细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用

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细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用
申请号	CN201510099629.0	申请日	2015-03-07	公开(公告)号	CN104770372A	公开(公告)日	2015-07-15
申请人	安徽农业大学;			发明人	花日茂; 吕培; 付稳; 吴祥为; 史陶中; 李湘琼; 柏钰; 马鑫; 操海群;
摘要	本发明分开了细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用。所述细交链孢菌酮酸的结构式为：其分子式为C10H15NO3，分子量为197；所述细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。经鉴定及生物活性实验证明，细交链孢菌酮酸对苹果腐烂病菌、茄褐纹病菌、梨黑星病菌均具有显著的抑菌活性。在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌、梨黑星病菌和苹果腐烂病菌的抑制率分别为95.9%、77.6%、100.0%，显示了其开发为微生物源杀菌剂的潜力。
权利要求	1.细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用，所述细交链孢菌酮酸的结构式为：其分子式为C10H15NO3 ，分子量为197；其特征在于：细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。 2.根据权利要求1所述的细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用，其特征在于，所述植物病原菌为苹果腐烂病菌或茄褐纹病菌或梨黑星病菌。
说明书全文	细交链孢菌酮酸在制备微生物源杀菌剂中的应用技术领域 [0001] 本发明属于微生物农药领域，具体涉及绣线菊内生真菌发酵代谢物中分离的抑菌活性物质及其应用前景。背景技术 [0002] 以微生物的代谢产物或者从微生物中分离得到的活性物质开发生物源农药是新农药创制的研究热点和方向之一。例如具有杀虫活性的阿维菌素、具有杀菌活性的井冈霉素和具有除草活性的双丙氨膦（Bialaphos，链霉菌产生）等。 [0003] 细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid）最初是在1957年Rosett等从Alternaria tenuis培养滤液中分离得到，结构由Stickings于1959年确定。其后，在 A. longipes，A. linicola，A. brassicicola，A. RaphaniAspergillus，sp.，Pyricularia oryzae，Phoma sorghina中都有人分离得到该物质。 [0004] 关于细交链孢菌酮酸，是链格孢菌（Alternania）分泌的一种毒素，具有一定的抗肿瘤、抗病毒及除草活性，也作为一种除草剂的先导引起人们的广泛关注。强胜等人报道了其对杂草致病性的广谱性和对某些作物的安全性，显示了其开发为微生物源除草剂的潜力；秦建春等人报道了其对虾卵Brine shrimp致死生测，显示了较高的细胞毒活性性。但是，目前没有人报道其对植物病原菌的抑制作用。发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供一种绣线菊内生真菌发酵物中分离鉴定出抑菌活性物质---细交链孢菌酮酸，该物质具有抑制植物病原菌的活性，在制备微生物源杀菌剂中的应用。 [0006] 本发明绣线菊内生真菌发酵物中分离鉴定出抑菌活性物质---细交链孢菌酮酸，其结构式为：分子式为C10H15NO3 ，分子量为197。 [0007] 经申请人所进行的鉴定及生物活性实验证明，细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌、梨黑星病菌和苹果腐烂病菌的抑制率分别为95.9%、77.6%、100.0%，显示了其开发为微生物源杀菌剂的潜力。附图说明 [0008] 图1是细交链孢菌酮酸在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌的菌丝抑制实验图。 [0009] 图2为细交链孢菌酮酸在100μg/mL浓度下对梨黑星病菌的菌丝抑制实验图。 [0010] 图3为细交链孢菌酮酸在100μg/mL浓度下对苹果腐烂病菌的菌丝抑制实验图。 [0011] 图4是细交链孢菌酮酸核磁共振1H NMR谱图。 [0012] 图5是细交链孢菌酮酸核磁共振13C NMR谱图。 [0013] 图6是细交链孢菌酮酸核磁共振H-H COSY谱图。 [0014] 图7是细交链孢菌酮酸核磁共振HSQC谱图。 [0015] 图8是细交链孢菌酮酸高分辨质谱图。 [0016] 本发明所述细交链孢菌酮酸的抗菌试验如下：1.植物病原真菌苹果腐烂病菌，茄褐纹病菌，梨黑星病菌； 2.病原微生物的培养用接种针挑取少量病原菌的斜面培养物，分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在（28±1）℃恒温箱中培养5天； 3.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性在100 mL的无菌三角瓶中，配制含有抑菌活性物质的无菌混合培养基（最终浓度为100 μg/mL），取10mL置于直径为9 cm无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入供试病原菌菌饼（直径为6 mm），菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1 ℃培养 48-96 h。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：。 [0017] 表1是抑菌活性物质在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌、梨黑星病菌和苹果腐烂病菌的菌丝抑制实验数据；由图1可见，细交链孢菌酮酸对茄褐纹病菌的抑制作用；由图2可见，细交链孢菌酮酸对梨黑星病菌的抑制作用；由图3可见，细交链孢菌酮酸对苹果腐烂病菌的抑制作用。具体实施方式 [0018] 1、抑菌活性物质提取分离：1）绣线菊内生真菌XXB07在28℃,160r/min摇床中发酵培养5天，发酵液通过抽滤得到发酵滤液； 2）将发酵滤液用正丁醇萃取3次，合并正丁醇相， 60℃减压浓缩得到正丁醇萃取物； 3）正丁醇萃取物通过2次硅胶柱层，薄层色谱以及HPLC指导收集具有抑菌活性的馏分； 4) 上述抑菌活性馏分合并，高压制备液相收集抑菌活性物质。 [0019] 2、抑菌活性物质抗菌实验：1) 培养植物病原微生物用接种针挑取少量苹果腐烂病菌、茄褐纹病菌、梨黑星病菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在（28±1）℃恒温箱中培养5天； 2）抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性在100 mL的无菌三角瓶中配制含有抑菌活性物质的无菌混合培养基（最终浓度为100 μg/mL），取10mL置于直径为9 cm无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入供试病原菌菌饼（直径为6 mm），菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1 ℃培养 48-96 h。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：。 [0020] 3.化合物鉴定：对分离得到的抑菌活性物质进行质谱、核磁共振氢谱和碳谱、以及二维核磁共振分析，见图4-8。查阅参考文献，综合分析得到的数据和谱学特征，最后经过多个数据库进行查新，该化合物为细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid），其结构为：由核磁共振谱和高分辨质谱得出的分子式为C10H15NO3，分子量为197。由抗菌实验证明：细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。