossway等，(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等，(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、土壤杆菌-介导转化(美国专 利第5,563,055和5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski等，(1984) EMBO J.3：2717-2722)和基因枪颗粒加速(参见，例如，Sanford等，美 国专利第4,945,050、5,879,918、5,886,244和5,932,782号；Tomes等， (1995)“植物细胞、组织和器官培养：基本方法”(Plant Cell，Tissue， and Organ Culture：Fundamental Methods)，Gamborg和Phillips编辑 (Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等，(1988)Biotechnology 6：923-926)； 和Lec1转化(WO 00/28058)。也可参见Weissinger等，(1988)Ann.Rev. Genet.22：421-477；Sanford等，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等，(1988)Plant Physiol. 87：671-674(大豆)；McCabe等，(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)； Finer和McMullen(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)； Singh等，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等，(1990) Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉 米)；美国专利第5,240,855、5,322,783和5,324,646号；Klein等，(1988) Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London) 311：763-764；美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier等(1987)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等，(1985)(胚珠组 织的实验操作)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues， Chapman等编辑(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler 等，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等(1992)Theor. Appl.Genet.84：560-566(颈须-介导转化(whisker-mediated transformation))；D′Halluin等(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)； Li等，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255；Christou和Ford(1995) Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过根癌土壤杆菌转化玉米)；所述文献均 以参考形式并于本文。
在具体的实施方案中，可使用多种瞬时转化方法向植物提供本发 明的抗病原体序列。该类瞬时转化方法包括但不限于直接向植物导入 该抗病原体蛋白质或其变异体和片段，或向植物导入该抗病原体蛋白 质转录物。该类方法包括，例如，显微注射或颗粒轰击。参见，例如， Crossway等，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura等，(1986) Plant Sci.44：53-58；Hepler等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91： 2176-2180和Hush等，(1994)The Journal ofCell Science 107：775-784， 所述文献均以参考形式并于本文。或者可使用本领域已知技术将所述 多聚核苷酸瞬时转化入植物中。该类技术包括病毒载体系统和以排斥 DNA后续释放的方式进行的多聚核苷酸沉淀。因此，可产生来自颗 粒-结合DNA的转录，但是它被释放以整合入基因组的转录频率大大 降低。该类方法包括使用聚乙烯亚胺包裹的颗粒(PEI；Sigma#P3143)。
在其它实施方案中，可通过将植物与病毒或病毒核酸接触将本发 明的多聚核苷酸导入植物中。通常，该方法涉及将本发明核苷酸构建 体中掺入病毒DNA或RNA分子。已知本发明的抗病原体多肽可首 先作为病毒多蛋白的一部分被合成，之后通过体内或体外的蛋白水解 产生期望的重组蛋白质。而且，已知本发明启动子也涵盖用于通过病 毒RNA聚合酶转录的启动子。向植物中导入多聚核苷酸并表达在所 述植物中编码的蛋白质(涉及病毒DNA或RNA分子)的方法为本领域 已知。参见，例如，美国专利第5,889,191、5,889,190、5,866,785、 5,589,367、5,316,931号和Porta等，(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；所述文献以参考形式并于本文。
将多聚核苷酸靶向插入植物基因组的特定位点的方法为本领域 已知。在一个实施方案中，通过使用位点特异重组系统将多聚核苷酸 插入期望的基因组位点。参见，例如，WO99/25821、WO99/25854、 WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所述文献均以参考形式 并于本文。简略而言，本发明多聚核苷酸可包含在被两个非重组基因 重组位点侧接的转化盒中。将该转化盒导入植物中，该植物的基因组 中稳定整合了被两个非重组基因重组位点(对应于转化盒的位点)侧接 的靶位点。提供适当的重组酶，并将该转化盒整合入靶位点。藉此将 目的多聚核苷酸整合入植物基因组的特异染色体位点。
根据传统方法已被转化的细胞可生长成植株。参见，例如 McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植株可生长并 被相同的转化株或不同株授粉，并产生后代，所述后代具有经鉴定的 期望表型特点的组成型表达。可生长两至三代以确定可稳定维持和遗 传期望表型特点的表达，然后收获种子以确保达到了期望表型特点的 表达。在该方式中，本发明提供了已转化种子(也称做“转基因种子”)， 所述种子含有被稳定整合入它们基因组的本发明核苷酸构建体(例如 本发明表达盒)。
谱系育种从两个基因型的杂交开始，例如一种感兴趣的优良品系 和另一种具有一个或多个可补足该感兴趣的优良品系的期望特性 (即，具有经稳定整合的本发明的多聚核苷酸，具有经调节的本发明 多肽的活性和/或水平等)的优良自交系。如果两个原始亲代未提供所 有期望的特性，可在繁育群中包括其它来源。在谱系法中，将更优良 的植物自交并在连续子代中筛选。由于自花授粉和筛选，在随后的子 代中同型系比杂合条件更具优势。通常在繁育的谱系法中进行五代或 更多连续子代的自花授粉和筛选：F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→ F5等。在近亲繁殖足够数量之后，连续子代可增加已发育自交株的 种子。在具体实施方案中，该自交系包含其基因座约95％或更多的纯 合等位基因。
除了用于产生回交基因转变(backcross conversion)之外，回交也 可与谱系育种联合使用以改良感兴趣的优良品系和使用该被改良的 优良品系生成的杂种。如前所述，回交可将来自一个品系(供体亲本) 的一种或多种具体期望的性状转化至自交植株(轮回亲本)中，其具有 整体良好的农学性状但是缺少一种或多种期望性状。然而，可使用相 同的方法使子代具有轮回亲本的基因型但是同时通过在更早的阶段 停止回交并进行自花授粉和筛选保留了非轮回亲本的许多组分。例如 产生了F1，例如商品杂交种。该商品杂交种可与其亲本品系回交产 生BC1或BC2。将子代自花授粉并进行筛选，使得新发育的杂交种 具有轮回亲本的许多特性并仍具有非轮回亲本的数种期望特性。该方 法可调节用于新杂交种和繁育的轮回亲本的价值和强度。
因此，本发明的一个实施方案为产生感兴趣的玉米近交品系的回 交转化方法，其包含将感兴趣的玉米近交品系植株与包含可赋予期望 性状(即，病原体抗性增强)的变异基因或转基因的供体植株杂交，筛 选包含可赋予期望性状的变异基因或转基因的F1子代植株，将F1 子代植株与感兴趣的玉米近交品系植株回交。该方法可进一步包括获 得感兴趣的玉米近交品系的分子标记曲线并使用该分子标记曲线筛 选具有期望性状和感兴趣近交品系的分子标记曲线的的子代。在相同 的方式中，该方法可用于生产F1杂交种，其方式为通过增加将感兴 趣的玉米近交品系的期望性状转变与不同的玉米植株杂交这最后一 步，得到含有可赋予期望性状的变异基因或转基因的F1杂交玉米种。
轮回筛选为用于植物育种方案以改良植物种群的方法。该方法使 单株之间交互授粉形成后代。使所述后代生长并通过任何数量的筛选 方法筛选更优良的后代，其包括单株、半同胞后代、全同胞后代、自 交后代和顶交。将所筛选的后代之间交互授粉形成另一种群的子代。 种植该种群并再次筛选更优良的植株并使其之间交互授粉。轮回筛选 是一个循环过程，因此可重复所需要的次数。轮回筛选的目的是为了 改良种群性状。经改良的种群可用作育种材料的来源，以获得近交品 系用于杂种或用作综合栽培种(synthetic cultivar)的亲代。综合栽培种 为数种经筛选的近交种相互杂交得到的子代。
当与分子标记增强的筛选结合时，集团选择为可用技术。在集团 选择中，基于表型和/或基因型从个体筛选种子。将这些经筛选的种 子混合(bulk)并用于生长下一世代。混合选择需要在混合试验田(bulk plot)种植植物群，允许植株自授粉，在混合试验田收获种子(in bulk)， 然后使用在混合试验田收获的种子种植下一代。除了自授粉外，可将 定向授粉用作育种方案的一部分。
诱变育种为可用于向优良品系中导入新性状的诸多方法之一。自 发产生或人工诱导的变异可作为植物育种者的差异性来源。人工诱变 的目的为增强突变频率以得到期望的特性。可通过多种不同的方法增 强诱变率，包括温度、长期种子贮藏、组织培养条件、放射；例如 X-射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(原子反应堆中铀235核裂 变的产物)、β-辐射(来自放射性同位素例如磷32或碳14的放射)或化 学诱变剂(例如碱类似物(5-溴-尿嘧啶)、相关化合物(8-乙氧咖啡因)、 抗生素(链黑霉素)、烷化剂(硫芥类、氮芥类、环氧化物类、1，2-亚乙 基胺类、硫酸盐类、磺酸盐类、砜类、内酯类)、叠氮化合物、羟胺、 亚硝酸或吖啶)。一旦通过诱变观察到期望性状，然后可通过传统育 种技术将该性状整合入现有种质，例如回交。诱变育种的细节可参见 “栽培种发育的原则(Principles of Cultivar Development)”Fehr，1993 Macmillan Publishing Company，New York，其公开内容以参考形式并 于本文。此外，在其它品系中产生的变异可用于产生包含该突变的优 良品系的回交转换。
如本文所使用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可 产生玉米植株的植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植株簇、和植物 或植物部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、分枝、果实、核 仁、穗、穗轴、壳、根、根尖、花药等)中完整的植物细胞等。谷粒 指不以生长或再生该种系为目的，由商业种植者生产的成熟种子。如 果这些部分包含导入的多聚核苷酸，那么再生植株的后代、变异体和 突变体也包含于本发明范畴，
本发明也可用于导入病原体抗性或保护植物种免受病原体攻击， 包括但不限于双子叶植物和单子叶植物。相关植物种的实例包括但不 限于玉蜀黍(zea mays)、芸苔(Brassica sp.)(例如，欧洲油菜(B.napus)、 芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可用作种子油来源的芸苔， 苜蓿(Medicago sativa))、水稻(Oryza sativa、Secale cereale)、高粱 (Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、谷子(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、稷(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、穇子(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、 小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、 马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯 (Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝 (Ananas comosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶 (Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花 果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、 橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、 蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣 (Lactuca sativa))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属的成员例如黄瓜(C.sativus)、 网纹甜瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花 (Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、碧冬茄(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、猩猩 木(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可应用于实施本发明的针叶树包括，例如，松树类诸如火炬松 (Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、坑木 松(pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；异叶铁杉(Tsuga canadensis)；西加云杉(Picea glauca)； 北美红杉(Sequoia sempervirens)；冷杉(true fir)诸如欧洲冷杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)、以及雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中， 本发明植物为农作物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉 花、红花、花生、高粱、小麦、谷子、烟草等)。在其它实施方案中， 玉米和大豆植株最佳，又在其它实施方案中玉米植株最佳。
其它感兴趣的植物包括可提供感兴趣的种子的谷类植物、油料种 子植物、和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、 大麦、水稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、 向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌 豆。豆类包括革荚豆、角豆、胡卢巴、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、利 马豆、蚕豆、兵豆、鹰嘴豆等。
抗病原体组合物、尤其是抗真菌组合物，也涵盖于本发明中。抗 病原体组合物可包含抗病原体多肽或含有编码抗病原体多肽的核苷 酸序列的经转化微生物。本发明的抗病原体组合物可应用于植物病原 体的环境，如下文所述，藉此保护植物免受病原体攻击。此外，抗病 原体组合物可与可接受的载体配制成例如，混悬液、溶液、乳剂、粉 剂(dusting powder)、可分散的颗粒、可湿性粉末、乳化原液、气雾剂、 被浸渍颗粒、佐剂、可包衣的糊剂以及在例如聚合物质中的包封物。
可根据本领域标准方法将编码本发明抗病原体、尤其是抗真菌多 肽的基因导入任何适当的微生物宿主。例如，可选择已知可占据一种 或多种感兴趣的农作物“植物圈”(叶面(phytosphere)、叶际、根际和/ 或根面)的微生物宿主。可选择这些微生物使得可以成功与具体环境 中的野生型微生物竞争，并提供表达该抗真菌蛋白质基因的稳定维持 和表达。
该类微生物包括细菌、藻类和真菌。尤其感兴趣的微生物为例如 细菌诸如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属 (Serratia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、黄杆菌属(Xanthomonas)、链 霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属 (Rhodopseudomonas)、Methylius、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋酸 杆菌属(Acetobacter)、乳酸菌属(Lactobacillus)、节杆菌属 (Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产 碱杆菌属(Alcaligenes)，真菌尤其是酵母，例如酵母菌属 (Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、赤酿母属(Rhodotorula) 和短梗霉属(Aureobasidium)。尤其感兴趣的是植物圈菌种例如丁香假 单孢菌Pseudomonas syringae)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、木糖醋杆菌 (Acetobacter xylinum)、土壤杆菌属、球形红假单胞菌 (Rhodopseudomonas spherodies)、野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木糖棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，以及植物圈酵母种诸如深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、 粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R. aurantiaca)、白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C. diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、 普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisia)、粉红掷孢酵母 (Sporobolomyces rosei)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母 (Kluyveromyces veronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。尤其 感兴趣的为经染色的染色微生物。
其它示例性原核生物(革兰氏阴性或革兰氏阳性)，包括肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，诸如大肠杆菌(Escherichia)、欧文菌属、志贺氏 杆菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形菌属(Proteus)；芽胞 杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，诸如根瘤菌属；螺菌 科(Spirillaceae)，诸如发光菌属(Photobacterium)、酵单胞菌属(Zymom onas)、沙雷氏菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫 弧菌属(Desulfovibrio)、螺旋菌属(Spirillum)；乳酸杆菌科(Lctobacteri aceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属和醋酸杆 菌属、固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化菌科(Nitrobacteraceae)。真 核细胞中为真菌，例如藻状菌纲和子囊菌，其包括酵母，例如酵母属 和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；担子菌纲(Basidiomycetes)酵母， 例如赤酿母属(Rhodotorula)、短梗霉属、掷孢酵母属等。
尤其感兴趣的微生物宿主生物体包括酵母，例如赤酿母 (Rhodotorula spp.)、短梗霉(Aureobasidium spp.)、酵母菌 (Saccharomyces spp.)和掷孢酵母(Sporobolomyces spp.)，叶轴生物体例 如假单胞菌(Pseudomonas spp.)、欧文菌(Erwinia spp.)和黄杆菌 (Flavobacterium spp.)，以及其它该类生物体，包括铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、 酿酒酵母、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠埃希杆菌 (Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
可将编码本发明抗病原体蛋白质的基因导入在植物上繁殖的微 生物(附生植物)中向潜在的目标害虫释放抗真菌蛋白质。附生植物， 例如可为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
例如可通过本领域已知方法从感兴趣的植物中分离根-定殖细 菌。具体而言，在根定殖的蜡样芽胞杆菌菌株可分离自植物的根部(参 见，例如Handelsman等，(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713-718)。 可通过本领域已知的标准方法将编码本发明抗真菌多肽的基因导入 根定殖蜡样芽胞杆菌中。
例如可通过电转化将编码本发明抗真菌蛋白质的基因导入根定 殖的杆菌中。具体而言，可将编码本发明抗真菌蛋白质的基因克隆至 穿梭载体中，例如pHT3101(Lerecius等，(1989)FEMS Microbiol.Letts. 60：211-218)。例如，可通过电穿孔将含有具体抗真菌蛋白质基因编码 序列的穿梭载体pHT3101转化入根定殖的杆菌中(Lerecius等，(1989) FEMS Microbiol.Letts.60：211-218)。
提供了保护植物免受病原体攻击的方法，其包括向病原体的环境 中应用有效量的本发明抗病原体蛋白质或组合物。“有效量”意指足以 控制病原体的蛋白质或组合物的量。可通过本领域技术人员已知的方 法将该抗病原体蛋白质和组合物应用至病原体的环境中。
可通过加入表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、摄食刺激 剂(feeding stimulant)、引诱剂、包胶剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV 保护剂、缓冲剂、助流剂(flow agent)或肥料、微量元素供体或其它影 响植物生长的制剂得到本发明的抗真菌组合物。可将一种或多种包括 但不限于除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动 物药剂、杀软体动物药剂、植物生长调节剂、落叶剂和肥料的农用化 学品与制剂工艺中通常使用的载体、表面活性剂或佐剂或其它组分结 合，以促进产品操作和对具体目标病原体的应用。适当的载体或佐剂 可为固体或液体并对应于制剂技术中常用的物质，例如，天然的或再 生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、胶粘剂、粘合剂或肥料。本发 明的活性成分通常以组合物形式使用并可应用于欲处理的农作物区 域、植物或种子。例如，本发明组合物可应用于正准备或已贮藏于粮 仓或地窖等的谷物。本发明组合物可与其它化合物同时或连续使用。 应用本发明活性成分或包含至少一种抗病原体蛋白质尤其是抗真菌 蛋白质的本发明农用化学品组合物的方法包括但不限于叶敷、种子包 衣或土壤应用。应用次数和应用比率取决于对应害虫或病原体侵袭的 强度。
适当的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，例如羧酸盐诸如 金属羧酸盐；长链脂肪酸羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙 氧化物的一或二酯或所述酯的盐；脂肪醇硫酸盐，例如十二烷基硫酸 钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙 氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐 例如烷基-苯磺酸盐或低烷基萘磺酸盐，例如，丁基-萘磺酸盐；磺化 萘甲醛缩合物的盐；磺化酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐例如 磺酰胺，例如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合物；或磺基丁二酸二 烷基酯，例如磺酸钠或丁二酸二辛酯。非离子试剂包括脂肪酸酯、脂 肪醇、脂肪酰胺或脂肪-烷基-或烯基取代酚与环氧乙烷、多元醇醚的 脂肪酯，例如失水山梨糖醇脂肪酸酯的缩合产物，该类酯与环氧乙烷 的缩合产物、例如聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧 丙烷的嵌段共聚物，炔二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇、或 乙氧基化炔二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂肪族一、 二或多胺诸如醋酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺例如聚氧乙烯烷 基胺的氧化胺；通过羧酸与二或多胺缩合制备的酰胺结合胺；或季铵 盐。
惰性材料的实例包括但不限于无机矿物质例如高岭土、层状硅酸 盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物材料例如软木、玉米芯粉末、花 生壳、谷壳和胡桃壳。
本发明抗病原体组合物可以适当形式直接应用或作为在应用前 需要使用适量水或其它稀释剂稀释的主要组合物的浓缩物。该抗病原 体多肽的浓度根据具体制剂的性质(具体而言，是作为浓缩物还是直 接使用)变化。该组合物包含1-98％固体或液体的惰性载体，以及 0-50％、最优0.1-50％的表面活性剂。以商业产品的标示比率给予这 些组合物，干燥形式最优约0.01lb-5.0lb/英亩，液体形式最优0.01 pts-10pts/英亩。
在进一步的实施方案中，可在制剂之前处理本发明的该组合物以 及转化微生物和抗病原体蛋白质以延长应用于目标病原体环境时的 抗病原体尤其是抗真菌活性，只要该预处理对活性无害。该处理可为 化学和/或物理方式，只要该处理不影响该组合物的性质。化学试剂 的实例包括但不限于卤化剂；醛例如甲醛和戊二醛；抗感染剂，例如 氯化苄烷氨；醇类，例如异丙醇和乙醇；组织固定剂，例如Bouin’s 固定剂和Helly’s固定剂(参见，例如Humason(1967)Animal Tissue Techniques(W.H.Freeman and Co.))。
本发明抗病原体组合物可应用于植物病原体的环境中作为保护 措施，其方式为例如在病原体出现时或病原体出现之前通过喷雾、雾 化、喷粉、撒施、包衣或倾倒、引入土壤内或土壤上、引入灌溉水中， 通过种子处理或广泛应用或喷粉。例如，本发明的抗病原体蛋白质和 /或转化微生物可与谷粒混合以在贮存中保护谷粒。一般在植物生长 的早期阶段较好地控制病原体是重要的，因为这是植物可被严重损害 的阶段。如有必要，本发明组合物可适当包含杀虫剂。在本发明的一 个实施方案中，在种植时将该组合物以本发明载体和杆菌株或转化微 生物的死亡细胞的组合物的颗粒形式直接应用于土壤。另一个实施方 案为包含本发明农药例如除草剂和杀虫剂、肥料、惰性载体和杆菌株 或转化微生物的死亡细胞的组合物的颗粒形式。
本发明组合物可用于以各种方法保护植物、种子和植物产物。例 如，该组合物可用于涉及通过选自喷雾、喷粉、撒施或种子包衣的方 法将有效量的抗病原体、尤其是抗真菌组合物置于该病原体的环境中 的方法。
在植物繁殖材料(果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子)、但尤 其是种子被作为商业产品出售之前通常经过包含除草剂、杀虫剂、杀 真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物药剂或数种该类制剂的混合物(如有 需要，可进一步包括载体、表面活性剂或制剂工艺中通常使用的应用 -促进佐剂)的保护性包衣处理以提供免受细菌、真菌或动物害虫引起 的损害的保护。为了处理种子，可通过用液体制剂浸渍块茎或谷粒将 该保护性包衣应用至种子或通过用组合的湿或干制剂将它们包衣。此 外，在特殊情况下也可使用其它应用于植物的方法，例如对芽或果实 进行处理。
可使用包含种子处理化合物例如克菌丹、萎锈灵、福美双、 methalaxyl、甲基嘧啶磷和其它通常用于种子处理的化合物的种子保 护性包衣处理包含含有编码本发明抗病原体多肽的核苷酸序列的 DNA分子的植物种子。或者，包含含有本发明抗病原体、尤其是抗 真菌组合物的种子保护性包衣的本发明种子可单独使用或与种子处 理中通常使用的种子保护包衣之一联合使用。
本发明抗真菌多肽可用于任何应用，包括将表面包衣以靶向微生 物。在该方式中，目标微生物包括人病原体或微生物。可用本发明抗 真菌多肽包衣的表面包括毛毡(carpet)和无菌医疗设备。本发明的聚合 物结合多肽可用于将表面包衣。将具有抗微生物性质的组合物整合入 聚合物的方法为本领域已知。参见美国专利第5,847,047号，将其以 参考形式并于本文。
本发明的实施方案对多种植物病原体、尤其是真菌病原体有效， 例如，禾生刺盘孢、玉米壳色单隔孢、禾本科镰孢和轮状镰刀霉。本 发明病原体包括但不限于病毒或类病毒、细菌、昆虫、线虫、真菌等。 病毒包括植物病毒，例如，烟草或黄瓜花叶病病毒、环斑病毒、坏死 病毒、玉米矮花叶病毒等。真菌病原体包括但不限于禾生刺盘孢、玉 米壳色单隔孢、禾本科镰孢和轮状镰刀霉。主要作物的具体病原体包 括：大豆：豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、Phytophthora megasperma fsp.glycinea、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、立 枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖镰 孢(Fusarium oxysporum)、Diaporthe phaseolorum var.sojae(大豆拟茎 点霉(Phomopsis sojae))、Diaporthe phaseolorum var.caulivora、齐整小 核菌(Sclerotium rolfsii)、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢 (Cercospora sojina)、东北霜霉(Peronospora manshurica)、束状刺盘孢 (Colletotrichum dematium)(平头刺盘孢(Colletotichum truncatum))、山 扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆壳针孢(Septoria glycines)、 大豆生叶点霉(Phyllosticta sojicola)、链格孢(Alternaria alternata)、丁 香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜 黄单菜豆病原变种(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、 Microsphaera diffusa、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、Phialophora gregata、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus)、大豆小丛壳(Glomerella glycines)、烟草环斑病毒(Tobacco Ring spot virus)、烟草线条病毒 (Tobacco Streak virus)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、德巴利腐霉 (Pythium debaryanum)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、大豆 异皮线虫(Heterodera glycines)、腐皮镰孢(Fusarium solani)；芸苔：白 锈菌(Albugo candida)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、 Leptosphaeria maculans、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)、 终极腐霉(Pythium ultimum)、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、粉红 镰孢(Fusarium roseum)、链格孢(Alternaria alternata)；苜蓿：密执安 棍状杆菌诡谲亚种(Clavibacter michiganese subsp.insidiosum)、终极腐 霉、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、华丽腐霉(Pythium splendens)、德 巴利腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、车轴草 霜霉(Peronospora trifoliorum)、Phoma medicaginis var.medicaginis、 苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、Leptotrochila medicaginis、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、 黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)、野油菜黄单胞菌苜蓿致病变种 (Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、Stemphylium herbarum、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)、 三叶草刺盘孢(Colletotrichum trifolii)、苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)、条纹单胞锈菌(Uromyces striatus)、三叶草核盘菌 (Sclerotinia trifoliorum)、草木樨壳多孢(Stagonospora meliloti)、葡柄霉 (Stemphylium botryosum)、Leptotrichila medicaginis；小麦：丁香假单 胞菌致黑致病变种Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)、冰草条黑 粉菌(Urocystis agropyri)、野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、链格孢(Alternaria alternata)、草本支孢霉 (Cladosporium herbarum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、蚕豆 镰孢(Fusarium avenaceum)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、小麦散黑 粉菌(Ustilago tritici)、Ascochyta tritici、麦类条斑病菌(Cephalosporium gramineum)、禾生刺盘孢、Erysiphe graminis f.sp.tritici、Puccinia graminis f.sp.tritici、Puccinia recondita f.sp.tritici、条形柄锈菌 (Puccinia striiformis)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)、颖 枯壳针孢(Septoria nodorum)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、燕麦壳针 孢(Septoria avenae)、Pseudocercosporella herpotrichoides、立枯丝核菌、 禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、Gaeumannomyces graminis var. tritici、瓜果腐霉、Pythium arrhenomanes、终极腐霉、Bipolaris sorokiniana、大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus)、雀麦草花叶 病毒(Brome Mosaic Virus)、土壤传播小麦花叶病毒(Soil Borne Wheat Mosaic Virus)、小麦线条花叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus)、小麦 梭斑病毒(Wheat Spindle Streak Virus)、美国小麦条点病毒(American Wheat Striate Virus)、麦角菌(Claviceps purpurea)、Tilletia tritici、小麦 光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麦散黑粉菌、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯丝核菌、Pythium arrhenomannes、禾生腐霉(Pythium gramicola)、瓜果腐霉、高原病毒(High Plains Virus)、欧洲小麦条点 病毒(European wheat striate virus)；向日葵：霍尔斯单轴霉(Plasmopara halstedii)、核盘菌、Aster Yellows、向日葵壳针孢(Septoria helianthi)、 向日葵拟茎点霉(Phomopsis helianthi)、向日葵链格孢(Alternaria helianthi)、百日草链格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、Phoma macdonaldii、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、 二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、稻根霉(Rhizopus oryzae)、无根 根霉(Rhizopus arrhizus)、匍茎根霉(Rhizopus stolonifer)、向日葵柄锈 菌(Puccinia helianthi)、大丽花轮支孢(Verticillium dahliae)、胡萝卜软 腐欧氏菌胡萝卜软腐变种(Erwinia carotovorum pv.carotovora)、顶头 孢(Cephalosporium acremonium)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、 婆罗门参白锈(Albugo tragopogonis)；玉米：禾生刺盘孢、亚粘团串珠 镰孢(Fusarium moniliforme var.subglutinans)、斯氏欧文菌(Erwinia stewartii)、轮状镰刀霉(F.verticillioides)、玉米赤霉(Gibberella zeae(禾 本科镰孢Fusarium graminearum))、Stenocarpella maydi玉米壳色单 隔孢(Diplodia maydis)、畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉(Pythium graminicola)、华丽腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、黄曲霉、玉米双极 菌O、T种(Bipolaris maydis O、T(异旋孢腔菌Cochliobolus heterostrophus))、炭设长蠕孢I、II & III(Helminthosporium carbonum I、 II & III(炭色旋孢腔菌Cochliobolus carbonum))、Exserohilum turcicum I、II & III、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)、玉米叶点霉(Phyllosticta maydis)、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢(Cercospora sorghi)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、多堆柄锈菌(Puccinia polysora)、 菜豆壳球孢、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、稻黑孢(Nigrospora oryzae)、草本支孢霉(Cladosporium herbarum)、月状弯孢霉(Curvularia lunata)、不等弯孢(Curvularia inaequalis)、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)、密执安棍状杆菌内布拉斯加亚种(Clavibacter michiganense subsp.nebraskense)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉 米矮花叶病毒A & B(Maize Dwarf Mosaic Virus A & B)、小麦条纹花 叶病毒(Wheat Streak Mosaic Virus)、玉米褪绿矮缩病毒(Maize Chlorotic Dwarf Virus)、高粱麦角菌(Claviceps sorghi)、燕麦假单胞菌 (Pseudonomas avenae)、菊欧文氏玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zea)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、谷物矮小螺原体 (Corn stunt spiroplasma)、大孢色二孢(Diplodia macrospora)、指疫霉 (Sclerophthora macrospora)、高梁指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、 菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、玉米指霜霉 (Peronosclerospora maydis)、甘蔗指霜霉(Peronosclerospora sacchari)、 丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana)、玉米壳锈菌(Physopella zeae)、玉 米头孢(Cephalosporium maydis)、顶头孢(Cephalosporium acremonium)、玉米枯黄斑点病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)、高原 病毒(High Plains Virus)、玉米花叶病毒(Maize Mosaic Virus)、玉米雷 亚多非纳病毒(Maize Rayado Fino Virus)、玉米线条病毒(Maize Streak Virus)、玉米条纹叶枯病毒(Maize Stripe Virus)、玉米粗缩病毒(Maize Rough Dwarf Virus)；高粱：Exserohilum turcicum、C.sublineolum、 高粱尾孢、高梁胶尾孢(Gloeocercospora sorghi)、高粱生壳二孢 (Ascochyta sorghina)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)、野油菜黄单胞菌栖绒毛草致病变种 (Xanthomonas campestris p.v.holcicola)、须芝草假单胞菌 (Pseudomonas andropogonis)、紫柄锈菌(Puccinia purpurea)、菜豆壳球 孢、Perconia circinata、轮状镰刀霉、链格孢、蜀黍生离蠕孢(Bipolaris sorghicola)、高粱长蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、月状弯孢霉、 高粱茎点霉(Phoma insidiosa)、燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans))、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高 梁生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachara sacchari)、Sporisorium reilianum丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana))、 高粱轴黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)、Sporisorium sorghi、甘蔗花叶 病毒H(Sugarcane mosaic H)、玉米矮花叶病毒A & B(Maize Dwarf Mosaic Virus A & B)、高粱麦角菌、立枯丝核菌、局限枝顶孢霉 (Acremonium strictum)、大孢指疫霉(Sclerophthona macrospora)、高梁 指霜霉(Peronosclerospora sorghi)、菲律宾指霜霉(Peronosclerospora philippinensis)、禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)、禾本科镰孢、 尖镰孢、Pythium arrhenomanes、禾生腐霉等。
线虫包括寄生线虫诸如根结线虫、孢囊线虫和根斑线虫(包括异 皮线虫(Heterodear spp.)、根结线虫(Meloidogyne spp.)、球异皮线虫 (Globodera spp.))，尤其是孢囊线虫的成员，所述线虫包括但不限于 大豆异皮线虫(Heterodear glycines)(大豆孢囊线虫)；甜菜异皮线虫 (Heterodear schachtii)(甜菜孢囊线虫)；燕麦异皮线虫(Heterodear avenae)(禾谷孢囊线虫(cereal cyst nematode))；和马铃薯金线虫 (Globodera rostochiensis)和Globodera pailida(马铃薯孢囊线虫)。根斑 线虫包括短体线虫(Pratylenchus spp.)。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或多于一个/种(即至 少一个/种)的该冠词的语法主语。举例而言，“一种成分”指一种或多 种成分。
单位、字首和标示符表示为SI接受形式。除非另外指明，核酸 由左向右以5’至3’方向书写；氨基酸序列由左向右从氨基至羧基的 方向书写。数字范围包括限定该范围的数值。本文中提及的氨基酸可 为它们普遍使用的三字母标示符或IUPAC-IUB生物化学命名委员会 建议使用的单字母标示符。同样，核苷酸以它们被普遍接受的单字母 编码表示。通过整体参考说明书更加全面地定义下文中定义的术语。
以下实施例用于阐述目的而不具有任何限制性。
实施例
培养真菌的方法为本领域已知。对于传代本文公开的真菌培养可 使用任何适于培养真菌的培养液，包括例如下文的马铃薯右旋糖培养 基(Becton Dickinson Microbiology Systems，Sparks，MD)、下文的 Czapek-Dox培养基(Becton Dickinson Microbiology Systems，Sparks MD)、Sabouraud培养基(BBL #210986，Voigt Global Distribution LLC， Kansas City，MO)等。
实施例1：分离抗真菌多肽LB-09812(SEO ID NO：1)
从欧洲山杨(Populus tremula L.)树木质的腐败部分收集土壤样 品。使用马铃薯右旋糖琼脂培养基分离生产抗真菌多肽SEQ ID NO：1 的目的真菌分离株，命名为IMV01051。之后该菌株被鉴定为 Penicillium glandicola(Oudemans)Seifert et Samson。在室温下于麦芽 提取物琼脂斜面上通过固定时间间隔传代得到该生物体的纯培养。将 分离株IMV 01051转移至Berkeley实验室，该培养物在PDA上生长 并将每个菌株的10个琼脂块(agar plug)(用无菌P1000塑料枪头取样) 置于2mL含有0.7mL 45％(w/v)无菌甘油的冷冻管中保存。然后将该 冷冻管置于木座(wooden block)中并于-20℃冰箱内冷冻过夜，冷冻速 率约为1℃/min。将新鲜冷冻的材料转移至-84℃冰箱长期保存。
通过对大亚基rRNA-编码基因的D1/D2结构域进行测序鉴定该 菌种。通过FastDNA Kit使用FastPrep和BIO 101系统(Q-BIOgene， Vista，CA)的SpinColumn方案进行总基因组DNA提取。在Platinum  PCR SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA)中进行PCR扩增。用于 PCR扩增和测序的通用真菌D1/D2结构域(核苷酸63-642)引物已在此 前公开于Kurtzman和Robnett(1998)Antonie Van Leeuwenhoek 73(4)：331-71；以及Kurtzman和Robnett(2003)FEMS Yeast Res. 3(4)：417-32，其完整内容均以参考形式并于本文。DNA测序在加利 福尼亚大学的Berkeley DNA测序实验室进行。
用EditView版本1.0.1.1(ABI，Foster City，CA)编辑原始序列并 使用在线多重序列比对子程序(BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.htmL)和MultAlin (prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmL))比对。使用Ribosomal Database Project(rdp.cme.msu.edu/htmL/)和Boxshade (ch.emnet.org/software/BOX_form.htmL；必须使用＂www＂前缀)的在线 子程序进一步分析D1/D2结构域比对序列的保守区域，最后在NCBI 数据库中(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST；必须使用前缀＂www＂)BLAST鉴 定菌种。
将已设定的一系列具体生长条件(即营养成分含量、温度、pH、 培养时间、通风等)应用于已分离的真菌以促进次级代谢产物和新颖 天然产物的生成。当在装有50mL培养基的250-mL锥形瓶中生长时 上述真菌株分泌目的小分子。菌株IMV 01051在含有麦芽糖(12.75 g/L)、麦芽浸膏(15g/L)、糊精(2.75g/L)、甘油(2.35g/L)、磷酸氢二钾 (1g/L)、氯化铵(1g/L)和细菌用蛋白胨(0.75g/L)的培养基上生长。用 盐酸将该培养基的pH调节至最终值4.8。于16℃、在转速为180rpm 的定轨摇床上将该菌株温育144小时。通过10322xg、15℃离心20 分钟将所得微生物发酵液的生物菌体和上清分离。检测不含细胞的上 清(标记为LB-09812)以测定是否存在不耐热抗真菌活性，提供大规模 (500mL)培养基的无细胞上清用于如下所述的固相萃取。
用Oasis HLB萃取柱(6克，35mL)(Waters Corporation，Milford， MA)进行固相萃取。具体而言，用一个柱体积的甲醇将SPE柱润湿， 然后用约40mL溶剂A(2％乙腈，0.1％TFA)活化。用5X溶剂处理大 约90mL粗品培养基滤液至终浓度为1X，并于3000xg离心20分钟。 将该上清液上样至SPE柱，用约40mL溶剂A洗涤。用约40mL溶 剂(90％乙腈，0.1％ TFA)洗脱SPE柱。在离心蒸发器(Speed Vac)中将 洗脱样品部分干燥，用液氮冷冻并低压冻干。
将干燥萃取物重悬于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(0.5mL：20mL 起始培养物滤液)中，然后使用Sephadex G10(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)离心柱富集重悬浮萃取物中的蛋白质。用 Sephadex G10(用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)预平衡，并于1000x g离 心1分钟)填充Bio-Spin一次性层析柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA)约0.75mL的柱床体积。将200μLSPE萃取物上样至各预离心的 (pre-spun)Bio-Spin柱，将已上样的Bio-Spin柱于1000x g离心5分钟 以洗脱蛋白质。
使用Jupiter 5μ C5  150mm x 4.6mm柱(Phenomenex， Torrance，CA)通过HPLC分离经G10处理的抗真菌萃取物。HPLC的 起始条件为5％乙腈、0.04％七氟丁酸(HFBA)、0.4mL/分钟。进样200 μL经G10处理的抗真菌萃取物后，将流速在1分钟内升高至0.8mL/ 分钟。又过一分钟后开始94分钟的指数曲线梯度(Waters梯度曲线 7，Waters Corporation，Milford，MA)至86％乙腈、0.04％ HFBA。将 HPLC流分分装至96孔澄清底部检测板的四个1/2区域中。在离心蒸发 器中干燥含有已分离萃取物的平板。然后使用如实施例3所述的抗真 菌平板检测，针对FVE、CGR、FGR和DMA筛选干燥的已分离萃 取物的抗真菌活性。在1/4X马铃薯右旋糖培养液(Becton Dickinson Microbiology Systems，Sparks，MD)中以4000孢子/mL检测FVE、FGR 和DMA。在1/4X Czapek-Dox(Becton Dickinson Microbiology Systems， Sparks MD)+180mL/L V8汁中以4000孢子/mL检测CGR。使培养 物于27℃生长24小时。通过在倒置显微镜下观察生长给检测评分。 约65.5-76分钟的HPLC流分具有对FVE、CGR，FGR和DMA的抗 真菌活性。
进行额外的HPLC分离以增加抗真菌流分。使用具有Zorbax 3.5μ C8  150mm x 1.0mm柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)的 μ-bore HPLC进一步纯化增加的抗真菌流分。起始条件为9.5％乙腈、 0.1％甲酸、0.025％三氟乙酸(TFA)、50μL/分钟。进样两分钟后，开 始25分钟的线性梯度，达到32％乙腈、0.1％甲酸、0.025％ TFA。使 用Agilent微流分收集器收集基于214nm的峰流分，在离心蒸发器中 干燥并如上所述检测抗真菌活性。在约27分钟时的洗出峰对FGR具 有活性。在联用Agilent MSD TOF质谱仪上得到ESI质谱图。该峰具 有肽的离子谱线，质量为3802Da。
有效的N-端测序需要还原和烷基化。将约10μg已干燥的蛋白质 重悬浮于pH 8.3的18μL 0.1M碳酸氢铵、8M尿素中。将该溶液转 移至限定容量的HPLC自动进样瓶中。加入1μL 200mM DTT并将 该溶液于50℃℃温育1小时。接着加入1μL 500mM碘乙酰胺并将 该溶液在暗处于37℃温育30分钟。然后通过加入2μL 25％三氟乙 酸淬灭碘乙酰胺烷基化。然后使用μ-bore HPLC于Zorbax 3.5μ C8  150mm x 1.0mm柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上纯 化该烷基化蛋白质。起始条件为7.7％乙腈、0.1％甲酸、0.025％ TFA。 15分钟之后进行70分钟线性梯度，达到70.7％乙腈、0.1％甲酸、 0.025％ TFA。该柱流速为50μL/分钟。使用Agilent微流分收集器收 集基于214nm的峰流分。
N-端测序
初始N-端测序得到以下序列：
ALHNSCSHPRCFNHAHCLTYS(SEQ ID NO：28)。进一步阐明 N-端序列需要对ArgC消化片段测序。
ArgC消化
通过加入水制备100ng/μL的ArgC(excision grade，Clostridium histolyticum Calbiochem cat.#324711)。将～2μg烷基化LB09812重悬 浮于pH 7.6的16μL 100mM Tris-HCl/10mM CaCl2，加入2μL 50mM DTT/5mM EDTA，然后加入用pH 7.6的100mM Tris-HCl/10mM CaCl2稀释至1:4的2μLArgC。将该溶液于37℃温育18小时。最终 用20μL 5％乙腈、0.1％甲酸、0.025％ TFA稀释该溶液，并进样至1.0 x 150mm Zorbax 300SB C8 3.5μm柱。起始条件为6.8％乙腈、0.1％ 甲酸、0.025％三氟乙酸(TFA)、50μL/分钟。进样后数分钟，开始66 分钟的线性梯度，达到26.6％乙腈、0.1％甲酸、0.025％ TFA。使用 Agilent微流分收集器收集基于214nm的峰。通过将约10％的HPLC 流分分离至装备了ESI源的联用Agilent MSD TOF质谱仪测定已分离 片段的质量。收集七个组分并进行N-端测序。于33分钟洗脱的ArgC 峰V产生了可用序列。
N-端测序结果
ArgC峰V：CFNHAHCLTYSHCHVXCS(SEQ ID NO：29)。
使用可以鉴定SEQ ID NO：24阐明的核苷酸序列(对应于 LB-09812蛋白质的全长基因组序列)的Genome Walker PCR测定 LB-09812抗真菌多肽的完整氨基酸序列。全长未加工的LB-09812蛋 白质阐明于SEQ ID NO：25。基因测序结果和来自LB-09812N-端测序 的结果一起预测了具有与HPLC-纯化LB-09812肽相同质量的成熟肽 (阐明于SEQ ID NO：1)。Genome Walker试验的进一步细节如下文所 示。
实施例2：分离抗真菌多肽LB-12922(SEQ ID NO：3)
在切尔诺贝利核事故12年之后，分离乌克兰Ternapol区的耕作 土壤样品。使用马铃薯右旋糖琼脂培养基分离生产抗真菌多肽SEQ ID NO：3的目的真菌分离株，命名为LB-12922。该菌株之后被鉴定为 Penicillium citreonigrum Dierckx。在室温下于麦芽提取物琼脂板上通 过固定时间间隔传代得到该生物体的纯培养。将分离株LB-12922转 移至Berkeley实验室，该培养物在PDA上生长并将每个菌株的10 个琼脂块(用无菌P1000塑料枪头取样)置于2mL含有0.7mL 45％ (w/v)无菌甘油的冷冻管中保存。然后将该冷冻管置于木座中并于-20 ℃冰箱内冷冻过夜，冷冻速率约为1℃/min。将新鲜冷冻的材料转移 至-84℃冰箱长期保存。
通过对大亚基rRNA-编码基因的D1/D2结构域进行测序鉴定该 菌种。根据操作说明(MIDI，Newark，DE)进行完整细胞脂肪酸甲酯 (FAME)分析(whole-cell fatty acid methyl ester analysis)。将该菌株的纯 培养在Sabouraud液体培养基中在定轨摇床(180rpm)上于30℃℃培 养3-5天。通过离心收集生物菌体，提取约50mL细胞。并在Agilent Technologies(Palo Alto，CA)Model 6890气相色谱仪上测定所述脂肪 酸甲酯的峰。用 Microbial Identification System Version 4.5 (MIDI，Newark，DE)分析色谱图。通过树状图子程序确立色谱图之间 的相似性。可用的真菌数据库不能在种或属水平鉴定该菌种。
对核糖体RNA-编码基因大亚基的D1/D2结构域的测序包括使该 菌种在Sabouraud液体培养基种生长，提取总基因组DNA并PCR扩 增该目标序列。通过FastDNA Kit使用FastPrep和BIO 101系统 (Q-BIOgene，Vista，CA)的SpinColumn方案进行总基因组DNA提取。 用于PCR扩增和测序的通用真菌D1/D2结构域(核苷酸63-642)引物 已于此前公开于Kurtzman和Robnett(1998)Antonie Van Leeuwenhoek 73(4)：331-71；以及Kurtzma和Robnett(2003)FEMS Yeast Res. 3(4)：417-32，将其完整内容均以参考形式并于本文。DNA测序在加 利福尼亚大学的Berkeley DNA测序实验室进行。
用EditView版本1.0.1.1(ABI，Foster City，CA)编辑原始序列并 使用在线多重序列比对子程序(BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.htmL)和MultAlin (prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmL))比对。使用Ribosomal Database Project(rdp.cme.msu.edu/htmL/)和Boxshade (ch.emnet.org/software/BOX_form.htmL；必须使用前缀＂www＂)的在线 子程序进一步分析D1/D2结构域的比对序列的保守区域，最后在 NCBI数据库中(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST；必须使用前缀＂www＂) BLAST鉴定菌种。
将已设定的一系列具体生长条件(即营养成分含量、温度、pH、 培养时间、通风等)应用于已分离的真菌以促进次级代谢产物和新颖 天然产物的生成。当在装有50mL培养基的250-mL锥形瓶中生长时， 上述真菌株分泌目的小分子。菌株IMV00738在包含葡萄糖(75g/L)、 酒石酸(4g/L)、酒石酸铵(4g/L)、磷酸铵(0.6g/L)、碳酸钾(1g/L)、氯 化铵(0.6g/L)、碳酸镁(0.4g/L)、硫酸铵(0.25g/L)、硫酸锌(700μg/L) 和硫酸亚铁(700μg/L)的培养基上生长。用盐酸将该培养基的pH调节 至最终值4.8。于16℃、在转速为180rpm的定轨摇床上将该菌株培 养144小时。通过10322xg、15℃离心20分钟将所得微生物发酵 液的生物菌体和上清分离。检测不含细胞的上清(标记为LB-12922)， 以测定是否存在不耐热抗真菌活性，提供大规模(500mL)培养基的无 细胞上清用于如下所述的固相萃取。
用Oasis HLB萃取柱(6克，35mL)(Waters Corporation，Milford， MA)进行固相萃取(SPE)。具体而言，用一个柱体积的甲醇将SPE柱 润湿，然后用约40mL的溶剂A(2％乙腈，0.1％ TFA)活化。用5X溶 剂A处理大约90mL粗品培养基滤液至终浓度为1X，并于3,000xg 离心20分钟。将该上清液上样至SPE柱，用约40mL溶剂A洗涤。 用约40mL溶剂(90％乙腈、0.1％ TFA)洗脱。在离心蒸发器(Speed Vac) 中将洗脱样品进行部分干燥，用液氮冷冻并低压冻干。
将干燥萃取物重悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(0.5mL:20 mL起始培养物滤液)中，然后使用Sephadex G10(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)离心柱富集重悬浮萃取物中的蛋白 质。用Sephadex G10(用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)预平衡，并于1000 xg离心1分钟)填充Bio-Spin一次性层析柱(Bio-Rad Laboratories， Hercules CA)约0.75mL的柱床体积。将200μLSPE萃取物上样至各 预离心的Bio-Spin柱，将已上样的Bio-Spin柱于1000xg离心5分 钟以洗脱蛋白质。
使用Jupiter 5μ C5  150mm x 4.6mm柱(Phenomenex， Torrance，CA)通过HPLC分离经G10处理的抗真菌萃取物。HPLC的 起始条件为5％乙腈、0.04％七氟丁酸(HFBA)、0.4mL/分钟。进样200 μL经G10处理的抗真菌萃取物后，将流速在1分钟内升高至0.8mL/ 分钟。又过一分钟后，开始94分钟的指数曲线梯度(Waters梯度曲线 7，Waters Corporation，Milford，MA)达到86％乙腈、0.04％ HFBA。将 HPLC流分分装至96孔澄清底部检测板的四个1/2区域中。在离心蒸发 器中干燥含有已分离萃取物的平板。然后使用如实施例3所述的抗真 菌平板检测，针对FVE、CGR、FGR和DMA筛选干燥的已分离萃 取物的抗真菌活性。在1/4X马铃薯右旋糖培养液(Becton Dickinson Microbiology Systems，Sparks，MD)中以4000孢子/mL检测FVE、FGR 和DMA。在1/4X Czapek-Dox(Becton Dickinson Microbiology Systems， Sparks MD)+180mL/L V8汁中以4000孢子/mL检测CGR。使培养 物于27℃生长24小时。通过在倒置显微镜下观察生长给检测评分。 约64.5-66分钟的HPLC流分具有对FVE、CGR、FGR和DMA的抗 真菌活性。63-72.5分钟的流分观察到对FVE的抗真菌活性。
进行额外的HPLC分离以增加63-72.5分钟抗真菌流分，使用 Zorbax 3.5μ C8  150mm x 1.0mm柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)的μ-bore HPLC进一步纯化已扩大的抗真菌组分。起始条件 为7.7％乙腈、0.05％甲酸、0.025％三氟乙酸(TFA)、50μL/分钟。进 样后，开始40分钟的线性梯度，达到25.7％乙腈、0.05％甲酸、0.025％ TFA。之后，开始20分钟梯度，达到43.7％乙腈、0.05％甲酸、 0.025％TFA。使用Agilent微流分收集器收集基于214nm的峰组分， 在离心蒸发器中干燥并如上所述检测抗真菌活性。在约41分钟时的 洗脱峰对FVE具有活性。在联用Agilent MSD TOF质谱仪上得到ESI 质谱图。该峰具有肽的离子谱线，质量为4445Da。
有效的N-端测序需要还原和烷基化。将约10μg已干燥的蛋白质 重悬浮于pH 8.3的18μL 0.1M碳酸氢铵、8M尿素中。将该溶液转 移至限定容量的HPLC自动进样瓶中。加入1μL 200mM DTT并将 该溶液于50℃℃温育1小时。接着加入1μL 500mM碘乙酰胺，并 将该溶液于37℃在暗处温育30分钟。然后通过加入2μL 25％三氟 乙酸淬灭碘乙酰胺烷基化。然后使用μ-bore HPLC于Zorbax 3.5μ C8  150mm x 1.0mm柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上纯化 该烷基化蛋白质。起始条件为7.7％乙腈、0.1％甲酸、0.025％ TFA。 15分钟之后，进行70分钟的线性梯度，达到70.7％乙腈、0.1％甲酸、 0.025％ TFA。该柱流速为50μL/分钟。使用Agilent微流分收集器收 集基于214nm的峰组分。烷基化的LB-12922于41分钟被洗脱。
N-端测序
初始N-端测序得到以下序列：
LSCYPSCMQNYCSHPRXFLXAT(SEQ ID NO：30)。
使用可以鉴定SEQ ID NO：26阐明的核苷酸序列(对应于 LB-12922蛋白质的全长基因组序列)的Genome Walker PCR测定 LB-12922抗真菌多肽的完整氨基酸序列。全长未加工的LB-12922蛋 白质阐明于SEQ ID NO：27。基因测序结果和来自LB-12922的N-端 测序的结果一起预测了具有与HPLC-纯化的LB-12922肽相同质量的 成熟肽(阐明于SEQ ID NO：3)。Genome Walker试验的进一步细节如 下文所示。
实施例3：多肽LB-09812(SEQ ID NO：1)的抗真菌活性
使用标准的平板检测法测定多肽SEQ ID NO：1对轮状镰刀霉 (FVE)、禾生刺盘孢菌(CGR)、禾本科镰孢(FGR)和玉米壳色单隔孢菌 (DMA)的抗真菌活性。
具体而言，将包含编码多肽SEQ ID NO：1核苷酸的大肠杆菌转化 载体与组氨酸-标记的麦芽糖结合蛋白通过因子XA切割位点融合并 用于该融合蛋白在大肠杆菌中的表达。然后亲和(Ni-NTA)纯化融合蛋 白，将蛋白质制备物用因子XA切割。然后用HPLC纯化需要的 LB-09812肽(SEQ ID NO：1)，用LCMS验证该肽的纯度和质量。如下 所示，将已纯化的肽定量并用于标准检测法中测定抗真菌活性。
生产孢子培养物的制备
使用V8琼脂板制备FVE的培养基。使用1/2x燕麦琼脂制备FGR、 CGR和DMA的培养基。培养基配方如下。
具体而言，将保存于-20℃含有硅胶真菌储备物的试管短暂火焰 灭菌，将约5颗晶体(crystal)撒至琼脂表面。每个真菌分离株制备2-3 块平板。新生长的培养基保存于塑料盒中防止培养基脱水。使FVE 培养物于室温在暗处生长。CGR培养物于室温在光照下生长。FGR 和DMA培养物在光照生长室中于27℃生长。每隔一周制备一次新 的培养物以保持可持续供应孢子。
孢子制备
从FVE、FGR、CGR和DMA的2-4周培养物制备孢子。对于 FGR、FVE和DMA，用少量的检测培养基润洗一部分培养物平板。 该润洗溶液可在DMA平板上保持足够长的时间使得分生孢子器破 裂。然后将检测培养基转移至无菌试管中。将样品涡旋，使用血细胞 计数仪定量孢子。
对于CGR，用无菌接种环在培养物平板的橙色区域轻微拖动。 然后将该接种环插入少量的检测培养基中，用接种环将所述培养基混 合使孢子悬浮。将样品涡旋，使用血细胞计数仪定量孢子。
用检测培养基将孢子稀释至需要的浓度(FGR、FVE和CGR为 4000孢子/mL，DMA为6000孢子/mL)，将其置于冰上直至抗真菌活 性检测。
检测平板制备细节：
在抗真菌平板检测中使用标准的无组织培养基处理的96孔平底 板或1/2区域未处理板(Costar)。FVE、FGR和DMA的检测培养基为1/4 x马铃薯右旋糖培养液，CGR的检测培养基为1/4x Czapec-Dox V8。
将不同浓度的抗真菌多肽以50μL/孔加入标准检测板或以25μL/ 孔加入半区域板。加入含有两倍上述浓度真菌孢子的相等体积的培养 基，以起始检测。或者通过将含有真菌孢子(如上)的培养基加入检测 板中(HPLC样品干燥于其中(Savant Speed-vac))检测HPLC分离的前 导样品(lead sample)。用气体渗透膜(＂Breathe-Easy＂，Cat.No.BEM-1， Diversified Biotech，Boston，MA)将板密封，检测在暗处于28℃进行 24-48小时。
温育阶段之后，将板置于倒置显微镜下，检测每块板并根据以下 参数在0-4内评分：0＝与阴性对照相比无真菌生长抑制，0.5＝轻微 抑制(整体生长少于阴性对照，但是单个孢子的生长并不明显)，1＝轻 微抑制(整体生长少于阴性对照，但是来自单个孢子的生长明显虽然 并未融合)，2＝中度抑制(可容易鉴别来自1个孢子的生长并明显少于 阴性对照，来自每个孢子的生长呈球形)，3＝强烈抑制(孢子已萌芽， 但是其生长仅限于短菌丝的一些分支)，4＝完全抑制(无孢子萌发，参 见，例如Duvick等，(1992)J.Biol.Chem.267：18814-18820)。含有抗 真菌活性各水平代表性实施例的评分表见图2。
结果
图3提供了SEQ ID NO：1阐明的多肽的抗真菌活性检测结果。该 多肽显示出对FVE、FGR、CGR和DMA的抗真菌活性。
培养基配方：
1x Czapek-Dox V8培养液
在每升体积中将35克Difco Czapek-Dox培养液(#233810)悬浮于 dH2O中并加入180毫升通过离心(3000xg即可)澄清的V8汁。将终 体积加至1升并于121℃灭菌20分钟。将该培养基滤器除菌去除任 何残留碎片。
1X马铃薯右旋糖培养液：
在每升体积中将24克Difco马铃薯右旋糖培养液(#0549-17-9)悬 浮于dH2O中，将终体积加至1升并于121℃灭菌20分钟。将该培 养基滤器除菌去除任何残留碎片。
V8琼脂：
在每升体积中将180mL V8汁和3克碳酸钙溶解于820mL去离 子水中，然后将17克溶于dH2O的Bacto-琼脂加入4升容器中。任 选在每升制备的培养基中滴加5％消泡剂A。加盖并于121℃灭菌20 分钟。在无菌罩中倾倒平板。
燕麦琼脂：
在每升体积中，将36.24克Difco燕麦琼脂(#0552-17-3)和溶于 dH2O中的4.25克琼脂悬浮于4升容器中，加盖并于121℃灭菌20 分钟。在无菌罩中倾倒平板。
表1：用于体外抗真菌活性检测的FVE、FGR、CGR和DMA菌 株的生长条件详情
  FVE FGR CGR DMA 分离株名称 MO33 73B ISU Carroll-IA-99 Warren-IN-96 孢子形成培养基 V8琼脂 1/2X燕麦琼脂 1/2X琼脂琼脂 1/2X琼脂琼脂 用于体外检测的 琼脂培养物菌龄 范围 2-4周 2-4周 2-4周 2-4周 开始琼脂培养的 建议时间 每隔一周 每隔一周 每隔一周 每隔一周 用于体内检测的 液体培养基 1/4x马铃 薯右旋糖培养 液 1/4x马铃薯右旋 糖培养液 1/4x Czapec-Dox V8 培养液 1/4x马铃薯 右旋糖培养液 用于体内检测的 孢子密度(孢子 /mL) 4000 4000 4000 6000
实施例4：从基因组DNA中分离全长LB-09812和LB-12922基因
进行Genome Walker试验分别从Penicillium glandicola和 Penicillium citreonigrum的基因组DNA中分离全长LB-09812和 LB-12922基因。
分离LB-09812和LB-12922基因
基因分离方法描述于Becton Dickinson BioSciences(前Clontech Laboratories，Inc.；Palo Alto，CA)出售的Genome Walker kit的使用手册 中。在Lawrence Berkeley国家实验室使用 SPIN Kit (QbioGene，Inc.，Carlsbad，CA)和根据使用说明中的冲击细胞破碎法 (ballistic cell disruption method)分离真菌系LB-09812和LB-12922的 基因组DNA。然后严格按照Genome Walker使用手册(Clontech PT3042-1，PR03300版)所述使用该DNA。简略而言，分别用限制性 内切酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI(均为平整末端内切酶)消化该 DNA。将该DNA用苯酚萃取然后用氯仿萃取，然后用乙醇沉淀。将 Genome Walker衔接头连接至限制酶切DNA的末端。所得DNA分 别标记为DL1-4。
对于LB-09812基因的分离，设计可获得的肽序列 ALHNSCSHPRCFNHAHCLTYS(SEQ ID NO：28)的下划线和斜体区域的许多 重叠、简并引物。这些引物用于使用适当的Genome Walker引物经过 一轮或两轮PCR在各DNA样品(DL1-4)上的扩增反应。在安装了来 自MJ Research(Watertown，Maine)的HotBonnet的model PTC-100热 循环仪上进行PCR。使用BD BioSciences AP2引物 (5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’；SEQ ID NO：31)和gspR2 (5’-RTGRTTRAARCAYCTNGGRTG-3’；SEQ ID NO：32)仅通过一轮 PCR克隆LB-09812的第一片段。使用BD AdvantageTM HF 2 PCR试 剂盒在25μL反应液中(引物终浓度为2mM)进行PCR反应。循环参 数为：92℃ 30秒，68℃ 3分钟，5个循环，然后92℃ 20秒，55 ℃ 3分钟，28个循环，最后65℃ 5分钟。将各反应液约20μL于 1.0％琼脂糖凝胶上跑胶，切割条带并用QIAquick凝胶提取试剂盒 (Valencia，Calif.)纯化并克隆至pCR-平头载体中(Invitrogen，San Diego， Calif)。对克隆进行测序验证。以这样的方式使用AP2和gspR2引物 克隆所得片段(LB-09812基因SEQ ID NO：2的一部分)。该基因片段 和籍此编码的蛋白质如下文所示，在SEQ ID NO：33和34中。
TACCCGGACGGGCTTCTTCACCCCGAGAACGGTGGCTACTACCTGAAGGATGGGG
ATGAAGTCGTCGTTGGCATTGCCAGCGACGATCTTTGCAAGGAGCTGGACGGTGC
ATTCGCTAGCGTCGATGCAAAAATTGCCGAAGAAGCTGAAAGCGCTGGACCCGA
AGATAATATTTCTGATGCTGAAAATGTCAAGAGAGATGTACTTGCCCTACATAAC
TCATGCAGCCACCCTCGCTGCTTCAATCAC(SEQ ID NO：33)
YPDGLLHPENGGYYLKDGDEVVVGIASDDLCKELDGAFASVDAKIAEEAESAGPED
NISDAENVKRDVLALHNSCSHPRCFNH(SEQ ID NO：34)
粗体区域对应于进行Genome Walker试验时已知的肽序列N端 的三分之二。使用如上所述PCR反应(但是使用BD BioSciences AP1 引物(5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；SEQ ID NO：35)和 gspF4(5’-TTYAAYCAYGCNCAYTGYTTRAC-3’；SEQ ID NO：36))获 得碳端。所得片段如下文所示，在SEQ ID NO：37中。
TTCAACCACGCTCACTGCYTGACCTACTCGCACTGCCATGTATGCTCTTCCCGCAA
GCGT
TGTCTTTAGAGTATCCTGCAATTTTGATAGTGGGAATGTTGGAGAGATTTACGAA
GGCTT
ACAGAGATGTGGTTGGATAGTGAAAGTGGGGGAGGTAGTCTGGGGGTATAGCGG
CCTCTG
GTTAGTTTCAATTAAGATGCGAATTTTGGCCTGATTCTTGCCTTGCTTTATTTAGA
TTCA
ACAGAAAATTAAGATACCTGAAATACCATTACAGAGCCTATATAAAGCTAGCGT
AGGGGG
GAAATCATCAGTTATTAAGAGGAGTCTCGGCGAACGAGATACTCAGGTTGACGA
GCAATC
CTCTGGTCAAAATTCCATCTGGAAAGATGTGTACCGTACCGTCAATAATTGGGTC
GATGA
GTAGTGCCCTAATTTAACGCCTGTACACGGTGAACTCCATGA(SEQ ID NO：37)
在阅读框1中被翻译，该片段编码下列多肽(SEQ ID NO：38)：
FNHAHCLTYSHCHVCSSRKRCL*SILQF**WECWRDLRRLTEMWLDSESGGGSLGV
*RPL
VSFN*DANFGLILALLYLDSTEN*DT*NTITEPI*S*RRGEIISY*EESRRTRYSG*RAI
LWSKFHLERCVPYRQ*LGR*VVP*FNACTR*TP*(SEQ ID NO：38)
从这2个基因组DNA片段产生的混合序列编码成熟LB-09812 氨基酸序列，SEQ ID NO：1。
为了获得推定前蛋白序列(即编码未加工蛋白质预测N-端甲硫氨 酸的序列)使用Genome Walker DL-2DNA作为模板进行两轮PCR。 用于两轮PCR的试剂和循环条件如上文所述，使用如下引物组合：
第1轮：BD BioSciences AP1引物 (5’-GTAATACGACTCACTAGGGC-3’；SEQ ID NO：35)和PHN99817 (5’-CGACGCTAGCGAATGCACCGTC-3’；SEQ ID NO：39)
第2轮：BD BioSciences AP2引物 (5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’；SEQ ID NO：31))和PHN99816 (5’-TCATCCCCATCCTTCAGGTAGTAGC-3’；SEQ ID NO：40).
如Genome Walker使用手册所述，将来自第一轮PCR的DNA稀 释50X并作为第二轮PCR的模板。为了以单个分子克隆LB-09812 基因，使用LB-09812基因组DNA作为模板，正向引物为PHN10110 (5’-TATACCAAACGAAGAAGGATAGT-3’：SEQ ID NO：41)，反向引物 为PHP10108(5’-ATCTAAATAAAGCAAGGCAAG-3’；SEQID NO：42)。如上所述纯化条带并克隆至pCR-平端载体用于测序验证， 得到SEQ ID NO：24。
对于LB-12922基因的分离，设计可获得的肽序列 LSCYPSCMQNYCSHPRXFLXAT(SEQ ID NO：30)的下划线和斜体 区域的许多重叠、简并引物。如上所述使用Genome Walker文库和 PCR克隆LB-09812。克隆LB-12922的第一个基因组区域为两轮PCR 反应的产物。第一轮PCR使用的引物为BD BioSciences AP1引物(SEQ ID NO：35)和gspP1BF1(5’-TGYATGCARAAYTAYTGY-3’；SEQ ID NO：50)。将第一轮反应液稀释50X并用作第二轮PCR的模板，使用 BDBioSciences AP2引物(SEQ ID NO：31)和gspP1BF3 (5’-TAYTGYAGYCAYCCNCG-3’；SEQ ID NO：51)作为引物。如上所述 纯化条带并克隆至pCR-平端载体用于测序验证。所得片段序列如下 所示，位于SEQ ID NO：43中： TACTGYAGCCATCCCCGTTGCTTCCTCCACGCTACTTGTTTGTCCTACTCTCATTG CCATGTGTGCGGTACCCGGAAGGTCTGTCTCTAA(SE ID NO：43) ，其编码LB-12992肽N-端的一半，YCSHPRCFLHATCLSYSHCHVCGTRKVCL* (SEQ ID NO：44)。在Genome Walker试验之前已知的该片段序列的残 基以粗体表示。当将该片段序列加至肽测序测定的N-端残基时可得 到成熟LB-12922肽(SEQ ID NO：3)的序列。
为了克隆LB-12992基因另外的5’基因组片段，如上所述进行另 一组Genome Walker反应。用于第一和第二轮PCR的基因特异性引 物分别为gspP1BR6(5’-YCKNGGRTGNGARCARTA-3’；SEQ ID NO：45)和gspP1BR1(序列5’-RCARTARTTYTGCATRCA-3’；SEQ ID NO：46)。这些反应得到以下核苷酸序列，位于SEQ ID NO：47中，其 大部分为SEQ ID NO：26：
ATGACTAAGACATCCATAGAGACCTTAATTACCCCTCACGACATCGACATGCAAT
ACATT
TTTACCTCCCTCGTTCAATTTCTGTGCTTCATGAACGTCATGGCTGAAGGTCTAAC
CCGG
TACCAAACCTCACCCCCGACTGATGTCGTGATTCTCCACGATAGACAATCCCTGA
ACGAT
TACGTGAAGATCAATCCAAACGGTCTGCTCCATGCCGAGAATGGAGGCTACTACC
TGAAA
GACATGGAAGACGTAGTCGTTGCTATCGCTAGTGATGACCTGTGCAATGAGCTGC
ATGGT
GCCTGGGCTAGCGCTGAGGCTGCTGCTGATGCGCTTGACGCGGCTGAATCTAATT
CTGGA
TCTGGCTCTTTGAGCGGCGCGAATGTTACGAAGAGAAACGAAGACCTTTCTTGTT
ATCCC
AGCTGTATGCAGAATTAT(SEQ ID NO：47)
为了以单个分子克隆编码推定未加工LB-12992蛋白的基因组序 列并从而确认其序列，将引物PHN100279 (5’-ATGTCCTCCTCCCAAGTTTCCTTC-3’；SEQ ID NO：48)和 PHN100615(5’-AGTGGGTGGATATTTGTCTCAGAAA-3’；SEQ ID NO：49)与作为模板的LB-12992基因组DNA用于Genome Walker-type 条件的单轮PCR。胶-纯化所得片段，将其克隆并全长测序，得到SEQ ID NO：26。
LB-09812的基因组序列阐明于SEQ ID NO：24，编码阐明于SEQ ID NO：25的预测全长未加工多肽。全长LB-09812多肽具有预测的信 号肽和前肽区。该推定的信号序列以粗体表示，预测切割位点用“^” 表示。使预测前肽区域为高亮且为斜体。预测成熟肽加下划线。
MKSISTSLVLVLCFLTTMIEG^ ALHNSCSHPRCFNHAHCLTYSH CHVCSSRKRCL(SEO ID NO：25)
如上所述相似地分离编码预测全长LB-12922多肽序列的基因组 序列。该序列阐明于SEQ ID NO：26并编码SEQ ID NO：27阐明的预 测全长、未加工多肽。该全长LB-12922多肽具有预测信号肽和前肽 区域。该全长LB-12922多肽具有预测信号肽和前肽区域。该推定信 号序列以粗体表示，切割位点用“^”表示。使预测前肽区域为高亮且 为斜体。预测成熟肽加下划线。
MTKTSIETLITPHDIDMQYIFTSLVQFLCFMNVMA^ LSCY PSCMQNYCSHPRCFLHATCLSYSHCHVCGTRKVCL(SEQ ID NO：27)
实施例5：转基因玉米植株的转化和再生
用含有与可驱动玉米植株细胞中表达的启动子和选择性标记(例 如，选择性标记基因PAT(Wohlleben等，(1988)Gene 70：25-37)，其 可赋予对除草剂双丙磷的抗性)可操作性连接的编码SEQ ID NO：1阐 明的抗病原体多肽的核苷酸序列的质粒轰击来自温室供体植株的未 成熟玉米胚。或者，在单独的质粒中提供选择性标记基因。
根据如下步骤进行转化。培养基配方如下所示。
靶组织制备
将穗去壳并用30％ Clorox漂白剂加0.5％ Micro去污剂表面灭菌 20分钟，并用无菌水冲洗两遍。将未成熟的胚切碎并将胚轴面朝下 放置(盾片面朝上)，每个平板放置25个胚，于560Y培养基中放置4 小时然后排列在2.5-cm靶区域内用于轰击。
DNA的制备
制备包含与驱动玉米细胞中表达的启动子可操作地连接的编码 SEQ ID NO：1阐明的抗病原体多肽的核苷酸序列的质粒载体。使用如 下所示的氯化钙沉淀方法将该质粒DNA和含有选择性标记(例如， PAT)的质粒DNA一起沉淀至1.1μm(平均直径)钨颗粒上：
100μl在水中的制备的钨颗粒
Tris EDTA缓冲液中含有10μl(1μg)DNA(1μg总DNA)
100μl 2.5M CaCl2
10μl 0.1M亚精胺
按顺序将各试剂加入钨颗粒混悬液，并同时置于多管漩涡混悬仪 上。将最终混合物简略超声处理并在持续漩涡混悬下温育10分钟。 在沉淀阶段后，将试管简单离心、移除液体，用500mL 100％乙醇洗 涤并离心30秒。再次移除液体，向终钨颗粒沉淀加入105μl 100％乙 醇。对于基因枪轰击而言，将钨/DNA颗粒简略超声处理并将10μl 点样于各大载体(macrocarrier)中央并在轰击之前干燥约2分钟。
基因枪处理
在基因枪#HE34-1或#HE34-2中以#4水平轰击样品板。所有样品 均接受650PSI的单次轰击，总计从各已制备的颗粒/DNA试管中取 10个等份试样。
后续处理
轰击后，将胚于560Y培养基中培养2天，然后转移至含有3mg/L Bialaphos的560R筛选培养基中，然后每2周移种一次。约筛选10 周后，将筛选-抗性愈伤组织克隆转移至288J培养基中开始植物再生。 体细胞胚成熟后(2-4周)，将发育好的体细胞转移至发芽培养基并转 移至光照培养室。约7-10天后，将正在发育的小植株转移至无272 激素的培养基试管中培养7-10天直至小植株生长起来。然后将植株 转移至含有盆栽土的平板中的嵌入物(inserts in flats)(相当于2.5＂盆) 中并在生长室里生长1周，接着在温室中继续生长1-2周，然后转移 至传统的600盆(1.6加仑)并生长至成熟。对真菌抗性进行监测并评 分。
轰击和培养基：
轰击培养基(560Y)，其包含4.0g/L N6基底盐(basal salts) (SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson’s维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L 2，4-D 和2.88g/L L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用D-I H2O定容)；2.0g/L 脱乙酰吉兰糖胶(用D-I H2O定容后加入)以及8.5mg/L硝酸银(将培 养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/L N6基 底盐(SIGMA C-1416)、1.0mL/L Eriksson’s维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/L盐酸硫胺素、30.0g/L蔗糖、2.0mg/L 2，4-D (用KOH调至pH 5.8后用D-I H2O定容)；3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶(用 D-I H2O定容后加入)；以及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙磷 (bialaphos)(两者均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0 mL/L MS维生素贮备液(0.100g烟酸、0.02g/L盐酸硫胺素、0.10g/L 盐酸吡哆醇、0.40g/L甘氨酸(用精制的(polished)D-I H2O定容) (Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/L肌醇、 0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L 0.1mM脱落酸(调至pH 5.6 之后用精制的(polished)D-I H2O定容)；3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶(用D-I H2O定容后加入)以及1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙磷(将培养基 灭菌并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐 (GIBCO 11117-074)、5.0mL/L MS维生素储备液(0.100g/L烟酸、0.02 g/L盐酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆醇和0.40g/L甘氨酸，用精制的 D-I H2O定容)、0.1g/L肌醇、40.0g/L蔗糖(调至pH 5.6之后用精制 的D-I H2O定容)和6g/L细菌培养用琼脂(用精制的D-I H2O定容后 加入)，灭菌并冷却至60℃.
实施例6 土壤杆菌介导的玉米转化和转基因植物再生
对于用编码SEQ ID NO：1多肽的核苷酸序列土壤杆菌介导转化 玉米而言使用Zhao描述的方法(美国专利第5,981,840号和PCT专利 公开说明书WO98/32326；其内容以参考形式并于本文)。简略而言， 从玉米中分离未成熟的胚并使其与土壤杆菌的混悬液接触，其中该细 菌可将该多聚核苷酸构建体转化至至少一个未成熟胚的至少一个细 胞中(步骤1：感染步骤)。在该步骤中将未成熟胚浸渍于土壤杆菌的 混悬液中以起始温育。将胚与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培 养步骤)。在感染步骤之后将未成熟胚培养在固体培养基上。在共培 养阶段之后可考虑任选进行“静息”步骤。在该静息步骤中，在至少存 在一种已知可抑制土壤杆菌生长的抗生素并且不加入植物转化筛选 试剂的条件下温育胚(步骤3：静息步骤)。在含有抗生素(但不含筛选 试剂)的固体培养基中培养未成熟胚，以消除土壤杆菌并提供被感染 细胞的静息阶段。接下来，在含有筛选试剂的培养基中培养接种胚， 并回收生长中的已转化愈伤组织(步骤4：筛选步骤)。在含有筛选试 剂的固体培养基中培养未成熟胚，得到转化细胞的选择性生长。然后 将愈伤组织再生至植株中(步骤5：再生步骤)，将生长于筛选培养基 中的愈伤组织培养于固体培养基中以再生植株。
实施例7：体细胞大豆胚培养物转化和大豆植株再生
下列储备液用于大豆植株的转化和再生：
储备液
硫酸盐100X储备液：37.0g MgSO4·7H2O、1.69g MnSO4·H2O、0.86g ZnSO4·7H2O、0.0025g CuSO4·5H2O。
卤化物100X储备液：30.0g CaCl2·2H2O、0.083g KI、0.0025g CoCl2·6H2O、
P，B，Mo 100X储备液：18.5g KH2PO4、0.62g H3BO3、0.025g Na2MoO4·2H2O。
Fe EDTA 100X储备液：3.724g Na2EDTA、2.784g FeSO4·7H2O。
2，4-D储备液：10mg/mL。
维生素B5 1000X储备液：10.0g肌醇、0.10g烟酸、0.10g盐酸吡哆 醇、1g硫胺素。
培养基(每升)
SB196：以上储备液各10mL、1mL B5维生素储备液、0.463g(NH4)2 SO4、2.83g KNO3、1mL 2，4-D储备液、1g天冬酰胺、10g蔗糖，pH 5.7。
SB103：1pk.Murashige & Skoog盐混合物、1mL B5维生素储备液、 750mg MgCl2六水合物、60g麦芽糖、2g脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.7。
SB166：每升添加了5g活性碳的SB103。
SB71-4：Gamborg’s B5盐(Gibco-BRL目录编号.21153-028)、1mL B5 维生素储备液、30g蔗糖、5g TC琼脂，pH 5.7。
可在旋转振荡器(150rpm)上在35mL液体培养基中于28℃在日光 灯下(日光灯提供日间16小时/夜间8小时循环)保持大豆胚混悬培养 物。通过在35mL新鲜液体培养基中温育约35mg组织，每两周移种 该培养物。
通过基因枪轰击方法(见Klein等，(1987)Nature 327：70-73)使用 Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器转化大豆胚发生的混悬培养物。
在基因枪轰击方法中可使用纯化的1)完整质粒DNA或2)仅包含 感兴趣的重组DNA表达盒的DNA片段。对于每八次轰击转化，制 备每DNA片段碱基对含有1-90皮克(pg)DNA片段的30μl混悬液。 用于表达抗真菌基因的重组DNA质粒或片段位于单独的重组DNA 质粒或来自选择性标记基因的片段。如下所示，将重组DNA质粒或 片段二者共沉淀至金颗粒上：将混悬DNA加入50μL 20-60mg/mL 0.6 μm金颗粒混悬液中，然后与50μL CaCl2(2.5M)和20μL精脒(0.1M) 混合。将该混合物脉冲涡旋5次，在小型离心机上旋转10秒钟，去 除上清。用150μL 100％乙醇洗涤DNA-包裹颗粒，脉冲涡旋并在小 型离心机上再次旋转，并用85μL无水乙醇重悬浮。之后将5μL的 DNA-包裹金颗粒载样于各大载体盘上。
将约150-250mg生长了两周的混悬培养物置于空的60mm x 15 mm培养皿中并用移液管将残余液体从组织中除去。将组织置于距防 护屏障约3.5英寸远的地方，每板组织轰击一次。将膜破裂压力设置 为650psi，并将轰击室抽真空至-28英寸汞柱。轰击18块板，轰击后 将来自各板的组织分至两个烧瓶中，放回至液体培养基中，并按照如 上所述培养。
轰击后七天，用添加了50mg/mL潮霉素或100ng/mL氯磺隆 (chlorsulfuron)(取决于转化中使用的选择性标记)的新鲜SB196培养 基替换液体培养基。每周或每两周更新该选择培养基。轰击后七周可 观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生的集簇中生长出来。移 除已分离的绿色组织并在单独的烧瓶中温育，以生成新的、克隆繁殖 的、转化胚形成的混悬培养物。每一新的系可认为是独立的转化事件。 然后，这些混悬液可通过移种以未成熟发育阶段的胚集簇混悬液保持 或可通过单个体细胞胚的成熟和萌芽再生至完整的植株。
将已转化的胚发生集簇从液体培养物中去除并置于不含有激素 或抗生素的固体琼脂培养基(SB166)上一周。于26℃在混合日光灯和 白炽灯(按照16小时日间：8小时夜间时间表)下培养该胚。一周后， 将该培养物转移至SB103培养基并在相同生长条件下继续保持3周。 在从液体培养基转移至固体培养基之前，通过PCR或Southern分析 检测所选系的组织中是否存在抗真菌基因。
四周后体细胞胚适于发芽，然后将其移出成熟培养基中并在空的 培养皿中干燥1-5天。将已干燥的胚种植于SB71-4培养基，使其在 上述相同的光照和发芽条件下发芽。将发芽胚转移至无菌土壤并生长 至成熟。
该说明书中的所有出版物和专利申请指明了本发明所属领域普 通技术人员的水平。所有出版物和专利申请均以参考形式以相同的程 度并于本文，该程度为明确和单独指明将各单独出版物或专利申请以 参考形式并于本文。
虽然通过图例和实施例详细的描述了上述发明以便清楚地理解， 但应当理解的是可在本发明权利要求的范围内进行某些变化和改变。
联邦资助研究或开发
本发明按照美国能源部(United States Department of Energy)颁发 的合同编码DE-AC02-05CH11231在政府资助下进行。政府享有本专 利的某些权益。
序列表
<110> D.J.阿尔蒂尔
      V.C.克雷恩
      I.A.埃兰斯卡亚
      J.T.吉利亚姆
      J.亨特-塞韦拉
      J.K.普雷斯奈尔
      E.J.谢珀斯
      C.R.西蒙斯
      T.托罗克
      N.亚尔帕尼
<120> 抗真菌多肽
<130> 035718/326498
<150> 60/800,804
<151> 2006-05-16
<160> 51
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> 肽
<222> (1)...(33)
<223> 预测成熟LB-09812肽
<400> 1

<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 核苷酸序列编码于SEQ ID NO：1阐明的预测成熟LB-09812肽
<221> CDS
<222> (1)...(102)
<400> 2

<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> 肽
<222> (1)...(39)
<223> 预测成熟 LB-12922肽
<400> 3

<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 核苷酸序列编码于SEQ ID NO：3阐明的成熟LB-12922肽
<221> CDS
<222> (1)...(120)
<400> 4

<210> 5
<211> 125
<212> PRT
<213> 黄曲霉(Aspergillus flavus)
<400> 5

<210> 6
<211> 378
<212> DNA
<213> 黄曲霉(Aspergillus flavus)
<400> 6


<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 7

<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(321)
<400> 8


<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 9

<210> 10
<211> 141
<212> PRT
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 10


<210> 11
<211> 426
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 基于cDNA XM_749066.1的经校正的序列
<221> CDS
<222> (1)...(426)
<400> 11


<210> 12
<211> 103
<212> PRT
<213> 禾本科镰孢(Fusarium graminearum)
<400> 12

<210> 13
<211> 312
<212> DNA
<213> 禾本科镰孢(Fusarium graminearum)
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> AACM01000196.1基因组DNA的片段
<221> CDS
<222> (1)...(312)
<400> 13


<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码大麦α淀粉酶信号肽的核苷酸序列
<400> 14

<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大麦α淀粉酶信号肽
<400> 15


<210> 16
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码结合至SEQ ID NO：2核苷酸序列的大麦α淀粉酶信号肽的核苷酸序列
<221> misc_feature
<222> (1)...(72)
<223> 编码大麦α淀粉酶信号肽的核苷酸序列
<221> misc_feature
<222> (73)...(174)
<223> 编码于SEQ ID NO：1阐明的成熟LB-09812肽的核苷酸序列
<400> 16

<210> 17
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列的大麦α淀粉酶信号肽
<221> SIGNAL
<222> (1)...(24)
<223> 大麦α淀粉酶信号肽
<221> 肽
<222> (25)...(57)
<223> 于SEQ ID NO：1阐明的成熟LB-09812肽
<400> 17

<210> 18
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码结合至SEQ ID NO：4核苷酸序列的大麦α淀粉酶信号肽的核苷酸序列
<221> misc_feature
<222> (1)...(72)
<223> 编码大麦α淀粉酶信号肽的核苷酸序列
<221> misc_feature
<222> (73)...(192)
<223> 编码于SEQ ID NO：3阐明的成熟LB-12922肽的核苷酸序列
<400> 18

<210> 19
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合至SEQ ID NO：3氨基酸序列的大麦α淀粉酶信号肽
<221> SIGNAL
<222> (1)...(24)
<223> 大麦α淀粉酶信号肽
<221> 肽
<222> (25)...(63)
<223> 于SEQ ID NO：3阐明的成熟LB-012922肽
<400> 19

<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 内质网定位序列
<400> 20

<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 内质网定位序列
<400> 21

<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 内质网定位序列
<400> 22

<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 内质网定位序列
<400> 23

<210> 24
<211> 453
<212> DNA
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 编码于SEQ ID NO：25阐明的全长LB-09812多肽基因组序列
<221> misc_feature
<222> (352)...(453)
<223> 编码于SEQ ID NO：1阐明的成熟LB-09812肽的核苷酸序列
<221> CDS
<222> (1)...(453)
<400> 24


<210> 25
<211> 150
<212> PRT
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)...(21)
<223> 预测信号肽
<221> PROPEP
<222> (22)...(118)
<223> 预测前肽区
<221> 肽
<222> (119)...(150)
<223> 于SEQ ID NO：1阐明的成熟LB-09812肽
<400> 25

<210> 26
<211> 525
<212> DNA
<213> Penicillum citreonigrum
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 编码于SEQ ID NO：27阐明的全长LB-12922多肽的基因组序列
<221> misc_feature
<222> (406)...(525)
<223> 编码于SEQ ID NO：3阐明的成熟LB-12922肽的核苷酸序列
<221> CDS
<222> (1)...(525)
<400> 26


<210> 27
<211> 174
<212> PRT
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)...(35)
<223> 预测信号肽
<221> PROPEP
<222> (36)...(136)
<223> 预测前肽区
<221> 肽
<222> (137)...(174)
<223> 于SEQ ID NO：3阐明的成熟LB-12922肽
<400> 27

<210> 28
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在N-端测序中产生的LB-9812肽的N-端片段
<400> 28

<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在N-端测序中产生的LB-9812肽的N-端片段
<400> 29

<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在N-端测序中产生的LB-12922肽的N-端片段
<221> 变体
<222> 17，20
<223> Xaa＝任意氨基酸
<400> 30

<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AP2 PCR引物
<400> 31

<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gspR2 PCR引物
<400> 32

<210> 33
<211> 249
<212> DNA
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 在Genome Walker试验中获得的LB-9812基因片段
<400> 33

<210> 34
<211> 83
<212> PRT
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> 肽
<222> (1)...(83)
<223>于SEQ ID NO：33阐明的核苷酸序列所编码的氨基酸序列
<400> 34

<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AP1 PCR引物
<400> 35

<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gspF4 PCR引物
<400> 36

<210> 37
<211> 462
<212> DNA
<213> Pencillium glandicola
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 在Genome Walker试验中获得的LB-9812基因片段
<400> 37


<210> 38
<211> 138
<212> PRT
<213> Penicillium glandicola
<220>
<221> 肽
<222> (1)...(138)
<223> 于SEQ ID NO：37阐明的核苷酸序列所编码的氨基酸序列
<400> 38

<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHN99817 PCR引物
<400> 39

<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHN99816 PCR引物
<400> 40

<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHN10110 PCR引物
<400> 41

<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHP10108 PCR引物
<400> 42

<210> 43
<211> 90
<212> DNA
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 在Genome Walker试验中获得的LB-12922基因片段
<221> CDS
<222> (1)...(30)
<400> 43

<210> 44
<211> 29
<212> PRT
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> 肽
<222> (1)...(29)
<223> 于SEQ ID NO：43阐明的核苷酸序列所编码的氨基酸序列
<400> 44

<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gspP1BR6 PCR引物
<400> 45

<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gspP1BR1 PCR引物
<400> 46

<210> 47
<211> 438
<212> DNA
<213> Penicillium citreonigrum
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 在Genome Walker试验中获得的LB-12922基因片段
<400> 47


<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHN100279 PCR引物
<400> 48

<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PHN100615 PCR引物
<400> 49

<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gspP1BF1 PCR引物
<400> 50

<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 
<223> gspP1BF3 PCR引物
<400> 51