[0001] 本发明涉及植物病理学领域，具体地说，涉及梨黑星病抗性的离体鉴定方法。

[0002] 梨黑星病(Venturia nashicola，Venturia pirina)又称疮痂病，是梨种植地区普遍发生的一种病害。梨黑星菌，属于子囊菌纲(Ascomycetes)，座囊菌目(Dothideals)，多孢菌科(Pleosporaceae)，黑星菌属(Venturia de Not)。梨黑星菌分为两大类V.nashicola和V.pirina，其中V.pirina以洋梨为寄主，V.nashicola以日本梨和中国梨为寄主。梨黑星病主要侵染梨树的绿色幼嫩组织，包括花序、叶片、叶柄、新梢、芽鳞及果实等，其中以叶片、果实为主。梨黑星病侵染的最典型症状是在病部产生明显的黑色霉层，呈鸡爪形状，又有黑霉病之称。叶片受害多发生在叶背，病部先呈现黄色，随后长出黑色霉斑，叶片正面呈现多角形或圆形褪绿黄斑，严重时，叶片正反面都长满黑色霉层，致使叶片干枯脱落。叶柄受害时，会产生圆形或长条状霉斑造成落叶。嫩梢发病时，除形成条状霉斑外，后期皮层龟裂，呈粗皮状的疮痂状。果实受害时，初期呈现淡黄色斑点，随后逐渐扩大长出黑霉层，严重时病部凹陷木栓化，停止生长呈畸形，易脱落。

[0003] 目前对梨黑星病的防治主要是化学防治，化学防治成本高、效率低、能够引起病菌生理小种的变异且容易造成环境污染，解决这种困境的方法是培育抗病品种，而培育抗病品种的关键是早期的抗病性评价。目前对抗病性的评价方法多采用分生孢子田间接种，田间接种首先是过程繁琐，包括喷施杀菌剂、套袋等，其次是或多或少会受到环境条件的影响，另外对病原需求量大。

[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种在梨离体叶片上接种梨黑星病菌的方法，从而评价品种的抗病性。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明的一种梨黑星病抗性的离体鉴定方法，从梨树上取旺盛生长的新梢顶部起第三片叶，置于铺有湿毛巾的托盘上，叶片背面向上，向叶片背面喷4
布浓度为5×10 个孢子/ml的梨黑星菌(Venturia de Not)的分生孢子液至淋湿，接种后套上塑料袋密封保湿，置于25℃人工气候箱中，15天后根据发病情况鉴定出抗病品种。

[0006] 本发明提供的梨黑星病抗性的离体鉴定方法，是将梨整个叶片上都喷布分生孢子液至淋湿，旨在获得在梨叶片离体状态下接种梨黑星病菌后的病情指数，如果这个病情指数比较接近于田间接种的结果，即为期望获得的比较准确的离体接种方法。

[0007] 本发明方法是利用梨的离体叶片在室内进行接种鉴定，通过严格控制接种条件并置于人工气候箱中培养，使环境条件带来的影响降至最低，并且省去了喷施杀菌剂和套袋等一系列步骤，操作过程简单，能够快速、高效、准确地完成对较大群体的梨黑星病抗病性的离体评价，而对其抗病性遗传规律进行分析，极具实用意义。

[0008] 图1为鸭梨×03-04-034杂交后代群体病斑面积/叶片面积次数分布图。

[0009] 图2为鸭梨×03-08-080杂交后代群体病斑面积/叶片面积次数分布图。

[0010] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0011] 实施例1梨黑星病抗性的离体鉴定方法

[0012] 1.1离体梨叶片上接种梨黑星病菌的方法，包括如下步骤：

[0013] 1.1.1材料采用抗病优系03-04-034、03-08-080，高感品种鸭梨、京白梨及中抗品种雪花梨，旺盛生长中新梢的第3片叶，其中03-04-034是从京白梨×鸭梨杂交群体中筛选出来的高抗黑星病的优系，03-08-080是从鸭梨×京白梨杂交群体中筛选出来的高抗黑星病的优系，鸭梨、京白梨、雪花梨是中国传统的名优品种。

[0014] 1.1.2采用完全试验设计，设置2个因素：温度和菌种形态；其中温度设置4个水3
平：20℃、25℃、30℃、35℃；菌种形态设置6个水平：菌丝、菌饼、分生孢子液浓度为5×10
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个孢子/ml、分生孢子液浓度为5×10 个孢子/ml、分生孢子液浓度为5×10 个孢子/ml，
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分生孢子液浓度为5×10 个孢子/ml。

[0015] 1.1.3梨黑星病菌(Venturia de Not)分生孢子液是从昌黎果树研究所田间自然发病的梨树叶片上分离得到的梨黑星病菌的分生孢子配制而成。2011年7月10日，从京白梨和鸭梨正反交群体中采集带有大块典型黑星病斑的叶片，用400ml蒸馏水洗涤病斑部位直至蒸馏水变成黑色，在显微镜下观察，确定其为梨黑星病菌分生孢子，分生孢子活性采用Catherine和Steve(2006)的方法测定，培养基采用PDA。最后用蒸馏水稀释至浓度为4
5×10 个孢子/ml，使用血球计数板检测分生孢子浓度，保存于0.1％蔗糖溶液中。将取自田间的分生孢子用PDA培养基纯化培养。菌丝接种方法是用接种针从培养基上直接挑取菌丝接种于叶片上；菌饼接种方法，是将菌丝连同培养基用打孔器打成直径为1cm的圆形小饼，将带菌丝的一面与叶片接触接种；分生孢子接种，则是将分生孢子配成不同浓度的分生孢子液，喷雾接种。

[0016] 1.1.4从梨树上取旺盛生长的新梢的从顶部起第三片嫩叶叶片，立即置于铺有湿毛巾的托盘上，叶片背面朝上，接种之后套上塑料袋密封保湿，置于不同温度的人工气候箱中。每份材料重复3次，每次重复3片叶。15天后调查发病情况。以田间接种结果作为对照，接种结果接近于田间对照的即是较好的离体接种方法。

[0017] 田间接种方法：选取生长势一致的2年生抗病优系及其高感姊妹系幼树，幼树均以杜梨为基砧，设3个重复，每个重复3株，每株选取叶片10片进行接种鉴定。试验材料正常管理，接种病原之后不再喷施杀菌剂。用于接种的分生孢子采自京白梨和鸭梨的正反交群体发病叶片。2011年7月10日，从京白梨和鸭梨正反交群体中采集带有大块典型黑星病斑的叶片，用400ml蒸馏水洗涤病斑部位直至蒸馏水变成黑色，在显微镜下观察，确定其为梨黑星病菌分生孢子，分生孢子活性采用Catherine和Steve(2006)的方法测定，培养基采4
用PDA。最后用蒸馏水稀释至浓度为5×10 个孢子/ml，分生孢子浓度使用血球计数板检测，保存于0.1％蔗糖溶液中。选取旺盛生长的新稍顶部第三片叶进行接种，接种时叶片背面用高压喷雾器喷雾至淋湿但不滴下。接种1个月后调查病情指数。评价标准如下：

[0018] 0级 无病斑

[0019] 1级 病斑占叶面积10％以下

[0020] 3级 病斑占叶面积11％-25％

[0021] 5级 病斑占叶面积26％-40％

[0022] 7级 病斑占叶面积41％-65％

[0023] 9级 病斑占叶面积65％以上

[0024] 黑星病病情指数计算：

[0025]

[0026] 其中公式中：SI为叶片黑星病病情指数

[0027] xi为各级病叶代表级数

[0028] ni为各级病叶数

[0029] N为总叶数

[0030] 重复3次，计算平均值。根据病情指数，确定种质对梨黑星病的抗性。

[0031] 1.2结果：

[0032] 03-04-034、03-08-080、雪花梨、京白梨、鸭梨田间接种病情指数调查结果如表1所示。

[0033] 表1 03-04-034、03-08-080、雪花梨、京白梨、鸭梨田间接种病情指数[0034]

[0035] 从表1可以看出，03-04-034、03-08-080经接种鉴定，表现为不发病，是高抗表型，雪花梨病情指数39.56，是中抗表型；京白梨病情指数75.11，鸭梨病情指数77.33，均是高感表型。以这几份材料的田间接种为对照，筛选离体叶片的最佳接种方法。不同菌种形态不同温度条件下接种的病情指数如表2所示。

[0036] 表2 离体叶片不同菌种形态不同温度条件下病情指数

[0037]

[0038]

[0039] 从表2可以看出，在25℃条件下，分生孢子接种浓度5×104个孢子/ml时，03-04-034、03-08-080均不发病，表现高抗；雪花梨病情指数38.27，表现中抗；京白梨病情指数80.25，鸭梨病情指数82.72，均表现为高感，接种结果最接近于田间接种，能客观的体现田间接种的准确结果。因此，离体叶片接种较好的方法为：取旺盛生长新梢顶部起第三片
4
叶，立即置于铺有湿毛巾的托盘上，叶片背面朝上，在叶片背面喷施浓度为5×10 个孢子/ml的分生孢子液至淋湿，接种之后套上塑料袋密封保湿，置于25℃人工气候箱中。每份材料重复3次，每次重复3片叶，15天后调查发病情况。

[0040] 实施例2鸭梨×03-04-034后代群体梨黑星病抗性的离体鉴定方法[0041] 对鸭梨×03-04-034共2372株杂交后代进行抗黑星病性评价，方法如下：

[0042] 取旺盛生长新梢顶部起第三片叶，立即置于铺有湿毛巾的托盘上，叶片背面朝上，4
在叶片背面喷布浓度为5×10 个孢子/ml的分生孢子液至淋湿，接种之后套上塑料袋密封保湿，置于25℃人工气候箱中。每份材料重复3次，每次重复3片叶。15天后调查发病情况。

[0043] 结果：调查发现发病植株162株，感病植株2210株，抗感分离比1∶13.6，符合1∶15的分离比率。在2210株感病植株中，感病程度不同，用病斑面积/叶片面积来表示感病严重度，病斑面积/叶片面积呈二型分布(图1)。表明不发病与发病表型表现为质量性状，而具有发病表现型的实生树，即发病表现型的严重度为数量性状。

[0044] 实施例3鸭梨03-08-080黑星病抗性的离体鉴定方法

[0045] 对鸭梨×03-08-080共1729株杂交后代进行抗黑星病性评价，方法如下：

[0046] 取旺盛生长新梢顶部起第三片叶，立即置于铺有湿毛巾的托盘上，叶片背面朝上，4
在叶片背面喷布浓度为5×10 个孢子/ml的分生孢子液至淋湿，接种之后套上塑料袋密封保湿，置于25℃人工气候箱中。每份材料重复3次，每次重复3片叶。15天后调查发病情况。

[0047] 结果：调查发现发病植株147株，感病植株1582株，抗感分离比1∶10.8，符合1∶15的分离比率。在1582株感病植株中，感病程度不同，用病斑面积/叶片面积来表示感病严重度，病斑面积/叶片面积呈二型分布(图2)。表明不发病与发病表型表现为质量性状，而具有发病表现型的实生树，即发病表现型的严重度为数量性状。

[0048] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。