基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法

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基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法
申请号	CN201310096982.4	申请日	2013-03-25	公开(公告)号	CN103146834A	公开(公告)日	2013-06-12
申请人	江苏省血吸虫病防治研究所;			发明人	曹俊; 白亮; 朱国鼎; 唐建霞; 周华云; 高琪;
摘要	本发明公开一种基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法。本发明提供的专用引物，由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物1及引物2组成；所述试剂由所述专用引物、探针1（序列SEQ ID NO:3）、探针2（序列SEQ ID NO:4）及探针3（序列SEQ ID NO:5）组成；所述反应试剂由所述试剂和Allglo反应缓冲液组成；所述试剂盒包括所述反应试剂。本发明提供了一种高效、快捷、简便的中华按蚊kdr基因突变位点检测方法，其特异性和敏感性高，可快速准确地检测出中华按蚊kdr基因突变类型。
权利要求	1.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的专用引物，其特征在于：由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物1及引物2组成。 2.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂，其特征在于：由权利要求1所述专用引物、探针1、探针2及探针3组成，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述探针1的5’和3’末端均标记MAR基团；所述探针2的5’和3’末端均标记JUP基团；所述探针3的5’和3’末端均标记NEP基团。所述探针1、探针2以及探针3核苷酸序列中的第7位碱基C以及探针2核苷酸序列中的第12位碱基T为锁核苷酸。 3.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的反应试剂，其特征在于：由权利要求2所述试剂和Allglo反应缓冲液组成，所述反应试剂中，所述引物1和引物2的终浓度均为 300～800nM，所述探针1、探针2以及探针3的终浓度均为200～600nM。 4.一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂盒，其特征在于：包括权利要求3所述的反应试剂。 5.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂或权利要求3所述反应试剂或权利要求4所述试剂盒在检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点以及制备中华按蚊击倒抗性基因突变位点检测产品中的应用，所述突变位点为L1014F或L1014C。 6.一种中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，其特征在于步骤如下：取10～ 20μl权利要求3所述反应试剂或权利要求4所述试剂盒中的所述反应试剂，加入1条中华按蚊蚊腿进行Allglo探针实时荧光定量扩增，扩增结束，仪器自动进行扩增曲线分析，并根据扩增曲线进行结果判定；所述扩增反应条件如下： 95℃预变性3～10min，95℃变性10～30s，60℃退火延伸20～60s，于所述退火延伸阶段采集信号，共35～45个循环；所述结果判定标准如下：仅FAM通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因不含有所述突变位点，为TTG纯合野生型；仅VIC/HEX通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014F突变位点，为TTT纯合突变型；仅CY5通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014C突变位点，为TGT纯合突变型；当FAM、VIC/HEX和CY5通道中任意两个有扩增信号时，所述击倒抗性基因为杂合型。 7.根据权利要求6所述中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，其特征在于：所述杂合型为野生突变杂合型或突变杂合型，包括TTG/TTT野生突变杂合型、TTG/TGT野生突变杂合型或TTT/TGT突变杂合型。
说明书全文	基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法技术领域 [0001] 本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及中华按蚊击倒抗性（kdr）基因突变位点的检测方法，尤其涉及基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性（kdr）基因突变位点的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。背景技术 [0002] 中华按蚊(Anopheles sinensis)是我国主要的传疟媒介之一，近期相关报道指出我国中部地区的中华按蚊传播能力较上世纪有了大幅度提高，其传疟能力的增强可能与本世纪以来我国中部和黄淮地区疟疾疫情爆发有密切联系。使用杀虫剂进行按蚊媒介控制是非常重要的疟疾防治手段，人类应用杀虫剂防治蚊虫已有80年余年历史，自本世纪80年代初，用拟除虫菊酯类杀虫剂处理蚊帐及喷洒灭蚊逐渐成为重要的抗疟措施之一。由于多年来杀虫剂的大量使用，传疟媒介对杀虫剂的抗性在全球范围内迅速扩散。近几年我国湖北、江苏等中部省份的媒介抗性监测数据显示，当地中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂的抗性显著上升，湖北省部分地区中华按蚊对溴氰菊酯杀虫剂半数致死浓度（LC50）较1998年上升了306倍。 [0003] 击倒抗性（kdr）是蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的分子机制之一，是由于昆虫钠离子通道蛋白第二结构域S6区段编码氨基酸序列发生突变所致，即kdr基因L1014位点（TTG）突变。研究发现，冈比亚按蚊中同时存在L1014F和L1014S突变，这些突变导致拟除虫菊酯类杀虫剂与钠离子通道蛋白上的结合位点发生变化，与杀虫剂的结合能力变弱，从而对其敏感性降低（D.Martinez-Torres，F.Chandre，M.S.Williamson，et al.．Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance(kdr)in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s[J]．Insect Mol Biol，1998，7（2）：179-184；J.Pinto，A.Lynd，N.Elissa，et al.．Co-occurrence of East and West African kdr mutations suggests high levels of resistance to pyrethroid insecticides in Anopheles gambiae from Libreville,Gabon[J]．Med Vet Entomol，2006，20（1）： 27-32）；2007年，KimH等报道了中华按蚊kdr基因存在L1014F（TTT）和L1014C（TGT）两种突变型，突变后中华按蚊对溴氰菊酯敏感性明显降低（H.Kim，J.H.Baek，W.-J.Lee，et al.．Frequency detection of pyrethroid resistance allele in Anopheles sinensis populations by real-time PCR amplification of specific allele (rtPASA)[J]．Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，87（1）：54-61）。因此，不同地区蚊虫击倒抗性相关基因突变频率的测定可为传疟媒介防制措施的制定提供科学依据。 [0004] 目前已有采用PCR和TaqMan法荧光定量PCR检测中国按蚊抗药性kdr基因突变的报道。2011年，武松等报道了中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立（武松，马尔健，刘茜等.中华按蚊击倒抗性突变PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报,2011,27(11):1008-1010）；中国专利CN102373280A和CN102373282A分别公开了一种中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒以及PCR-RFLP检测试剂盒，但上述PCR方法需开盖检测结果，易引起交叉污染和假阳性，需依据电泳条带强弱进行结果判定，降低试验敏感性和特异性，易错判误判，同时在电泳中需使用毒性EB染液，不利于操作人员健康；中国专利CN102373281A公开了一种中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒，但TaqMan探针合成复杂，价格昂贵，需在两管内用不同的TaqMan探针组合分别进行荧光定量扩增，操作和检测程序较繁琐，且检测敏感性和特异性还有待提高；此外，上述方法均需预先提取按蚊基因组DNA作为扩增模板，费时费力，检测效率低，易污染。 [0005] 在现场媒介监测中，迄今尚缺乏敏感性和特异性高、成本低、简便快速的中华按蚊kdr基因突变检测方法及相应试剂和试剂盒。发明内容 [0006] 针对现有中华按蚊kdr基因突变位点检测方法及试剂盒存在上述缺陷，本发明的第一个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的专用引物，是由核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物1及引物2组成。 [0007] 本发明的另一目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂，由所述专用引物、探针1、探针2及探针3组成， [0008] 所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； [0009] 所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； [0010] 所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； [0011] 所述探针1的5’和3’末端均标记MAR基团； [0012] 所述探针2的5’和3’末端均标记JUP基团； [0013] 所述探针3的5’和3’末端均标记NEP基团。 [0014] 所述探针1、探针2以及探针3核苷酸序列中的第7位碱基C以及探针2核苷酸序列中的第12位碱基T为锁核苷酸。 [0015] 本发明的第三个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的反应试剂，由所述试剂和Allglo反应缓冲液组成，所述反应试剂中，所述引物1和引物2的终浓度均为300～800nM，优选为500nM，所述探针1、探针2以及探针3的终浓度均为200～600nM，优选为400nM。 [0016] 本发明的第四个目的是提供一种检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点的试剂盒，包括所述的反应试剂。 [0017] 本发明的第五个目的是提供所述专用引物或所述试剂或所述反应试剂或所述试剂盒在检测中华按蚊击倒抗性基因突变位点以及制备中华按蚊击倒抗性基因突变位点检测产品中的应用，其中，所述突变位点为L1014F或L1014C。 [0018] 本发明的第六个目的是提供一种中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法，步骤如下：取10～20μl所述反应试剂或所述试剂盒中的所述反应试剂，加入1条中华按蚊蚊腿进行Allglo探针实时荧光定量扩增，扩增结束，仪器自动进行扩增曲线分析，并根据扩增曲线进行结果判定； [0019] 所述扩增反应条件如下： [0020] 95℃预变性3～10min，95℃变性10～30s，60℃退火延伸20～60s，于所述退火延伸阶段采集信号，共35～45个循环；优选地，95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸30s，于所述退火延伸阶段采集信号，共40个循环； [0021] 所述结果判定标准如下： [0022] 仅FAM通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因不含有所述突变位点，为TTG纯合野生型； [0023] 仅VIC/HEX通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014F突变位点，为TTT纯合突变型； [0024] 仅CY5通道有扩增信号时，所述击倒抗性基因存在L1014C突变位点，为TGT纯合突变型； [0025] 当FAM、VIC/HEX和CY5通道中任意两个有扩增信号时，所述击倒抗性基因为杂合型。其中，所述杂合型为野生突变杂合型或突变杂合型，包括TTG/TTT野生突变杂合型、TTG/TGT野生突变杂合型或TTT/TGT突变杂合型。 [0026] 本发明的有益技术效果如下： [0027] 本发明提供了一种基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法及相应试剂和试剂盒，其特异性和敏感性高，可快速准确地检测出中华按蚊kdr基因突变类型，与现有技术相比具有以下优势： [0028] 1．与普通PCR、AS-PCR和PCR-RFLP相比，本发明为完全闭管式检测，能有效避免交叉污染和假阳性，无需电泳和其他后处理，可直接根据荧光定量扩增曲线进行突变分型鉴定，无错判误判，准确率高； [0029] 2．与TaqMan探针相比，本发明Allglo探针采用两端相同的荧光基团（MAR、JUP、NEP），互为报告基团和淬灭基团，不同于TaqMan探针一端为荧光基团而一端为淬灭基团的结构，在提高Tm值的同时可降低本底影响，提高了检测敏感性和特异性，且合成简单，价格便宜； [0030] 3．本发明无需提取按蚊基因组DNA，可直接取蚊腿作为扩增模板，并将三重探针合于一管同时进行检测，操作十分简单，检测效率高、成本低； [0031] 4．本发明建立了一种高效、准确、快捷、简便的中华按蚊kdr基因突变位点检测方法，有望在中华按蚊媒介监测工作中进一步推广应用，从而为疟疾监测工作提供新的工具。附图说明 [0032] 图1为本发明荧光定量扩增引物以及Allglo探针设计区域示意图，其中，Primer-F和Primer-R：荧光定量扩增上下游引物；Probe：Allglo探针设计区域。 [0033] 图2为中华按蚊kdr基因L1014位点TTG野生纯合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。 [0034] 图3为中华按蚊kdr基因L1014位点TTT突变纯合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。 [0035] 图4为中华按蚊kdr基因L1014位点TGT突变纯合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。 [0036] 图5为中华按蚊kdr基因L1014位点TTG/TTT野生突变杂合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。 [0037] 图6为中华按蚊kdr基因L1014位点TTG/TGT野生突变杂合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。 [0038] 图7为中华按蚊kdr基因L1014位点TTT/TGT突变杂合型Allglo荧光定量PCR扩增图谱。具体实施方式 [0039] 以下通过实施例对本发明进行具体说明。 [0040] 以下实施例所使用试剂和仪器如下：Roche Probe Master（2×）购自Roche公司；探针1（kdr-TTG）、探针2（kdr-TTT）以及探针3（kdr-TGT）由上海辉睿生物有限公司合成；LightCycler480荧光定量专用八连管购自Bioplastic公司；荧光定量PCR仪Roche Lightcycler480II购自Roche公司；引物1（上游引物Primer-F）和引物2（下游引物Primer-R）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Fast Tissue-to-PCR Kit中华按蚊gDNA提取试剂盒、Thermo Scientific Maxima Probe qPCR Master Mix（2×）购自美国Thermo公司；其他材料或试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 [0041] 实施例1引物和探针的设计 [0042] 根据中华按蚊击倒抗性（kdr）基因序列（GenBank的登录号GI84646709）和L1014位点突变情况，用Primer Premier6.0设计一对引物和三种探针：引物1（上游引物Primer-F）和引物2（下游引物Primer-R）核苷酸序列分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针1（kdr-TTG）、探针2（kdr-TTT）以及探针3（kdr-TGT）核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，上述三种探针的5’和3’末端分别采用MAR、JUP、NEP基因标记，其中，三种探针第7位碱基C、第8位碱基T为锁核苷酸。上述引物和探针具体设计区域参见图1。 [0043] 实施例2反应体系和条件的设计 [0044] 本发明采用三重探针检测方法，即每个反应管中都含有可检测TTG、TTT及TGT的三种探针kdr-TTG、kdr-TTT及kdr-TGT。 [0045] 配制Allglo实时荧光定量PCR反应体系：Roche Probe Master（2×）5μl，上游引物Primer-F和下游引物Primer-R终浓度500nM，探针kdr-TTG、kdr-TTT及kdr-TGT终浓度400nM，灭菌水补至10μl，中华按蚊蚊腿一条，并装于LightCycler480荧光定量专用八连管中。 [0046] 确定Allglo实时荧光定量PCR反应条件：将八连管置于Roche Lightcycler480II进行实时荧光定量PCR扩增，反应条件设定如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸30s，共40个循环，于所述退火延伸阶段采集信号，扩增结束后仪器自动进行扩增曲线分析。 [0047] 探针kdr-TTG检测采用FAM通道（检测波长465-510nm)，探针kdr-TTT检测选用VIC/HEX通道（检测波长533-580nm），探针kdr-TGT检测选用CY5通道（检测波长618-680nm）。 [0048] 实施例3检测结果判定 [0049] 结合扩增曲线对检测结果进行分析和判读。 [0050] kdr基因型鉴别：根据不同通道的荧光定量扩增曲线鉴别具体的基因型。当仅FAM通道有扩增信号时，kdr基因不含有突变位点，为TTG纯合野生型；当仅VIC/HEX通道有扩增信号时，kdr基因存在L1014F突变位点，为TTT纯合突变型；当仅CY5通道有扩增信号时，kdr基因存在L1014C突变位点，为TGT纯合突变型；当FAM、VIC/HEX和CY5通道中任意两个通道有扩增信号时，kdr基因为突变子（野生突变杂合型或突变杂合型），即当FAM和VIC/HEX通道均有扩增信号，而CY5通道无扩增信号时，kdr基因为TTG/TTT野生突变杂合型，当FAM和CY5通道均有扩增信号，而VIC/HEX通道无扩增信号时，kdr基因为TTG/TGT野生突变杂合型，当VIC/HEX和CY5通道均有扩增信号，而FAM通道无扩增信号时，kdr基因为TTT/TGT突变杂合型。 [0051] 实施例4中华按蚊现场样本的Allglo探针实时荧光定量PCR检测 [0052] 140只中华按蚊现场检测样本来自江苏泗洪、南京六合现场捕获成蚊。上述每只按蚊取一条蚊腿，用实施例1～实施例3所述方法进行Allglo实时荧光定量PCR扩增，同时设置无模板阴性对照（NTC），扩增结束，结合扩增曲线对检测结果进行分析和判读，分型鉴定结果参见表1，其中，TTG野生纯合型、TTT突变纯合型、TGT突变纯合型、TTG/TTT野生突变杂合型、TTG/TGT野生突变杂合型以及TTT/TGT突变杂合型kdr基因的荧光定量PCR扩增曲线分别参见图2～图7。 [0053] 对比例1中华按蚊现场样本的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测 [0054] 用Fast Tissue-to-PCR Kit中华按蚊gDNA提取试剂盒提取上述140只中华按蚊基因组DNA，提取步骤如下：取1～3条中华按蚊蚊腿置于1.5ml离心管中，加入100μl蛋白酶K，使组织完全浸没于液下，55℃孵育10min，95℃孵育3min，加入100μl Neutralization液，混合均匀，于8000g离心3min，吸取上清液贮存于新离心管中备用。 [0055] 根据中华按蚊钠离子通道蛋白（VGSC）基因序列（Genbank登录号：GI84646709）及其L1014位点的常见突变类型（H Kim,JH Baek,WJ Lee,et al.Frequency detection of pyrethroid resistance allele in Anopheles sinensis populations by real-time PCR amplification of specific allele(rtPASA)[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2007,87(1):54-61.），设计一对实时荧光定量PCR扩增引物和3条探针，上游引物和下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，TaqMan-MGB探针kdr-TTG（野生型）、TaqMan-MGB探针kdr-TTT（L1014F突变）以及TaqMan-MGB探针kdr-TGT（L1014C突变）核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，3条探针的5'端分别采用FAM、HEX和NED标记，3'端采用MGB修饰。引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成，TaqMan-MGB探针由上海基康生物科技公司合成。 [0056] TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系：总反应体系10μl，其中Thermo Scientific Maxima Probe qPCR Master Mix（2×）5μl，引物浓度500nmol/L，TaqMan-MGB探针浓度500nmol/L，DNA模板2μl，置于Roche Lightcycler480II进行PCR扩增。 [0057] TaqMan探针实时荧光定量PCR反应条件：采用两步法，即50℃2min，95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；40℃冷却10s；在60℃退火时采集信号。 [0058] 分别选用FAM通道（检测kdr-TTG探针）和VIC/HEX通道（检测kdr-TTT和kdr-TGT探针）鉴别kdr基因L1014位点野生型和突变型。分型鉴定结果参见表1。 [0059] 另取上述按蚊蚊腿共140条，分别提取基因组DNA（提取方法同上），采用PCR扩增kdr基因（具体方法参见如下文献：D.Zhong，X.Chang，G.Zhou，et al.．Relationship between Knockdown Resistance,Metabolic Detoxification and Organismal Resistance to Pyrethroids in Anopheles sinensis[J]．PLoS One，2013，8（2）：e55475），交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，根据测序结果进行kdr基因分型鉴定，将实施例4和对比例1分型鉴定结果与之进行比对，结果参见表1。 [0060] 表1TaqMan和Allglo荧光定量分型鉴定结果比对 [0061] [0062] 由表1数据可知，本发明Allglo荧光定量PCR检测结果与测序结果完全符合，而TaqMan荧光定量PCR检测出现3个样本错检，可见本发明Allglo荧光定量PCR检测准确性高于TaqMan荧光定量PCR检测。 [0063] 上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其它改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。