[0001] 本发明涉及多肽，其能有效抗真菌，尤其是抗植物致病性真菌，并抗寄居于农产品的真菌。本发明还涉及制备这种多肽的方法，以及编码这种多肽的核酸。另外，本发明涉及使用本发明的多肽处理植物的方法和制品，还涉及本发明的核酸用于生产免受真菌损伤的作物的用途。

[0002] 真菌对人感染是严重的问题，尤其是对于免疫缺陷的患者，因为迄今只知道少数可靠的抗真菌活性药物。最常使用的包括吡咯衍生物，例如克霉唑或酮康唑，与其他化合物(例如两性霉素B)相比其低毒，因此经常是真菌感染治疗的唯一可能。

[0003] 除了在人和动物中的感染，真菌还可造成植物的严重损伤。由真菌对作物的感染所造成的产量损失是现代农业最为严重的问题之一。已知超过8000种真菌可造成植物疾病。例如，疫霉属(Phytophthora)造成马铃薯植物腐朽，全世界每年因此损失20％的马铃薯收成。特别重要的是镰刀菌属(Fusarium)，其侵染谷类植物，例如小麦、玉米和大麦。例如，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在这些植物中造成疾病，其表现为茎上的眼点、叶坏死或根损伤，以及玉米穗腐烂。1992至2001年期间，美国小麦种植中禾谷镰刀菌造成的损失总计超过26亿美元(Schisler et al.Biological control of Fusarium head blight of wheat and deoxynivalenol levels in grain via use of microbial antagonists；Adv Exp Med Biol.2002；504:53-69)。除了对被侵染的谷物造成较高的产量及质量损失外，真菌还造成毒性代谢物(真菌毒素)对谷物的显著污染，当其被摄取时造成伴随显著健康问题的严重中毒(中毒症)。这继而导致动物生产领域严重的经济损失。迄今已鉴定了约100种由镰刀菌产生的毒素，其中来自单端孢霉烯类的脱氧瓜蒌镰菌醇和瓜萎镰菌醇是谷物种植中最重要的真菌毒素。这些蛋白合成强效抑制剂的效果包括皮肤毒性和对高等动物神经及消化系统的不利影响。因此这些物质是对人及家畜的重要威胁。

[0004] 基于数量比例，二硫代甲氨酸酯类和秋兰姆二硫化物是农业中所用的最重要的杀真菌剂，其次是吡咯。对二硫代甲氨酸酯类和秋兰姆二硫化物的使用存在疑虑，特别是因为其水污染可能性及其较低特异性的作用机制(Bayerisches  Landesamt  fur Wasserwirtschaft,Leaflet No.4.5/14,as of July 25,2005)。吡咯例如丙环唑或灭菌唑在植物保护中使用的问题主要在于具有相同作用机制(抑制真菌特异性羊毛甾醇-14α-脱甲基酶)的化学相关物质还用于医药。因此，存在以下危险，即通过环境中潜在的人病原性真菌抗性选择，用于医药的吡咯真菌毒素的有效性降低(Report of the German Federal Institute for Health-Related Consumer Protection and Veterinary Medicine of June 7,2001)。尽管对吡咯抗性的形成发生的相对缓慢，并因此从植物保护角度被看作是一个中度风险，但即便今日仍认为无法恢复到无抗性情况。然而，吡咯如今被认为是综合植物栽培不可或缺的成分。

[0005] 除了对生长作物的侵染，真菌也体现了种子、谷物、果实及其他农产品的储藏和库存中的重要问题。真菌寄居不仅导致因产品不得不被丢弃的直接损失，如果被真菌毒素污染的食物和饲料被摄取，其还具有严重中毒的风险。然而，在库存保护中杀真菌剂的使用(其原则上可行，并且从经济角度是值得期待的)受到高度限制。在植物保护中，杀虫剂的使用和收获之间通常有足够的时间间隔，活性物质可被降解。相反，对于储存的作物，其随时可能被销售或消费。因此，由于卫生学或毒理学的原因，很多高效杀虫剂无法用于库存保护。其他制品只能降低浓度使用，以符合允许的最高水平。这导致控制成功性的降低以及不得不重复该措施，这使得从经济的角度讲该处理的目的性存在争议。例如，目前德国和奥地利并无杀真菌剂获批用于库存保护。因此，并无控制储藏产品中产毒性真菌的令人满意的方案。

[0006] 为了改善情况(主要是植物保护领域)，对合成低分子量杀真菌剂的各种替代品进行了研究，部分已投入使用。一种可能是用非毒性土壤真菌对作物植株进行控制性接种，其与真菌虫害竞争，通过部分尚未完全研究透彻的机制杀死它们或抑制其生长。真菌病理学、抗生作用、铁载体释放、竞争生境和营养、诱导系统抗性机制及植物生长促进经探讨与之相关。迄今，主要在可可作物处理取得了良好的效果，以控制在南美洲由有害的可可丛枝病菌(Moniliophthora(可可簇叶病菌同义词))引起的扫帚病。基于子座木霉(Trichoderma stromaticum)配制的制品于2012年2月在巴西获批。基于共生或内生木霉属(T.martiale,T.ovalisporum)的其他制品正处于研发中，用于抗由棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)造成的可可黑色腐败，以及抗可可链疫孢荚腐病菌(Moniliophthora roreri)，其为造成可可念珠菌果腐病的病原体。

[0007] 另一种用于控制有害真菌的可能策略(其尚未进入医药或农业实践)是应用所谓的抗微生物肽。这些抗微生物肽包括基因编码的寡肽，其通常由15至45个蛋白质氨基酸以线性链连接组成(Zasloff,M.Antimicrobial  peptides  of multicellular organisms.Nature 2002,415:389-95；Boman,H.G.Antibacterial peptides:basic facts and emerging concepts.J Intern Med.2003,254:197-215)。抗微生物肽在大多数多细胞生物中都已发现，并且是哺乳动物(包括人)的免疫系统的重要成分。抗微生物肽对如昆虫和其他节肢动物生物的免疫防御至关重要，这些生物无获得性免疫系统。大多数已知抗微生物肽具有两亲性结构，其中亲水部分具有正电荷。这使得肽能与通常带负电的细菌膜相互作用，并在包埋入膜内后形成孔状结构。由于真核生物的膜通常不带电或仅带微弱的负电荷，大多数抗微生物肽的活性主要是抗微生物，其效力通常对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌更显著。一些抗微生物肽，例如杀菌肽、麻蝇毒素和螫蝇抗菌肽(stomoxyn)(其特征在于α-螺旋结构)显示广谱活性，并且不同程度地具有抗真菌、原生动物和肿瘤细胞的活性。然而，这些抗微生物肽与生物膜的非特异性相互作用的趋势也经常产生溶血活性并因此对哺乳动物具有毒性。对许多抗微生物肽实际应用的进一步限制是由于高盐浓度，甚至经常由于150mM的生理NaCI浓度对其活性的降低(Marr et al.Antibacterial peptides for therapeutic use:obstacles and realistic outlook.Curr Opin Pharmacol.2006,6:
468-72)。这是因为与靶膜静电相互作用的中和。对于一些抗微生物肽，已描述了主要的或唯一的杀真菌活性。这些抗微生物肽包括大腊螟霉菌素(gallerimycin)、夜蛾抗菌肽(heliomicin)、蚂蚁抗菌肽(termicin)、果蝇霉素(drosomycin)、PsDl和NaDl(Lobo et al.Antifungal Pisum sativum defensin 1interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle.Biochemistry.2007,46:987-96；van der Weerden et al.The plant defensin,NaDl,enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.J Biol Chem.2008,283:14445-52)。这些抗微生物肽的特征在于由3或4个二硫键稳定的紧密的三维结构。具有该结构特征的抗微生物肽被称为防卫素，与其活性范围或产生其的生物无关。Alo3情况特殊，因为它是唯一已知的仅由3个β链组成，而不含其他防卫素中所见α螺旋部分的防卫素。对真菌膜的识别不依赖于电荷而发生，至少在某些情况下通过与中性葡糖神经酰胺的特异性结合(Aerts et al.The mode of antifungal action of plant,insect and human defensins.Cell Mol Life Sci.2008,65:2069-79)。进一步描述了碧蝽金属肽(metchnikowin)抗真菌，特别是革兰氏阳性细菌的活性(Levashina et al.Metchnikowin,a novel immune-inducible proline-rich peptide from Drosophila with antibacterial and antifungal properties.Eur J Biochem.1995,233:694-700)。
该富含脯氨酸的肽由26个氨基酸残基组成，与典型的抗微生物肽不同，其缺少膜溶解活性。
具有显著的抗革兰氏阴性细菌活性的较短的富含脯氨酸的抗微生物肽穿透生物膜而不破坏该膜，并抑制细胞内部的分子伴侣蛋白DnaK(Kragol et al.The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding.Biochemistry.2001,40:3016-26)。碧蝽金属肽是否也具有该作用机制并不清楚。

[0008] 杀真菌活性肽在医药和化妆品中的应用看似合理，特别是用于皮肤或粘膜，例如以粉末、乳剂、凝胶、洗液、香波、喷雾、口腔洗剂或牙膏形式。另外，存在口服或注射的可能，例如在致命性急性感染的情况下。在植物保护和库存保护领域也可以外部使用，例如通过喷雾或应用粉末状制剂。活性肽制品可合成性产生，主要通过固相合成，或通过相应核酸在不同宿主生物中的异源表达。由于纯的形式的寡肽和多肽制品很复杂，因此有必要寻找可替换的应用形式，主要用于植物保护中。至少在研究领域得到确认的一种方法是产生基因改造植物，其中导入编码待生产的活性肽的核酸。由于在某些情况下不希望植物对该活性物质进行恒定生产，有利的是以如下方式导入核酸，其表达受到启动子控制，所述启动子由真菌感染直接活化，或被与真菌感染相关的植物的应激反应活化。

[0009] 编码防卫素夜蛾抗菌肽和果蝇霉素的核酸被导入马铃薯植物，并能够介导针对烟草蛙眼病(Cercospora nicotianae)较小但统计上显著的抗性(Banzet et al.Expression of insect cysteine-rich antifungal peptides in transgenic tobacco enhances resistance to a fungal disease.Plant Sci.2002,162:995-1006)。类似地，针对白粉病菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)和小核盘菌(Sclerotinia minor)的抗性可通过将编码大腊螟霉菌素的核酸导入马铃薯植物中而获得(Langen  et al.Transgenic expression of gallerimycin,a novel antifungal insect defensin from the greater wax moth Galleria mellonella,confers resistance to pathogenic fungi in tobacco.Biol Chem.2006,387:549-57)。除了这些对真菌具有特异活性的防卫素之外，还制备产生具有更广谱活性的抗微生物肽的基因改造植物。例如，编码杀菌肽A的外源基因在水稻中的表达导致对水稻胚细胞病原体稻瘟病菌(magnaporthe grisea)的抗性增加(Coca et al.Enhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe grisea conferred by expression of a cecropin A gene in transgenic rice.Planta 2006,223:392-406)。通过在马铃薯和烟草植物中异源表达编码人工杂种肽的基因，获得针对茄病镰刀菌(Fusarium solani)的增强抗性，所述杂种肽由杀菌肽和蜂毒中的蜂毒素的序列单元组成(Osusky et al.Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens.Nat Biotechnol.2000,18:
1162-6；Yevtushenko et al.Pathogen-induced expression of a cecropin A-melittin antimicrobial peptide gene confers antifungal resistance in transgenic tobacco.J Exp Bot.2005,56:1685-95)。在大麦中导入碧蝽金属肽外源基因时，观察到针对禾谷镰刀菌和布氏白粉菌(Blumeria graminis)的增加的抗性(Rahnamaeian et al.Insect peptide metchnikowin confers on barley a selective capacity for resistance to fungal ascomycetes pathogens.J Exp Bot.2009,60:4105-14)。

[0010] 由于这些数据，抗微生物多肽被认为原则上适于在植物和库存保护中控制真菌感染。然而目前仅知晓很少的这些肽，其大体上具有抗真菌，尤其是抗植物病原性真菌的特异活性。使用具有广谱活性的肽具有以下风险，有用的细菌例如作为共生生物且与植物相关的细菌的生长受到阻碍。另外，这些肽的存在于将被人或动物摄取的产品中，会导致对天然肠道菌群的干扰，并由此对健康产生不利影响。另外的问题来自于以下事实，大多数已知的抗微生物肽在生理pH值下具有净正电荷。由此产生的与不同的带负电的生物多聚体的非特异性相互作用会导致很难预料的毒性效应。因此，存在肥大细胞与强阳性物质接触时释放组胺的风险(Vaara,M.New approaches in  peptide antibiotics.Curr Opin Pharmacol.2009,9:571-6)。另外，许多已知的抗微生物肽具有两亲结构，其具有包埋入哺乳动物细胞生物膜中的趋势，具有可测量的溶血活性，由此存在进一步的毒性可能。

[0011] EP 0 798 381 A2公开了来自双翅目苍蝇的多肽及其用于制备具有抗镰刀菌属的增强抗性的转基因植物的用途。数据库EMBL(在线)中2011年3月1日，EBI登录号JG 407441的条目公开了来自铜绿蝇(Lucilia cuprina)的多肽。与该多肽相关的功能并未公开。

[0012] 一组具有杀真菌活性的多肽被出人意料的发现了。本发明的多肽特征在于与SEQ ID No.2至少12个连续(contiguous)氨基酸残基一致，尤其是与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少65％的序列同源性。

[0013] 典型地，暴露于浓度为1-1000μΜ，尤其是2μΜ的本发明多肽会导致禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)孢子萌发的半峰抑制(half-maximum inhibition)。

[0014] 在一个实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2一致。

[0015] 在本发明另一个实施方案中，本发明的多肽有效对抗镰刀菌属和/或疫霉属生物的生长。

[0016] 本发明的多肽可被衍生化，尤其是在N末端、C末端和/或肽链中。N末端的衍生化可包括部分或完全的烷化作用、酰化作用或其他N修饰。C末端的衍生化可包括酰胺化、酯化或其他末端羧基的修饰。多肽链的衍生化可特别包括改善本发明多肽性能的修饰，例如PEG化、羟乙基淀粉化(HESylation)等等。如果需要，本发明的多肽还可与具有对生物细胞结构的亲合力的结构单元偶联，其中对所述生物使用本发明的多肽。用来获得改良的多肽性能的适合的衍生化对于本领域技术人员是已知的。本发明还要求保护具有所述活性的本发明多肽的衍生物。

[0017] 特别地，本发明涉及具有以下序列的多肽：

[0018] z1-QHGYGAGGHGQQGYGSQHSSHAPQGGHVVREQGFSGHVHEQQAGHHHEAGHHEQAGHHEQSGQQVHGQGHGYK-Z2，

[0019] 其中

[0020] Z1是多肽的N末端，或多肽的末端氨基衍生物，或具有10个以下任意氨基酸的链；

[0021] Z2是多肽的C末端，或多肽的末端羧基衍生物，或具有10个以下任意氨基酸的链。

[0022] 特别地，Z2可以具有SHGY-Z3的氨基酸序列，其中Z3是多肽的C末端，或多肽的末端羧基衍生物，或具有6个以下任意氨基酸的链。

[0023] 在本发明另一个实施方案中，本发明的多肽在肽链中可以具有部分或完全的D-氨基酸或D-反-倒位(D-retro-inverso)肽结构。

[0024] 本发明还涉及编码本发明多肽的多核苷酸用于生产本发明多肽，或用于控制真菌的用途，其中所述多核苷酸具有以下序列，其与选自以下的寡核苷酸或多核苷酸探针在使用0.2xSSC于42℃清洗的严格条件下杂交：

[0025] SEQ ID No.3第1-231核苷酸残基的互补链；

[0026] SEQ ID No.3第1-102核苷酸残基的互补链；

[0027] SEQ ID No.3第103-331核苷酸残基的互补链；

[0028] SEQ ID No.4第18-251核苷酸残基的互补链；

[0029] SEQ ID No.4第18-119核苷酸残基的互补链；

[0030] SEQ ID No.4第120-251核苷酸残基的互补链。

[0031] 本发明还涉及本发明的多肽或编码所述多肽的本发明的核酸用于控制真菌，尤其是植物致病性真菌、镰刀菌属和/或疫霉属生物、霜霉纲(Peronosporomycetes)生物的用途。

[0032] 另外，本发明涉及生产本发明多肽的方法。

[0033] 本发明还涉及除丝光绿蝇(Lucilia sericata)野生型细胞之外的细胞，其含有表达本发明多肽，尤其是SEQ ID No.1或2的多肽的核酸。

[0034] 本发明还涉及含有本发明细胞的转基因作物。

[0035] 图1示出通过反向色谱和质谱，对以完全合成方式制备的蛋白LserFCP1-77的分析结果。

[0036] 图2示出用IPTG对大肠杆菌细胞诱导不同时间段后的SDS-PAGE分析结果，所述大肠杆菌细胞经基因改造用于生产由硫氧还蛋白、六聚组氨酸序列、因子Xa识别序列和LserFCP1-77组成的融合多肽。

[0037] 图3示出固定化金属离子亲合色谱纯化由硫氧还蛋白、六聚组氨酸序列、因子Xa识别序列和LserFCP1-77组成的融合多肽的结果，以及相关SDS PAGE分析的结果。

[0038] 图4示出Mono-Q色谱分离用因子Xa处理由硫氧还蛋白、六聚组氨酸序列、因子Xa识别序列和LserFCP1-77组成的融合多肽后获得的切割产物的结果，以及相关SDS PAGE分析的结果。

[0039] 图5示出通过反向色谱和质谱，对以重组形式制备的多肽LserFCP1-77的分析结果。

[0040] 图6示出利用肠激酶处理融合多肽后获得的切割产物的Mono-Q色谱分离结果，其中，融合多肽由硫氧还蛋白、六聚组氨酸序列、肠激酶识别序列和LserFCP1-77组成，以及获得的多肽LserFCP1-73的质谱分析结果。

[0041] 图7示出与水对照相比，规定浓度的多肽LserFCP1-77抑制禾谷镰刀菌孢子萌发的测试结果。

[0042] 图8示出LserFCP1-77抑制禾谷镰刀菌孢子萌发的剂量效应关系。

[0043] 图9示出与水对照相比，规定浓度的多肽LserFCP1-73抑制禾谷镰刀菌孢子萌发的测试结果。

[0044] 图10示出与水对照相比，规定浓度的多肽LserFCP1-77抑制寄生疫霉(Phytophthora parasitica)孢子萌发的测试结果。

[0045] 根据本发明，术语“杀真菌活性”被理解为杀死真菌，抑制真菌生长以及防止真菌孢子萌发。这些效应可被完全或部分判定。

[0046] 根据本发明，术语“控制真菌”被理解为杀死真菌，或抑制现存真菌的生长，以及防止真菌寄居和防止真菌孢子萌发。

[0047] 根据本发明，“真菌”还被理解为俗称为真菌(或霉菌)的那些生物，即使这并未正确反映与系统发生(phylogenesis)相关的科学证据。特别地，本发明的“真菌”意在包括霜霉纲(以前命名为卵菌纲(Oomycota)或卵菌纲(Oomycetes))的代表，包括疫霉属。

[0048] 本发明的多肽适于控制造成健康相关或经济损失的真菌。

[0049] 在本发明的优选实施方案中，本发明的多肽用于控制造成植物疾病或农产品储藏损失的真菌。

[0050] 在本发明另一个优选实施方案中，本发明的多肽用于控制疫霉属和镰刀菌属的真菌。

[0051] 本发明的多肽可以纯的形式或以不同剂型形式用于控制真菌。对于外部使用，所述多肽可被稀释形成含有0.01-30mg/ml各个多肽的液体溶液或悬浮液，或与膨胀剂固体混合用作粉尘或粉末。采用普通方法向特定作物和病原体施用的方法是文献中已知的(Methods for Evaluating Pesticides for Control of Plant Pathogens,K.D.Hickey,Ed.,The American Phytopathological Society,1986)。施用方法包括单独或周期性地对植物或植物部分、种皮进行含水和不含水喷雾，以及整合入喷雾系统。可添加入制剂的辅助添加剂包括稳定剂、改善溶解性能的试剂、湿润剂以及允许微胶囊封装的试剂。

[0052] 为了特别有效地控制真菌，本发明的多肽可以和其他杀真菌活性物质组合使用。而且可以与杀菌性、抗病毒性、杀线虫性、杀昆虫性及植物保护中常用的其他活性物质组合。还可以与肥料、植物激素和生长调节剂组合。通过本发明的多肽控制真菌的一种可能是通过名为转化的方法将编码所述多肽的多核苷酸序列引入其遗传物质而基因改造植物。用于制备本发明该基因改造植物的方法是本领域技术人员已知的(Methods for Plant Molecular Biology,A.Weissbach,H.Weissbach,Eds.,Saunders College Publishing/Harcourt Brace,June  1988；Methods in plant  molecular  biology  and biotechnology,B.R.Glick,J.E.Thompson,CRC Press,Boca Raton,FL,1993)。在本发明的有利变体中，具有适当改造载体的人工基因构建体通过包被DNA的微粒轰击、所谓的浸花法或土壤杆菌介导的转化整合入植物、植物部分或植物细胞中。其他可能的方法包括例如显微注射、化学渗透、电穿孔和与含有DNA的单元例如细胞、微细胞、原生质体或脂质体的原生质体融合。在本发明另一个有利的变体中，编码本发明多肽的基因经合成制备，其中核苷酸三联体(每个核苷酸三联体编码一个氨基酸)调整为基因改造植物优选的密码子使用。另外，可以根据已知方法将待转移的外源基因置于可由损伤和生长素活性活化的启动子的控制下，由此在真菌寄居后获得增加的表达(Rahnamaeian.Insect peptide metchnikowin confers on barley a selective capacity for resistance to fungal ascomycetes pathogens.J Exp Bot.2009,60:4105-14)。在本发明一个有利的实施方案中，谷物和/或马铃薯植物经基因改造能够生产本发明的多肽。

[0053] 对应于SEQ ID No.1或No.2的多肽可用于控制真菌。另外，还可以使用由序列截断或添加另外的氨基酸残基所产生的多肽或寡肽。

[0054] 另外，可以使用具有添加的额外序列单元的多肽的变体，例如在重组形式制备中获得更高产量或有利于纯化。

[0055] 在某些情况下，使用由SEQ ID No.1的至少12个连续氨基酸残基组成的寡肽可能是有利的。另外，去除个别氨基酸残基，或用不同的氨基酸残基取代它们可能是有利的。还可以插入额外的氨基酸残基。当由截短的或延长的多肽变体出发时，也可进行所述变化。特别地，用具有相似理化性质的氨基酸残基取代个别氨基酸残基可能是有利的。因此，主要的氨基酸残基在以下组内可彼此互换：

[0056] 精氨酸和赖氨酸；

[0057] 谷氨酸和天冬氨酸；

[0058] 谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸；

[0059] 甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸；

[0060] 亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；

[0061] 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；

[0062] 丝氨酸和苏氨酸。

[0063] 对来自SEQ ID No.1的多肽的鉴定可通过例如使用已知方法筛选基因组和/或cDNA基因文库而进行，所述方法在例如Sambrook和Russell的关于分子克隆的书(Sambrook and Russell 2001 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NJ)中有描述。例如可使用细菌或噬菌体作为受体生物制备基因文库。而且所述基因文库可以是电子化储存于适合介质的序列数据的形式，尤其是若该数据由名为下一代测序(Next Generation Sequencing)的技术产生，其无需对核酸分子进行分子克隆。对于筛选用的探针，特别地，可以使用对应于SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或其序列片段的互补链的核苷酸序列。这些探针的序列可以在遗传密码子简并性的范围内变化，并且还可含有例如肌苷(其并非天然存在于编码蛋白的核酸中)的核苷，以提高氢键结合的能力。

[0064] 所述筛选还可使用针对对应于SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或其序列片段的多肽制备的抗体进行。

[0065] 由于其相对较小的尺寸，本发明的多肽可通过化学肽合成的方法制备(实施例1)。这可以包括使用已知的例如根据B.Merrifield的固相方法。所述合成可使用Fmoc或Boc保护基团策略手动进行，或在自动肽合成仪的辅助下进行。可以合成较小片段的多肽，随后将其连接起来。

[0066] 本发明多肽的制备还可通过在不同的受体生物和受体细胞中异源表达适合的核酸构建体而进行。所需的基因改造方法在Sambrook和Russell的关于分子克隆的书(Sambrook and Russell 2001Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NJ)中有描述。可使用原核系统(例如大肠杆菌或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))或真核系统(例如昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)。

[0067] 在本发明的优选实施方案中，所述制备在大肠杆菌中以硫氧还蛋白和六聚组氨酸序列融合多肽进行，其中提供用于切割本发明多肽的特定蛋白酶识别序列(实施例2、3和4)。

[0068] 通过异源表达获得的本发明的多肽可从基因改造的生物或细胞的细胞裂解液或上清液中通过多种已知方法纯化。特别适合的方法包括固定化金属离子亲合色谱、阴离子交换色谱和反向色谱(实施例3)。

[0069] 实施例1：

[0070] 合成制备多肽LserFCP1-77

[0071] 在聚合物载体树脂上完全通过固相合成制备具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽。通过反相色谱(柱：Alltech Alltima C18 4.6x 250mm,Fischer Scientific)(使用在水中的渐增甲醇梯度)对产物的分析产生基本均一的峰，可以预计纯度至少80％(图1)。在通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)的进一步分析过程中，在m/z 746.50处观察到优势分子离子，其对应于11倍质子化的靶分子(图1)。

[0072] 实施例2：

[0073] 在大肠杆菌中构建用于重组制备LserFCP1-77和LserFCP1-73的质粒

[0074] 为了在大肠杆菌中进行异源表达，制备合成基因，其编码多肽LserFCP1-77的序列(SEQ ID No.1)。对密码子使用进行调整以适应受体生物大肠杆菌K12。基于合同，由Eurofins MWG Operon(Anzingerstr.7a,85560Ebersberg,Germany)公司进行基因合成。在编码序列的5'和3'末端添加能使其插入载体pASK-IBA33plus中的其他序列。因此，完全合成制备的多核苷酸具有SEQ ID No.4所示序列。使用两个BsaI限制性核酸内切酶切割位点，将合成基因以定向方式插入载体pASK-IBA33plus中。由此获得的构建体用于转化TOP10和BL21菌株大肠杆菌细胞。

[0075] 在基于pASK-IBA33plus的构建体起始的进一步的实验中，合成的基因被再克隆入载体pET-32a(+)。进行该再克隆以获得编码由硫氧还蛋白、六聚组氨酸序列、蛋白酶识别序列和多肽LserFCP1-77组成的融合多肽的质粒。制备该质粒的两个变体，在一个变体中，编码的识别序列是肠激酶特异性的，在另一个变体中，编码的识别序列是凝结因子Xa特异性的。相应地，质粒被命名为pET-32-FCP-EK和pET-32-FCP-Xa。

[0076] 对于这些质粒的构建，合成基因通过PCR扩增，其中使用引物添加插入新载体所需的额外序列。使用由KpnI限制酶切位点、连接序列、编码肠激酶识别序列的序列以及编码多肽LserFCP1-77的最初氨基酸残基的特异性序列组成的正向引物1构建pET-32-FCP-EK。使用由KpnI限制酶切位点、连接序列、编码因子Xa识别序列的序列以及编码多肽LserFCP1-77的最初氨基酸残基的特异性序列组成的正向引物2构建pET-32-FCP-Xa。对于两种构建体，使用由EcoRI限制酶切位点、终止密码子和编码多肽LserFCP1-77的最末氨基酸残基的特异性序列组成的反向引物3。

[0077] 引物1(正向)：

[0078] 5′-tgaggtaccgacgacgacgacaagcagcatggctatggagcgg-3′

[0079] 引物2(正向)：

[0080] 5′-tgaggtaccggtggtggctccggtattgagggtegccageatggctatggagcgg-3′[0081] 引物3(反向)：

[0082] 5′-tcagaattettaatacccgtgegatttgtag-3′

[0083] PCR产物通过KpnI和EcoRI限制酶切位点插入载体pET-32a(+)中，获得的构建体用于BL21(DE3)(Novagen/Merck)菌株大肠杆菌细胞的转化。转化细胞的鉴定通过在含有氨苄西林的营养培养基上选择而进行。在其基因组DNA中，所用的大肠杆菌菌株含有致溶菌的λ噬菌体，在其上面编码T7RNA聚合酶的基因受到lacUV5启动子的控制。T7RNA聚合酶基因的表达以及在表达质粒上的T7启动子控制下的外源基因的表达通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。在诱导后的不同时间对应融合多肽的形成通过SDS PAGE检测，随后经考马斯蓝染色(图2)。

[0084] 实施例3：

[0085] 在大肠杆菌中产生重组多肽LserFCP1-77

[0086] 用如实施例2中所述构建的质粒pET-32-FCP-Xa转化BL21(DE3)(Novagen/Merck)菌株的大肠杆菌细胞，并在6个具有挡板的1升的爱伦美(Erlenmeyer)玻璃瓶中培养，每个玻璃瓶含有400ml LB培养基，添加300mg/l氨苄西林，于37℃下以250rpm摇动。在通过浊度测定在600nm处观察到0.4的吸光值后，通过添加1mM IPTG进行诱导。在持续培养3小时之后，通过离心收集细菌细胞(10,000x g,10min,4℃)。沉淀重悬于200ml的缓冲液A(100mM NaCl,30mM Tris,pH 7.5)，细胞在高压匀浆器(Microfluidizer M 110PS,Microfluidics,30Ossipee Road,Newton,MA02464U.S.A.)中通过剪切力裂解。离心(70,000x g,30min,4℃)后，上清液经0.22mm膜过滤。细胞裂解液以4ml/min的流速填充于载有Co2+离子的固定化金属离子亲合色谱柱(16x 100mm,TALON Superflow Resin,Clontech Laboratories,
1290Terra Bella Avenue,Mountain View,CA 94043,U.S.A.)上。所述柱之前用缓冲液A平衡。在填充样品后，用缓冲液A清洗柱，直至280nm处的检测产生恒定值。用缓冲液A中的
30mM-100mM的咪唑进行分级梯度洗脱。主要的融合多肽被100mM咪唑洗脱。经SDS PAGE伴随考马斯蓝染色分析，产生高于90％的纯度(图3)。

[0087] 通过凝胶渗透色谱(HiPrep Desalting Column 26/10,GE Healthcare,Buckinghamshire,U K)在10mM NaCl，10mM Tris，pH 7.5下对融合多肽进行再缓冲。10μg融合多肽与500单位的因子Xa(Merck)在10ml切割缓冲液(100mM Tris-HCl,20mM NaCl,pH 7.5)中室温孵育16h。反应产物以1ml/min的流速填充在用10mM Tris-HCl，pH 8平衡的强离子交换柱(MonoQ 5/50GL,GE Healthcare)上，并用相同的缓冲液清洗柱。用0-300m M NaCl梯度经20分钟进行洗脱。SDS PAGE分析表明多肽LserFCP1-77(其作为切割产物获得，并在
11分钟洗脱)与剩余多肽组分完全分离(图4)。色谱图中对应的峰仅在UV吸收检测，而非荧光测量时可见。这可由多肽LserFCP1-77的氨基酸序列中色氨酸残基的缺失得到解释。在SDS PAGE分析中，LserFCP1-77的分子量显示明显的30kDa，而非预期的8.2kDa。该非典型电泳行为可能归因于SDS分子与多肽的无效结合。多肽的确认通过反向色谱(柱：BioBasic 8,
2x 150mm,Dionex；梯度:10-80％位于水中的乙腈，含有0.1％甲酸)，直接注入ESI质谱仪(amaZon ETD,Bru ker Daltonik,Fahrenheitstr.4,D-28359Bremen)进行检查。在m/z 684处观察到的优势分子离子对应于12倍质子化的靶分子(图5)。

[0088] 实施例4：

[0089] 在大肠杆菌中产生重组多肽LserFCP1-73

[0090] 用如实施例2中所述构建的质粒pET-32-FCP-EK转化BL21(DE3)(Novagen/Merck)菌株的大肠杆菌细胞。细胞的培养和细胞裂解液的处理以类似于实施例3中所述的操作进行，除了使用0.1单位的肠激酶(Novagen)进行融合多肽的切割。在该情况下，也可通过阴离子交换色谱分离靶分子(图6)。然而质谱分析(micrOTOF II,Bruker Daltonik,Fahrenheitstr.4,D-28359Bremen)表明并未形成预期的多肽LserFCP1-77(图6)。数据清楚地表明已形成的多肽是具有7755Da分子量的LserFCP1-73。这可以解释为LserFCP1-77序列最后四个氨基酸残基似乎已被肠激酶的非特征活性切掉。

[0091] 实施例5：

[0092] 确定LserFCP1-77抗禾谷镰刀菌的活性

[0093] 禾谷镰刀菌(IFA 65菌株)

[0094] 供应源：奥地利塔累的农业生物技术交流部门(Interuniversitary Department for Agricultural Biotechnology of Tulln,Austria)

[0095] 参考文献：Steiner B,Kurz H,Lemmens M,Buerstmayr H.Differential gene expression of related wheat lines with contrasting levels of head blight resistance after Fusarium graminearum inoculation.Theor Appl Genet.2009Feb；118(4):753-64.

[0096] 禾谷镰刀菌于室温培养于SNA-琼脂平板上直至孢子形成。用水将孢子从平板上扫去，调整至20,000孢子/ml的密度，于4℃储存待用。进行测试时，0.05ml每份的孢子悬浮液与0.05ml每份的不同浓度的LserFCP1-77溶液在96-孔微孔板的孔中组合。于室温孵育24h后，使用4倍物镜和10倍放大倍数，通过显微镜检测孢子萌发。结果经拍照记录(图7)。对萌发和未萌发的孢子比例进行计数，获得的数据用于剂量效应关系图示(图8)。由此证实发生半峰抑制的浓度为1.6μΜ。另外，由萌发的孢子形成的菌丝长度经观察作为对抑制的半定量测量(图7)。

[0097] 实施例6：

[0098] 确定LserFCP1-73抗禾谷镰刀菌的活性

[0099] 与水对照相比，通过实施例5中所述测试系统确定浓度100μΜ的LserFCP1-73的效力。观察到LserFCP1-73对孢子萌发的完全抑制(图9)。

[0100] 实施例7：

[0101] 确定LserFCP1-77抗寄生疫霉的活性

[0102] 寄生疫霉(分离物329)

[0103] 供应源：法国INRA(IN  RA  (institut  national  de  la  recherche agronomique))

[0104] 参考文献：Keller H,Pamboukdjian N,Ponchet M,Poupet A,Delon R,Verrier JL,Roby D,Ricci P.Pathogen-induced elicitin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive response and nonspecific disease resistance.Plant Cell.1999Feb；11(2):223-35.

[0105] 寄生疫霉于25℃在Rye B琼脂平板上培养8天。用水洗掉孢子囊，获得的孢子囊悬浮液于4℃孵育4h以诱导游动孢子的形成。在RPMI 1640培养基中以1:50稀释后，确定孢子密度并调整至20,000孢子/ml。通过实施例5中所述方法进行该测试进一步的操作。结果也通过拍照记录(图10)。

[0106] 序列表

[0107] 氨基酸根据IUPAC命名法缩写如下：丙氨酸A,精氨酸R,天冬酰胺N,天冬氨酸E,半胱氨酸C,谷氨酸D,谷氨酰胺Q,甘氨酸G,组氨酸H,异亮氨酸I,亮氨酸L,赖氨酸K,甲硫氨酸M,苯丙氨酸F,脯氨酸P,丝氨酸S,苏氨酸T,色氨酸W,酪氨酸Y,缬氨酸V

[0108] SEQ ID NO:1—LserFCP1-77

[0109] QHGYGAGGHGQQGYGSQHSSHAPQGGHVVREQGFSGHVHEQQAGHHHEAGHHEQAGHHEQSGQQVHGQGHGYKSHGY

[0110] SEQ ID NO:2—LserFCP1-73

[0111] QHGYGAGGHGQQGYGSQHSSHAPQGGHVVREQGFSGHVHEQQAGHHHEAGHHEQAGHHEQSGQQVHGQGHGYK

[0112] SEQ ID NO:3—编码LserFCP1-77的丝光绿蝇cDNA

[0113] 5′-CAACACGGCTATGGTGCCGGTGGCCATGGCCAACAAGGCTATGGTAGCCAACATAGCAGTCATGCTCCCCAAGGTGGACATGTTGTCCGTGAACAAGGTTTTAGTGGTCATGTTCATGAACAACAGGCTGGGCATCATCATGAAGCTGGCCATCATGAGCAAGCTGGTCATCATGAACAATCTGGTCAACAAGTTCATGGTCAAGGTCATGGCTATAAAAGTCATGGTTAT-3′

[0114] SEQ ID NO:4—编码LserFCP1-77的合成基因，其具有适合大肠杆菌的密码子使用[0115] 添加的用于克隆的非编码序列区段以斜体字母打印。

[0116]