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首页 / 专利库 / 苹果黑星病 / 一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法

一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法
申请号 CN202311516904.5 申请日 2023-11-15 公开(公告)号 CN117551804A 公开(公告)日 2024-02-13
申请人 西北农林科技大学; 西安黄氏生物工程有限公司; 发明人 胡小平; 黄颖琪; 王强; 秦君; 黄卫利;
摘要 本发明适用于植物病原菌检测方法技术领域，提供了一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法，检测苹果黑星病菌的RPA引物及CRISPR/Cas12a引物；检测苹果黑星病菌的试剂盒，包含上述引物、Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶以及Cas12/13专用核酸检测试纸条。检测方法包括：利用RPA扩增产物、体外转录合成的指导RNA和FB探针建立CRISPR/Cas12a检测反应体系；反应结束后将Cas12/13专用核酸检测试纸条插入到反应管中，观察试纸条上检测线的变化；若在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应，证明含有苹果黑星病菌。本发明特异性强、灵敏度高、结果准确且实用性高。
权利要求

1.一种检测苹果黑星病菌的RPA引物及CRISPR/Cas12a引物。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述RPA的上游引物RPA‑F如SEQ ID No.1所示，RPA的下游引物RPA‑R如SEQ ID No.2所示，CRISPR/Cas12a的指导RNA引物如SEQ ID No.3所示。

3.一种检测苹果黑星病菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶以及Cas12/13专用核酸检测试纸条。

5.一种检测苹果黑星病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、利用RPA扩增产物、体外转录合成的指导RNA和FB探针建立CRISPR/Cas12a检测反应体系；

60μL的CRISPR/Cas12a检测反应体系包括以下成分：

10×NEB CutSmart Buffer:6μL；

Cas12a(1μM):6μL；

指导RNA(300nM):18μL；

FB探针(1μM):2μL；

RPA反应产物:2μL；

无酶水:26μL；

步骤S2、反应结束后将Cas12/13专用核酸检测试纸条插入到反应管中，观察试纸条上检测线的变化；若在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应，证明含有苹果黑星病菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，CRISPR/Cas12a检测反应体系的反应条件为：在37℃下反应20‑30min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，试纸条插入到反应管中的检测时间为2‑3min。
说明书全文

一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物病原菌检测方法技术领域，尤其涉及一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法。

背景技术

[0002] 苹果黑星病(Apple Scab)是由苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)引起的一种真菌病害，可危害苹果的叶片、叶柄、枝条、芽鳞、花器和果实，造成严重的经济损失。除苹果外，该病还可以侵染苹果属中山楂(Crataegus spp.)、花楸(Sorbus spp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、火棘(Pyracantha spp.)、花红(Malus asiatica Nakai)、小苹果(Malus spp.)等。
[0003] 苹果黑星病菌属于中高等级风险的病原菌，在我国具有较高的扩散风险。因此，研发苹果黑星病菌的快速检测鉴定技术体系对我国苹果产业发展意义重大。为此我们提出一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种检测苹果黑星病菌的引物、试剂盒及其检测方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 一种检测苹果黑星病菌的RPA引物及CRISPR/Cas12a引物。
[0007] 进一步的，所述RPA的上游引物RPA‑F如SEQ ID No.1所示，RPA的下游引物RPA‑R如SEQ ID No.2所示，CRISPR/Cas12a的指导RNA引物如SEQ ID No.3所示。
[0008] 一种检测苹果黑星病菌的试剂盒，包含上述引物。
[0009] 进一步的，还包括Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶以及Cas12/13专用核酸检测试纸条。
[0010] 一种检测苹果黑星病菌的方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤S1、利用RPA扩增产物、体外转录合成的指导RNA和FB探针建立CRISPR/Cas12a检测反应体系；
[0012] 60μL的CRISPR/Cas12a检测反应体系包括以下成分：
[0013] 10×NEB CutSmart Buffer:6μL；
[0014] Cas12a(1μM):6μL；
[0015] 指导RNA(300nM):18μL；
[0016] FB探针(1μM):2μL；
[0017] RPA反应产物:2μL；
[0018] 无酶水:26μL；
[0019] 步骤S2、反应结束后将Cas12/13专用核酸检测试纸条插入到反应管中，观察试纸条上检测线的变化；若在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应，证明含有苹果黑星病菌。
[0020] 进一步的，所述步骤S1中，CRISPR/Cas12a检测反应体系的反应条件为：在37℃下反应20‑30min。
[0021] 进一步的，所述步骤S2中，试纸条插入到反应管中的检测时间为2‑3min。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023] 1、特异性强。本发明通过在antiSMASH上预测了苹果黑星病菌次级代谢产物基因，选择SM6.1‑NRPS基因作为检测靶标，从其相对保守区域获得苹果黑星病菌的特异性区间以及特异性靶标位置，可实现苹果黑星病菌的精准、快速鉴定。
[0024] 2、灵敏度高。本发明对苹果黑星病菌的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至0.001fg/uL。
[0025] 3、结果准确。本发明通过RPA引物扩增、Cas12a‑指导RNA的靶定裂解双层保障，确保检测结果的准确性和可靠性。
[0026] 4、实用性高。本发明通过一次合成体外指导RNA，即可长期使用，且整个检测技术方法只需要在恒温(37℃)条件下进行短时间反应，不需要成本较高的仪器设备，结果可直接通过试纸条反应来判断，整个检测流程小于1h，能够快速准确地检测出病原菌，可用于苹果黑星病菌的早期田间鉴定。

附图说明

[0027] 图1为本发明中实施例2的测试结果图。
[0028] 图2为本发明中实施例3的测试结果图。
[0029] 图3为本发明中实施例4的测试结果图。

具体实施方式

[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031] 以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
[0032] 本发明一个实施例提供的一种检测苹果黑星病菌的RPA引物及CRISPR/Cas12a引物。
[0033] 作为本发明的一种优选实施例，所述RPA的上游引物RPA‑F如SEQ IDNo.1所示：
[0034] 5’‑GGGCCATGACCATCTCAACGTATGCCAATACCG‑3’；
[0035] RPA的下游引物RPA‑R如SEQ ID No.2所示：
[0036] 5’‑GCGCCACACCTCGAACATAATCAAGTATGGACA‑3’；
[0037] CRISPR/Cas12a的指导RNA引物如SEQ ID No.3所示：
[0038] 5’‑AGTTCTCCCTGATAAAGTGGCGCATCTACACTTAGTAGAAATTA‑3’。
[0039] 在本发明实施例中，通用引物序列如SEQ ID No.4所示：
[0040] 5’‑TAATACGACTCACTTATAGGTAATTTCTACTAAGTGTAGAT‑3’。
[0041] 本发明一个实施例提供的一种检测苹果黑星病菌的方法，本发明基于RPA‑CRISPR/Cas12a的技术原理，根据GenBank数据库查找苹果黑星病菌的全基因组序列，在antiSMASH上预测了其次级代谢产物基因，选择SM6.1‑NRPS基因作为检测靶标，使用SnapGene软件在其相对保守的区域设计一对特异性RPA引物，使用SEQ ID NO.3序列和通用引物序列SEQ ID NO.4合成DNA模板，利用T7聚合酶体外转录合成指导RNA。其流程为：
[0042] 首先利用一对RPA引物对靶标DNA进行快速扩增，该过程通常需要10‑20min；随后以RPA反应为底物，利用Cas12a蛋白、体外合成指导RNA和FB探针进行裂解实验；将裂解后的反应液滴加到试纸条上，2‑3min后观察试纸条颜色的变化。如果在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应。具体为：
[0043] 1)利用待测样品DNA和两条RPA引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，建立RPA反应体系，进行靶标DNA的快速扩增，其反应体系如表1所示：
[0044] 表1
[0045]
[0046]
[0047] 将反应管放置在37℃条件下反应10‑20min；
[0048] 2)利用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对指导RNA的DNA模板进行扩增，其反应体系如表2所示：
[0049] 表2
[0050]
[0051] 反应条件如表3所示：
[0052] 表3
[0053]
[0054] 3)利用2)合成的DNA模板，体外转录合成指导RNA，其反应体系如表4所示：
[0055] 表4
[0056]
[0057]
[0058] 4)RPA‑CRISPR/Cas12a检测体系(探针修饰：5’‑异硫氰酸荧光素FITC和3’‑生物素biotin)如表5所示：
[0059] 表5
[0060]
[0061] 5)试纸条结果判读。反应结束后将试纸条插入到反应管中，2‑3min后观察试纸条测试线的颜色变化，如果测试线颜色变深，则为阳性反应。
[0062] 在37℃下反应20‑30min，反应结束后将Cas12/13专用核酸检测试纸条插入到反应管中，2‑3min后观察试纸条上检测线的变化，若在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应，证明含有苹果黑星病菌。
[0063] 本发明一个实施例提供的一种检测苹果黑星病菌的试剂盒，包含上述引物。
[0064] 作为本发明的一种优选实施例，还包括Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶、相应buffer体系以及Cas12/13专用核酸检测试纸条。
[0065] 实施例1、本发明一个实施例提供的一种检测苹果黑星病菌的方法，包括以下步骤：
[0066] 步骤A、引物设计和合成
[0067] 根据GeneBank数据库查找苹果黑星病菌的全基因组序列，在antiSMASH上预测了其次级代谢产物基因，选择SM6.1‑NRPS基因作为检测靶标，使用SnapGene软件在其相对保守的区域设计一对特异性RPA引物，引物分别为：
[0068] RPA‑F：5’‑GGGCCATGACCATCTCAACGTATGCCAATACCG‑3’
[0069] (SEQ ID NO.1)
[0070] RPA‑R：5’‑GCGCCACACCTCGAACATAATCAAGTATGGACA‑3’
[0071] (SEQ ID NO.2)
[0072] 将上述合成的引物，用灭菌双蒸水分别稀释为10μmol/L，将引物置于4℃冰箱避光保存备用。
[0073] 步骤B、指导RNA的合成
[0074] 根据步骤A中RPA扩增的特异性区间和CRISPR/Cas12a指导RNA的PAM模式(TTTN)，筛选～20nt靶标位点，并设计指导RNA引物如下：
[0075] crRNA：5’‑AGTTCTCCCTGATAAAGTGGCGCATCTACACTTAGTAG AAATTA‑3’(SEQ ID NO.3)
[0076] Univ：5’‑TAATACGACTCACTTATAGGTAATTTCTACTAAGTGTAGA T‑3’(SEQ ID NO.4)[0077] 1)crRNA的DNA模板合成，反应体系50μL，具体如下：
[0078] 10×Pfu Buffer：5μL；
[0079] 2.5mM的dNTP：4μL；
[0080] 10μM的SEQID3：2μL；
[0081] 10μM的SEQID4：2μL；
[0082] 4000U/mL的Pfu DNA聚合酶：0.25μL；
[0083] 无酶水：36.75μL；
[0084] 上述反应体系的最佳反应条件为：预变性94℃反应1min；变性94℃反应30s、退火56℃反应25s、延伸72℃反应35s，整个PCR第二步循环30次；最后72℃延伸2min。
[0085] 2)crRNA的体外合成，反应体系为20μL，具体如下：
[0086] crRNA的DNA模板：5μL；
[0087] 2000U/mL RNA酶抑制剂：1μL；
[0088] 10×Transcription Buffer：2μL；
[0089] 1000U/mL T7 RNA聚合酶：2μL；
[0090] 2.5mM的NTP：4μL；
[0091] 无酶水：6μL；
[0092] 上述体系最佳反应条件为：37℃反应1‑2h。
[0093] 步骤C、苹果黑星病菌的RPA‑CRISPR/Cas12a检测
[0094] 1)待测苹果黑星病菌的基因组DNA的提取
[0095] 取适量的待测样品放入2mL离心管中，并加入600μL的DNA裂解液(0.1M Tris‑HCl，50mM EDTA,0.5M NaCl,5mM SDS,pH 7.0)，加入两颗直径大小为5mm的小钢珠，40Hz震荡
30s，15000rpm离心5min，取上清并使用无水乙醇沉淀，12000rpm离心10min，移除上清液，加入100μL无酶水，得到基因组DNA的提取物。
[0096] 2)RPA反应体系为50μL，具体如下：
[0097] RPA缓冲液：25μL；
[0098] 10μM的SEQID1：2μL；
[0099] 10μM的SEQID2：2μL；
[0100] RPA反应酶：3μL；
[0101] 待测样品DNA：1μL；
[0102] 无酶水：17μL；
[0103] 上述体系最佳反应条件为：37℃反应10‑20min。
[0104] 3)CRISPR/Cas12a反应体系为60μL，具体如下：
[0105] 10×NEB CutSmart Buffer：6μL；
[0106] 1μM的Cas12a：6μL；
[0107] 300nM的指导RNA：18μL；
[0108] 1μM的FB探针：2μL；
[0109] RPA反应产物：2μL；
[0110] 无酶水：26μL；
[0111] FB探针：5’FAM‑TTATTAAT‑3’Bio；
[0112] 上述体系最佳反应条件为：37℃反应15‑30min。
[0113] 4)检测结果的分析与判断
[0114] CRISPR/Cas12a反应结束后将Cas12a专用试纸条插入到反应管中，2‑3min后观察试纸条测试线的颜色变化，如果测试线(T)和质控线(C)颜色变深，则为阳性反应；如果只有质控线变色，测试线处无颜色变化，则为阴性反应。
[0115] 实施例2、苹果黑星病菌的RPA‑CRISPR/Cas12a的特异性测试
[0116] 按照上述步骤C中RPA‑CRISPR/Cas12a的检测方法，依次对4种苹果常见病原菌苹果腐烂病菌(Valsa  mali)、苹果褐斑病菌(Diplocarpon  mali)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)和苹果黑星病菌(Erwinia amylovora)，1种外源病原菌假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)和苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)进行检测，同时以清水为阴性对照。
[0117] 测试结果：如图1所示，只有苹果黑星病菌的样品出现阳性反应，其它苹果常见病原菌、假禾谷镰刀菌和清水对照均为阴性反应。该结果说明本发明提供的引物及方法对苹果黑星病菌具有很高的特异性，能很好地将其与其他苹果病原菌区分。
[0118] 实施例3、苹果黑星病菌的RPA‑CRISPR/Cas12a的灵敏性测试
[0119] 按照上述步骤C中RPA‑CRISPR/Cas12a的检测方法，将待测苹果黑星病菌的基因组拷贝数依次稀释到1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg和0.001fg每μL，分别以其为模板进行RPA‑CRISPR/Cas12a反应，每个反应中加入2μL DNA模板。
[0120] 测试结果：如图2所示，样品1pg‑0.001fg反应结果都为阳性，该结果说明本发明对苹果黑星病菌基因组的极限检测拷贝数低至0.001fg/uL，灵敏度极高。
[0121] 实施例4、RPA‑CRISPR/Cas12a技术在检测实际带菌样品的应用
[0122] 将6份带有苹果黑星病菌的苹果叶片分别作为待测样品，且以健康苹果叶片为对照。
[0123] 测试结果：如图3所示，6个待测样品的检测均显示阳性反应，在试纸条的测试条带处出现颜色变化，而健康苹果样品显示阴性反应。该结果说明本发明对苹果黑星病菌具有较好的检测效果，可在复杂样品中快速、准确地检测病原菌，具有较好的应用前景。
[0124] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

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