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首页 / 专利库 / 苹果蠹蛾 / 一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法

一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法
申请号 CN201510814414.2 申请日 2015-11-20 公开(公告)号 CN105255883A 公开(公告)日 2016-01-20
申请人 青岛农业大学; 发明人 李长友; 孟祥谦; 郑桂玲; 万方浩;
摘要 本发明提供一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法。本发明扩增苹果蠹蛾以及其他几种昆虫细胞系线粒体COI基因片段的PCR引物对，其正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2。优化后的正向引物序列为SEQ ID NO：3，反向引物序列为SEQ ID NO：4。本发明还提供一种苹果蠹蛾细胞系的鉴别方法。本发明从分子水平探索了苹果蠹蛾细胞系与其他几种昆虫细胞系线粒体COI基因片段序列的不同，建立了苹果蠹蛾与暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾等细胞系的鉴别方法。
权利要求

1.一种检测苹果蠹蛾细胞系的PCR引物对，其特征在于，所述的PCR引物对的正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的检测苹果蠹蛾细胞系的PCR引物对，其特征在于，所述的PCR引物对的正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

3.权利要求1或2所述的PCR引物对在检测苹果蠹蛾细胞系中的应用。

4.一种苹果蠹蛾细胞系的鉴别方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得到DNA提取液；

2)利用权利要求1或2所述的PCR引物对步骤1)中的DNA提取液进行PCR扩增；

3)用限制性内切酶Hinf I对步骤2)的PCR扩增产物进行酶切；

4)将步骤3)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在

320bp和380bp有条带时，则被测样品确定为苹果蠹蛾细胞系。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的PCR扩增体系如下：基因组DNA溶液1μL，10μmol/L的正向引物溶液1μL，10μmol/L的反向引物溶液1μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10×Taq缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTP4μL，灭菌纯水

37.5μL。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的PCR扩增条件如下：

94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸5分钟。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中限制性内切酶Hinf I酶切反应条件为37℃酶切1小时。
说明书全文

一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法。

背景技术

[0002] 苹果蠹蛾(Cydia pomonella)属鳞翅目、小卷叶蛾科，原产于欧洲中南部。20世纪50年代入侵我国新疆，目前已入侵新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、黑龙江等地区，直接威胁我国东部苹果产区，对我国苹果产业构成严重威胁，已成为我国一种重要的检疫性有害生物。研究苹果蠹蛾的生物学和生理学特性对于该虫的综合治理具有重要的意义，但在国内非疫区饲养苹果蠹蛾具有一定的难度和潜在风险，建立苹果蠹蛾细胞系不会造成苹果蠹蛾对保护区的入侵，可以通过培养的苹果蠹蛾细胞来开展上述相关研究，细胞系的建立为相关研究提供了一个便捷、快速的途径。
[0003] 细胞系的建立及培养过程中可能会被其他细胞污染而转变为其他昆虫种类的细胞系或多种不同种类昆虫细胞共存的细胞系，这就会对后期研究苹果蠹蛾的昆虫生理学及生物学特性造成很大的影响。而目前鉴定细胞系的方法，如细胞系DNA扩增产物指纹图谱(DAF)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等，其鉴定结果易受多种因素的影响，存在着重复性差和灵敏度低等问题。

发明内容

[0004] 本发明提供一种鉴别苹果蠹蛾细胞系的PCR引物及其鉴别方法，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明首先提供一种用于检测苹果蠹细胞系的PCR引物对，其引物序列信息如下：
[0006] 正向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′(SEQ ID NO：1)，[0007] 反向引物HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′(SEQ ID NO：2)。
[0008] 对上述的引物进行了优化，使优化后的引物扩增的灵敏性更高和重复性更好，优化后的引物的序列信息如下：
[0009] 正向引物MU1：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3′(SEQ ID No：3)，[0010] 反向引物MD2：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3′(SEQ ID No：4)。
[0011] 本发明还提供一种苹果蠹蛾细胞系的鉴别方法，其步骤如下：
[0012] 1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得到DNA提取液；
[0013] 2)利用上述的引物对步骤1)中的DNA提取液进行PCR扩增；
[0014] 3)用限制性内切酶Hinf I对步骤2)的PCR扩增产物进行酶切；
[0015] 4)将步骤3)酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品在320bp和380bp有条带时，则被测样品确定为苹果蠹蛾细胞系；
[0016] 所述步骤(2)的PCR扩增体系如下：
[0017] 基因组DNA溶液1μL，10μmol/L的正向引物溶液1μL，10μmol/L的反向引物溶液1μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10×Taq缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，灭菌纯水37.5μL。
[0018] 所述步骤2)的PCR扩增条件为：
[0019] 94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸5分钟。
[0020] 所述步骤3)中限制性内切酶Hinf I酶切反应条件为：37℃酶切1小时。
[0021] 本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为鉴别苹果蠹蛾细胞系提供了简便、稳定的酶切鉴别方法。
[0022] 本发明从分子水平探索了苹果蠹蛾细胞系与其他几种昆虫(如暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾)细胞系线粒体COI基因片段序列的不同，建立了苹果蠹蛾与暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾等细胞系的鉴别方法。

附图说明

[0023] 图1为苹果蠹蛾和其他几种昆虫细胞系COI基因片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000 DNA Marker；1-5，苹果蠹蛾卵、苹果蠹蛾细胞系、暗黑鳃金龟细胞系、甜菜夜蛾细胞系和粉纹夜蛾细胞系。
[0024] 图2为几株苹果蠹蛾细胞系COI基因片段PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000 DNA Marker；1-7，苹果蠹蛾细胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、Cp-E-11、Cp-E-12和Cp-E-13。
[0025] 图3为几株苹果蠹蛾细胞系PCR扩增产物经Hinf I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000 DNA Marker；1-7，苹果蠹蛾细胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、Cp-E-11、Cp-E-12和Cp-E-13。
[0026] 图4为苹果蠹蛾与暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系PCR扩增产物经Hinf I酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；其中M，DL5000 DNA Marker；1-4，苹果蠹蛾细胞系、暗黑鳃金龟细胞系、甜菜夜蛾细胞系和粉纹夜蛾细胞系。

具体实施方式

[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0028] 实施例1：苹果蠹蛾细胞系与其他几种昆虫细胞系基因组COI基因片段的扩增和序列分析
[0029] 申请人分析了扩增获得的苹果蠹蛾细胞系COI基因部分序列(SEQ ID No：5)与苹果蠹蛾卵基因组扩增的COI基因部分序列(SEQ ID No：6)；在NCBI数据库中进行Blast比对，利用DNASTAR软件对苹果蠹蛾和其他几种昆虫的COI基因片段进行对比分析，发现苹果蠹蛾与暗黑鳃金龟的COI基因核苷酸一致性为81.6％，与甜菜夜蛾的COI基因核苷酸一致性为87.9％，与粉纹夜蛾的COI基因核苷酸一致性为83.9％，结果表明苹果蠹蛾的COI基因核苷酸序列与其他几种昆虫的COI基因核苷酸序列存在明显的差异。
[0030] 根据序列分析结果，申请人设计了如下的引物：
[0031] 正向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′(SEQ ID NO：1)，[0032] 反向引物HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′(SEQ ID NO：2)。
[0033] 利用上述的引物对，PRIMER 5.0软件对苹果蠹蛾和其他几种昆虫的COI基因片段序列进行分析，首先保证该引物不仅能够扩增苹果蠹蛾细胞系与苹果蠹蛾卵基因组DNA中的线粒体COI基因片段，还能扩增其他几种昆虫(如暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾)的线粒体COI基因片段；而且，扩增的产物中确保苹果蠹蛾COI的扩增片段可被限制性内切酶Hinf I酶切(酶切位点为GANTC)，而其他昆虫(如暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾)的COI基因片段不能被限制性内切酶Hinf I酶切。从而能够有效的区分苹果蠹蛾细胞系，并确定苹果蠹蛾细胞系是否被其它遗传背景近似的细胞系污染。
[0034] 利用设计的引物对进行检测，具体步骤如下：
[0035] (1)苹果蠹蛾及暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系基因组DNA的提取[0036] 对苹果蠹蛾细胞系Cp-E-10及暗黑鳃金龟细胞系Hp-E-1、甜菜夜蛾细胞系Se-1和粉纹夜蛾细胞系Tn9-4s的细胞悬液用MagExtractor-Genome试剂盒进行基因组DNA的提取，得到几种昆虫细胞系的基因组DNA溶液。
[0037] (2)苹果蠹蛾及暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系COI基因片段的PCR扩增[0038] 分别以苹果蠹蛾、暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系的基因组DNA溶液为模板，以优化前的引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0039] PCR扩增体系为：
[0040] 细胞系的基因组DNA溶液：1μL，10μmol/L的正向引物：溶液1μL，10μmol/L的反向引物溶液：1μL，5U/μL Taq酶：0.5μL，10×Taq缓冲液：5μL，2.5mmol/L dNTP：4μL，灭菌纯水：37.5μL。
[0041] PCR扩增条件为：
[0042] 94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸5分钟。
[0043] 用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行检测。
[0044] 用优化前的引物虽能扩增苹果蠹蛾及其他几种昆虫细胞系的线粒体COI基因片段，但出现扩增条带亮度差别较大、条带模糊的现象，有时没有扩增产物出现，存在着扩增效果和重复性不够稳定的问题。
[0045] 因此，对上述的引物进行优化，优化后的引物序列信息如下：
[0046] 正向引物MU1：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3’；
[0047] 反向引物MD2：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3’；
[0048] 由于优化后的两条引物退火温度接近，引物间和引物内二聚体显著降低，用该引物不仅能够扩增苹果蠹蛾细胞系与苹果蠹蛾卵基因组DNA中的线粒体COI基因片段，还能扩增其他几种昆虫(如暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾)的线粒体COI基因片段，电泳结果表明，均检测出一条长度在700bp左右的条带(如图1所示)，引物扩增条带清晰，亮度均一，扩增效果好，并且重复性和稳定性显著提高。
[0049] 实施例2几株苹果蠹蛾细胞系的PCR-RFLP图谱
[0050] (1)几株苹果蠹蛾细胞系基因组DNA的提取
[0051] 对实验室所建立的7株苹果蠹蛾细胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、Cp-E-11、Cp-E-12和Cp-E-13的细胞悬浮液用MagExtractor-Genome试剂盒进行基因组DNA的提取，得苹果蠹蛾各个细胞系的基因组DNA溶液。
[0052] (2)几株苹果蠹蛾细胞系COI基因片段的PCR扩增
[0053] 分别以几株苹果蠹蛾细胞系的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0054] PCR扩增体系为：
[0055] 苹果蠹蛾细胞系的基因组DNA溶液：1μL，10μmol/L的正向引物：溶液1μL，10μmol/L的反向引物溶液：1μL，5U/μL Taq酶：0.5μL，10×Taq缓冲液：5μL，2.5mmol/L dNTP：4μL，灭菌纯水：37.5μL。
[0056] 引物序列如下：
[0057] 正向引物MU1：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3’；
[0058] 反向引物MD2：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3’；
[0059] PCR扩增条件为：
[0060] 94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸5分钟。
[0061] (3)利用限制性内切酶Hinf I对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行酶切，得酶切产物；
[0062] 酶切体系如下：
[0063] 10×NEB缓冲液2μL，PCR扩增产物5μL，Hinf I内切酶1μL，灭菌纯水12μL。
[0064] 酶切反应条件为：37℃酶切1小时。
[0065] (4)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)制得的酶切产物进行分离，经EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，几株苹果蠹蛾细胞系的PCR-RFLP产物都在320bp和380bp处有条带，这几株被检测样品均为苹果蠹蛾细胞系(如图3所示)，也说明该鉴别方法的重复性和稳定性较好。
[0066] 实施例3苹果蠹蛾细胞系与其他几种昆虫细胞系PCR-RFLP图谱的区别[0067] (1)苹果蠹蛾及暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾基因组DNA的提取[0068] 对苹果蠹蛾细胞系Cp-E-10及暗黑鳃金龟细胞系Hp-E-1、甜菜夜蛾细胞系Se-1和粉纹夜蛾细胞系Tn9-4s的细胞悬液用MagExtractor-Genome试剂盒进行基因组DNA的提取，得到苹果蠹蛾及暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系的基因组DNA溶液。
[0069] (2)苹果蠹蛾及暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾COI基因片段的PCR扩增[0070] 分别以苹果蠹蛾的基因组DNA溶液和暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系的基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。
[0071] PCR扩增体系为：
[0072] 苹果蠹蛾、暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾细胞系的基因组DNA溶液：1μL，10μmol/L的正向引物：溶液1μL，10μmol/L的反向引物溶液：1μL，5U/μL Taq酶：
0.5μL，10×Taq缓冲液：5μL，2.5mmol/L dNTP：4μL，灭菌纯水：37.5μL。
[0073] 引物序列如下：
[0074] 正向引物MU1：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3’；
[0075] 反向引物MD2：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3’；
[0076] PCR扩增条件为：
[0077] 94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸5分钟。
[0078] (3)利用限制性内切酶Hinf I对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行酶切，的酶切产物；
[0079] 酶切体系如下：
[0080] 10×NEB缓冲液2μL，PCR扩增产物5μL，Hinf I内切酶1μL，灭菌纯水12μL。
[0081] 酶切反应条件为：37℃酶切1小时。
[0082] (4)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)制得的酶切产物进行分离，经EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像凝胶上在320bp和380bp处有2条带时，被检测样品来源于苹果蠹蛾；当电泳图谱显示只有700bp左右的条带时，则被检测样品来源于其他昆虫细胞系(如暗黑鳃金龟、甜菜夜蛾和粉纹夜蛾)(如图4所示)。

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