一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法

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一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法
申请号	CN202211521974.5	申请日	2022-11-30	公开(公告)号	CN115747313A	公开(公告)日	2023-03-07
申请人	句容市丰源生态农业有限公司; 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所;			发明人	窦永敏; 许媛; 肖婷; 杨敬辉;
摘要	本发明属于病原菌抗药性检测技术领域，公开了一种快速检测梨黑星病菌对多种药剂抗药性的方法，在灭菌细胞培养板中选取一个孔加入培养基作为对照，其他每个孔加一种含药培养基，将制备好的检测试剂盒密封冷藏保存，得到梨黑星病菌检测试剂盒；取梨黑星病病原菌孢子，点在梨黑星病菌检测试剂盒内的每一个孔中，加盖密封，将接种后的试剂盒25℃恒温培养2d，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性；克服了传统的病原菌抗药性检测技术需要田间采样，实验室分离纯化，接种到含药培养基或喷洒药剂的植物组织上的耗时费力且一次性检测数量有限的缺陷，具有省时省力、操作方便、无需采样，可就地同时检测多种药剂抗性且快速准确的优点。
权利要求	1.一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在灭菌细胞培养板中选取一个孔加入培养基作为对照，其他每个孔加一种含药培养基，将制备好的检测试剂盒密封冷藏保存，得到梨黑星病菌检测试剂盒；取梨黑星病病原菌孢子，点在梨黑星病菌检测试剂盒内的每一个孔中，加盖密封，将接种后的试剂盒25℃恒温培养2d，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性，正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。 2.根据权利要求1所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，所述培养板为6孔、12孔、24孔、48孔灭菌细胞培养板中的一种。 3.根据权利要求1所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，所述培养基采用PDA培养基。 4.根据权利要求3所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，所述培养基的配制步骤为：在培养基中加入供测药剂母液，配置成所需要的浓度，在无菌工作台上将培养基加入到培养板中，完成后加盖密封，4℃冰箱保存备用。 5.根据权利要求1所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，将病原菌时用无菌独立包装棉签或牙签取样，直接接种到所述检测试剂盒中，加盖密封保存。 6.根据权利要求1所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，所述药剂包括多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟硅唑和腈菌唑中的一种或多种。 7.根据权利要求1所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，对梨黑星病菌病原菌基因相对表达量进行测定，根据基因相对表达量评估梨黑星病菌病原菌的抗药性。 8.根据权利要求7所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，梨黑星病菌病原菌基因相对表达量测定包括以下步骤：(1)选取梨黑星病菌病原菌表达量对药物较为敏感的基因； (2)进行梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成； (3)设计荧光定量PCR引物； (4)通过荧光定量PCR检测梨黑星病菌病原菌的步骤(1)所述基因的表达量。 9.根据权利要求8所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成，包括以下步骤：(1)用CTAB法提取梨黑星病菌的总DNA； (2)在PCR反应管中加入2μL基因组缓冲液、1μL去基因组酶gDNA Eraser、1μL模板DNA，使用无核酶水定容至10μL； (3)将反应体系置于42℃环境下反应2min，然后置于冰上； (4)在反应后的PCR管中加入4μL反应缓冲液、4μL反转录酶、1μL引物混合物、4μL无核酶水； (5)将反应体系置于37℃环境下反应12min，合成cDNA。 10.根据权利要求8所述的梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于，PCR反应体系为：总体积20μL；包括正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、cDNA模板1.0μL、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix‑UDG 10μL、ddH2O8.0μL； PCR反应程序为：40℃反应2min，80℃反应2min；然后85℃反应15s，60℃反应34s，40个循环。
说明书全文	一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法技术领域 [0001] 本发明属于病原菌抗药性检测技术领域，尤其涉及一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法。背景技术 [0002] 植物病原菌抗药性，是指病原菌长期在单一药剂或同类药剂选择作用压力下，通过遗传、变异，对此获得的适应性。随着科技的发展，病原菌抗药性的研究成为一个热点问题，现代的分子检测手段日新月异，可以通过核酸水平的分子诊断技术检测杀菌剂的抗药性，但是对于基因组中控制抗性的突变位点不明确的病原菌或不具备抗药性分子检测条件的单位，只能采用传统的病原菌抗药性检测技术。 [0003] 传统的病原菌抗药性检测技术，主要是菌丝生长法、孢子萌发法，需要田间采样，实验室分离纯化，接种到含药培养基或喷洒药剂的植物组织上，这个过程耗时、费力，而且一次性检测数量有限。发明内容 [0004] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，省时省力、操作方便、无需采样，可就地同时检测多种药剂且快速准确。 [0005] 本发明所采用的技术方案为： [0006] 一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，包括以下步骤： [0007] 在灭菌细胞培养板中选取一个孔加入培养基作为对照，其他每个孔加一种含药培养基，将制备好的检测试剂盒密封冷藏保存，得到梨黑星病菌检测试剂盒； [0008] 取梨黑星病病原菌孢子，点在梨黑星病菌检测试剂盒内的每一个孔中，加盖密封，将接种后的试剂盒25℃恒温培养2d，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性，正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。 [0009] 进一步的，所述培养板为6孔、12孔、24孔、48孔灭菌细胞培养板中的一种。 [0010] 进一步的，所述培养基采用PDA培养基。 [0011] 进一步的，所述培养基的配制步骤为：在培养基中加入供测药剂母液，配置成所需要的浓度，在无菌工作台上将培养基加入到培养板中，完成后加盖密封，4℃冰箱保存备用。 [0012] 进一步的，将病原菌时用无菌独立包装棉签或牙签取样，直接接种到所述检测试剂盒中，加盖密封保存。 [0013] 进一步的，所述药剂包括多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟硅唑和腈菌唑中的一种或多种。 [0014] 进一步的，对梨黑星病菌病原菌基因相对表达量进行测定，根据基因相对表达量评估梨黑星病菌病原菌的抗药性。 [0015] 进一步的，梨黑星病菌病原菌基因相对表达量测定包括以下步骤： [0016] (1)选取梨黑星病菌病原菌表达量对药物较为敏感的基因； [0017] (2)进行梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成； [0018] (3)设计荧光定量PCR引物； [0019] (4)通过荧光定量PCR检测梨黑星病菌病原菌的步骤(1)所述基因的表达量。 [0020] 进一步的，梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成，包括以下步骤： [0021] (1)用CTAB法提取梨黑星病菌的总DNA； [0022] (2)在PCR反应管中加入2μL基因组缓冲液、1μL去基因组酶gDNA Eraser、1μL模板DNA，使用无核酶水定容至10μL； [0023] (3)将反应体系置于42℃环境下反应2min，然后置于冰上； [0024] (4)在反应后的PCR管中加入4μL反应缓冲液、4μL反转录酶、1μL引物混合物、4μL无核酶水； [0025] (5)将反应体系置于37℃环境下反应12min，合成cDNA。 [0026] 进一步的，PCR反应体系为：总体积20μL；包括正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、cDNA模板1.0μL、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix‑UDG 10μL、ddH2O8.0μL； [0027] PCR反应程序为：40℃反应2min，80℃反应2min；然后85℃反应15s，60℃反应34s，40个循环。 [0028] 有益效果 [0029] 本发明提供的一种梨黑星病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，通过首先制备梨黑星病菌检测试剂盒，然后进行田间取样就地检测，最后根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性的方法对多种药剂的抗药性进行快速检测；克服了传统的病原菌抗药性检测技术需要田间采样，实验室分离纯化，接种到含药培养基或喷洒药剂的植物组织上的耗时费力且一次性检测数量有限的缺陷，具有省时省力、操作方便、无需采样，可就地同时检测多种药剂且快速准确的优点。 [0030] 本发明方法实现了梨黑星病菌对药剂抗药性的快速高效检测，与传统的梨黑星病菌抗药性检测方法相比，本发明提供的检测方法特异性高、可重复性高、准确性高、灵敏度高、检测周期短等优势，采用的试剂盒方便易于携带，实现梨黑星病菌的快速检测。附图说明 [0031] 图1为本发明实施例1的6孔灭菌细胞培养板示意图。具体实施方式 [0032] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明： [0033] 实施例1： [0034] A)试验地点：句容后白镇梨园 [0035] B)试验时间：2021年8月 [0036] C)试验目的：检测20株梨黑星病菌对多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟硅唑和腈菌唑5种药剂的抗药性水平。 [0037] D)实施方法： [0038] (1)制备梨黑星病菌检测试剂盒：由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所实验室内制备梨黑星病菌检测试剂盒：首先确定供测药剂的区分计量和培养基种类(具体见表1)，选取6孔灭菌细胞培养板(见图1)，将灭菌培养基制备成含药培养基，加入到培养板中，每个孔加一种含药培养基，以PDA培养基作为空白对照，将制备好的检测试剂盒密封，4℃下冰箱保存备用。 [0039] 将要测定抗药性的药物如多菌灵选取6个浓度，分别为0ppm、5ppm、10ppm、15ppm、20ppm和25ppm，每个孔加入一种浓度的含药培养基；6个孔加入等量的梨黑星病病原菌孢子，25℃恒温培养2d后，根据每孔梨黑星病病原菌孢子的最终数量和药物浓度数据绘制回归曲线，得到该梨黑星病病原菌菌株与药物浓度的曲线；并根据不同该梨黑星病病原菌菌株与药物浓度的曲线确定药物用于检测的浓度。经试验测定，5种药物除多菌灵的检测浓度选择10ppm外、其他4种药物苯醚甲环唑、戊唑醇、氟硅唑和腈菌唑的检测浓度选择5ppm时，具有较好的检测效果。 [0040] 表1药剂的区分计量和培养基种类 [0041]药剂名称区分计量(ppm) 培养基种类多菌灵 10 PDA 苯醚甲环唑 5 PDA 戊唑醇 5 PDA 氟硅唑 5 PDA 腈菌唑 5 PDA [0042] (2)取样检测：取20个上述试剂盒，装入整理箱中，带入试验田间； [0043] (3)药剂抗药性的判定：在梨园内，用独立包装灭菌棉签或牙签，轻轻的在发病并产生霉层的梨果实上蘸取病原菌孢子，点在试剂盒内的每一个孔中，加盖密封，每株病原菌接种一个试剂盒；将接种后的试剂盒带回实验室，25℃恒温培养2d，检查结果，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性，正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。 [0044] 进一步的，本发明还可以采用下述步骤对药剂抗药性进行定量评估。 [0045] 对梨黑星病菌病原菌基因相对表达量进行测定，根据基因相对表达量评估梨黑星病菌病原菌的抗药性。 [0046] 梨黑星病菌病原菌基因相对表达量测定包括以下步骤： [0047] (1)选取梨黑星病菌病原菌表达量对药物较为敏感的基因； [0048] (2)进行梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成； [0049] (3)设计荧光定量PCR引物； [0050] (4)通过荧光定量PCR检测梨黑星病菌病原菌的步骤(1)所述基因的表达量； [0051] 梨黑星病菌病原菌总DNA的提取以及cDNA的合成，包括以下步骤： [0052] (1)用CTAB法提取梨黑星病菌的总DNA； [0053] (2)在PCR反应管中加入2μL基因组缓冲液、1μL去基因组酶gDNA Eraser、1μL模板DNA，使用无核酶水定容至10μL； [0054] (3)将反应体系置于42℃环境下反应2min，然后置于冰上； [0055] (4)在反应后的PCR管中加入4μL反应缓冲液、4μL反转录酶、1μL引物混合物、4μL无核酶水； [0056] (5)将反应体系置于37℃环境下反应12min，合成cDNA。 [0057] PCR反应体系为：总体积20μL；包括正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、cDNA模板1.0μL、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix‑UDG 10μL、ddH2O8.0μL。 [0058] PCR反应程序为：40℃反应2min，80℃反应2min；然后85℃反应15s，60℃反应34s，40个循环。 [0059] E)试验结果见表2。 [0060] 表2梨黑星病菌对5种药剂的抗药性检测 [0061]药剂名称抗性频率(％) 多菌灵 95 苯醚甲环唑 10 戊唑醇 5 氟硅唑 5 腈菌唑 5 [0062] 应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。