[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种SEQ ID No：1氨基酸序列的多肽的用途，即多肽Cbf-14具有抗真菌感染作用的用途。背景技术：

[0002] 真菌感染性疾病是由致病性真菌新型隐球菌、霉菌、酵母菌及癣菌等在接触到一个有利条件时引起的浅表或深部感染，常见于高危人群，包括骨髓和实体器官移植、广谱抗生素治疗、肿瘤和免疫抑制治疗、插管等侵袭性治疗以及AIDS患者。真菌感染性疾病如皮肤癣病、真菌性肠炎、肺炎、脑膜炎等发病率虽稍低于细菌性感染，但多因病症顽固、危害性大、治疗周期长、不易完全根除等特点给临床治疗带来很大困难。

[0003] 现有抗真菌药物主要分为多烯类及非烯类抗生素、唑类、烯丙胺类、5-氟胞嘧啶和芬净类等，因对肾脏、肾上腺有较大毒性反应，除少数可内服外多为局部用药，单一用药效果差，且真菌耐药性逐日增加。因此，研制高效低毒的新型抗真菌药物对临床用药具有重要意义。

[0004] 抗菌肽是一类广泛存在于生物体内，具有多种生物学功能的小肽类物质，是生物体固有免疫系统的重要组成部分，具有广谱抗菌性，特别是对耐药性微生物有强杀菌作用。抗菌肽一般由15～45个氨基酸组成，其结构多数具有两亲性，热稳定性高，均带有正电荷。
目前研究已知其主要通过静电作用被吸附到带负电荷的细菌细胞质膜表面，使两侧膜电位升高，从而在膜上形成离子通道，膜结构因此遭到破坏，细胞内外渗透压失衡，胞内水溶性物质大量渗出，最终导致细菌死亡。此作用机理独特，不易使细菌对其产生耐药性，并且由于其低免疫原性、高选择性、对正常细胞没有任何破坏作用、易于被人体分解排除等特性，因此被视为近年来发现的具有替代传统抗生素潜质的重要物质。除此之外，研究证实多肽还具有抗真菌、原虫、病毒、肿瘤细胞以及促进伤口愈合等免疫调节类生物学活性，显示出其在医学上良好、广阔的应用前景。

[0005] 发明人在前期的研究中，基于多肽设计原理，由Cathelicidin家族抗菌多肽采用生物信息学技术设计并筛选出的高活性小分子α-螺旋肽，利用固相化学合成法获得多肽Cbf-14，具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，由14个氨基酸组成，带7个正电荷，分子量为1819.33，等电点为12.31。其全序列为：精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸。具有抗耐药性病原菌感染功效，特别是具有抗超级耐药细菌的功效。该技术记载于中国专利申请
CN2012101719018中。后续研究结果在CN201310053960X公开了多肽Cbf-14具有抗肿瘤的作用，特别是抗肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌或恶性黑色素瘤的作用。

[0006] 本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID：NO.1所示的多肽具有抗真菌感染的功效，特别是具有抗白色念珠菌和新型隐球菌的功效。可用于制备抗真菌感染的药物。

[0007] 药效学实验表明，多肽Cbf-14具有明显的抑制或杀灭白色念珠菌和新型隐球菌的作用，可作为抗真菌候选药物。

[0008] 下面是本发明的部分药效学实验及结果。

[0009] 一、多肽Cbf-14对白色念珠菌和新型隐球菌的体外抑制作用

[0010] (1)菌液的制备

[0011] 将实验用真菌从甘油管中接至沙氏葡萄糖琼脂斜面，30℃培养，取白色念珠菌24h培养物，新型隐球菌48h培养物，挑取5个菌落悬浮于5mL无菌生理盐水中，在漩涡振荡器上6 6
振荡15秒混匀，并调节菌悬液至1×10～5×10CFU/mL。再用RPMI 1640培养基作1：50稀释，再进行1：20稀释以制成菌液浓度为1×103～5×103CFU/mL的试验浓度，当与等量药物混合后，菌液的最终浓度为0.5×103～2.5×103CFU/mL。

[0012] (2)药液的配置

[0013] 分别精确称取一定量的多肽Cbf-14和咪康唑配置成浓度为1024μg/mL的药物贮存液，0.22μm膜无菌过滤除菌，分装，置-70℃保藏备用。

[0014] (3)最小抑菌浓度(MIC)的测定

[0015] 用RPMI 1640培养基分别将各药物贮存液倍比稀释成浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL的药液。取一次性无菌、U形孔底的96孔板，从低浓度到高浓度加入100μL药液(2倍终浓度)于反应板的各排；加入100μL含1×103～5×103CFU/mL的菌液；
同时设立生长对照孔(加有100μL菌液和不含药物的100μL RPMI 1640培养液)。30℃孵育
48h(白色念珠菌)，72h(新型隐球菌)。观察抗菌效果，并记录MIC值。重复试验3次，结果见表
1：

[0016] 表1多肽Cbf-14和咪康唑对白色念珠菌和新型隐球菌临床株及标准株的MIC[0017]

[0018] 由药敏试验结果表1可看出白色念珠菌和新型隐球菌对多肽Cbf-14敏感性较强，其MIC值较低，表明多肽Cbf-14对这两种真菌有着明显的抑菌作用，特别是对新型隐球菌的MIC值低至4～16μg/mL，由此可得出多肽Cbf-14具有研制成为替代现用抗真菌药物的良好潜质。

[0019] (4)最小杀菌浓度(MFC)的测定

[0020] 依次将上述未见真菌生长的各管培养物分别吸取0.1mL加到无菌平皿中，倾注适量温度不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀，置30℃再培养24h计数，平皿上菌落小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度MFC。重复试验3次，结果见表2：

[0021] 表2多肽Cbf-14和咪康唑对白色念珠菌和新型隐球菌临床株及标准株的MFC[0022]

[0023] 由表2可得出与表1类似的结论，多肽Cbf-14对于白色念珠菌和新型隐球菌具有明显的杀菌作用。新型隐球菌多由呼吸道侵入，在肺部引起炎症，当机体免疫功能下降时可向全身播散，主要侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等，病情严重，疗程长，预后差，病死率高。两性霉素B是目前对抗此病菌药效最强的抗真菌药物，但因其不良反应多且严重，在临床应用中有较多局限性，由新型隐球菌引起的感染仍是临床上的一个严峻问题。白色念珠菌为最主要的真菌致病菌，多引起皮肤及粘膜性感染，其临床上的主要用药为氟康唑，但该药虽具有明显的抑菌作用，却缺乏杀菌活性，因此其用药后复发性较高。表2数据显示多肽Cbf-14对于不同来源的白色念珠菌和新型隐球菌均有良好的杀菌活性，且其新颖的作用机制不易使病菌对其产生耐药、并且几乎无毒副作用。因此，我们可初步将多肽Cbf-
14拟为一种良好的新型抗真菌替代候选药物。

[0024] (5)多肽Cbf-14和咪康唑对白色念珠菌和新型隐球菌临床株及标准株杀菌曲线的绘制

[0025] 分别将4×MIC浓度的多肽Cbf-14和咪康唑药液，与制备好的约1×106CFU/mL的菌悬液混合，使其终浓度为105CFU/mL左右。放置于30℃静置培养，分别于0、0.5、1、2、4、8、12、16和24h时，吸取一定量培养物系列稀释，并进行平皿活菌计数，每个稀释度做三个平行实验，取平均值。以真菌浓度对数为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1、2、
3、4。

[0026] 从图1、2、3和图4中发现多肽Cbf-14作用于细胞2h时使真菌细胞数下降50％左右，在4h或8h对真菌基本杀灭完全，对白色念珠菌和新型隐球菌作用效果类似，且作用效果强于对照药物咪康唑。由此表明多肽Cbf-14对于此两种真菌杀菌作用较强，并且在较短时间内完成，因此进一步显示出多肽Cbf-14可作为良好的新型抗真菌替代候选药物的潜质和可行性。

[0027] 二、多肽Cbf-14对新型隐球菌细胞膜结构的影响

[0028] 采用透射电镜的方法观察多肽Cbf-14对新型隐球菌细胞膜的影响。将新型隐球菌培养至对数期，加入终浓度为4倍MIC的多肽Cbf-14孵育4h，孵育结束后离心洗涤三次，沉淀重悬于1mL 2.5％戊二醛固定，4℃过夜。弃掉固定液，用PBS缓冲液洗涤2次。1％OSO4固定，4℃1h。用0.1M磷酸漂洗液漂洗15min三次，1％锇酸固定液固定2-3h。再次漂洗。然后用乙醇梯度脱水。分别为：50％乙醇15-20min，70％乙醇15-20min，90％乙醇15-20min，90％乙醇：90％丙酮(1:1)15-20min，90％丙酮15-20min，低温4℃进行，100％丙酮室温15-20min三次。
然后进行包埋，用纯丙酮和包埋液进行包埋，包埋后进行固定，分别在37℃烘箱过夜，45℃烘箱12h，60℃烘箱24h。然后用JEM-1011切片机切片，最后加入醋酸铀-枸橼酸铅双染色。透射电镜观察，拍片。鉴定真菌细胞膜的变化。图5为多肽Cbf-14作用于新型隐球菌后其细胞形态的变化。

[0029] 从图5中我们可以发现多肽Cbf-14对新型隐球菌细胞膜的破坏现象非常明显。对照组细胞结构完整，形态正常，细胞圆润且边缘光滑；多肽Cbf-14试验组作用1h之后细胞膜上有明显破裂形成，大量细胞内含物流出；作用2h之后新型隐球菌细胞明显皱缩，不能维持正常的细胞形态。通过透射电镜图我们可以准确判断出多肽Cbf-14对于新型隐球菌主要作用在细胞膜上，且对于真菌有很好的杀菌活性。

[0030] 图1是多肽Cbf-14对白色念珠菌ATCC10231的杀菌曲线图。

[0031] 图2是多肽Cbf-14对白色念珠菌临床株1#的杀菌曲线图。

[0032] 图3是多肽Cbf-14对新型隐球菌ATCC4902的杀菌曲线图。

[0033] 图4是多肽Cbf-14对新型隐球菌临床株3#的杀菌曲线图。

[0034] 图5是多肽Cbf-14对新型隐球菌ATCC4902的透射电镜图。

[0035]