德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法

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德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法
申请号	CN201910186062.9	申请日	2019-03-12	公开(公告)号	CN109750111A	公开(公告)日	2019-05-14
申请人	中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心;			发明人	谭伟龙; 艾乐乐; 吕恒; 杨庆贵; 吕瑞辰; 杨露; 朱长强; 胡丹; 丁晨曦;
摘要	本发明公开了德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。并公开了其蛋白及鉴定引物和鉴定方法。本发明以一对引物扩增德国小蠊相关抗性基因突变的基因片段并进行测序，通过四引物ARMS-PCR法鉴定德国小蠊抗性基因。本发明可以广泛应用于德国小蠊抗性基因突变的鉴定需求及相应的科研领域。
权利要求	1.德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其特征在于：德国小蠊的钠离子通道基因的1059位密码子由GAT突变为AAA。 2.根据权利要求1所述的德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。 3.德国小蠊击倒抗性相关突变蛋白，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。 4.德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定引物，包括如下两个引物对：引物对1：F1:5′-AGCAACTTTGGTTCATCCAATCT-3′R1:5′-GTGCCAAATTAACCAATCAGATATCCGAT-3′引物对2：F2:5'-TGGGCATCTGGCGTCTGTTT-3′R2:5'-TCCTTATGGCTGTCATCCTTGTAT-3′。 5.权利要求4所述的引物在快速鉴定德国小蠊击倒抗性相关突变基因中的应用。 6.一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定方法，其特征为：采用权利要求4所述的两个引物对，利用四引物ARMS-PCR技术检测德国小蠊钠离子通道抗性基因突变(GAT-AAA)，通过PCR反应和常规电泳技术，检测出该突变位点的三种基因型。 7.根据权利要求6所述的德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定方法，其特征在于：所述ARMS-PCR扩增PCR反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5μl、dNTP Mixture(2.5mM)2μl、20μmol/L的引物F2、R1各1μl、20μmol/L的引物F1、R2各0.5μl、cDNA模板1μl、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5μl，由双蒸水补足至25μL。
说明书全文	德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法技术领域 [0001] 本发明涉及一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因、蛋白及鉴定引物和鉴定方法，属于生物技术领域。背景技术 [0002] 德国小蠊是分布最广泛，也是最难治理的一类世界性家居卫生害虫。德国小蠊的繁殖速度比一般蟑螂要快数千倍，在适宜条件下，一只雌虫一年可以繁殖4代左右，经过半个月左右其虫卵即可孵化成长为成虫，群体数量比一般蟑螂多几倍乃至几千倍。德国小蠊的生活习性与一般蟑螂相似，喜在宾馆、酒店的中西厨房、酒吧、餐厅、包房等场所活动。与蟑螂的危害相类似，德国小蠊会损坏食品、家具、纺织衣物、纸张等日常生活用品，并且在活动其间会将大量有害物质及致病病原传播到人们的食品及用具中，对人们的生命健康造成危害。当人类接触其污染过的食品以及生活用品后，还可能引发人体感染过敏、诱发哮喘和过敏性鼻炎等。除此之外，德国小蠊能够携带多种病原微生物，包括伤寒杆菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、霉菌病毒以及寄生虫卵等，可以造成各种传染病的流行。为了降低德国小蠊给人们生活工作和身体健康带来的影响与危害，目前国内外均主要采用各类化学杀虫剂对其进行杀灭，然而由于杀虫剂的滥用和误用以及德国小蠊较快的生活世代，造成德国小蠊抗药性的问题日益严重。 [0003] 研究表明德国小蠊对氯氰菊酯、胺菊酯、氯菊酯、右旋反式氯丙炔菊酯等均产生了不同程度抗性。为了深入认识其抗性的产生机理并指导杀虫剂的合理使用，因此开展关于德国小蠊抗药性机理的研究。针对德国小蠊的抗性机理研究表明，其抗药性产生的机理主要可分为四类，行为抗性、靶标抗性、代谢抗性和表皮穿透速率降低。昆虫的钠离子通道基因点突变导致了靶标抗性，是德国小蠊对菊酯类杀虫剂产生抗性的最重要机制，会带来较强的抗性，且与抗性表型连锁，因此监测突变基因的频率可以监测抗性表型。我们在实验室内通过药膜接触法筛选出了具有抗性表型的德国小蠊，并扩增了其钠离子通道基因片段，测序后将得到的核酸序列与德国小蠊敏感品系的相应序列进行比对,发现在其钠离子通道ⅡS4-ⅡS6结构域的1059位密码子存在突变, 由GAT突变为AAA，导致该位点氨基酸由天冬氨酸突变为赖氨酸，表明该品系的抗性表型可能与击倒抗性(kdr)有关。本实验建立一种四引物ARMS-PCR 检测技术，针对该抗性突变(D1059K)，检测该突变的存在与否。四引物扩增抗拒突变系统PCR(四引物ARMS-PCR)是一种简便快捷的检测方法，其原理是利用引物3’末端碱基互补性来控制引物的延伸，针对目标碱基突变位点设计一对延伸方向相反的内因物，使其3’末端碱基正好位于突变位点，并分别与该位点的两种基因型互补，再搭配一对延伸方向相对的外引物(包含突变位点且两条引物距离突变位点的距离差距足够大)，将两对引物按恰当比例混合后加入同一扩增反应，根据扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果可直接判断突变位点的有无与突变状态。发明内容 [0004] 1、发明目的。 [0005] 本发明提出了一种德国小蠊击倒抗性相关新型突变基因和蛋白的序列，以及相关的鉴定方法和鉴定引物。 [0006] 2、本发明所采用的技术方案。 [0007] 一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因，德国小蠊的钠离子通道基因的 1059位密码子由GAT突变为AAA。 [0008] 优选的，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。 [0009] 一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。 [0010] 通过测序比对发现第1059位密码子由GAT突变为AAA，导致该位点氨基酸由天冬氨酸突变为赖氨酸(D1059K)。 [0011] 本发明公开了德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定引物，包括如下四个引物： [0012] 引物对1：F1:5′-AGCAACTTTGGTTCATCCAATCT-3′ [0013] R1:5′-GTGCCAAATTAACCAATCAGATATCCGAT-3′ [0014] 引物对2：F2:5'-TGGGCATCTGGCGTCTGTTT-3′ [0015] R2:5'-TCCTTATGGCTGTCATCCTTGTAT-3′ [0016] 并公开了上述的引物在快速鉴定德国小蠊击倒抗性相关突变基因中的应用。 [0017] 本发明还公开了一种德国小蠊击倒抗性相关突变基因的鉴定方法，其特征为：采用上述的四引物，利用四引物ARMS-PCR技术检测SNP，通过PCR反应和常规电泳技术，检测出击倒抗性相关基因突变的三种基因型，具体为：突变纯合子为两条条带(515bp和162bp)，突变杂合子为三条条带(515bp、162bp 和353bp)，不含有该突变位点则为515bp和353bp两条条带。 [0018] 建议的反应体系，所述ARMS-PCR扩增PCR反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5μl、dNTP Mixture(2.5mM)2μl、20μmol/L的引物F2、R1各1μl、 20μmol/L的引物F1、R2各0.5μl、cDNA模板1μl、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5μl，由双蒸水补足至25μL。 [0019] 3、本发明所产生的技术效果。 [0020] 本发明公布了德国小蠊钠离子通道因中的一种新型的基因突变位点(GAT-AAA,1059),该突变位点的存在与德国小蠊对于拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性密切相关，增强了德国小蠊的抗性。因此针对该突变位点我们建立了一种简单、便捷的德国小蠊kdr突变等位基因检测方法，即四引物ARMS-PCR 技术。针对该基因突变位点设计了两对扩增引物，可以在一次PCR反应中，完成对德国小蠊kdr基因型的检测。使用该方法，仅需要提取单只德国小蠊的基因组，使用常规PCR仪器即可完成检测，检测快速准确，结果显示直观，可以迅速鉴定个体基因型。 [0021] 本发明可以广泛的应用于德国小蠊抗性基因的检测和筛查，为研究德国小蠊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性提供指导。附图说明 [0022] 图1为ARMS-PCR扩增体系示意图。 [0023] 图2为实施例1中对德国小蠊提取DNA后进行PCR反应的电泳图。 [0024] 图3为实施例1中对德国小蠊钠离子通道突变基因进行鉴定的电泳图。具体实施方式 [0025] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 [0026] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量 [0027] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 [0028] 实施例1：德国小蠊抗性基因突变及鉴定 [0029] (1)德国小蠊击倒时间测定：分别配制四种药物(高氯、98％氯菊酯、 95％胺菊酯、右旋反式氯丙炔菊酯，浓度0.4mg/ml)150ml，取配制好的药物15ml，用医用酒精定容至30ml，置于新取的纸杯中。将裁剪为50cm×40cm 的洁净纱布完全润湿，将纱布于室温条件下晾干(药物终浓度30mg/m2)。取德国小蠊(11只为一组)，利用培养皿将其反扣于已晾干的纱布之上，每隔2 分钟观察并记录德国小蠊击倒状况，并且及时取出击倒的德国小蠊，置于 1.5 ml EP管内。每种药物测两组，共测88只。 [0030] (2)测试过的德国小蠊(88只)利用日本TAKARA公司提供的DNA提取试剂盒按操作说明进行提取，提取后的DNA立即进行PCR反应。取测序引物用于第一步PCR：将合成好的引物BgF2和BgR溶于去离子水中(终浓度20 μmol/L)，保存于零下20摄氏度条件下备用。 [0031] 测序引物： [0032] BgF2 5′-TTGCACAATTTTCTGTTTGGATA-3′ [0033] BgR 3′-TCTGATCGGATATCTGATTGGTTA-5′； [0034] PCR扩增体系： [0035] 预制扩增反应MIX(Taq酶)45μl，上游引物1μl，下游引物1μl， DNA模板3μl。 [0036] PCR扩增参数： [0037] 94℃，3min；(94℃，30s；52℃，30s；72℃，1min)35；72℃， 5min。 [0038] (3)电泳与测序：扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后于紫外透射仪上观察结果，图2所示为部分扩增结果，将条带明亮无异且无杂带的产物送至华大基因进行测序。 [0039] (4)德国小蠊钠离子通道抗性基因测序结果：测序结果与NCBI数据库中数据进行BLAST比对，从中检测出了一个新型的基因突变位点，测序得到的片段如SEQ ID NO.3所示，88只德国小蠊中有10只含有该突变。 [0040] 德国小蠊钠离子通道基因第1059位密码子由GAT突变为AAA，导致该位点氨基酸由天冬氨酸突变为赖氨酸(D1059K)。 [0041] (5)针对突变基因位点设计引物，利用APMS-PCR技术鉴定突变位点： [0042] 引物对1：F1:5′-AGCAACTTTGGTTCATCCAATCT-3′ [0043] R1:5′-GTGCCAAATTAACCAATCAGATATCCGAT-3′ [0044] 引物对2：F2:5'-TGGGCATCTGGCGTCTGTTT-3′ [0045] R2:5'-TCCTTATGGCTGTCATCCTTGTAT-3′ [0046] 引物对1和引物对2用于APMS-PCR，将合成好的引物F1、R1和F2、R2 溶于去离子水中(终浓度20μmol/L)，保存于零下20摄氏度条件下备用。 [0047] ARMS-PCR扩增体系： [0048] 5×PrimeSTAR GXL Buffer 5μl；dNTP Mixture(2.5mM)2μl；内引物(F2、R1)1μl；外引物(F1、R2)0.5μl；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5μl；模板1μl；RNase-free H2O 13.5μl。 [0049] ARMS-PCR扩增参数： [0050] 98℃，10s；55℃，30s；68℃，1min/kb；共35个循环。 [0051] (6)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳结束后于紫外透射仪上观察结果。如图3所示，突变纯合子的扩增结果为两条条带(515bp和162bp)，突变杂合子为三条条带(515bp、162bp和353bp)，如果不含有该突变位点，则为515bp和353bp的两条条带。 [0052] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。