一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法

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一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法
申请号	CN201510656407.4	申请日	2015-10-12	公开(公告)号	CN106566864A	公开(公告)日	2017-04-19
申请人	李保华; 青岛农业大学;			发明人	李保华; 练森; 董向丽; 王彩霞;
摘要	本发明公开了一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法，涉及梨黑星病菌子囊孢子的检测技术。本方法适用于检测梨黑星病越冬病叶上子囊孢子发育进度和可释放子囊孢子的数量。具体方法为：从落地的越冬病叶上切取完整的子实体，置于载玻片上，镜检子实体内容物，根据子实体内有无子囊和子囊孢子，及其所占比例可以推断子囊孢子的发育进度；从落地的越冬病叶上剪取有一定数量子实体的黑星病叶，粘贴在水琼脂上，激发成熟的子囊孢子释放，用载玻片收集子囊孢子，镜检子囊孢子的释放量，子囊孢子释放量代表了可释放子囊孢子的数量。本发明的优点在于：方法简洁，快速，结果可靠，为梨黑星病研究、病害监测预测和防治决策提供了一套简便而又可靠的检测技术，填补了梨黑星病研究与防治中无子囊孢子检测技术的空白。
权利要求	1.一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法，其特征在于：适用于检测落地的越冬病叶上梨黑星病菌子囊孢子的发育进度和可释放子囊孢子的数量；用带弧度的刀尖从检测样品上切取一定数量的子实体，置于载玻片上压破镜检，可检测子囊孢子的发育进度；从越冬病叶上剪取有一定数量假囊壳（小黑点）的病斑，粘贴在水琼脂平板上，促使成熟的子囊孢子释放，用载玻片收集释放的子囊孢子，镜检孢子数量，可推算越冬病叶上可释放子囊孢子的数量；具体过程包括取样、制作刀片、切取子实体、镜检子囊孢子发育进度、制作水琼脂平板、促使子囊孢子释放、收集子囊孢子、镜检子囊孢子数量等步骤；所述落地的越冬病叶是指前一年发生黑星病的梨树叶片，于10~11月份落到地面上，并在地面上越冬的叶片；落地病叶上的黑星病菌自3月份开始产生子囊孢子；所述子囊孢子的发育进度是指病菌在形成子囊孢子的发育过程中所处时期，由未发育假囊壳、已形成子囊的假囊壳、已形成子囊孢子的假囊壳和已释放子囊孢子的假囊壳四类子实体的相对比率表示；所述可释放子囊孢子是指已经发育成熟，遇水后能够弹射释放的子囊孢子；在果园中这些孢子遇雨水后能够释放，并随气流传播侵染梨树的叶片和果实；所述取样是指果园内和果园周边地面上随机捡取越冬的梨黑星病叶，由于子囊孢子的形成受环境影响较大，取样时尽量从不同的环境中取样；所述制作刀片是指制作切取子实体的特制刀片；取双面剃须刀片，从中间掰为两半，用火焰将一角烧红，再用剪刀从刀片中央向烧制一角斜剪，剪出刀尖就带有一定弧度，非常适合切取叶片表面的子实体；所述切取子实体是指带弧度的刀尖从待检测样品上切取的体积最大的子实体，每个叶片上2~20个，一般为10个，置于载玻片上压破，用于镜检；所述镜检子囊孢子发育进度是指在100倍的显微镜下检查子实体内容物，并根据内容物的有无和形态将子实体分成不同类别，统计各类子实体的相对比率，用各类子实体的相对比率表示子囊孢子的发育进度；所述制作水琼脂平板是指称取一定量琼脂粉，加入蒸馏水，并加热至沸腾，边加热边搅拌，使琼脂粉融化，倒入培养皿中，冷凝后制成水琼脂平板；水琼脂中琼脂粉的含量为 1~5%，常用浓度为1%；所述促使子囊孢子释放是指从越冬病叶上剪取有一定数量子实体的病斑，粘贴在水琼脂平板上，有子实体的一面背对琼脂平板，使成熟的子囊从水琼脂中吸水，膨胀后弹出子囊孢子；所述收集子囊孢子是指在病叶下放置干净在载玻片，距离病斑不超过0.5cm，收集从病叶上上弹射出来的子囊孢子，收集时间为病叶粘贴到琼脂板上开始计算，时间为2小时；所述镜检子囊孢子的数量是指在显微镜下检查记录着落到载玻片上所有子囊孢子的数量。 2.权利要求1所述的一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法，其特征是：从越冬病叶上切取一定数量的子实体，压破后镜检子实体内容物，根据子实体内容物，确定每个子实体所处发育阶段，统计所处不同发育阶段子实体的相对比率，确定子囊孢子群体的发育进度。 3.权利要求1所述的一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法，其特征是：从越冬病叶上剪取黑星病斑的病斑粘贴在水琼脂上，激发子囊孢子释放，用载玻片收集子囊孢子，镜检子囊孢子的释放量，根据子囊孢子释入量可推断可释放子囊孢子的数量。
说明书全文	一种快速检测梨黑星病菌子囊孢子的方法技术领域 [0001] 本发明涉及梨黑星病子囊孢子的检测技术，尤其适用于检测梨树落地病叶上子囊孢子的发育进度和可释放子囊孢子的数量。背景技术 [0002] 梨黑星病是梨树的主要病害。梨黑星病又称疮痂病，主要为害果实、叶片、幼梢等绿色幼嫩组织，造成落叶、落果、果实畸形等，流行年份损失巨大，感病品种损失高达60%以上。例如，2001年梨黑星病发病严重，安徽砀山县全县酥梨33％以上受其为害，直接损失近2.5亿kg。 [0003] 子囊孢子是梨黑星病菌的主要初侵染菌源。梨黑星病菌主要有两种越冬方式，一是以菌丝在病芽内越冬，次年梨树萌芽，越冬病菌产生分生孢子，随雨水传播侵染周围的果实和叶片；另一种越冬方式是以未成熟的假囊壳在落叶上越冬，次年梨树萌芽，假囊壳逐渐发育成熟，并释放子囊孢子，随气流传播侵染叶片和果实，引起初侵染。其中，子囊孢子造成的初侵染是导致梨黑星病后期流行的主要侵染菌源，在病害的流行中作用较大。 [0004] 子囊孢子的发育进度和形成数量受环境因子影响较大。梨黑星病菌主要以未成熟的子囊壳越冬，越冬后的发育进度和子囊孢子的形成数量主要受温度和降雨影响，每年的成熟时间和形成数量差异很大。 [0005] 子囊孢子的发育进度和形成数量监测是防治梨黑星病的基础。在梨黑星病菌的初侵染期，喷药保护果实和叶片不受病原菌的侵染是防治梨黑星病重要措施。定期检测子囊孢子的发育进度和可释放子囊孢子的数量就可以了解子囊孢子的释放期和释放量。根据子囊孢子的释放量和释放期可以决定是否防治黑星病及防治的时间。因此，子囊孢子的发育进度和形成数量监测是梨黑星病防治决策的重要依据。 [0006] 检测子囊孢子的传统方法是切片和镜检。组织切片是将产有假囊壳的叶组织通过切片机或徒手切片，切成10~60微米的组织切片，然后在显微镜下观测查找子囊和子囊孢子。该方法需要组织切片，检测效率低，不适合检查和检测大量样品。除此之外，目前还没有更高效的检测方法。发明内容 [0007] 本发明的目的在于提供一套快速检查和检测梨黑星病菌子囊孢子的发育进度和可释放子囊孢子数量的方法，为梨黑星病的研究和病害防治提供一套简便、快捷而准确的检测方法。 [0008] 本发明采用的技术原理如下：梨黑星病菌在有性生殖过程中可产生假囊壳、子囊和子囊孢子。子囊的为棒状，特征明显，在显微镜下清晰可见，很容易识别，如图1所示。根据假囊壳内子囊、子囊孢子的形态，推断子囊孢子的发育进度。子囊发育成熟后能吸水膨胀，从顶部弹射出子囊孢子，收集有一定数量假囊壳病叶上释放出来的子囊孢子，检查子囊孢子的数量，可以推算可释放子囊孢子的数量。 [0009] 本项发明采用的如下技术方案：用特制刀片从越冬病叶上切取一定数量的子实体，置入载玻片上，压破，检查假囊壳的内容物，根据内容物形态分为未发育的假囊壳、未发育成熟的假囊壳、发育成熟的假囊壳、已释放子囊孢子的假囊壳四类，以各类假囊壳的相对比率为指标，推断子囊孢子的发育进度。从越冬病叶上切取具有一定数量假囊壳的病斑，粘贴在1%水琼脂平板上，使成熟的子囊吸水膨胀，释放子囊孢子，在病斑下方放置载玻片，收集释放的子囊孢子，在显微镜下检查记录子囊孢子的数量，依此推算可释放子囊孢子的数量。 [0010] 梨黑星病菌子囊孢子检测的具体步聚如下：（1）取样：春季从梨园内或梨园周边的地面上采集梨黑星病的越冬病叶；由于梨黑星病菌子囊孢子的发育受环境因子的影响较大，检测子囊孢子尽量从不同的环境中采集越冬病叶；也可以于梨树落叶期，收集梨黑星病的病叶，放入网袋中，置于果园内，次年春季定期取出一定数量的越冬病叶，检测子囊孢子发育进度和形成数量；每次检测取5~30个病叶，一般用20个叶片；（2）制作刀片：取双面剃须刀片，掰为两半，用火焰将一角烧红，然后用剪刀从刀片中央剪向烧制一角斜剪，剪出的刀尖，带有一定弧度；（3）发育进度检测：每次检测用带有一定弧度的刀尖从每个越冬病叶上切取体积最大的假囊壳，每个叶片至少2个，一般为10个，放到载玻片上，用盖玻片压破，在100倍显微镜下，检查每个假囊壳的内容物，若假囊壳内a）没有子囊和子囊孢子，计为未发育的假囊壳； b）若只有子囊，没有子囊孢子，计为未发育成熟的假囊壳；c）若有子囊孢子，计为发育成熟的假囊壳；d）若假囊壳内无内容物，计为已释放子囊孢子的假囊壳；计算各类假囊壳的相对比率，用各类假囊壳的相对比率表示子囊孢子的发育进度；（4）水琼脂平板准备：称取一定量琼脂粉，加入蒸馏水，并加热至沸腾，边加热边搅拌；琼脂粉融化后，倒入培养皿中，冷凝后制成水琼脂平板；水琼脂中琼脂粉的含量为1~5%，常用浓度为1%，融化后的水琼脂倒入直径9cm的培养皿中，每皿20ml，制成水琼脂平板；（6）发生量检测：用剪刀从越冬病叶上剪取叶片上假囊壳最多的病斑，每个病斑上假囊壳的数量为10~50个，病斑宽度为0.2~2cm，长度为0.5~10cm；将病斑粘贴1%水琼脂平板上，有假囊壳的一面背对琼脂平板，每皿一块病斑；取培养皿盖，放置一个干净的载玻片，将贴有病斑的培养皿倒扣在培养皿盖上，病斑对准载玻片；将培养皿在20~30℃的室温下放置1~12小时，一般为2小时，取去载玻片，在100倍的显微镜下检查病斑上释放出子囊孢子的数量。 [0011] 本发明的优点在于：本发明所提出的检测方法简便、快速、检测结果准确可靠，填补了梨黑星病子囊孢子无检测方法的空白。 [0012] 应用实例一，浸水时间对梨黑星病菌子囊孢子的释放的影响：5 月中旬从梨园中采集有大量假囊壳的越冬梨叶，在实体显微镜下剪成每片约有30个假囊壳的叶片。在15℃条件下，将带有假囊壳的叶片放入水中，将病叶片分别浸水10sec、1min、5min、10min、 30min、60min，取出叶片，用吸水纸吸干叶片上的水。然后用凡士林粘到培养皿上，有假囊壳的一面朝上，每培养皿2 个叶片，以不浸水的叶片为对照。在培养皿盖中放置两个载玻片，将粘有叶片的培养皿倒扣在培养皿盖上，病叶片正对载玻片，在室温下放置24h。取出载玻片，检查记录载玻片上的子囊孢子，计为已释放孢子。将1%的水琼脂20mL倒入培养皿中，冷凝后，制成水琼脂平板。将已释放孢子的病叶片粘贴在水琼脂平板上，在皿盖中放置两个玻片，然后将粘有病叶片的培养皿倒扣在培养皿盖上，病叶片正对载玻片，并密封保湿。收集叶片上释放的子囊孢子，24h后取出载玻片，检查记录载玻片上的孢子总量，计为未释放孢子，计算病叶片浸水后，子囊孢子的释放百分率。全部试验重复三次。结果表明，假囊壳成熟后遇水可释放子囊孢子。病叶片浸水10sec就可以激发子囊孢子的释放，孢子的释放率达79%。随浸水时间延长，孢子的释放率有所增加，但增加幅度不大。侵水30分钟的处理，子囊孢子的释放率最高，为96%，如表1所示。 [0013] 应用实例二，温度对子囊孢子的释放动态的影响：5 月中旬从梨园中采集有大量假囊壳的越冬梨叶，在实体显微镜下剪成每片约有30个假囊壳的叶片。取6个直径为9cm的培养皿，将1%的水琼脂20mL倒入培养皿中，冷凝后，制成水琼脂平板。将有假囊壳叶片粘贴在水琼脂的平板上，每皿2 个叶片；取培养皿盖，放置两个载玻片；喷水将叶片迅速湿透，并将培养皿倒扣在培养皿盖上，叶片正对载玻片。将6个培养皿分别放置在放10℃、20℃和30℃的环境中，每个温度2个，收集释放的子囊孢子。分别在喷水后10min、20min、 40min、60min、80min、100min 160min、220min、12h 和24h 更换新的载玻片。检查记录各个时间段的载玻片上收集的孢子总数。结果表明，梨叶片被喷水湿润后，10min之内开始释放子囊孢子；浸水后30min 子囊孢子的释放达到高峰期；浸水后60min内，子囊孢子的释放率已达80%。温度对子囊孢子释放没有显著的影响。10℃、20℃和30℃三个温度下子囊孢子的释放动态如图2所示。 [0014] 附图说明：图1 梨黑星病菌的子囊孢子、成熟的子囊、未成熟的子囊和假囊壳；图2 梨黑星病越冬病叶上子囊孢子在不同温度下的释放动态。