白蚁的生物防治

本发明一般地说属于害虫的生物防治领域，具体地说属于采用行为调节剂与昆虫病原真菌组合来防治白蚁的领域。

在滋生期间，白蚁堆积泥土而毁坏包括住宅、商业建筑、和家具的木质建筑物，造成巨大经济损失。白蚁还损害地毯和其它地面料，墙面料，墙粉，壁板，和干的墙材料。住宅滋生白蚁让房主，特别是那些想出售房屋的房主，很恼火。

防治白蚁最常见的方法是定期喷施化学杀虫剂或对四周是土的建筑注射大量的杀虫剂。使用化学处理的问题是：费用高;对人、畜和环境的长期作用尚不清楚;重复的化学处理之后一段时间，可能会产生抗性昆虫品系，因而需要增大使用量或施用不同的化学品;且目前使用的化学品倾向于驱避白蚁而非杀死之，因此对白蚁的防治效果比料想的要小。

昆虫病原菌或许可替代通常使用的高毒化学杀虫剂用于防治害虫。真菌是一类有希望的适合用作生物药剂防治白蚁的昆虫病原菌。

已知真菌或是单细胞生物或多细胞菌落。它们是真核生物因而比细菌更高分化，但比高等植物分化程度低。真菌不能利用光作能源，因此限制在腐生或寄生生活方式。真菌最通常的生长和繁殖形式为无性繁殖或无性生殖，包括孢子形成和随后的孢子萌发。无性孢子，或分生孢子，形成在菌丝的顶端以及侧面，菌丝为多细胞菌落的分枝丝状结构。在适宜的环境下，分生孢子萌发，膨大，并产生萌发管，萌 发管生长一段时间后成菌丝，菌丝再形成菌落。

目前，大多数评价昆虫病原真菌生物防治害虫的工作，集中在涉及农业上的重要害虫和蚊虫的应用。绿僵菌（Metarhizium        anisopliae）是最广泛研究的生物防治昆虫的真菌之一。已将绿僵菌通过许多方法施于害虫，方法包括：直接喷施，注射，和将真菌施于昆虫生活或取食的植物或土壤物质。某些昆虫种类，已出现感染该真菌而死亡的结果。绿僵菌，如Hanel和Watson在73        Bull.Ent.Res.305-313（1983）中报道的，和球孢白僵菌（Beauveria        bassiana），如Bao和Yendol在16Entomophaga        343-352（1971）中报道的，为感染白蚁的真菌的实例。如Kramm等在40        J.Invert.Pathol        1-6（1982）中报道的，一种白蚁中，感染的个体将真菌传染给其蚁群的未感染的成员。

以前大多数利用昆虫病原真菌的研究受到限制的原因是，研究是在实验室条件下进行的，完全不同于昆虫实际的生活条件。大多数报道例中，处理昆虫的死亡是由于吞下或注射非常大量的孢子而取得的，而孢子本身可能是有毒的。在其它情况下，在含有大量真菌孢子的试管或培养皿中滚动或对昆虫喷粉而得到感染。显然，应用这些方法在商业或大规模使用上是不可行的。再者，政府法规会使它难以注册成一种需要对昆虫滋生地，特别是人或食物可能被污染的地区，随机释放大量真菌孢子的真菌杀虫剂。还没有人开发出一种感染白蚁，并确保真菌接种物被广泛地传播的，特别是通过繁殖种群传播的，特效的且商业上可行的方法，用于治理和生物防治侵扰房屋或建筑的白蚁。

Gunner等的美国专利5，057，315，和5，057，316中公开了使用含有病原真菌的传染箱来吸引，并用真菌致死感染昆虫。实施例包括蟑螂 和飞行昆虫。传染箱设计既保持真菌培养物又迫使昆虫进入接触真菌。依据昆虫的类型，通过一种或几种方式如箱的形状，使用食物，引诱剂，调味品，诱饵，或颜色，将昆虫吸引入箱。

需要提供用于白蚁的传染箱。然而，这样的箱以前未描述过，且不清楚箱的形状，也不清楚用什么作白蚁的引诱剂。

因此本发明的目的是提供使用昆虫病原真菌生物防治白蚁的方法和装置。

本发明的再一目的是提供方便，可靠，和经济可行的使用真菌生物防治白蚁的装置。

本发明的再一目的是提供驱避白蚁，防止白蚁滋生和损害建造物或地区的方法和手段。

本发明的再一目的是提供最终传染饲养蚁群的全部或大多数白蚁的方法和手段。

本发明的另一目的是提供用各种真菌感染和杀死白蚁，以避免形成抗性种群的方法和手段。

已开发出保护建造物不受白蚁侵扰的方法。优选实施方案中，采用激发一系列行为，包括取食，吸引，和尾随的召引刺激剂（本文称作“引诱剂”），如用真菌Gloeophyllum        trabeum或其挥发物，吸引白蚁与潜在的致死真菌，如绿僵菌或球孢白僵菌接触。另一实施方案中，使用如绿僵菌的天然驱避白蚁的真菌，并用于防止白蚁进入由驱避真菌包围的地区。以传染箱或与营养组合物配制的方式，提供单独的或与引诱剂真菌组合的昆虫病原真菌，并直接施于走廊或通路直至蚁巢最初感染，侵染白蚁并致蚁群死亡。真菌的优点是，一旦建立，真菌在一定的时间内连续保护建造物不受白蚁损害。当白蚁经传染箱 接种时，虽然其它真菌也可用作病原菌，但最优选的昆虫病原真菌是绿僵菌和球孢白僵菌。绿僵菌是优选的驱避真菌。Gloeophyllum        trabeum为优选的引诱真菌。实施例证实了使用含绿僵菌和球孢白僵菌的箱可防治白蚁。

图1为白蚁传染箱的透视图。

图2A和2B为觅食时暴露于真菌后，习惯路线上白蚁减退的曲线图，将生存率相对于处理后以天为单位的时间绘成曲线图。图2A为与对照（○）相比暴露于绿僵菌后的生存率（□），图2A为与对照（◇）相比暴露于球孢白僵菌的生存率（□）。

本发明主要依据两个发现：（1）昆虫病原真菌可以用来感染和杀死白蚁，但需要引诱剂将白蚁诱入与真菌接触和（2）某些类型的真菌，由于他们对白蚁的天然驱避性，可用于从某个地区将白蚁逐出。将单独或与真菌引诱剂及其衍生化合物组合的病原真菌，或驱避真菌，以营养制剂或起始感染或驱避白蚁的真菌培养物的传染箱的形式，施于要处理或保护的区域。

与防治白蚁的昆虫病原真菌相关的主要问题是，病原真菌应表现出驱避白蚁，使得它极难以得到充分扩散感染而显著减少白蚁的种群。将真菌或其它引诱剂与昆虫病原真菌组合克服了昆虫病原真菌的驱避性，解决了这一问题。

另一主要问题是如何维持有效杀死白蚁的真菌培养物，此问题通过开发出的营养制剂得以解决，该制剂当施于有白蚁的土壤时能有效地建立真菌培养物。营养制剂由在培养基上的真菌组成，营养基如糠或其它纤维素质食物，营养制剂可以干粉施用，如谷粉或锯木屑。

另一更主要问题是用感染致死的真菌感染白蚁。此问题已由在要 处理或保护的区域的附近使用有效建立真菌培养物的传染箱而解决。传染箱包括真菌培养物的营养源，以及在要保护或处理的区域事先建立的包含或保护的真菌。

真菌的选择

可从感染的白蚁（病原真菌）或从白蚁侵扰的食物（真菌引诱剂）分离菌，或使用常规技术从土壤或从保藏的培养物中分离菌，以得到有用的真菌。这些真菌可从美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn        Drive，Rockville，Maryland（ATCC）或昆虫病原真菌培养物USDA-ARS保藏中心，U.S.Plant，Soil        and        Water        Lab，Tower        Road，Ithaca，New        York（ARSEF）不受限制地得到。筛选存在真菌的土壤样品得到土壤分离菌，然后用生物测定测试真菌对昆虫的作用。当暴露的昆虫死亡时致病性便得到确认。

至少两种昆虫病原真菌，绿僵菌和球孢白僵菌，已显示感染和杀死白蚁的作用。例如包括MM.anisopliae        ATCC        62176和ARSEP        1112，它们还显示驱避白蚁作用。

如下面的实施例所示，在实验室条件下将白蚁暴露于土壤筛选分离菌，可以得到有用的真菌。有用的病原真菌为那些直接接触之后能杀死白蚁的真菌。有用的真菌驱避剂为那些在如下所述的土壤盒测试中，驱避白蚁的真菌。如本文中采用的，“真菌趋避剂”包括如Metarhizium        spp.的真菌，或由有效驱避白蚁的真菌产生的化合物。

引诱剂

有用的引诱剂为那些吸引白蚁，或刺激白蚁召引其它白蚁聚集和 取食的引诱剂。优选的白蚁引诱剂包括Gloeophyllum        trabeum（正式名Lenzites        trabea）和它的一些代谢产物，由某些真菌腐坏的含可提取引诱剂物质的木材，和如下列文献中描述的某些有机化合物模拟尾随激素Watanabe        and        Casida，56∶3        J.Econ.Ent.300-307（1963），Matsumura，F.，等人，65∶2        J.Econ.Ent.600-602（1972），Smythe，R.V.，等人，58∶3        J.Econ.Ent.420-423（1965），和Prestwich，G.D.，等人，10∶8        Journal        of        Chemical        Ecology        1201-1217（1984），其中的技术引入本文。箱的形状及其组成，以及箱的位置也可用来吸引白蚁。

如Matsumura，F.，等人，62∶3        J.Econ.Ent.699-603（1969）;Watanabe        and        Casida（1963）中描述的，一些真菌腐坏的木材，含有白蚁的引诱剂。例如，由褐腐真菌G.trabeum腐坏的木材含有（S.S.E）-3，6，8-十二碳三烯-1-醇和其它已知召引白蚁的化合物。Grace，J.K.，92        Proc.Entomol.Soc.Wash.773-777（1990）中，用白蚁对与抗氧化剂组合的由G.trabeum腐坏的木材的提取物的反应，进行涉及尾随活性的行为生测。Watanabe和Casida（1963）还发现许多有机化合物可以吸引白蚁。已观察到白蚁引诱剂活性受木材的大小影响，木材的大小必须超过最小质量以保证召引。

已知至少一种真菌，G.trabeum产生吸引白蚁的物质并掩盖病原真菌的驱避力。其它的有用真菌是腐坏木材的真菌。可从ATCC得到几种G.trabeum分离菌，对ATCC        13021作了测试并确认其有吸引力。

真菌的培养基

可用在传染箱的适合培养基是已知的。培养基的例子是本领域熟练技术人员已知的并可从市场得到，包括马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），或绿僵菌属和白僵菌属生长用的米琼脂。米琼脂由1%葡萄糖，1%酵母浸出液，5%米粉，1.5%琼脂和0.5% 5×Dubois孢子盐溶液组成。5×Dubois孢子盐溶液由15g（NH4）2SO4/1000ml;0.30g MgSO47H2O/1000ml;0.15g MnSO4H2O/1000ml;0.0375g CuSO45H2O/1000ml;0.0375g ZnSO47H2O/1000ml;和0.0038g FeSO47H2O/1000ml组成。每一种盐完全溶解后加入另一种盐，并将溶液用高压消毒。

其它的有用培养基是已知的并可从本领域熟练技术人员已知的那些中优选出来。例如，PDA或象锯木屑的纤维素材料可用作培养基，用于G.Trabeum的生长。

传染箱

如本文采用的，“箱”是指在存在的种群中，用于起始传染过程的接种箱。传染箱（1）在很小的体积中，浓缩极高浓度的病原真菌接种物，直接使白蚁接触孢子侵染并杀死白蚁;（2）含有真菌孢子和/或菌丝，使真菌最小地暴露给环境且使真菌不进入环境，因此增加培养物的成活力并最小地污染真菌培养物;和（3）通过白蚁引诱剂如Gloeophyllum        trabeum或其挥发产物的存在将白蚁吸引到病原真菌，克服了病原真菌的驱避特性，引诱剂可以单独或与作为白蚁食物源的锯木屑或木片组合使用。

该箱可由非生物降解材料，或生物降解材料制成，并设计建成有效抗白蚁传染的传染区。重量轻的小传染箱（或栓）不显眼，并可容易置于大量白蚁滋生的位置，增加装置的有效率。

在箱内，一种真菌培养物可用作引诱剂而第二种在长时期内提供传染孢子的持续供应。这些孢子附在白蚁上并产生穿透白蚁表皮的萌发管，导致白蚁在短时间内死亡。如由木材分解产生的挥发化合物的引诱剂，可以单独提供或与如Gloeophyllum        trabeum的木材分解真菌组合提供引诱作用。虽然外接触是主要的传染方式，白蚁也可由相互接触和由消化孢子传染。

这些引诱剂作为白蚁的食物源，单独或与纤维质材料结合，激发另外的箱与蚁群道路间的白蚁尾随行为反应，因此召引其它的白蚁受感染并由此将孢子传到蚁群中的其它白蚁。

一旦进入箱内，白蚁就直接与昆虫病原真菌接触。真菌的分生孢子附在白蚁体上。附着之后，分生孢子在昆虫表皮上萌发，形成穿透白蚁外皮的萌发管。萌发管不断穿透直到到达白蚁的内体腔（血腔）而杀死之。白蚁死后，给予适宜的相对湿度和温度条件，白蚁体上真菌菌丝可产生孢子，且其它白蚁可由于暴露于死去的白蚁产生的分生孢子而传染。未感染的白蚁暴露于感染白蚁或白蚁尸体表面的孢子后，会有效地传播病原菌。通过白蚁的社会行为可提高孢子的传播，社会行为，例如，清理，接触交流，运输和埋葬尸体，和粪便物的交换，以及自相残杀。一些白蚁也会消化孢子，它促成或导致白蚁的死亡。

箱由形成箱基本形态的外箱和装填箱单元的内核心的混合物组成。室箱可用常规材料包括玻璃，金属，压模或可塑塑料，或木材构建，但优选由下列构建：可生物降解纤维质材料如卡纸板，纸板，木材，压合树脂刨花或刨花板，膨胀纤维素，制型纸或泥炭。

如图1所示，室10应有大得足以让白蚁自由出入的12个小开口（2-5mm直径）或能易于让白蚁嚼透的薄壁14。

优选的实施方案是管状构建物。形状可从园形至相截的多尖端的多角形，但最好是三角管。箱的长度应从10至30cm，边宽3至8cm。箱的顶端16是尖的，为的是方便将箱安置在地上。顶端16可由与箱壁14相同的材料制成，并涂有树脂或其它材料以增加强度，或顶端可由更硬的材料如塑料或木材制成。室箱的盖18在填充后用纸或塑料盖覆盖。

箱内，室核心可装填以下几种成分的混合物：（1）白蚁的基本食物源（纤维质材料，最廉价的锯木屑，（2）引诱剂：在锯木屑上生长4-8周的G.trabeum培养物，杀死的G.trabeum培养物，或G.trabeum培养物的提取物，或合成的化学引诱剂，定留剂，外激素或追踪激素;和（3）致死剂（绿僵菌或其它生长在固体或液体培养基上的昆虫病原生物，与食物链和保护剂，或孢子一起配制成干或湿制剂。）核心混合物应含有在比例上超过致死真菌的引诱剂，优选剂量为，100g用G.trabeum接种的锯木屑：5g与燕麦糠混合的绿僵菌菌丝干制剂：1g绿僵菌孢子。

这些成分可以是空间分离的或均匀混合的，以最大地让白蚁接触致死真菌并给白蚁个体提供超剂量的致死真菌孢子。为生长或固定适合的真菌培养物或为在装置内保持营养物，培养物可施于用作支撑基质的惰性晶板或栅板。

可由下列方式将箱适当地安置：（1）如果箱是由硬质材料建造，将它直接插在地上;（2）将它插在用如泥铲或样品芯仪的工具挖的洞中;（3）将它放在可用来将箱插在地上的空筒工具的内套里。

下面给出的是一般的准则，它可依据场所，白蚁的密度和种类，气候，和其它可影响箱有效率的变化因素而改变。将箱置于要保护的 构建物的地区周围，距离构建物不小于3米但最好是5至10米。箱应集中在有白蚁活动的地区或白蚁活动地区和要保护的地区间。箱间隔距离为0.1米至1米。

温室和实验室测试表明致死真菌绿僵菌在土壤中以高水平存留达90天以上，而球孢白僵菌属在农业土壤中至少从五月存留至十月。

传染箱和制剂的制备

先建如图1所示的箱单元，然后用核心内容物装填之，便可构建出适合感染白蚁的传染箱。箱单元可切自有弹性的平板纤维产品，折成所要的形状并粘接在一起。更希望的是在切割和折叠之前，先将塑料，树脂/木，制型纸或泥炭板造形。造形形成槽和壁上的孔而折叠形成最后的形状。可以是一次造成完整的形状，或也可造成可以由粘，钉或小缝榫接的组装部件。

接下来用核心混合物填充装配箱。该核心混合物分三个步骤配制。步骤Ⅰ中，为白蚁和G.trabeum两者制备纤维质营养物，典型的是锯木屑。将锯木屑装在塑料袋或其它容器中，用高压消毒两次，之间冷却时间为12-24小时。用采自液体培养基如马铃薯葡萄糖汁的G.trabeum菌丝接种锯木屑。将锯木屑和G.trabeum菌丝混合并在24-27℃下培养4至8周。

步骤Ⅱ中，将纤维素G.trabeum培养物与配制的绿僵菌菌丝混合。该制剂由采自液体培养物（1%酵母浸出液，1%胨，4%葡萄糖）的绿僵菌菌丝与干食料（燕麦糠粉），矿物盐和防腐剂混合而制备。将混合物干燥并研磨制成颗粒。

最后，步骤Ⅲ中，将上述制备物与绿僵菌分生孢子混合，该分生 孢子采自大米琼脂生长板，已在大米上接种并生长三周。然后用手工或机器将核心混合物装入箱中并封上盖。此外，可将支撑基质核或栅格核插入箱中。基质核为装有如前述真菌制备物的小袋：纤维素材料中的G.trabeum和琼脂中的绿僵菌，或干的菌丝制剂或采集的孢子。

下列非限定性实施例证明传染箱，制剂和其成分控制白蚁的效力的理论和功能参数。在所有的例子中，观察到白蚁的行为明显受箱成分的影响，并且白蚁虫口被存在于传染箱中的真菌明显减少。

实施例1        将Weed        Wood白蚁（Zootermopsis        angusticollis）直接暴露于绿僵菌和白僵菌，证明真菌杀死白蚁的效力

将白蚁五个一组转移到真菌生长了7天时间的培养盘上。5分钟后，将白蚁移至干净盘，并去除多余的分生孢子。30分钟后，将白蚁转移到铺上一层湿滤纸和Kim手巾的固定板上。然后在室温下在固定板上放上装有湿纸的塑料盒。结果如表1所示。

表1        接触选择的真菌后观察白蚁（Zootermopsis        agusticollis）反应

真菌试剂        暴露后30分钟        第3天的        第5天的

白蚁的表现        白蚁死亡率        尸体表现

绿僵菌        缓慢        100%        覆盖真菌

ATCC    62176

球孢白僵菌        病态        100%        覆盖真菌

ESC    71

球孢白僵菌        病态        80%        一些真菌生长

ARSEF    721

对照        良好        0%        不适用

如表1所示，三天后所有的＃62176和＃71处理的白蚁死亡，而所有的对照白蚁都活着。五天后，尸体出现真菌生长的覆盖物。

由此得出结论，白蚁个体与病原真菌培养物的直接接触导致白蚁的死亡。

实施例2        将白蚁直接暴露于真菌分离菌对Fastern        Subteeranean白蚁（Reticulitermes        flavipes）的感染

从Montague，Massachusetts的森林收集含白蚁的木材。将白蚁从木材中分离，并置入个体可以移出做生测的实验室蚁群。将十只白蚁放在含有病原真菌形成孢子的培养板的表面15分钟。处理后，将白蚁转移到含有滤纸的固定板上并观察一段时间。

表2中显示的结果表明，一些绿僵菌和白僵菌菌种对白蚁很有效，并可用作白蚁防治。由于土壤分离菌也显示高的效力，这证明，可使用常规方法从土壤中获得这些病原真菌。

表2        接触生物测定法的抗Reticulitermis        flavipes真菌活性

分离菌        死亡百分率

来源        #        菌属        24小时        72小时

ARSEF21112 绿僵菌 100 100

1912        100        100

2080        100        100

925        60        100

1095        60        100

538        40        100

1080        40        100

1116        40        100

2167        40        100

23        10        100

2951        0        100

1489        0        100

1878        0        80

ARSEF        252        90        100

721        63.6        100

1079        0        80

ATCC338249 绿僵菌 70 100

62176        0        100

ATCC        48585        白僵菌        50        100

48586        0        80

土壤 ESC4(JK) 130 绿僵菌 40 100

土壤    ESC(JK)        131        30        100

土壤    ESC(JK)        196        0        100

昆虫    ESC(JK)        10        白僵菌        90        100

昆虫    ESC        71        80        100

昆虫    ESC        70        60        100

土壤    ESC(JK)        223        50        100

昆虫    ESC(JK)        241        30        100

土壤    ESC(JK)        161        0        100

1.接触生物测定法：将动物置于生长真菌的盘上15分钟，然后将它们转移至含有湿滤纸的固定板上观察。

2.ARSEF：USDA-ARS昆虫病原真菌培养物保藏中心

3.ATCC：美国典型培养物保藏中心

4.ESC：EcoScience        Corporation分离菌

实施例3        将感染的白蚁直接放入蚁群传染蚁群的成员

将白蚁（Z.angusticollis）四个一组置于纤维素粉和从琼脂生长板上刮下的绿僵菌或球孢白僵菌分生孢子的混合物覆盖的小木片（2cm×0.5cm×0.5）的培养皿中。将白蚁暴露于此传染源一小时，然后移至固定板。48小时后，将一组暴露的白蚁引入至另一组未暴露于真菌的白蚁中。接触九天后，将第二组的未显示任何生病迹象的白蚁，转移至第三组未暴露的白蚁中。一段时间后观察各组白蚁的死亡率。

五天后，开始暴露于真菌的两培养皿中的第一组白蚁成员全部死亡，第13和15天之间，第二组的死亡。第23天，最后一次转移14天后，所有暴露的白蚁死亡且有些产生真菌。各种的对照白蚁全部存活。

该研究的结果说明，病原真菌在白蚁间转移，且导致从未接触过原传染源的白蚁死亡。传染的传播可能发生在如进行清理的社会行为中。

实施例4        通过暴露于蚁巢外的真菌而感染白蚁

将三个小培养盘（15×100mm）和一个大培养盘（20×150mm）用管连接成一系列相互连接的室。大培养盘模仿蚁巢有水池和几片木材。 让白蚁在此环境里生活一个月。将或是绿僵菌或是球孢白僵菌的分生孢子的真菌制剂，涂在滤纸盘和/或置于最外室的牙签上。六个白蚁一组，且处理重复两次。

结果示于图2中。重复的数据加在一块以增加样本的虫口数。用ATCC62176处理的白蚁死亡，其LT50为26天，而所有对照都存活。用ESC71进行的试验出现相似的结果，结果是LT50为22天。

上述研究的结论是，当配制的真菌放置在白蚁觅食区域内时，小蚁群的所有成员可被真菌感染杀死。

实施例5        在距蚁巢一定距离，对土壤施用真菌制剂进行比较

1.土壤盒效力测试

将塑料盒（15×20×35cm）的底部埋入土中2至3cm，将含有300只白蚁的模拟蚁巢置于盒的一端。由两个20×100mm培养皿底制成蚁巢，边上开四个洞，开口面对在一起放好，并装上滤纸和木片。让白蚁适应此环境3至10天。在盒的另一端，在土中挖一个1.5-2cm深的洞，施用真菌制剂。将木板（5cm×3cm×7cm）置于含有制剂的洞中，并半埋在土里。制剂包括（A）颗粒形式（燕麦、麸谷和菌丝）和（B）粉形式（纤维素和分生孢子）。定期查看木材，土壤和巢，观察真菌对白蚁的活性。

表3中所示的结果说明，可以通过在木材附近施用真菌制剂而保护木材。还说明可以通过在离开蚁巢的一定距离，在白蚁侵扰的地点施用真菌制剂杀死蚁群。

表3        白蚁对土壤中的真菌制剂的反应

真菌        真菌生长和白蚁反应

第3天        第20天

ATCC    62176

制剂A        真菌生长        白蚁全部死亡

制剂B        不生长        白蚁全部死亡

ESC    71

制剂A        真菌生长        木材周围没有白蚁,

蚁巢有生气

制剂B        不生长        白蚁贯通活动,

蚁巢有生气

对照

制剂A        白蚁在木材下挖洞        白蚁贯通活动,

在木材上穿洞

制剂B        白蚁在木材下挖洞        白蚁贯通活动,

在木材上穿洞。

实施例6        离开蚁群一定距离诱导真菌致病力的筛选

将塑料盒底埋入土中2至3cm，将含有约300只白蚁的人工蚁巢置于一端。巢由两个20×100mm的培养皿底制成，边上开四个洞。将培养皿的开口对在一起放好，并装上滤纸和木片。将白蚁转移至巢中，并让其适应环境3至7天。在盒的另一端，在土壤中挖 一个洞，施用干的菌丝制剂，在洞上放木板（5×3×7cm），再盖上土。定期查看木材，土壤和蚁巢，观察真菌对白蚁的活性。

一组分离菌的效力示于表4中。在许多情况下，真菌生长良好。在特定的情况下，白蚁被驱逐出真菌生长的地区。在有限数量的情况下，在蚁巢中发现死蚁。之后，从蚁巢的尸体上找到真菌。

最有效的杀死蚁巢的分离菌为ATCC        62176和ESC        70，分别为绿僵菌和白僵菌。其它高效且驱避的分离菌为2080和1112。

实施例7        白蚁引诱剂试验

开始在短距离上进行研究，确定G.trabeum作为引诱剂的效果。将由玻璃和木材制成的场地（60×60×50cm），涂上一层薄塑料。在最后的试验中，在塑料上面放上一层薄土。将边上带有六个孔并含有湿滤纸的转换培养皿中的白蚁（150至300只），放在该场所的一边。

在一组试验中，将装有（a）潜在引诱剂和（b）对照材料的微离心管（1.5ml）放在场所的另一边，离蚁巢15cm和25cm远处。场所用定时照像机录像并观察15天。另一组试验中，做法相似，除了用G.trabeum锯木屑和绿僵菌（分生孢子或菌丝）的混合物装试管，代替G.trabeum锯木屑和对照的锯木屑。所有的试验重复三次。

结果显示G.trabeum感染的锯木屑优于未感染的锯木屑。当绿僵菌分生孢子或菌丝与G.trabeum混合时，白蚁对绿僵菌的存在没有反应;这就是说，它们进入引诱剂管和引诱剂加绿僵菌的管。在两种情况下，在试验开始后2-7小时，它们与管接触并挖出管中的锯木屑或G.trabeaum/绿僵菌锯木屑混合物。当土壤存在时，它们建立朝向试验样口的土隧道。在比较加绿僵菌菌丝的G.trabeam锯木屑与单独的G.trabeum锯木屑的试验中，15天后暴露于绿僵菌的蚁巢白蚁全部死亡（死亡率100%）。带G.trabeum锯木屑的绿僵菌分生孢子制剂未取得这样高的死亡率。

上述研究的结论是（1）与未腐坏的木材相比，白蚁较喜欢由真菌G.trabeum部分腐坏的木材，且腐坏的木材激发白蚁召引和挖掘活性，和（2）G.trabeum存在时，白蚁不理会致死真菌并以相似的 活性忙碌;这就是说，G.trabeum克服致死真菌的驱避作用。

实施例8：使用引诱真菌确立白蚁的觅食范围

将场所（122×366×30.5cm）建好并盖上1cm的土。将含约1000只白蚁和滤纸的双培养皿人工巢，置于场所的另一端，离四面墙壁中的三面61cm远。

A）在场所的中央放置G.trabeum腐坏的木片（15×3×2cm），离巢122，183和244cm远。将它们保留一周，并且间一天监视一次白蚁的活性。

B）将装有用G.trabeum接种并培养几周的锯木屑的纸板管（15cm高×4cm直径）置于离巢122，183和244cm远。将它们保留一周，定期观察白蚁的活性。

C）将如上述的木片和纸板管移至离巢60cm之内;将它们保留一周，并定期观察白蚁的活性

观察到白蚁在离巢30至60cm远掘隧道。在离巢远达200cm的区域可见白蚁。然而，未观察到试验A的木片上或周围或者试验B的管中有白蚁。另一方面，如试验C中所示，一旦木片或纸板管移近巢，隔夜便发现木片上和管中有白蚁。

与田野中的相比，实验室条件下白蚁觅食的范围会更受限制。这些条件下的召引会只在有限的距离内发生。巢中充足的食物也会降低觅食的需要。然而，即使在这些条件下，G.trabeum显然起着召引刺激物的作用。

实施例9        真菌引诱剂箱对白蚁的吸诱作用

A.木材试验

将约1000只白蚁从Montague，Massachusetts的森林区采集的木材中分离出，并置于带湿滤纸的培养皿中。

试验场所为122×122×30cm（长×宽×高），由plexi玻璃制成，没有盖。将场所填5cm的土。用G.trabeum接种用高压消毒的湿木片（15×3×2cm），生长8周，并置于4cm直径和13cm长的纸管中。高压消毒的木片进行类似处理，但不用G.trabeum接种。第三种情况下，使用非经高压消毒的木片装入相同类型的纸管。将蚁群放在盖有培养皿的场所中央。培养皿壁上的四个开口作为白蚁四个方向的入口，每个孔指向场所的一个角。将管靠场所壁垂直放置，一面壁三个，隔10cm，每只管都部分插入土中。管的安排如下：

面1：管A-G.trabeum木材

管B-高压消毒的木材

管C-木材

面2：管D-高压消毒的木材

管E-木材

管F-G.trabeum木材

面3：管G-G.trabeum木材

管H-高压消毒的木材

管I-木材

面4：管J-高压消毒的木材

管K-G.trabeum木材

管L-木材

一天后，任何管中未发现白蚁，虽然巢中的白蚁入侵了土壤。5 天后，在所有含G.trabeum的管中发现白蚁，但其它管中却没有。

从此试验得出结论：即使在土中，箱内的G.trabeum也有效地吸引白蚁。

B.锯木屑试验

除提及的外，试验条件与上述木材试验的相同。用如下所列的各种锯木屑代替纸板管中的木片：（1）未经高压消毒的新鲜锯木屑（增湿的）;（2）高压消毒的锯木屑（增湿并经高压消毒25分钟）;（3）G.trabeum锯木屑（增湿并高压消毒，然后用G.trabeum接种并在室温下培养约8周）。

如上所述按以下顺序安排试验管：

面1：管A-高压消毒的锯木屑

管B-未经高压消毒的锯木屑

管C-G.trabeum锯木屑

面2：管D-未经高压消毒的锯木屑

管E-高压消毒的锯木屑

管F：G.trabeum锯木屑

面3：管G：未经高压消毒的锯木屑

管H：高压消毒的锯木屑

管I：G.trabeum锯木屑

面4：管J：高压消毒的锯木屑

管K：G.trabeum锯木屑

管L：未经高压消毒的锯木屑

此试验的结果是：巢中的白蚁走入土中，很少留在巢中。所有的 G.trabeum管中和一支高压消毒的管（管H）中发现白蚁。此试验的结论是G.trabeum吸引白蚁，但在此项研究所用的时间和距离内，单独的锯木屑不吸引白蚁。白蚁只从一组放置在土壤中的箱中选择G.trabeum接种的箱。

实施例10        用土盒选择试验比较真菌制剂

将塑料盒底埋在表土中3cm深，将含有300只白蚁的人工巢放在一端。巢由两个20×100cm培养皿底制成，在边上有四个孔，开口对好放在一起，并装有滤纸和木片。让白蚁适应此环境3至10天，在盒的另一边，将两块小木片放于在土中挖的浅洞里。

每块木用引诱剂（G.trabeum感染的木片），或配制的真菌（与燕麦糠混合的ATCC62176），或两者处理或未处理。每盒中板的安排如下所示：

盒        板1        板2

A        木材        木材和引诱剂

B        木材        木材和配制的62176

C        木材和配制的62176        木材和引诱剂

D        木材        木材和引诱剂和配制的62176

引诱剂放在木块上面同时配制的致死真菌（62176）放在木块下的土壤中。

当给定一选择（盒A中）时，与单独的木材相比，白蚁较喜欢与G.trabeum有关的木材。白蚁穿透木块的表面建造可见的隧道以到达G.trabeum感染的木材。在盒B中，与置于绿僵菌制剂上的木块相比，白蚁较喜欢未处理的木块。这些结果表示绿僵菌驱避白蚁。在盒C中， 与放置于绿僵菌制剂上的木块相比，白蚁较喜欢G.trabeum处理的木块。当绿僵菌和G.trabeum置于相同的木块附近（盒D）时，比单独的绿僵菌如盒B中，蚁巢中的白蚁死亡要快。

G.trabeum显示吸引并引起白蚁召引其它白蚁，建巢和取食。与白蚁相遇时，绿僵菌驱避白蚁。当两种菌组合时，由于引诱剂（召引刺激物）的存在，白蚁与致死真菌的接触要容易。因此，可得出结论，以适当的比例和空间构象组合，G.trabeum将克服绿僵菌的驱避性质并最终导致广泛传染和杀死蚁群。

实施例11        绿僵菌ATCC62176颗粒剂的驱避作用

在前面描述的场所中，将两个含有G.trabeum锯木屑的培养皿相距45cm远放置，并离随后放置蚁群的位点60cm远。在一个培养皿周围放上20mm宽的一圈培养物62176制剂，而另一培养皿由对照制剂（没有绿僵菌的燕麦麸）包围。然后将制剂与土壤混合形成在G.trabeum锯木屑皿周围的制剂区。再用水喷施场所以放置土以及制剂。五天后，蚁群转移入离两培养皿60cm远的场所中。观察G.trabeum皿中真菌生长和白蚁的活性并用来评价制剂的驱避效果。在同样的时间设立三个场所作为重复Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，各场所具有与上述相同的设置。

蚁群引入12天后，白蚁穿过对照制剂区，抵达三个场所所有的G.trabeum皿中。在这三个场所中，每个有几百只白蚁。皿中的白蚁还挖掘锯木屑并建造隧道，这点从皿外可见。在相同的时期内，只有两个场所中（场所Ⅰ和Ⅱ）一些白蚁穿过62176制剂区，并且这些引诱剂皿中，每皿都不超过20只白蚁。62176包围的培养皿外见不到白蚁活动或任何隧道。

显而易见，穿越62176制剂区的白蚁数与穿越对照制剂区的白蚁数之间有显著的差别。这表示如果该制剂与G.trabeum锯木屑空间分离，62176对白蚁有阻隔作用。

实施例12        应用绿僵菌ATCC62176颗粒剂保护场所中的木质构建物

材料和方法

场所为122×366×30.5cm（宽×长×高）的底部带15mm深土壤的Plexi玻璃场所。

从Montague，Massachusetts采集白蚁并放在室温下。使用前，将白蚁移出木材并转移到装有滤纸的培养皿中。

木框由大块木料构建。

A部分由4片在表面带许多2cm深槽的5×10×30cm的木材制成。这4片木材用钉子钉在一起成10×35×35cm木质长方体。

B部分由4片5×10×30cm的木材制成。用钉子钉在一起成5×40×40cm的木质长方体。B部分钉在A部分上形成木框。

将从液体培养基上采集的ATCC培养物62176菌丝与消毒的燕麦麸粉混合。在室温下用气流干燥混合物过夜，然后研磨成颗粒并过14＃筛。

高压消毒木片（13×3×2cm），用G.trabeum接种，并在室温下培养4至8周，制得G.trabeum木材。

将木框放在场所中央。在木框基座周围和下面，将培养物ATCC62176与土混合并将木框安置在上面。在木框中央，在土上放一 堆G.trabeum木材。然后将木框用一片纸板盖上，以防止干燥和保持这一地区黑暗。场所的各端离木框120cm远处，与几片湿滤纸一起转移一蚁群（600-1000只），蚁群用一边开有几个小口的培养皿盖上，形成蚁巢。使用的两个蚁群，一个约1000只白蚁，另一个约600只白蚁。然后每周观察每个场所一或两次，察看真菌生长以及木框内和G.trabeum木堆上白蚁的活动，并定期喷水保持土壤湿润。另一场所设置类似的材料，除了使用对照制剂（没有62176菌丝的燕麦制剂）和两个各含1000只白蚁的蚁群。

制剂施用后两天，观察制剂上真菌生长。施用一周后，62176开始产生分生孢子。分生孢子产生开始后，在制剂上，约持续20天可见到分生孢子。相同时期里，发现白蚁生活在巢内以及巢周围的土内，但被保护的“木框”或“G.trabeum木堆”里没有。

试验开始五周后，在“木框下”和“G.trabeum木堆”里发现几百只白蚁。再过十天，发现在木框下的白蚁（几百只）全都死亡，而在“G.trabeum木堆”里的还活着。

白蚁移入“G.trabeum木堆”和“木框”后两周，在“G.trabeum木堆”内和一个蚁巢（原有约1000只白蚁的巢）中发现死蚁。发现在大多数土壤中的白蚁死尸上，真菌生长出。从在巢中找到的死尸上分离出绿僵菌。

试验完成后（试验开始后67天），将蚁巢和场所的土壤以及“木框”分开，彻底检查。一个巢中（发现死蚁的巢）少于10%的蚁种群还存活着，即该巢中多于90%的白蚁被杀死。另一巢中，未发现死蚁，并且从巢和土壤中找出的白蚁数与原白蚁数大约相同。更重要的是，未见木质构建物受白蚁侵扰而损害。

对照试验中，在构建物上使用的制剂不含绿僵菌，一周后在木构建物上发现白蚁。随后，白蚁向上，向周围掘隧道，进入木。顺木框内发现几百只白蚁，包括第二代和卵。

发现白蚁与真菌的接触存在三个阶段。首先，蚁群成员花一周的时间，穿越120cm觅食与构建物相遇。接着白蚁察觉到处理的构建物有绿僵菌存在并避开。一旦真菌在土中达到最大生长，真菌开始死亡。驱避性质马上消失，并且侵扰白蚁穿过障碍物。然而，土壤中还存在新近产生的分生孢子。当觅食白蚁穿过施用真菌制剂的地区时，分生孢子附在白蚁上并感染它们。觅食者还将分生孢子带回巢中感染其它的蚁群成员。这种作用似乎快得足以保护构建物，即使蚁数相当高。

实施13        绿僵菌ATCC62176/G.trabeum        ATCC        13021浸泡过箱的土壤场所试验

箱：用G.trabeum锯木屑，绿僵菌ATCC        62176制剂和62176分生孢子以100∶5∶1比率的均匀混合物，装填纸管（3cm直径×5cm高）。

空白对照室：比率为100∶5的G.trabeaum锯木屑和颗粒，装填纸管。

场所（122×122×30）和白蚁与实施例9中的相同。每只培养皿含约1000只白蚁，并且作为蚁群对待。用5cm深的土填充场所。

每一场所中，有一蚁群在场所的中央并有四个传染箱。各箱对着放置，并在每个场所的墙中央，埋入土中。三个场所安置绿僵菌ATCC62176/G.trabeum        ATCC        13021箱作为重复，和一 个场所安置对照箱作为对照。

在所有62176处理的场所，试验开始一周后，发现四个室中的两个有白蚁。然而，二至三周后，虽然土中仍有白蚁活着，但箱内未发现白蚁。对照场所中，从第30天至试验结束时的第70天，发现其中的箱有白蚁。

为确定这些土壤场所中白蚁的死亡率，在第45天将两个62176处理的场所分开。两个场所中都得到30%至40%的白蚁死亡率。第70天，在第三个62176箱处理的场所中得到100%的死亡率，而对照场所中未发现白蚁数量减少。在对照场所中还观察到第二代繁殖卵以及小令幼虫。

从此试验可得出结论：绿僵菌ATCC62176和G.trabeum        ATCC13021浸泡的锯木屑箱能够吸引，并随后消灭白蚁种群。