[0001] 相关申请的交叉参考本申请要求2013年9月20日提交的美国临时申请系列号61/880,498的权益，其经此引用并入本文。

[0002] 发明背景昆虫不育技术(SIT)是一种物种特异性生物防治方法，可以减少或消除害虫种群，而无需化学杀虫剂。该技术需要释放大量绝育的雄虫，其随后与野生雄虫竞争与雌虫交配以减少种群(Knipling,1960；Vreysen等人,2000；Klassen等人,1994；Hendrichs等人,1995；
Bloem和Bloem,1999)。辐射或化学不育剂通常用于绝育SIT用雄虫，但是这些处理会降低它们竞争配偶的能力，这通常需要产生和释放更多的不育雄虫以提高功效(Holbrook和Fujimoto,1970；Mayer等人,1998；Helsinki和Knols,2008)。如果不释放雌虫的话，SIT被认为是更有效的(Knipling,1959；Robinson,2002)，因为不育的雌性昆虫也会破坏作物或传播疾病。已经对一些昆虫如地中海果蝇开发了基因性别鉴定技术以便在它们成熟前优先消除雌虫。这些通常涉及将雄性决定染色体连接至显性可选标记的染色体易位，同时雌虫对隐形有害基因是纯合的。不幸的是，当昆虫大规模养殖时，由于雄性染色体重组，这些易位往往失败(Franz等人,1994)。

[0003] 常规SIT先前已经用于控制蚊子(Lofgren等人,1974)，但是由于不育雄虫的受限的竞争力，该方法还没有广泛使用。开发了新的转基因方法——使用携带和传播有害基因的基因改变的蚊子(Alphey等人,2010)，但是释放基因改造昆虫在许多社区/国家可能遭到禁止或推迟，直到充分考虑公众意见和监管问题。

[0004] 发明概述本文中提供的是改造昆虫。在一个实施方案中，改造昆虫包括与对照昆虫相比降低的睾丸特异性编码区的表达。在一个实施方案中，该改造昆虫是雄性。在一个实施方案中，与对照昆虫相比时，该改造昆虫包括降低的生育力、降低的生殖力或其组合。任选和优选地，与对照昆虫相比，该改造昆虫的竞争力并未显著降低。

[0005] 在一个实施方案中，该改造昆虫是蚊科(例如伊蚊属(Aedes spp.)、按蚊属(Anopheles spp.)或库蚊属(Culex spp.))、实蝇科(例如地中海实蝇(Ceratitis capitata)、实蝇属(Anastrepha spp.)或果实蝇属(Bactrocera spp.))、卷蛾科(例如苹果蠹蛾(Cydia pomonella))、双翅目(例如螺旋蛆蝇(Cochliomyia hominivorax)或舌蝇属(Glossina spp.))，或鳞翅目(例如澳古毒蛾(Orgyia anartoides))的成员。在一个实施方案中，该改造昆虫是蚊子，如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、法老按蚊(Anopheles farauti)、四斑按蚊(Anopheles quadrimaculatus)、斑须按蚊(Anopheles stephensi)、尖音库蚊(Culex pipiens)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)或环跗库蚊(Culex tarsalis)。在一个实施方案中，该睾丸特异性编码区选自表2或其同源物。超过一个睾丸特异性编码区的表达可能降低。

[0006] 在一个实施方案中，与对照昆虫相比，该改造昆虫进一步包括降低的编码性别分化多肽的编码区的表达，如双性雌性剪接变体。

[0007] 本文中还提供了制备改造昆虫的方法。在一个实施方案中，该方法包括向昆虫，如幼年昆虫施用包括抑制睾丸特异性编码区的表达的双链RNA(dsRNA)的组合物。令幼年昆虫成熟至成年，其中与对照昆虫相比，该成虫具有降低的生育力、降低的生殖力或其组合。在一个实施方案中，该睾丸特异性编码区选自表2或其同源物。超过一个睾丸特异性编码区的表达可能降低。

[0008] 在一个实施方案中，该方法用于制备改造昆虫，所述改造昆虫是蚊科(例如伊蚊属(Aedes spp.)、按蚊属(Anopheles spp.)或库蚊属(Culex spp.))、实蝇科(例如地中海实蝇(Ceratitis capitata)、实蝇属(Anastrepha spp.)或果实蝇属(Bactrocera spp.))、卷蛾科(例如苹果蠹蛾(Cydia pomonella))、双翅目(例如螺旋蛆蝇(Cochliomyia hominivorax)或舌蝇属(Glossina spp.))，或鳞翅目(例如澳古毒蛾(Orgyia 
anartoides))的成员。在一个实施方案中，该改造昆虫是蚊子，如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、法老按蚊(Anopheles farauti)、四斑按蚊(Anopheles 
quadrimaculatus)、斑须按蚊(Anopheles stephensi)、尖音库蚊(Culex pipiens)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)或环跗库蚊(Culex tarsalis)。

[0009] 在一个实施方案中，该施用包括向该昆虫喂饲该组合物。该dsRNA可以存在于喂饲给该昆虫的细菌中，且所述细菌可以是活的或灭活的。在一个实施方案中，该昆虫是幼虫(larva)或蛹。在一个实施方案中，该睾丸特异性编码区选自表2或其同源物。在一个实施方案中，该组合物进一步包括抑制睾丸特异性编码区的表达的至少一种另外的dsRNA。在一个实施方案中，该方法进一步包括向该昆虫施用抑制编码双性雌性剪接变体的编码区的表达的第二dsRNA。还提供的是通过该方法产生的改造昆虫和通过该方法产生的昆虫种群。

[0010] 本文中进一步提供的是用于昆虫的生物防治的方法。在一个实施方案中，该方法包括向环境中释放本文中描述的改造昆虫的种群，其中下一代中成活后代的数量减少。在一个实施方案中，通过比较向环境中释放野生型昆虫来确定该减少。

[0011] 本文中还提供的是产生雄性偏置(male-biased)的昆虫种群的方法。在一个实施方案中，该方法包括向幼虫阶段的昆虫种群施用包括抑制编码双性雌性剪接变体的编码区的表达的双链RNA(dsRNA)的组合物，并且其中该昆虫种群与未施用该组合物的昆虫种群相比具有降低的雄虫数量。

[0012] 还提供的是本文中公开的双链RNA，包括单链RNA多核苷酸和单链DNA和对应于该双链RNA的双链多核苷酸。

[0013] 术语“和/或”指的是列举的要素的一个或全部，或列举的要素中任意两个或更多个的组合。

[0014] 词语“优选的”和“优选地”指的是在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施方案。但是，在相同或其它情况下，其它实施方案也可能是优选的。此外，描述一个或多个优选实施方案并不意味着其它实施方案是不可用的，并且并非意在将其它实施方案从本发明的范围排除。

[0015] 当术语“包含”及其变体出现在说明书和权利要求书中时，这些术语不具有限制性含义。

[0016] 除非另行说明，“一个”、“一种”、“该”和“至少一种”可互换使用并指的是一个或超过一个。

[0017] “适于”要发生的事件的条件，或“合适的”条件是不会阻止此类事件发生的条件。由此，这些条件允许、提高、促进和/或有利于该事件。

[0018] 同样在本文中，通过端点描述数值范围包括归属于该范围的所有数字(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等等)。

[0019] 对包括离散步骤的本文中公开的任何方法而言，该步骤可以以任何可行的顺序进行。在适当情况下，两个或更多个步骤的任何组合可以同时进行。

[0020] 本发明的上述概述并非意在描述各个公开的实施方案或本发明的每一实施。下面的描述更特别例示了说明性实施方案。在本申请通篇的几个地方，通过实例的清单提供指导，该实例可以以各种组合使用。在各种情况下，所列举的清单仅用作代表性的组，不应解释为排他性的清单。

[0021] 附图概述图1.编码多肽的埃及伊蚊(Aedes aegypti)的睾丸特异性编码区。

[0022] 图2.编码多肽的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的睾丸特异性编码区。

[0023] 示例性实施方案详述本文中提供的是产生昆虫如蚊子的方法，所述昆虫是不育的和/或具有降低的生殖力。
此类昆虫可用于昆虫不育技术(SIT)程序以消灭害虫并由此减少能由害虫引起的疾病传播和/或经济损失。SIT是通过向所在地释放大量不育雄虫(在此它们与野生雄虫竞争配偶)来控制害虫的生物方法，并可以有效地减少或消除害虫种群。产生蚊子或其它害虫的不育雄虫的现有方法传统上依赖于使用辐射或广谱化学不育剂以使雄虫绝育，但是这些方法通常使雄虫虚弱，在释放时不具有高度竞争力。已经开发了依赖于产生基因改造蚊子的一些新方法，但是这些途径需要释放能够将该基因传播到种群中的昆虫，这可能对关注的区域之外的种群产生无法预料的影响。

[0024] 因此，本文中提供的是制备改造昆虫的方法。本文中所用的术语“改造”指的是已经通过引入外源性多核苷酸“由人手”进行改变的昆虫。本文中所用的“外源性多核苷酸”指的是已经引入到昆虫中的多核苷酸，并且包括但不限于并非正常或天然存在于昆虫体内的多核苷酸。在一个实施方案中，该外源性多核苷酸是双链RNA(dsRNA)。在一个实施方案中，本文中描述的改造昆虫具有与对照昆虫相比降低的睾丸特异性编码区的表达、与对照昆虫相比降低的雌性特异性编码区的表达，或其组合。具有降低的睾丸特异性编码区的表达和/或降低的雌性特异性编码区的表达的改造昆虫可以包括外源性多核苷酸。改造昆虫可以处于任何发育阶段，如幼虫、蛹或成虫。在一个实施方案中，改造昆虫是将发育为具有降低的生育力、降低的生殖力或其组合的成虫的幼虫或蛹。在一个实施方案中，改造昆虫是成虫并具有降低的生育力、降低的生殖力或其组合。本文中所用的“对照”昆虫是相同种属的昆虫，但是相对于改造昆虫是未经改造的。

[0025] 可以使用本文中描述的方法改造的昆虫包括但不限于害虫，如充当基于病毒、细菌和/或寄生虫的疾病的载体和/或对作物、水果、蔬菜、动物和/或人类造成破坏的昆虫。在一个实施方案中，昆虫是蚊科的成员。此类昆虫的实例包括蚊子，如伊蚊属(Aedes spp.)(例如埃及伊蚊(A.aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)和刺扰伊蚊(A.vexans))、按蚊属(Anopheles spp.)(例如冈比亚按蚊(A.gambiae)、法老按蚊(A.farauti)、四斑按蚊(A.quadrimaculatus)、斑须按蚊(A.stephensi)、阿拉伯按蚊(A.arabiensis))和库蚊属(Culex spp.)(例如尖音库蚊(C.pipiens)、致倦库蚊(C.quinquefasciatus)和环跗库蚊(C.tarsalis))。在一个实施方案中，昆虫是实蝇科的成员。此类昆虫的实例包括果蝇，如地中海实蝇(Ceratitis capitata)(通常称为地中海果蝇)、实蝇属(Anastrepha spp.)(例如墨西哥按实蝇(A.ludens)、加勒比按实蝇(A.suspense)、西印度按实蝇(A.oblique))和果实蝇属(Bactrocera spp.)(例如昆士兰果实蝇(B.tryoni)、东方果实蝇(B.dorsalis)和油橄榄果实蝇(B.oleae)、瓜实蝇(B.cucurbitae))。在一个实施方案中，昆虫是卫生害虫或动物害虫，其为双翅目的成员，如旋丽蝇(螺旋蛆蝇(Cochliomyia hominivorax))或采采蝇(舌蝇属(Glossina spp)，如须舌蝇(G.palpalis)、梭舌蝇(G.fuscipes)、刺舌蝇(G.morsitans)、拟寄舌蝇(G.tachinoides)、长须舌蝇(G.longipalpis)、G.fusca、透翅蛾舌蝇(G.tabaniformis)、短须舌蝇(G.brevipalpis)、G.vanhoofi、奥斯丁舌蝇(G.austeni))。在一个实施方案中，昆虫是鳞翅目(例如毒蛾科的成员，例如澳古毒蛾(Orgyia anartoides))或卷蛾科(例如苹果蠹蛾(Cydia pomonella))的成员。

[0026] 在一个实施方案中，制备改造昆虫的方法包括向昆虫施用包括多核苷酸的组合物。本文中所用的术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸(无论核糖核苷酸或脱氧核苷)的聚合形式，并包括双链和单链DNA和RNA。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列，和非编码序列，如调控序列。下面定义编码序列、非编码序列和调控序列。多核苷酸可以直接获自天然来源，或可以借助重组、酶促或化学技术来制备。多核苷酸在拓扑学上可以是线性或环形的。多核苷酸例如可以是载体(如表达载体或克隆载体)的一部分或片段。

[0027] 在一个实施方案中，该多核苷酸可以是抑制睾丸特异性编码区的表达的双链RNA(dsRNA)。在另一实施方案中，该多核苷酸可以是编码dsRNA的DNA序列。应当理解的是，本文中公开为DNA序列的序列可以通过用尿嘧啶核苷酸替换每个胸腺嘧啶核苷酸由DNA序列转换为RNA序列。该昆虫可以是幼虫或成虫。幼年昆虫包括除成虫外的所有阶段，例如幼虫和蛹。在一个实施方案中，被施用本文中描述的组合物的昆虫是幼虫。

[0028] 本文中所用的“编码区”是编码未加工的前体RNA(即包括外显子和内含子的RNA分子)并经加工以获得翻译为多肽的mRNA的核苷酸序列。编码区的边界通常由在其5’端处的转录起始位点和在其3’端处的转录终止子来决定。本文中所用的“睾丸特异性编码区”是在睾丸中表达，但是在其它雄性组织中或在雌性中不存在或以不可检测的水平表达(使用qRT-PCR技术)的编码区。本文中所用的“雌性特异性编码区”是编码性别分化多肽的编码区，所述性别分化多肽在雄性和雌性中均表达，但是在雄性和雌性中表达不同的剪接变体。“雌性特异性编码区”是仅在雌性中表达的变体。

[0029] 如实施例1中所述，已经识别了睾丸特异性编码区，其在表达降低时导致降低的生育力和/或降低的生殖力，并且不会显著降低竞争力。在一个实施方案中，可以在改造昆虫中降低的编码多肽的睾丸特异性编码区包括但不限于以下列Genbank登录号可获得的编码区：AAEL001684、AAEL002275、AAEL004231、AAEL004471、AAEL004939、AAEL005010、AAEL005975、AAEL006726、AAEL006975、AAEL007188、AAEL007434、AAEL010639和AAEL011310。这些编码区各自被转录和加工以产生mRNA序列，其显示在图1和表1中。

[0030] 表1.
在一个实施方案中，表1中显示的编码区可用于其中被施用dsRNA的昆虫是蚊科的一员的方法。在一个实施方案中，该昆虫是埃及伊蚊(Aedes aegypti)。在其它实施方案中，导向作为表1中显示的编码区的同源物的编码区的dsRNA可用于其它昆虫。例如，实施例1显示了导向作为表1中显示的编码区的同源物的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的编码区的dsRNA降低了生育力和/或生殖力，并且对黑腹果蝇的竞争力没有显著影响(参见表7)。使埃及伊蚊基因(蚊科的一员)沉默的编码区也作用于黑腹果蝇(实蝇科的一员)的证据表明本文中描述的方法用于其它昆虫的适用性。因此，作为本文中公开的编码区的同源物的存在于其它昆虫中的编码区(例如在表1中和表7中显示的黑腹果蝇编码区)可用于制备使睾丸特异性编码区沉默的dsRNA，期望该dsRNA将在其它昆虫中降低生育力和/或生殖力。

[0031] 作为同源物的编码区是共享家系的编码区，例如它们均衍生自存在于共同祖先中的编码区。本领域技术人员可以通过使用常规方法容易地确定非-埃及伊蚊昆虫中的编码区是否是本文中公开的编码区的同源物。在一个实施方案中，本领域技术人员可以使用本文中公开的编码区的核苷酸序列并设计用于低严格PCR的简并PCR引物。低严格PCR是识别已知编码区的同源物的常规方法。在另一实施方案中，本领域技术人员可以使用容易获得的数据库以便在另一种昆虫中识别本文中公开的编码区的同源物。合适的数据库的实例包括但不限于VectorBase(可以通过万维网在vectorbase.org处获得)和GenBank(可以通过万维网在ncbi.nlm.nih.gov/genbank处获得)。

[0032] 在另一实施方案中，本领域技术人员可以通过本文中公开的编码区和另一编码区之间的序列同一性水平来识别本文中公开的编码区的同源物。在一个实施方案中，当比较两个核苷酸序列时，大于50％的百分比同一性被取做可能的同源性的证据。E值(期望值)表示预期仅偶然匹配该查询的在检索的数据库中的命中(序列)数量，因此小于0.01的E值(即序列随机存在的机会小于1％)与大于50％的百分比同一性结合被认为是识别可能同源物的合适评分。确定两个序列之间的核苷酸序列同一性的方法容易获得并且在本领域是常规的。在一个实施方案中，在昆虫中的作为表1中编码区的同源物的编码区可以使用BLAST-X算法针对NCBI的使用缺省参数的非冗余数据库来识别。如果该候选编码区与表1中的相应编码区具有至少大于50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列同一性，候选编码区被认为是表1中公开的编码区的同源物。

[0033] 一个或多个公开在表1中的编码区的降低的表达可导致在昆虫中降低的生育力、降低的生殖力或其组合。生育力指的是雄虫种群呈现于未交配雌虫配偶后产生存活卵的能力(参见表4)。如果种群中至少50％的雄虫不育，例如在呈现于未交配雌虫后不能产生存活卵的话，接受靶向一种或多种mRNA的一种或多种dsRNA的雄虫种群被认为具有充分降低的生育力。降低的生殖力指的是由不完全不育的雄性产生的后代数量的降低。如果由不完全不育的雄性产生的后代数量与对照雄性相比降低至少50％的话，能育雄性被认为具有充分降低的生殖力。

[0034] 虽然降低的睾丸特异性编码区的表达常常导致降低的生育力和/或降低的生殖力，预期在睾丸特异性编码区中的某些突变也会降低雄虫的竞争力。竞争力指的是雄性昆虫寻找配偶并与野生型雄性昆虫竞争雌性昆虫的能力。如果雄虫不能与野生雄虫竞争雌虫的话，在种群控制的环境中释放改造的雄性昆虫的种群是无效的。如实施例1中所述，识别了其中沉默不会显著影响昆虫竞争力的几个睾丸特异性编码区。竞争力可以通过测定施用靶向表1中公开的编码区或其同源物的一种或多种dsRNA(并具有降低的生育力和/或降低的生殖力)的雄虫在与对照雄虫竞争时是否导致种群减少来测量(参见表6)。如果种群大小减少至少20％，降低表1中公开的编码区或其同源物的表达不会显著改变雄性昆虫的竞争力。在本文中描述了确定是否改变竞争力的方法。在一个实施方案中，竞争力可以通过以下方法测定：将5只dsRNA处理过的雄虫和5只未处理的雄虫暴露于10只未交配雌虫，确定后代的数量，并与将5只未处理的雄虫与10只未交配雌虫混合所得的后代数量进行比较。

[0035] 在一个实施方案中，该方法包括向昆虫施用抑制性别分化多肽的表达的dsRNA。合适的性别分化多肽的实例包括当在发育昆虫中沉默时抑制雌虫发育并提高发育的昆虫在成虫阶段时为雄性的可能性的那些。当用于发育的昆虫的种群时，包括施用此类dsRNA的方法将导致偏向雄性的种群。例如，施用此类dsRNA的发育的昆虫的种群将导致其为、为至少或为不大于50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％雄性的成虫种群。在一个实施方案中，向昆虫施用降低了一个或多个睾丸特异性编码区的表达的dsRNA和抑制性别分化多肽的表达的dsRNA。

[0036] 在一些昆虫中可以靶向的合适的性别分化多肽的实例包括但不限于双性、性致死和性别转换基因。这些蛋白质的功能已经在模型昆虫物种黑腹果蝇中充分描述，并且编码部分或全部的这些蛋白质的相关基因已经在多种昆虫中被识别(Gempe and Beye,2010)。通常，性别分化多肽在雄虫和雌虫中均被表达，但是在雄虫和雌虫中表达不同的剪接变体。
在目前检查过的所有昆虫中均已发现双性基因，并通常以类似于在黑腹果蝇中观察到的方式起作用(Salvemini,2011)。在检查过的许多昆虫中找到了性别转换基因，并且证据表明，其在雌虫和雄虫中不同地剪接。用于使性别分化编码区沉默的dsRNA被设计为靶向雌虫发育所必需的mRNA。因此，靶向在将要变成雌虫的昆虫中表达的该剪接变体，而不靶向将要变成雄虫的昆虫中表达的该剪接变体。这些剪接变体的特性对许多昆虫是已知的。对于其中剪接变体的特性未知的那些昆虫，其可以通过与已知的剪接变体进行比较来由本领域技术人员容易地确定。可以使用降低双性基因编码的蛋白质的表达的任何dsRNA。在表2中显示了两种dsRNA的实例，并且可以使用一种或两种。

[0037] 本文中描述的方法中使用的dsRNA包括有义链和反义链。该有义链的长度为至少19个核苷酸；但是，更长的长度通常更合意。因此，该有义链可以是但不限于例如至少50、至少100、至少200、至少300或至少400个核苷酸。在所有脊椎动物中，长度大于30个核苷酸的dsRNA将诱导干扰素介导的细胞免疫应答，导致细胞死亡。无脊椎动物，包括昆虫，缺少这种基于干扰素的应答，因此，可以递送更长的dsRNA。有义链与该dsRNA靶向的mRNA，即靶mRNA基本相同，或相同。本文中所用的术语“相同”是指该有义链的核苷酸序列具有与靶mRNA的一部分相同的核苷酸序列。本文中所用的术语“基本相同”是指该有义链的序列在一定数量的核苷酸处不同于靶mRNA的序列，但是保持互补反义链结合靶mRNA和使靶mRNA的表达沉默的能力。例如，有义链的序列在在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸处不同于靶mRNA的序列，而剩余的核苷酸与多核苷酸如mRNA的序列相同。

[0038] dsRNA多核苷酸的另一链(在本文中称为反义链)与该有义链基本互补，或互补。术语“互补”指的是两条单链多核苷酸彼此碱基配对的能力，其中在一个多核苷酸上的腺嘌呤将与第二多核苷酸上的胸腺嘧啶或尿苷碱基配对，在一个多核苷酸上的胞嘧啶将与第二多核苷酸上的鸟嘌呤碱基配对。与另一多核苷酸如靶mRNA“互补“的反义链指的是该反义链的核苷酸与多核苷酸如靶mRNA的核苷酸序列互补。本文中所用的术语“基本互补”指的是该反义链包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个并非与多核苷酸如靶mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸。

[0039] 本文中还提供的是对应于本文中公开的有义链和反义链的单链RNA多核苷酸和单链DNA多核苷酸。本文中还提供的是本文中公开的双链多核苷酸，包括单链多核苷酸的补体。

[0040] 本文中描述的dsRNA可以包括在一条或两条链上的突出端(overhang)。突出端是存在于双链RNA的一条链上的一个或多个未配对的核苷酸，即它们在该双链多核苷酸的另一条链上不具有相应的互补核苷酸。突出端可以在有义链、反义链、或有义与反义链的3’端处。突出端的长度通常为1、2或3个核苷酸。在一个实施方案中，该突出端在3’末端处，并具有序列尿嘧啶-尿嘧啶(或者如果其为DNA的话，具有序列胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)。并非意在限制，此类突出端可用于提高dsRNA的稳定性。在一个实施方案中，如果存在突出端的话，当确定有义链是否与靶mRNA相同或基本相同时不考虑该突出端，并且当确定反义链是否与靶mRNA互补或基本互补时不考虑该突出端。

[0041] 本文中描述的双链RNA的有义与反义链还可以例如通过由核苷酸构成的间隔基共价连接。此类多核苷酸在本领域中通常称为发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)。在有义与反义链碱基配对时，该间隔区通常形成环。构成该环的核苷酸数量可以改变，已经报道了3至23个核苷酸的环(Sui,2002；Jacque,2002)。在一个实施方案中，shRNA包括后接核苷酸环的有义链和类似的反义链。在一个实施方案中，反义链可以在核苷酸环结构之前，随后可以是有义链。

[0042] 本文中描述的dsRNA可以被修饰。此类修饰可用于提高多核苷酸在特定环境中的稳定性。修饰可以包括核酸糖修饰、碱基修饰或骨架修饰，或其任意组合。该修饰可以是合成的、天然存在的或非天然存在的。dsRNA可以包括在该多核苷酸中存在的一个或多个核酸处的修饰。骨架修饰的实例包括但不限于膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸。核酸碱基修饰的实例包括但不限于肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸核苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)或丙炔修饰。核酸糖修饰的实例包括但不限于2’-糖修饰，例如2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖、2'-O-甲氧基乙基核苷酸、
2'-O-三氟甲基核苷酸、2'-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2'-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或
2'-脱氧核苷酸。多核苷酸可以购得，合成以包括此类修饰(例如Dharmacon Inc.,Lafayette,CO)。

[0043] 可用于本文的dsRNA是生物活性的。生物活性的dsRNA导致靶标编码区的表达的转录后抑制，也称为沉默。不希望被理论束缚，在向昆虫施用dsRNA后，该dsRNA的反义链将与靶mRNA和信号细胞核酸内切酶杂交以剪切该靶mRNA。结果是抑制了通过该mRNA编码的多肽的表达。可以例如通过测量该细胞中靶mRNA的量的降低、测量该mRNA编码的多肽量的降低、或通过测量与该mRNA编码的多肽的表达相关的表型的改变来确定靶标编码区的表达是否被抑制。

[0044] 可用于使由表1和表7中公开的编码区编码的mRNA的表达沉默的多核苷酸的实例显示在表2中。表2中还包括的多核苷酸的实例可用于使被双性编码区的雌性剪接变体编码的mRNA的表达沉默。

[0045] 表2.

[0046] 本领域技术人员将理解，表2中显示的示例性dsRNA各自的一部分可用于使靶mRNA的表达沉默，并且也可以使用更长的dsRNA。本领域技术人员还可以理解，能够使用其它dsRNA以使表2中公开的靶mRNA的表达沉默。

[0047] 可以采用本领域中常规和已知的方法设计可用于本文中描述的方法中的dsRNA多核苷酸。例如，可以使用容易获得的算法来识别抑制本文中描述的mRNA之一的表达的候选dsRNA多核苷酸。候选多核苷酸是经测试以确定是否其降低本文中描述的编码区之一的表达的多核苷酸。候选多核苷酸可以与位于编码该多肽的区域中或位于该mRNA的5'或3'未翻译区中的核苷酸相同。可以使用公众可获得的算法(例如BLAST)以比较候选多核苷酸序列与编码序列来筛选候选多核苷酸。可能与非靶标编码区表达的mRNA形成双链体的那些通常不作进一步考虑。剩余的候选多核苷酸可以随后经测试以确定它们是否抑制编码区的表达。

[0048] 通常，通过将候选多核苷酸引入表达适当的多肽的细胞来个别地测试候选多核苷酸。在一个实施方案中，该候选多核苷酸可以在体外制备，并随后施用于昆虫，或施用于表达该靶mRNA的细胞。体外合成的方法包括例如使用常规DNA/RNA合成仪的化学合成。用于此类合成的合成多核苷酸与试剂的商业供应商是公知的。用于体外合成的方法还包括例如在无细胞系统中使用环形或线形载体的体外转录。在一个实施方案中，该候选多核苷酸可以作为dsRNA施用。在一个实施方案中，候选多核苷酸还可以作为编码该候选多核苷酸的构建体施用于昆虫，或施用于表达该靶mRNA的细胞。此类构建体在本领域是已知的，并包括例如编码和表达候选多核苷酸的有义链和反义链的载体，以及包括编码候选多核苷酸的有义链和反义链的序列的RNA表达载体，所述候选多核苷酸侧接有可操作地连接的调控序列，如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子，这导致产生RNA多核苷酸。

[0049] 可用于评估候选多核苷酸的细胞可以是表达适当的靶mRNA的细胞。细胞可以是离体的或体内的。本文中所用的术语“离体”是指已经从昆虫身体中取出的细胞。离体细胞包括例如原代细胞(例如最近从昆虫中取出并能够在组织培养基中受限生长的细胞)和培养细胞(例如能够在组织培养基中扩大培养的细胞)。本文中所用的术语“体内”是指在昆虫体内的细胞。

[0050] 将候选多核苷酸(包括编码候选多核苷酸的载体)引入细胞的方法在本领域中是已知的，并且是常规的。当细胞为离体细胞时，此类方法包括例如使用递送试剂转染，所述递送试剂如脂质或基于胺的试剂，包括阳离子脂质体或高分子DNA结合阳离子(如聚-L-赖氨酸和聚乙烯亚胺)。或者，电穿孔或病毒转染可用于引入候选多核苷酸、或编码候选多核苷酸的载体。当该细胞是体内细胞时，此类方法包括但不限于用该候选多核苷酸喂饲昆虫或将昆虫浸泡在包含该候选多核苷酸的组合物中。

[0051] 当评估该候选多核苷酸是否用于抑制本文中描述的靶mRNA的表达时，可以测量含有候选多核苷酸的细胞中靶mRNA的量，并将其与对照细胞(例如不含有该候选多核苷酸的相同类型的细胞)进行比较。测量细胞中mRNA水平的方法在本领域中是已知的，并且是常规的。此类方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。用于扩增靶mRNA的引物和具体条件可以由本领域技术人员容易地确定。其它方法包括例如Northern印迹法和阵列分析。

[0052] 用于评估候选多核苷酸是否用于抑制由靶mRNA编码的多肽的表达的其它方法包括监控该多肽。例如，测定方法可用于测量由该mRNA编码的多肽的量的降低，或测量由该mRNA编码的多肽的活性的降低。测量多肽量的降低的方法包括测定含有候选多核苷酸的细胞中存在的多肽，并与对照细胞进行比较。使用本领域中常规且已知的方法可以确定细胞是否表达该多肽中的一种，所述方法包括例如Western免疫印迹法、ELISA、免疫沉淀或免疫组化方法。

[0053] 在一个实施方案中，当与对照细胞相比时，候选多核苷酸能够将靶mRNA的表达降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。

[0054] 本文中描述的dsRNA可以通过载体中存在的多核苷酸来编码。载体是复制型多核苷酸，如质粒、噬菌体或粘粒，另一种多核苷酸可以连接至载体以便引起连接的多核苷酸的复制。含有本文中描述的多核苷酸的载体的构建采用本领域已知的标准连接反应技术。参见例如Sambrook,1989。载体可以提供进一步克隆(扩增该多核苷酸)，即克隆载体，或提供多核苷酸的表达，即表达载体。术语载体包括但不限于质粒载体。载体可以导致整合到细胞的基因组DNA中。通常，载体能够在细菌宿主，例如大肠杆菌中复制。本文中描述的多核苷酸可以作为两种独立的互补型多核苷酸存在于载体中，其各自可以经表达以产生dsRNA的有义链和反义链，或作为含有有义链、环区和反义链的单个多核苷酸存在于载体中，其可以经表达以产生具有该dsRNA的有义链和反义链的RNA多核苷酸。

[0055] 载体的选择取决于所得构建体中的多种所需特性，如选择标记、载体复制率等等。在本文中适于克隆或表达该载体的宿主细胞是原核生物或真核细胞。合适的原核生物包括细菌域的成员和古细菌域的成员。在一个实施方案中，合适的原核生物是大肠杆菌。

[0056] 表达载体任选包括与本发明的多核苷酸可操作地连接的调控序列。通常，该启动子导致产生RNA多核苷酸。此类启动子的实例包括引起RNA聚合酶(如RNA聚合酶III复合物)结合以引发本发明的可操作地连接的多核苷酸的转录的那些。在一个实施方案中，此类启动子的实例包括U6和H1启动子。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。另一调控序列是转录终止子。合适的转录终止子在本领域是已知的，并包括例如5个连续的胸腺嘧啶核苷酸的一段序列。

[0057] 将该多核苷酸，如dsRNA施用于该昆虫。向昆虫施用dsRNA的方法包括但不限于通过直接注入昆虫的施用、通过喂饲的施用、和通过将昆虫暴露于其中dsRNA渗透角质层的条件的施用(例如将该昆虫浸泡在包含一种或多种dsRNA的组合物中)。该多核苷酸存在于适于所选施用途径的组合物中。因此，配制要注入的组合物以适于注射，例如，与接受的昆虫等渗等等。待用于通过浸泡施用的组合物适于保持昆虫的存活力。此类组合物的一个实例是不含氯和杀虫剂的水溶液。dsRNA可以在幼虫阶段、蛹阶段或成虫阶段施用于昆虫。

[0058] 该多核苷酸可以与适于所选择的施用途径的化合物复合。例如，多核苷酸可以与纳米粒子缔合(参见例如Zhu等人,美国公开专利申请2013/0137747)和/或促进细胞摄取多核苷酸的其它化合物(参见例如Whyard等人,美国公开专利申请2013/0237586)。在一个实施方案中，该多核苷酸以喂饲给昆虫的固体形式存在。可以根据所针对的昆虫来使用不同的固体形式，并且不同固体形式的使用是本领域技术人员已知的，并且是常规的。在一个实施方案中，该固体形式为细胞。该细胞可以是将被昆虫消化并能够设计经工程改造以表达该dsRNA的任何细胞。该细胞可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞的实例包括细菌域的成员和古细菌域的成员。细菌的一个实例是常规使用的宿主细胞大肠杆菌(Eschericia coli)，另一实例是假单胞菌属(Pseudomonas spp)。真核细胞的实例包括但不限于单细胞微生物如酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，以及植物细胞。可以包含该dsRNA并喂饲给昆虫的其它固体形式是实验室培养昆虫过程中常规使用的，并容易获得。在一个实例中，细胞与营养源和基质如琼脂或其它胶状物质混合，其随后喂饲给昆虫，如幼虫。包含具有dsRNA的细胞、营养源和琼脂的组合物的一个实例在实施例1中公开。在一个实施方案中，与营养源和基质结合的dsRNA不存在于细胞中。本文中还提供的是包含本文中公开的dsRNA的细胞。

[0059] 喂饲给昆虫的细胞可以是能够复制的，或者可以被灭活，即不能复制。细胞可以以任何方式被灭活，只要灭活细胞中的dsRNA保持生物活性，例如不丧失使靶标编码区沉默的能力。灭活细胞的方法在本领域中是已知的并且是常规的，并包括例如热、高压、抗生素(抑菌的或杀菌的)等等。

[0060] 施用给昆虫的剂量足以导致被该靶mRNA编码的多肽的降低的表达。本领域技术人员可以容易地确定此类剂量。在一个实施方案中，当注射该dsRNA时，dsRNA的浓度为、为至少、或为不大于0.01毫克/毫升(mg/ml)、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml。在一个实施方案中，当注射超过一种mRNA时，组合的dsRNA的浓度为、为至少、或为不大于0.01毫克/毫升(mg/ml)、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml。在一个实施方案中，注射的体积为、为至少、或为不大于5纳升(nl)、10nl、15nl、20nl或25nl。昆虫可以被注射一次，或超过一次。在一个实施方案中，昆虫可以在不同的发育阶段被注射。

[0061] 在一个实施方案中，当dsRNA通过浸泡昆虫来施用时，dsRNA在水溶液中的浓度为、为至少、或为不大于0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、或1mg/ml。在一个实施方案中，当存在超过一种mRNA时，组合的dsRNA的浓度为、为至少、或为不大于0.01毫克/毫升(mg/ml)、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、或1mg/ml。该昆虫可以连续或短时期暴露于该dsRNA。在一个实施方案中，该昆虫暴露于含有该dsRNA的溶液以、以至少、或以不多于每天30分钟、1小时、或2小时。在一个实施方案中，该暴露为、为至少、或为不多于1、2、3、4、5或6天。在一个实施方案中，该昆虫是幼虫或蛹，并且暴露在发育阶段的每一天进行。

[0062] 在一个实施方案中，当dsRNA通过喂饲给昆虫来施用时，每天喂饲昆虫该组合物1次或更多次数。在一个实施方案中，该暴露为、为至少、或为不多于1、2、3、4、5或6天。在一个实施方案中，该昆虫为幼虫，并且暴露在发育阶段的每一天进行。

[0063] 在一个实施方案中，可以向昆虫施用超过一种dsRNA。例如，昆虫可以被用单独的组合物注射超过一次，其各自含有一种类型的dsRNA，或者用包含不同类型的dsRNA的组合物注射一次。同样，昆虫可以喂饲包含不同微生物的组合物，其各自含有一种类型的dsRNA，或可以喂饲单一微生物，其已经被工程改造为包含超过一种类型的dsRNA。当向昆虫施用超过一种dsRNA时，不同类型的dsRNA可以靶向相同的mRNA或不同的mRNA。靶向不同mRNA的dsRNA的一些组合在其具有的降低生育力、降低生殖力和/或提高雄性偏置的效果方面具有协同效应。具有协同效应的组合的实例显示在表14中。已经发现，单独使用时不会降低生育力和/或生殖力的dsRNA在与其它dsRNA一起使用时可以导致生育力和/或生殖力的显著降低。例如，针对AAEL001156、AAEL002084、AAEL006841、AAEL007544、AAEL011098、AAEL012096或AAEL014408的dsRNA在与其它dsRNA结合使用时导致协同效应(表14)。

[0064] 本文中还提供的是改造昆虫，包括但不限于通过本文中公开的方法产生的改造昆虫。所述昆虫可以是幼虫、蛹、或成虫。在一个实施方案中，该改造昆虫为雄性。在一个实施方案中，与对照昆虫相比改造昆虫具有降低的生殖力、降低的生育力或其组合的表型。任选地，该改造昆虫与对照昆虫相比在竞争力方面没有显著改变。

[0065] 本文中还提供的是改造昆虫的种群。该种群的昆虫可以是幼虫、蛹、成虫或其组合。该种群与对照种群相比具有降低的生殖力、降低的生育力或其组合。任选地，该改造昆虫与对照昆虫相比在竞争力方面没有显著改变。在一个实施方案中，该种群包括雄性偏置的成虫。例如，该种群为、为至少或为不大于50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％雄性。进一步提供的是制备改造昆虫的种群的方法，包括制备雄性偏置的种群。在一个实施方案中，改造昆虫的种群可以通过在防范设施中大群繁育来制备。在一个实施方案中，改造昆虫的种群可以通过在环境中将昆虫暴露于一种或多种多核苷酸，如dsRNA来制备。例如，在自然环境中的昆虫可以通过向天然环境中存在的饵食中添加dsRNA来暴露于dsRNA。昆虫，如幼虫阶段的昆虫摄取该饵食和该dsRNA。充当诱饵的包括食物物质的组合物还可以包括引诱剂(如信息素)以吸引昆虫。无意限制昆虫的种群的大小，并且可以为例如至少100、至少10,000、至少100,000或至少一百万只改造昆虫。

[0066] 还提供的是使用本文中描述的改造昆虫的方法。在一个实施方案中，方法涉及昆虫的生物防治。生物防治指的是在限定区域内降低目标昆虫的种群，包括控制目标昆虫的种群的繁殖。该区域可以是实验室环境，或自然环境。该方法包括将改造昆虫的种群释放到环境中。该方法导致该环境中该昆虫的成活后代的数量降低，由此导致该环境中该昆虫的数量降低。该方法可以导致在限定区域内消除、抑制、遏制或预防目标昆虫。

[0067] 该环境可以是其中存在目标昆虫的任何地点。释放的昆虫可以处于任何发育阶段，例如幼虫、蛹或成虫，或其组合。在一个实施方案中，释放的昆虫是成虫。向环境中释放昆虫以便用于生物防治的方法，如昆虫不育技术的方法，可以根据昆虫而改变，并且在本领域中是公知并且常规的。或者，可以在自然环境中使用饵食。

[0068] 在一个实施方案中，该昆虫(例如，埃及伊蚊)被喂饲双链RNA(dsRNA)，并且摄取的dsRNA诱导基因特异性RNA干扰(RNAi)，降低一种或多种靶向的基因的表达，导致雄虫不育。此外，该昆虫可以同时喂饲靶向雌性特异性基因的dsRNA，由此抑制雌虫发育。如实施例中所描述的那样，dsRNA的组合导致产生仅为雄性的蚊子，并且当用能育雄虫在交配竞争中进行测试时，该绝育的雄虫在减少蚊子的种群方面高度有效。对雄性繁殖基因的广泛搜索发现，并非所有基因在被RNAi靶向时均能令雄虫不育，并且其它基因使得雄虫无法竞争雌虫配偶。

[0069] 本文中还提供的是以下观察结果：在昆虫的幼虫发育过程中喂饲该昆虫dsRNA可以在成虫中诱发不育。该结果是预料不到和令人惊讶的；在许多昆虫中，在摄取dsRNA后的基因沉默在肠道组织中更为明显，并且肠道之外的沉默可能显著降低，几近于无。这种结果表明，该RNAi表型可以在昆虫的发育过程中持续，并且该dsRNA可以到达性腺以诱发所需表型。

[0070] 这种产生不育的、仅雄性的昆虫的方法是相对于其中性别分类受到挑战(如辐射或用化学不育剂处理时)的其它现有方法的改进方法，并且是相对于使用基因改造昆虫(其中将转基因扩散至非目标种群的可能性颇成问题)的改进。

[0071] 通过以下实施例描述本发明。要理解的是，特定的实施例、材料、量和程序应当根据本文中所述的本发明的范围和精神宽泛地解释。

[0072] 实施例1为了产生不育昆虫而不使用辐射、非特异性化学不育剂化合物或转基因昆虫，开发了使用递送至昆虫的幼虫阶段的口服双链RNA(dsRNA)来使昆虫绝育的方法。在本发明中，识别了几种基因，所述基因当被RNAi靶向时可以使雄性昆虫绝育。在本研究之前，摄入的dsRNA是否可以有效地在肠道之外的所有组织(特别是昆虫的性腺)中使基因沉默还不清楚。除了使与雄虫(和雌虫)生育力相关的基因沉默之外，还确定了通过用靶向涉及性别分化的双性基因的雌性变体的dsRNA喂饲幼虫，可以改变性别比例。结合睾丸特异性与雌性特异性dsx dsRNA，有可能产生几乎完全为雄性且完全绝育或具有严重降低的生殖力的蚊子种群。还发现这些dsRNA可以在细菌中表达，并且向蚊子喂饲活的或热灭活的细菌具有相同的效果。

[0073] 结果1.在蚊子埃及伊蚊中识别睾丸特异性基因。

[0074] 使用抑制性消减杂交技术(参见方法)，识别了37种主要或完全在雄性埃及伊蚊睾丸中表达的基因(表3)。尽管已经在VectorBase中分配了登录号(可以经由万维网获得)，此前并未在蚊子中确定这些基因的功能和组织特异性表达。RT-PCR证实，所有37种基因在这些物种中在睾丸中表达，15种基因既没有显示在幼虫阶段、在其它成年雄性组织中表达的迹象，也没有显示在雌虫卵巢中表达的迹象。使用生物信息学搜索，在某些其它昆虫，包括模型物种黑腹果蝇的已测序基因组中发现了所述37种基因中除三种之外全部的假定同源物(表3)。

[0075] 表3.埃及伊蚊基因的主要或严格在睾丸中表达的基因。在SSH筛选中识别基因，相对于雄虫身体其余部分选择性扩增在睾丸中表达的基因。使用RT-PCR评估基因是否在其它雄虫组织中、在晚龄幼虫中或在雌虫卵巢中显示任何表达。基因依递增的基因登录号排序[0076] 2.使雄虫不育或生育能力低下的睾丸特异性基因的RNAi。

[0077] 使用体外转录，对所有15种睾丸特异性基因制备双链RNA并注入雄性蛹中。QRT-PCR证实，在昆虫体内诱导RNAi，转录物的敲低为对照物水平的40至94％(对照物是用非蚊子特异性gus-dsRNA注射的雄虫)。所有15种目标基因的敲低导致不育或生育能力极弱的雄虫(表4)。但是，并非所有dsRNA同样有效；一些诱导高水平RNAi并对雄性生育力具有较大的影响，而其它dsRNA具有较弱的RNAi效应和对生育力或生殖力的较少影响。总体上，12种dsRNA在大于50％的处理过的雄虫中诱导不育，较低的(<对照物的50％)雄虫生殖力，或高不育频率与低繁殖力。

[0078] 表4.一些睾丸特异性基因的RNAi介导的敲低在雄性蚊子中导致提高的不育频率和降低的生殖力。通过标注是否生殖力降低超过50％(+)、在超过50％雄虫中诱导不育(+)以及二者皆备(++)来评估基因用作SIT用RNAi靶标的潜在适宜性1.由衍生自5只昆虫的组的汇集RNA的三个样品使用qRT-PCR评估的RNAi；
2.基于10只昆虫的三次试验的百分比不育，向各dsRNA注射的昆虫提供两只未交配配偶；如果经1周时间未产生存活卵的话，个体被视为不育；
3.相对于在gus-dsRNA-注射的个体与未交配配偶之间的三组对照交配(其在交配后7天生产43±5个存活卵/雌虫)计算产生存活卵的那些个体的百分比生殖力。

[0079] 3.使雄虫和雌虫不育或生育能力低下的性腺特异性基因的RNAi。

[0080] 使用体外转录技术，对识别为在睾丸和卵巢中表达的6种基因制备dsRNA，并随后注入蛹中，相对于用对细菌gus基因特异性的dsRNA注射的昆虫，雄性和雌性昆虫均导致不育或具有显著降低的生殖力(表5)。

[0081] 表5. dsRNA注入蛹对雄虫和雌虫生育力或生殖力的影响。该值表示三次重复试验的平均值和标准误差1.由衍生自5只昆虫的组的汇集RNA的三个样品使用qRT-PCR评估的RNAi；
2.基于10只昆虫的三次试验的百分比不育，向各dsRNA注射的昆虫提供两只未交配配偶；如果经1周时间未产生存活卵的话，个体被视为不育；
3.相对于在gus-dsRNA-注射的个体与未交配配偶之间的三组对照交配(其在交配后7天生产43±5个存活卵/雌虫)计算产生存活卵的那些个体的百分比生殖力。

[0082] 4.还降低雄虫竞争能力的一些睾丸特异性基因的RNAi。

[0083] 在蚊子埃及伊蚊中测试的15种睾丸特异性dsRNA中，一部分不利地影响雄性交配行为，而其它对雄性交配适合性具有最低程度的负面影响或不具有负面影响。在15种检查的基因中，3种显著降低了雄虫的交配竞争力，3种略微降低了雄虫的交配竞争力，而其余10种dsRNA产生了高百分比的不育雄虫，这些不育雄虫可以有效地竞争雌虫配偶，并因此减少了下一代中产生的后代的数量(表6)。代表进一步筛选以识别合适RNAi的强候选者的这10种dsRNA靶向基因目标是在该物种中产生用于SIT应用的不育雄虫。

[0084] 表6. dsRNA注射的雄虫与可育雄虫竞争并可以减少下一代中的后代数量。将五只dsRNA处理过的雄虫与5只未处理的雄虫和10只未交配雌虫混合。在一周后，收集卵并孵化以评估下一代的种群大小。所述值表示三次重复试验的平均值和标准误差。用gus-dsRNA注射的雄性蛹用作阴性对照物和预期最大种群大小。如果种群大小未减少超过10％，表明对交配竞争力的强负面影响，如果种群未减少超过20％，表明部分负面影响1.种群大小与gus-dsRNA处理过的对照物进行比较，采用学生t检验来比较该值。

[0085] 5.同样诱发不育的黑腹果蝇中的同源基因的RNAi，和一些对雄性交配竞争力具有有限的负面影响或不具有负面影响。

[0086] 用对应于先前识别的10种候选蚊子基因(第4部分中)中的9种的dsRNA注射黑腹果蝇幼虫。对所有注射的dsRNA诱导RNAi，并且9种dsRNA中的6种显著降低了生殖力(降低超过30％)不育，并且6种中的4种仍使雄虫能够与可育雄虫竞争配偶(在一代后种群减少>30％；
表7)。这些发现表明，几种候选基因还可以在其它昆虫物种中用作潜在的SIT目标。

[0087] 表7.黑腹果蝇中的睾丸基因的RNAi产生了竞争配偶的不育雄虫1.数值代表基于衍生自10只汇集的雄虫的RNA的靶向基因表达的降低；
2.Ds-RNA处理过的雄虫与两只未交配雌虫交配，产生的后代数量与gus-dsRNA-处理过的雄虫进行比较。如果与对照物相比后代减少30％的话(φ2，P<0.05)雄性生育力/生殖力被评估为降低。虽然对生育力或生殖力的合适的降低的截断值被认为是30％，黑腹果蝇中靶向的所有这些睾丸基因均导致生育力或生殖力在统计学上的显著降低；
3.五只dsRNA处理过的雄虫与5只未处理的雄虫和5只雌虫混合。相对于与10只可育雄虫交配的对照组，超过30％的存活成年后代产率的降低被认为是显著的(ANOVA，P<0.05)。
虽然30％被认为是显著的，大多数黑腹果蝇中靶向的这些睾丸基因导致下一代中后代的减少，除了标记为“ns”的那些，其表明相对于阴性对照物在生殖力数值方面没有显著差异。

[0088] 6.向蚊子幼虫喂饲dsRNA可以令该昆虫作为成虫不育。

[0089] 用几种可摄取的靶向睾丸基因的dsRNA的制剂处理蚊子幼虫。将幼虫每天1小时暴露(共5天)于溶解在水中的dsRNA，在用识别为对生育力具有显著影响的dsRNA前十位中的七种处理过的雄虫中诱导部分不育和降低的生殖力(表8)。向幼虫连续喂饲表达发夹dsRNA的大肠杆菌细菌(活的或热灭活的)。使用存活或死亡的细菌，三种dsRNA有效地在许多雄虫中诱发完全不育，并在剩余雄虫中显著降低了生殖力。当细菌被热灭活并混合到蚊子喂饲制剂中时，没有观察到RNAi影响的效力的显著损失。这证明有可能利用细菌大规模生产大量dsRNA，并且RNAi效果持续至成年。还突出了使用细菌廉价地并以对喂饲幼虫有吸引力且有效诱导RNAi的形式生产该dsRNA的价值。

[0090] 表8.向蚊子幼虫喂饲dsRNA可以在雄性蚊子中诱发不育和降低的生殖力。该值表示与两只雌虫交配的10只雄虫的三次重复试验的平均值和标准误差1.％不育表示在与两只未交配雌虫交配后完全不育(无成活后代)的雄虫的百分比
2.％生殖力是指相对于衍生自与两只未交配雌虫各自交配的对照雄虫(gus-dsRNA注射的)的后代数量，剩余可育雄虫的成活后代数量。

[0091] 提高的dsRNA浓度提高了dsRNA的绝育效果(表9)。RNAi已知是剂量依赖性的，并且通过提高水处理中的dsRNA的浓度可以增强RNAi的功效。

[0092] 表9.通过提高水中dsRNA的浓度可以实现更高的绝育率。幼虫每天暴露于dsRNA 1小时，向发育的雄虫提供未交配雌虫以测试它们的生育力

[0093] 提高的绝育率也可以通过结合两种不同的dsRNA(靶向不同的基因)来实现。当蚊子暴露于水中的dsRNA或喂饲表达两种不同的dsRNA的大肠杆菌时观察到这种现象(表10)。将表9中显示的绝育率与表10中的值进行比较，显而易见的是可以增强绝育，即使使用较低的各dsRNA的dsRNA浓度(例如0.01mg/ml)。即使单独情况下在诱导RNAi方面并非特别有效的dsRNA在与另一种dsRNA混合时也要有效得多，表明dsRNA的组合是提高绝育效率的有效途径。

[0094] 表10. dsRNA的组合提高了绝育效果。蚊子幼虫每天在两种dsRNA(各自为0.01mg/ml，组合为0.02mg/ml)中浸泡1小时或连续喂饲等浓度的两种大肠杆菌菌株

[0095] 7.向蚊子幼虫喂饲dsxF-dsRNA抑制了雌性蚊子的发育。

[0096] 双性(Doublesex)是在雄性和雌性昆虫中区别地剪接的性别分化基因。dsx的雌虫F剪接变体产生DSX ，其充当控制许多雌性特异性基因在昆虫中的表达的转录因子。相反，DSXM，衍生自雄性特异性剪接变体的蛋白，协调雄性特异性基因的表达。在蚊子中RNAi介导的dsxF的敲低通过递送两种靶向dsx的雌性特异性外显子的dsRNA来实现——通过将昆虫浸泡在两种组合的dsRNA中或喂饲等浓度的两种表达dsRNA的大肠杆菌菌株，所述两种dsRNA各自靶向两种不同的dsxF序列。该dsxF dsRNA抑制雌性成虫的发育，喂饲dsxF dsRNA导致强雄性偏置的昆虫种群(表11)。尽管一些雌虫仍然发育，它们的生育力远低于平均水平；在提供雄性配偶一周后检查它们的受精囊显示在大多数雌虫中均没有精子的迹象，这表明它们并未试图交配。有趣的是，当提供血粉时，仅有一只dsxF-dsRNA处理过的雌虫试图吸血。这些结果表明，如果蚊子幼虫被喂饲dsxF-dsRNA的话，由该培养发育的极少雌虫不应降低绝育雄虫的交配效率，并且不应构成显著的健康风险。

[0097] 表11.用dsxF-dsRNA处理蚊子导致显著减少的雌虫数量，并且所有雌虫均是不育的1.向幼虫连续喂饲热灭活的大肠杆菌；
2.处理混合性别的幼虫；
3.在一周时间内向雌虫提供2只雄虫，提供血粉，并监控卵的孵化。

[0098] 8.用表达dsxF-dsRNA和睾丸特异性-dsRNA的大肠杆菌混合物喂饲蚊子幼虫产生了大多为雄性的蚊子，其均是不育的或具有显著降低的生育力。

[0099] 将两种大肠杆菌菌株混合，一种表达靶向雌性特异性dsxF转录物的dsRNA，另一种表达靶向AAEL004231转录物的dsRNA。这些与喂饲制剂混合(参见方法)以便连续喂饲该蚊子幼虫。将产生的成虫确定性别并提供配偶以评估它们的生育力(产生任何后代？)和生殖力(后代的数量)。喂饲这些大肠杆菌的昆虫几乎完全发育为雄虫(96％雄虫)，表明大部分雌虫因dsxF转录物沉默而未能发育(表12)。该雄虫的绝大部分(96％)是不育的，并且在那些可育的雄虫中，它们产生的后代少于对照处理(其喂饲gus-dsRNA)所产生的后代的1％。在产生的极少数雌虫中，它们的生殖力降低至对照雌虫的11％。

[0100] 表12.喂饲表达对dsxF和AAEL004231特异性的dsRNA的大肠杆菌的蚊子幼虫发育成不育的雄性蚊子。对照幼虫以表达gus-dsRNA的细菌为生。该值表示对50只幼虫的四次重复试验的平均值和标准误差1.在发育8天后发育成雄虫的蚊子的百分比
2.在提供两只未交配雌虫一周后未产生后代的雄虫的百分比
3.经dsRNA处理过的雄虫在与两只雌虫交配后在1周中所产生的后代的平均数量；
4.在作为幼虫喂饲dsRNA后可育的雌虫的百分比。括号里的数字表示经一周时间各雌虫所产生的后代的数量。

[0101] 9.混合dsRNA喂饲的蚊子与未处理的蚊子导致快速种群衰落。

[0102] 来自于喂饲表达靶向雌虫发育和雄性生育力的两种dsRNA的大肠杆菌的培养的蚊子与未处理的蚊子在保持50只未处理雌虫的小型群体饲育箱中混合，并改变dsRNA喂饲的雄虫与未处理的雄虫的比例。收集自dsRNA喂饲的培养的蚊子并未进行性别分类，这意味着在dsRNA喂饲的雄虫中包含非常小的百分比的雌虫。对下一代的数量的影响是显著的，即使用25％的dsRNA喂饲的昆虫来接种该种群也如此，并且当不育雄虫的比例超过50％时，该种群非常强烈地减少(表13)。这表明，即使在没有从dsRNA喂饲的昆虫中完全消除雌虫的情况下，不育雄虫有效地与可育雄虫竞争，并减少了蚊子的种群。少数非不育雄虫(其具有低生殖力)不会阻碍其它雄虫减少该种群的能力。

[0103] 蚊子幼虫还浸泡在等摩尔浓度的两种dsRNA(0.2mg/ml)中，对种群的降低百分比是同等的，如果并不比细菌喂饲法略微更有效的话(表14)。

[0104] 表13.将dsRNA喂饲(通过大肠杆菌喂饲)蚊子混合到蚊子种群中减少了下一代的有效数量。该值表示三次重复试验的平均值和标准误差1.dsRNA处理过的蚊子通常由96％雄虫和4％雌虫组成
2.在混合绝育昆虫与未处理昆虫后12天后活体幼虫的数量。

[0105] 方法：RNA分离：从二日龄雄性埃及伊蚊中解剖睾丸与雄性附腺(MAGs)并储存在RNAlater(Ambion)中。储存在RNAlater中的组织在4℃下在14,000g下离心5分钟，移除上清液，组织用0.5毫升DEPC处理过的水洗涤，并再次沉淀以去除液体上清液。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)进行总RNA提取，并按照制造商的说明书使用Oligotex mRNA Mini试剂盒(Qiagen)分离mRNA。该聚-A RNA(1μg)用于构建各消减文库。

[0106] 消减文库构建：抑制消减杂交法(SSH；Diatchenko等人,1996)用于识别相对于雄性分子体内其它组织在埃及伊蚊睾丸中优先表达的基因。使用PCR-选择cDNA消减试剂盒(Clontech)根据制造商的建议构建睾丸特异性消减文库，使用睾丸cDNA作为cDNA的TESTER源，并且衍生自身体其它部分的cDNA，减去MAGs，充当该DRIVER cDNA。该SSH特异性衔接子连接至该TESTER cDNA，并且将cDNA的两个池进行杂交用于正向消减文库。构建反向消减文库用于随后的示差筛选，其中TESTER与DRIVER标识反转。对应于公用序列的杂交的扩增被抑制，产生富集在睾丸中差异化表达的序列的文库。正向消减文库连接到pDrive质粒载体(Qiagen)中，其用于转化DH5α大肠杆菌细胞(Invitrogen)。所得cDNA文库在补充有100μg/ml氨苄青霉素、80μg/ml Xgal、0.5mM IPTG的LB琼脂上铺板，并在37℃下培养整夜。

[0107] 示差筛选：通过使用引物tubF(5’CGTCGTAGAACCGTACAAC,SEQ ID NO:38)和tubR(5’CAGGCAGGTGGTAATCC,SEQ ID NO:39)比较预测的非差异化表达基因(β-微管蛋白)的丰度，采用qRT-PCR来评估睾丸文库的消减的效率。使用PCR-选择cDNA消减筛选试剂盒(Clontech)按照制造商的说明书对该睾丸消减文库筛选差异化表达的EST。简单地说，随机选择120个大肠杆菌克隆并在50微升LB-氨苄青霉素(100μg/ml)中在96孔板中以适度的摇振在37℃下生长6小时。两微升的各细菌培养物随后一式两份在LB琼脂板上点样，并在37℃下令其生长4小时，随后使用标准技术将细菌菌落转移到Hybond+膜(Amersham Biosciences)上。按照制造商的说明书使用PCR-选择示差筛选试剂盒(Clontech)，通过随机引物法通过用32P-ATP标记来自各文库的100ng总cDNA来制备用于正向和反向消减文库的探针。正向和反向消减探针在旋转炉中使用Rapid–Hyb缓冲液(Amersham Biosciences)在
65℃下进行2.5小时杂交到该DNA膜上。该膜用低严格性(2×SSC，0.5％SDS；3×，各20分钟)和高严格性(0.2×SSC，0.5％SDS；3×，各20分钟)缓冲液在65℃下洗涤。放射性标记的DNA使用PharosFX分子成像系统(Bio-Rad)来检测。

[0108] 睾丸基因的识别：所选菌落(正向消减探针为强信号，反向消减探针为低信号)在2毫升LB-氨苄青霉素(100μg/μl)中生长整夜并使用Qiagen Miniprep试剂盒纯化。使用Big Dye v3.1化学进行测序反应。将DNA序列与VectorBase数据库中的埃及伊蚊基因组进行比较，并针对NCBI的使用缺省参数的非冗余数据库使用BLAST-X来识别预测的黑腹果蝇同源物。

[0109] 睾丸表达的RT-PCR确认：使用qRTR-PCR，比较在睾丸、卵巢和雄性体内该基因的表达水平减去睾丸和MAG的表达，由此证实和量化识别的基因的组织和性别特异性表达。一式三份在BioRad iQ5实时PCR检测系统上使用表15中列举的引物进行反应。S7核糖体蛋白(S7rp)基因表达用作内标以比较RNAi的水平。当使用Pfaffl(2001)的方法计算引物组的PCR效率时，单一参比基因被认为是足够的，并且发现对RNAi靶向的所有基因(β-tub、AeCS1、AeCS2和hsp83)是基本等效的，对于S7rp参比基因，其值为95.2％至98.1％。还进行-ΔΔC了解链曲线分析，并证实在每一样品中用各个引物对仅扩增单一产物。使用2 T方法(Livak and Schmittgen 2001)进行基因表达的分析，将特异性dsRNA处理过的样品与gus-dsRNA处理过的样品中的表达进行比较。

[0110] 表15.用于扩增dsRNA合成用或qRT-PCR分析用的基因片段的引物。SEQ ID NOs:显示在括号内

[0111] 在埃及伊蚊中分离dsxF基因片段：两个引物对，dsxf1-正向(GGTCAAGCCGTGGTCAATGAAT；SEQ ID NO:40)与
dsxf1-反向(CAACATTCTCCGCGCACAGG；SEQ ID NO:41)，和
dsxf2-正向(GCAAATGCTGTTTAACGATAATAG；SEQ ID NO:42)与
dsxf2-反向(CGGAGCCGTTTGGCAACGG；SEQ ID NO:43)用于扩增该dsxF转录物的两种雌性特异性外显子的部分(Genbank登录号：DQ440532和DQ440533)。这两种PCR产物随后用作模板以便通过体外转录来制备dsRNA，并以等摩尔浓度用于dsRNA浸泡或克隆到pL4440质粒中，以用于转化大肠杆菌，用于细菌喂饲，如下所述。

[0112] 将dsRNA注射到蚊子蛹中：使用QIAshredders(Qiagen)以均质化组织，以及RNeasy RNA提取试剂盒(Qiagen)从晚龄蛹和早期成年雄性埃及伊蚊中提取总RNA。RNA用扩增级DNase I(Invitrogen)处理，1μg用于使用First Strand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)来合成cDNA。该cDNA用作模板DNA，用于长度为260至380bp的基因片段的PCR扩增，使用表15中列出的引物。将该基因片段亚克隆到克隆载体pDrive(Qiagen)中，后者使用ApaI与PstI或MluI与NotI限制性内切酶从pDrive中切离，随后连接到类似消化的质粒pL4440中——一种具有趋同的T7启动子的载体(由Andrew Fire,斯坦福大学提供)。一种对大肠杆菌为特异性的细菌基因，β-葡萄糖醛酸酶(gus)基因的401bp的片段，通过PCR由pBacPAK8-GUS质粒(Clontech)使用下列引物来扩增：GusF 5’CCCTTACGCTGAAGAGATGC(SEQ ID NO:44)和GusR 5’GGCACAGCACATCAAAGAGA(SEQ ID NO:45)。如上所述将该401bp PCR产物克隆到dsRNA转录质粒pL4440中以便用作阴性对照物。pL4440中各个基因片段的体外转录的DNA模板使用下列pL4440-特异性引物进行PCR-扩增：pL4440F 5’ACCTGGCTTATCGAA(SEQ ID NO:46)和pL4440R 5’TAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:47)。PCR产物随后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。随后用MEGAscript RNAi试剂盒(Ambion)进行dsRNA的体外转录和纯化。将dsRNA在20mM磷酸盐，pH7中稀释至0.1mg/ml，并用50nl注射各个蛹。为了评估RNAi，允许昆虫发育，直到羽化后的第3天，并如上所述提取RNA。

[0113] 向蚊子幼虫喂饲dsRNA：每天将蚊子幼虫浸泡在脱氯自来水中的两种浓度的体外转录dsRNA(0.02和0.2mg/ml的dsRNA)中1小时，随后送回它们的饲养托盘。为了喂饲幼虫细菌，含有蚊子基因的pL4440质粒用于转化HT115(DE3)大肠杆菌细胞，并通过使补充有50微升/毫升氨苄青霉素和0.4mM IPTG的Luria肉汤的液体培养物生长来诱导dsRNA生产。一旦培养物达到0.7-0.8的OD，通过离心将细胞沉淀成小粒并与含有氨苄青霉素和IPTG的1％LB-琼脂和1克磨碎的Purina Rabbit Chow(冷却至42℃以确保细菌不会被热灭活)混合。将该琼脂细菌混合物铺板至5毫米厚度，冷却，随后使其成为5毫米立方体以便喂饲给蚊子幼虫。为了在相同混合物中喂饲热灭活细菌，在形成小粒后，将细菌暴露于70℃下1小时，随后与琼脂-兔饲料混合物混合并铺板和立方化。琼脂立方体在需要前保存在4℃下。蚊子幼虫以0.5只幼虫/毫升水的密度饲养(10只幼虫的组在20毫升中)并每天提供单个含细菌琼脂的立方体。当蛹发育时，将它们转移到单独的小瓶中等待羽化和性别分类。

[0114] 蚊子生育力测定方法：在25毫升塑料小瓶中向单个的3日龄dsRNA处理过的蚊子提供未交配过的配偶2天时间。向蚊子任意提供10％的蔗糖，为了评估生育力和生殖力，在交配后2天向雌虫提供血粉(来自于大鼠)，并在喂食血粉后一周至10天在放置在该小瓶中的湿润纸巾上收集卵。卵在25℃下培育4天，随后浸没在水中以评估孵化率并计算生殖力。如果没有产生卵，或者所有卵均未能孵化，该dsRNA处理过的昆虫被认为是不育的。对于小的种群，交配竞争仅涉及20只蚊子，使用具有覆盖筛网的盖子的500毫升玻璃罐，而在较大(45×45×45厘米)的筛分笼中使用100只蚊子进行交配竞争。

[0115] 在果蝇中的RNAi：使用表16中列举的引物将黑腹果蝇基因的片段PCR扩增。如上所述制备dsRNA，并注射(20nl，0.1mg/ml)到游走期晚龄幼虫体内。在成虫羽化后两天，收集昆虫并提取RNA以评估RNAi的程度。

[0116] 为了测试dsRNA对生育力的影响，将dsRNA处理过的雄虫与两只未交配雌虫交配，并将产生的后代的数量与gus-dsRNA处理过的雄虫进行比较。如果与对照物相比后代减少30％以上(φ2，P<0.05)的话，雄性的生育力/生殖力被认为是降低的。通过将五只dsRNA处理过的雄虫与五只未处理的雄虫和5只雌虫混合来评估该dsRNA处理过的雄虫与可育雄虫竞争配偶的能力。相对于与10只可育雄虫交配的对照组，超过30％的存活成年后代产率的降低被认为是显著的(ANOVA，P<0.05)。

[0117] 表16.用于扩增来自黑腹果蝇的基因片段的引物和用于RNAi的qRT-PCR分析的引物。SEQ ID NOs:显示在括号内

[0118] 参考文献：Alphey等人,(2010)防治蚊子传播疾病的昆虫不育方法：一种分析(Sterile-Insect Methods for Control of Mosquito-Borne Diseases:An Analysis).Vector Borne Zoonotic Dis.10:295–311.Baum J.A.,Bogaert,T.,Clinton,W.,Heck,G.R.,Feldmann,P.,Ilagan,O.,Johnson,S.,Plaetinck,G.,Munyikwa,T.,Pleau,M.,Vaughn,T.,Roberts,J.,2007.通过RNA干扰防治鞘翅目昆虫(Control of coleopteran insects through RNA interference).Nat.Biotechnol.25,1322-1326.
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[0119] 除非另行说明，在本说明书和权利要求书中使用的所有表示组分的量、分子量等等的数字应当理解为在所有情况下被术语“大约”修饰。因此，除非另有相反的指示，在本说明书和权利要求书中提出的数值参数是近似的，可以根据要通过本发明获得的所需性质而改变。最起码地，并且并非试图将等同原则限于权利要求的范围，各个数值参数应至少按照所报道的有效数字的位数和通过应用普通的舍入技术来解释。

[0120] 尽管描述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，尽可能精确地报道在具体实例中陈列的数值。但是，所有数值固有地包含必然由其相应的试验测量中所发现的标准偏差所导致的范围。

[0121] 所有标题是为了阅读者的方便，不应用于限制标题后的文本的含义，除非如此规定。