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植物抗病原体系统
申请号 CN201410665696.X 申请日 2009-08-04 公开(公告)号 CN104522032B 公开(公告)日 2017-01-18
申请人 赫希玛有限公司; 发明人 R·L·希斯; M·A·安德森; N·L·范德威尔登; J·A·麦肯纳; S·珀恩;
摘要 本发明涉及植物抗病原体系统。总的来说，本发明涉及保护植物不受植物病原体且特别是不受真菌病原体。本发明特别提供了抑制植物中的病原体感染且改善对敏感植物的损害的多价方法。
权利要求

1.用于保护植物不受与经由真菌病原体感染相关的疾病的方法，所述方法包括给所述植物的细胞提供植物防御素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物防御素是真菌透化植物防御素，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是选自NaCys1、NaCys2、NaCys3、NaCys4、CC6和Hv-CPI6的半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin，并且所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、StPot1A、NaPin1A和NaPin1B，其中与由任一防御素或蛋白酶抑制剂以用于组合接触的相同剂量与所述病原体单独接触提供的抑制相比较，由所述植物防御素和所述蛋白酶抑制剂组合提供的病原体抑制程度是协同的。

2.权利要求1的方法，其中所述真菌透化植物防御素选自NaD1、Tomdef2和PhD1A。

3.权利要求1的方法，其中所述防御素和所述蛋白酶抑制剂由遗传修饰的植物细胞生产，并且其中无一在遗传修饰之前由所述植物细胞生产。

4.权利要求1的方法，其中所述防御素和所述蛋白酶抑制剂局部应用于所述植物、所述植物的根系或者所述植物的种子。

5.权利要求1的方法，其中所述防御素或所述蛋白酶抑制剂之一由所述细胞生产，并且所述防御素或所述蛋白酶抑制剂中的另一种局部应用于所述植物、所述植物的根系或者所述植物的种子。

6.权利要求1的方法，其中所述真菌病原体是真菌，其选自镰刀菌属(Fusarium)物种、核盘菌属(Sclerotinia)物种、腐霉菌属(Pythium)物种、轮枝孢属(Verticillium)物种和疫霉属(Phytopthera)物种。

7.权利要求6的方法，其中所述真菌选自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola)、链格孢(Alternaria alternata)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)、玉米尾孢(Cercospora zeae maydis)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢镰刀菌石竹专化型(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi)、尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、Fusarium pseudograminearum、轮枝样镰刀菌(Fusarium verticilloides)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Stenocarpella maydis、烟草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、玉米瘤黑粉菌(Ustilago zeae)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、Macrophomina phaseolina、Phialophora gregata、Diaporthe phaseolorum、大豆尾孢菌(Cercospora sojina)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Phakopsora pachyrhizi、大孢链格孢(Alternaria macrospora)、棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phoma exigua)、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、Phymatotrichopsis omnivora、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)、萝卜链格孢(Alternaria raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、狗牙根壳针孢(Septoria nodorum)、Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、Ustilago tritici、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、网腥黑粉菌(Tilletia caries)和矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)。

8.权利要求1的方法，其中所述植物选自：红花、卡诺拉油菜、小麦、玉米、棉花、甜菜、稻、马铃薯、番茄、洋葱和豆类植物。

9.权利要求8的方法，其中所述豆类植物选自大豆、苜蓿和豌豆植物。

10.分离的植物细胞，所述植物细胞经遗传改造并产生植物防御素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物防御素是真菌透化植物防御素,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是选自NaCys1、NaCys2、NaCys3、NaCys4、CC6和Hv-CPI6的半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin，并且所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、StPot1A、NaPin1A和NaPin1B。

11.权利要求10的分离的植物细胞，其中所述真菌透化植物防御素选自NaD1、Tomdef2和PhD1A。

12.抑制真菌病原体的种皮组合物，其包含植物防御素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物防御素是真菌透化植物防御素,所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是选自NaCys1、NaCys2、NaCys3、NaCys4、CC6和Hv-CPI6的半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin，并且所述丝氨酸蛋白酶抑制剂选自牛胰蛋白酶抑制剂、StPot1A、NaPin1A和NaPin1B，其中与由任一防御素或蛋白酶抑制剂以用于组合接触的相同剂量与所述病原体单独接触提供的抑制相比较，由所述植物防御素和所述蛋白酶抑制剂组合提供的病原体抑制程度是协同的。

13.权利要求12的种皮组合物，其中所述真菌透化植物防御素选自NaD1、Tomdef2和PhD1A。
说明书全文

植物抗病原体系统

[0001] 本申请是申请号为200980132913.6、申请日为2009年8月4日、发明名称为“植物抗病原体系统”的中国发明专利申请的分案申请。
[0002] 提交数据
[0003] 本申请涉及且要求于2008年8月5日提交的美国专利申请号61/086,444的优先权，所述专利的完整内容通过引用合并入本文。
[0004] 领域
[0005] 总的来说，本发明涉及植物不受植物病原体且特别是不受真菌病原体的保护。本发明特别提供了抑制植物中的病原体感染且改善对敏感植物的损害的多价方法。
[0006] 背景
[0007] 在本说明书中由作者参考的出版物的书目细节在说明书结束时按字母顺序收集。
[0008] 在本说明书中提及任何现有技术并非且不应视为承认或以任何形式暗示这个现有技术构成任何国家中的共有一般知识的部分。
[0009] 由于通过植物病原体例如真菌病原体的感染的农作物损失是农业生产中的主要问题，并且每年在杀真菌剂应用上花费数百万美元以制止这些损失(Oerke和Dehne，2004)。需要鉴定用于处理通过病原体例如真菌感染的新抗微生物剂和策略。考虑到病原体发展抗性的倾向，这是特别重要的。
[0010] 已进化出抗微生物肽以保护生物体不受病原体。它们的特异性在很大程度上依赖于它们源于其的生物体，可能是由于由各种病原体置于这些生物体的进化压力。像这样，与真菌病原体相比较，从哺乳动物物种 中分离出的肽一般显示出针对细菌病原体更高程度的活性，推测是由于来自细菌感染的更高风险。相比之下，由于由植物面对的真菌感染的更高风险，植物抗微生物肽一般显示出更高的抗真菌活性。
[0011] 植物防御素代表一类抗微生物肽(由Lay和Anderson，2005综述)。存在具有不同空间和时间表达模式和活性谱的广泛多样的防御素。
[0012] 这些肽的特异性的潜在机制仍是未知的，尽管推测涉及与质膜组分的相互作用。因为膜透化是许多抗微生物肽的共同活性，并且各种细胞类型的膜组成是高度可变的，所以特异性脂质的存在推测在某些情况下负责抗微生物肽的功效。特别地，细菌细胞的质膜在外层中包含带负电荷的磷脂，而哺乳动物细胞则不是(Matsuzaki，1999)。这些带负电荷的脂质可以与带正电荷的抗微生物肽相互作用。为支持这个假设，体外研究已证实带负电荷的脂质的存在对于许多抗微生物肽的膜透化活性是重要的(Matsuzaki等人，1995；
Matsuzaki，1999；Epand等人，2006)。
[0013] 膜透化已暗示为关于某些植物防御素的作用机制，尽管透化机制仍未得到研究。在植物防御素RsAFP2和DmAMP1的情况下，提出透化涉及在细胞表面上的特定受体。在质膜中特异性鞘脂的存在也是这些防御素的活性所需的，可能作为结合位点(Thevissen等人，
2000；Thevissen等人，2004；Thevissen等人，2005；Ramamoorthy等人，2007)。
[0014] 植物病原体诱导显著的植物产量损失，并且目前用于病原体控制的策略是昂贵的且对环境潜在性损害的。考虑到改善农业生产经济的需要，需要新策略用于保护农业和观赏上重要的植物不受一系列疾病，特别是真菌病。
[0015] 概述
[0016] 本文公开的是用于减少经由病原体例如真菌因子引起的对农作物和观赏植物的损害的系统。传统控制方法涉及化学杀真菌剂的应用。这增加了农作物和花生产的成本。依照本发明，鉴定了在植物防御素和蛋白酶抑制剂之间令人惊讶的协同作用，导致预防和改善植物中的疾病状 况的功效增加。
[0017] 因此，本发明提供了用于保护植物不受与经由病原体感染相关的疾病的系统，该系统包括给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体或功能同系物、类似物、衍生物或其变体。在一个特定实施方案中，植物病原体是真菌。提及“植物”在一个方面包括植物及其后代。
[0018] 因此，本发明尤其提供了用于保护植物不受经由真菌病原体感染和/或用于减少真菌病原体相关疾病的严重度发生率的系统。该系统包括使用至少一种防御素和一种蛋白酶抑制剂的组合的多价方法。出乎意料地，给定防御素和给定蛋白酶抑制剂对给定真菌病原体的组合作用是协同的，即当它们在植物环境中组合时(至少)2种组分的抗病原体活性大于蛋白酶抑制剂或防御素单独作用的抑制效应的总和。
[0019] 因此，本发明进一步提供了用于保护植物不受与经由病原体感染相关的疾病的系统，该系统包括以协同有效量给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体或功能同系物、类似物、衍生物或其变体，以减少经由病原体的感染。
[0020] 提及“系统”包括植物管理系统、方案和方法。如上所述，在一个特定实施方案中，病原体是真菌病原体。
[0021] 提及“提供植物的细胞”包括从外源来源提供防御素和蛋白酶抑制剂，或从细胞内提供两者或一种外源提供和一种细胞内提供。
[0022] 本发明进一步考虑了植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体形式在制造遗传修饰植物中的用途，所述遗传修饰植物对真菌感染较不敏感或显示出更少的真菌感染相关损害。
[0023] 在一个实施方案中，存在用于保护农作物或观赏植物不受真菌病的系统，其包括给植物提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或其功能同系物、类似物或变体或等价物。在这个实施方案中，与每种组分单独的组合分开效应相比较，由2种组分的真菌抑制程度被视为协同的。在一个实施方案中，存在通过至少一种植物防御素例如NaD1或其抗真菌变体和各种蛋白酶抑制剂中的至少一种的组合对镰刀菌属(Fusarium)物种的协 同抑制，所述蛋白酶抑制剂包括但不限于来自植物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂例如StPin1A(如美国专利号7,462,695中所述以前称为Pot1A的马铃薯I型抑制剂)或牛胰蛋白酶抑制剂I-P。对通过系统组分各自抑制分别敏感的任何真菌通过使用组合比单独使用任一组分可以更有效地得到控制。
[0024] 本发明进一步提供了用于保护植物不受与经由真菌病原体感染相关的疾病的系统。该系统包括给植物的细胞提供植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的前体或功能同系物、类似物、衍生物或其变体。
[0025] 本发明的多价方法包括包括协同作用的植物防御素和蛋白酶抑制剂。这些组分可以通过重组方法在植物细胞内产生且任选从植物细胞输出或输入到植物细胞内。备选地，组分可以局部地提供给植物细胞，例如以喷雾剂、气溶胶、粉剂的形式或作为肥料或植物食物的部分。如上所述，在另外一个备选方案中，防御素或蛋白酶抑制剂之一通过重组方法提供，并且这些组分的另一种外源提供。
[0026] 本发明的另一个方面考虑了用于抑制真菌生长、复制、感染和/或维持的方法，该方法包括使真菌暴露于植物防御素和蛋白酶抑制剂的组合。
[0027] 再次，与由任一组分以用于组合暴露的相同剂量与真菌单独接触提供的抑制总和相比较，在防御素和蛋白酶抑制剂的存在下的真菌抑制程度是协同的。
[0028] 如果可以显示每种组分单独地发挥针对真菌的抑制活性，或组合中的组分发挥协同的组合抑制效应，那么真菌对经由系统的个体组分各自“的抑制是敏感的”。
[0029] 本发明延伸至系统组分对真菌细胞透性的作用的测量。采用可以鉴定其定位的物质，无论是在真菌细胞内部还是外部。该物质在本文中特别被称为“透性指示剂化合物”。透性指示剂化合物是其在细胞内部或外部的存在可以依靠具有可检测性质进行可检测测量的化合物，所述可检测性质例如荧光、放射性标记、免疫学特征等。此外，透性指示剂化合物是这样的化合物，其在正常条件下保持在细胞外，并且除非细胞透 性已从细胞的正常生理条件改变，否则将无法在细胞内检测出。原则上，透性的指示剂还可以是正常保留在细胞内，仅在异常条件下渗漏出去的化合物，但前面一种类型的指示剂更常见。可以用于监控从细胞外到细胞内环境的移动的透性指示剂化合物的例子包括与核酸结合的荧光染料例如 Green，或碘化丙啶。其他例子包括FITC标记的右旋糖酐或免疫金标记的抗体，其定位可以通过显微镜检查进行检测。荧光标记的防御素其自身也可以用作透性指示剂化合物。从细胞内环境释放到细胞外环境的ATP的测量(如通过引用合并入本文的美国专利申请号US12/362,657中公开的)也可以用作透性的指示剂。术语“可检测的量”意欲传达透性指示剂化合物的量方面的差异可以半定量地进行评估，足以用于比较目的。为了比较植物防御素对真菌细胞透性的可能作用的目的，使用植物防御素NaD1作为用于比较的基础。
[0030] 本发明的实施方案包括其中防御素是具有针对至少一种致病性真菌的杀真菌和/或抑制真菌活性的任何防御素的那些。此类抗真菌防御素的例子包括但不限于来自萝卜的NaD1、PhD1A、PhD2、Tomdef2、RsAFP2、RsAFP1、RsAFP3和RsAFP4，来自大丽花(dahlia)的DmAMP1，来自七叶树(Aesculus hippocatanum)的MsDef1、MtDef2、CtAMP1、PsD1、HsAFP1、VaD1、VrD2、ZmESR6、AhAMP1和AhAMP4，来自苜蓿(alfalfa)的AflAFP，来自豌豆的NaD2、AX1、AX2、BSD1、EGAD1、HvAMP1、JI-2、PgD1、SD2、SoD2、WT1、pl39和pl230。嵌合防御素分子和/或保留抗真菌活性的防御素变体也可以用于本发明的系统中以用于植物保护。
[0031] 嵌合防御素分子和/或保留抗真菌活性的防御素变体也可以用于本发明的系统中以用于植物保护。
[0032] 本发明进一步考虑了植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的功能同系物、类似物、衍生物或其变体在制造用于保护植物或其后代不受真菌病原体的系统中的用途。
[0033] 在另一个方面，本发明提供了植物防御素和蛋白酶抑制剂或任一或两者的功能同系物、类似物、衍生物或其变体在制造保护不受真菌病原体的植物或其后代中的用途。
[0034] 表1
[0035] 用于在抗病原体系统中使用的植物防御素的例子
[0036]
[0037] 在本发明的实施方案中有用的蛋白酶抑制剂包括但不限于来自下述类别的蛋白酶抑制剂：丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶抑制剂和羧肽酶。
[0038] 可以通过本发明的系统保护不受真菌感染的植物包括对真菌敏感或包括防御素和蛋白酶抑制剂的组合物可以应用于其的那些，所述真菌对蛋白酶抑制剂和植物防御素敏感，所述蛋白酶抑制剂和植物防御素可以作为转基因在那种植物中表达。本文还考虑了组合转基因和局部应用方法。蛋白酶抑制剂一般是蛋白质或肽或其化学类似物。植物可以是单子叶植物，特别是来自禾本科(Poaceae)的植物，以及谷类，例如玉蜀黍、大麦、小麦、稻等，或双子叶植物，特别是来自茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、锦葵科(Malvaceae)和豆科(Fabaceae)的植物。
[0039] 来自许多真菌性病原体特别是其为丝状真菌的那些的感染和损害，可使用本发明的系统在许多植物物种中得到控制。可控制的真菌和卵菌纲病原体的例子包括但不限于，镰刀菌属(Fusarium)、轮枝孢属(Verticillium)、腐霉菌属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、核盘菌属(Sclerotinia)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、疫霉属(Phytophthora)、毛盘孢属(Colletotrichum)、尾孢属(Cercospora)和链格孢属(Alternaria)物种，和锈菌。重要的应用包括但不限于蛋白酶抑制剂和抗真菌防御素协同组合用于例如保护植物不受禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)(Fov)、禾生刺盘孢(Colletotrichum 
graminicola)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola)、链格孢(Alternaria alternata)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甜菜生尾孢(Cercospora beticola)、玉米尾孢(Cercospora zeae maydis)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、 尖孢镰刀菌石竹专化型(Fusarium oxysporum f.sp.dianthi)、尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、Fusarium pseudograminearum、轮枝样镰刀菌(Fusarium verticilloides)、禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、芸苔根肿菌(Plasmodiophora 
brassicae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Stenocarpella(Diplodia)maydis、烟草根串珠霉(Thielaviopsis basicola)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、玉米瘤黑粉菌(Ustilago zeae)、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、Macrophomina phaseolina、Phialophora gregata、Diaporthe phaseolorum、大豆尾孢菌(Cercospora sojina)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Phakopsora 
pachyrhizi、大孢链格孢(Alternaria macrospora)、棉尾孢(Cercospora gossypina)、短小茎点霉(Phoma exigua)、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、
Phymatotrichopsis omnivora、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、芸苔链格孢
(Alternaria brassicae)、萝卜链格孢(Alternaria raphani)、禾白粉菌(Erysiphe graminis)(布氏白粉菌(Blumeria graminis))、小麦壳针孢(Septoria tritici)、狗牙根壳针孢(Septoria nodorum)、Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌(Rhizoctonia 
cerealis)、Ustilago tritici、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、网腥黑粉菌(Tilletia caries)和矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)。
[0040] 本文还考虑了包括植物防御素和蛋白酶抑制剂(或其前体)或其抗真菌同系物、类似物、变体和功能等价物的农学组合物。
[0041] 本文进一步考虑了用于管理植物的植物病原体感染的方案，其包括操纵植物环境以提供以抑制病原体量的植物防御素和蛋白酶抑制剂。
[0042] 在一个特定实施方案中，提及“植物病原体”包括真菌和其他相关生物体。一般地，当该系统包括表达防御素和蛋白酶抑制剂的遗传修饰 植物时，术语“植物”包括其后代。当该系统包括局部应用防御素和蛋白酶抑制剂的组合时，该效应一般局限于特定植物。
[0043] 本文使用的序列标识符的概括在表2中提供。
[0044] 表2
[0045] 序列标识符的概括
[0046]SEQ ID NOS.    
1 NaCys1 核酸序列
2 NaCys1 氨基酸序列
3 NaCys2 核酸序列
4 NaCys2 氨基酸序列
5 NaCys3 核酸序列
6 NaCys3 氨基酸序列
7 NaCys4 核酸序列
8 NaCys4 氨基酸序列
9 StPin1A 核酸序列
10 StPin1A 氨基酸序列
11 NaD1 核酸序列
12 NaD1 氨基酸序列
13 Hv-CPI6 核酸序列
14 Hv-CPI6 氨基酸序列
15 CC6 核酸序列
16 CC6 氨基酸序列
17 NaPin1A 核酸序列
18 NaPin1A 氨基酸序列
19 NaPin1B 核酸序列
20 NaPin1B 氨基酸序列
21 Tomdef2 核酸序列
22 Tomdef2 氨基酸序列
23 PhD1A 核酸序列
24 PhD1A 氨基酸序列
25 BTIP 氨基酸序列
26 JRF1 合成引物
27 JRF2 合成引物
28 JRR1 合成引物
29 JRF3 合成引物
30 JRF4 合成引物
[0047]SEQ ID NOS.    
31 HvCys6F 合成引物
32 HvCys6R 合成引物
33 CC6F 合成引物
34 CC6R 合成引物
35 MHvCys6F2 合成引物
36 MHvCys6F 合成引物
37 MCC6 合成引物
38 CC6R2 合成引物
39 Sac2StPin1A5’ 合成引物
40 Pot1SalI3’ 合成引物
41 NaPin1Afw 合成引物
42 NaPin1Arv 合成引物
43 NaPin1Bfw 合成引物
44 NaPin1Brv 合成引物
[0048] 附图简述
[0049] 图1A-1E是显示的图示。图1A花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)NaCys1(SEQ ID NO:2)、NaCys2(SEQ ID NO:4)、NaCys 3(SEQ ID NO:6)和NaCys4(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列比对。保守氨基酸以黑色框出。星号代表对于蛋白酶抑制剂活性必需的氨基酸。图1B大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂Hv-CPI6和玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6的氨基酸序列比对。图1C显示在兔中针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys1产生的抗体在蛋白质印迹上可以检测出至少1ng细菌表达的NaCys1、NaCys2和NaCys 3。图1D NaCys1、NaCys 3和NaCys4对木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性，和图1E NaCys1、NaCys 3和NaCys4对组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性。
[0050] 图2是显示在兔中针对StPin1A(SEQ ID NO:10)产生的多克隆抗体在蛋白质印迹上可以检测出至少50ng细菌表达的StPin1A的图示。分子大小标记的大小以kDa给出。
[0051] 图3A到3F是图示法，并且图3H是显示防御素NaD1(SEQ ID NO:12)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的组合在体外对禾谷镰刀菌生长的作用。通过在接种生长培养基后24-26小时时达到的在595nm(A595)处的光密度 中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对在横轴上的蛋白酶抑制剂浓度(μM)进行标绘。实线与在0μM NaD1的存在下获得的样品结果有关；虚线：0.125μM NaD1；点线：0.25μM NaD1；点-虚线：0.5μM NaD1。图3A.NaD1和NaCys1(SEQ ID NO:
2)的组合。图3B.NaD1和NaCys2(SEQ ID NO:4)的组合。图3C.NaD1和NaCys 3(SEQ ID NO:6)的组合。图3D.NaD1和NaCys4(SEQ ID NO:8)的组合。图3E.NaD1和大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂Hv-CPI6(SEQ ID NO:14)的组合。图3F.NaD1和玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6(SEQ ID NO:16)的组合。图3G.在图3A-3F中举例说明的真菌生物测定法中来自加和应答的预期效应(Ee)与观察到的应答(Io)比较。图3H.显示在NaD1的存在下NaCys1-FITC摄取到真菌菌丝内的免疫荧光显微照片。禾谷镰刀菌菌丝与(a)无蛋白质或(b、c和d)4μM FITC标记的NaCys1一起温育1小时，并且通过光学(左图)和荧光显微镜检查(右图)进行显现。(b)不含NaD1的NaCys1-FITC(c和d)含NaD1(0.5μM)的NaCys1-FITC。NaCys1-FITC仅进入已用NaD1处理的菌丝的细胞质。
[0052] 图4A到4E是显示防御素NaD1和丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合在体外对禾谷镰刀菌生长的作用的图示法。如图3中所述测量的真菌生长针对在横轴上的蛋白酶抑制剂浓度(μM)进行标绘。实线与在0μM NaD1的存在下获得的样品结果有关；虚线：0.25μM NaD1；点线：0.5μM NaD1；点-虚线：1μM NaD1。图4A.NaD1和牛胰蛋白酶抑制剂I-P的组合。图4B.NaD1和马铃薯(Solanum tuberosum)1型马铃薯抑制剂(StPin1A)的组合。图4C和4D.NaD1分别与花烟草1型马铃薯抑制剂NaPin1A(SEQ ID NO:18)和NaPin1B(SEQ ID NO:20)的组合。图4E.在图4A-4D中举例说明的真菌生物测定法中来自加和应答的预期效应(Ee)与观察到的应答(Io)比较。
[0053] 图5举例说明除NaD1外的防御素可以与蛋白酶抑制剂协同作用，以延缓禾谷镰刀菌的生长。图5A是NaD1、Tomdef2(SEQ ID NO:22)和PhD1A(SEQ ID NO:24)防御素的序列比对。图5B到5I是显示番茄防御素Tomdef2或矮牵牛防御素PhD1A和蛋白酶抑制剂的组合在体外对禾 谷镰刀菌生长的作用的图示法。通过在接种生长培养基后40小时时达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对在横轴上的蛋白酶抑制剂浓度(μM)进行标绘。实线与在0μM防御素的存在下获得的结果有关；虚线：0.125μM防御素；点线：0.25μM防御素；点-虚线：0.5μM防御素。图5B-5E.Tomdef2(SEQ ID NO:22)和B.NaCys2(SEQ ID NO:4)、C.玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6(SEQ ID NO:16)、D.牛胰蛋白酶抑制剂I-P(SEQ ID NO:25)和E.马铃薯1型马铃薯抑制剂StPin1A的组合。图5F-5I.矮牵牛防御素PhD1A和F.NaCys2、G.玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6、H.牛胰蛋白酶抑制剂I-P和I.马铃薯1型马铃薯抑制剂StPin1A的组合。图5J-5K.分别在图5B-5E和图5F-5I中举例说明的真菌生物测定法中来自加和应答的预期效应(Ee)与观察到的应答(Io)比较。当获得协同作用时，数目用星号进行标记。
[0054] 图6是显示防御素NaD1和蛋白酶抑制剂的组合在体外对尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)生长的作用的协同作用表。通过在接种生长培养基后40小时时达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生长。在用与NaCys2(SEQ ID NO:4)、玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6(SEQ ID NO:16)、牛胰蛋白酶抑制剂I-P(SEQ ID NO:25)和马铃薯1型马铃薯抑制剂StPin1A(SEQ ID NO:10)组合的NaD1(SEQ ID NO:12)的真菌生物测定法中，来自加和应答的预期效应(Ee)与观察到的应答(Io)比较。当获得协同作用时，数目用星号进行标记。
[0055] 图7A到7E是显示防御素NaD1(SEQ ID NO:12)和蛋白酶抑制剂的组合在体外对禾生刺盘孢生长的作用的图示法。通过在接种生长培养基后40小时时达到的在595nm(A595)处的光密度中的增加测量真菌生长(纵轴)，并且针对在横轴上的蛋白酶抑制剂浓度(μM)进行标绘。实线与在0μM NaD1的存在下获得的结果有关；虚线：1.25μM NaD1；点线：2.5μM NaD1；点-虚线：5μM NaD1。图7A-7D.NaD1与7A.NaCys2(SEQ ID NO:4)、7B.玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6(SEQ ID NO:16)、7C.牛胰蛋白酶抑制剂I-P(SEQ ID NO:25)和7D.马铃薯1型马铃薯 抑制剂StPin1A(SEQ ID NO:10)的组合。图7E.在图7A-7D中举例说明的真菌生物测定法中来自加和应答的预期效应(Ee)与观察到的应答(Io)比较。当获得协同作用时，数目用星号进行标记。
[0056] 图8A是由在用pHEX116瞬时表达后的棉花子叶制备的提取物的蛋白质印迹。印迹用针对NaCys1(SEQ ID NO:2)产生的抗体进行探测。泳道1：用空pBIN19载体转染的子叶样品，泳道2：用pHEX116转染的子叶样品，泳道3：SeeBlue Plus2标准，泳道4：20ng重组HPLC纯化的NaCys2(SEQ ID NO:4)。10.9kDa NaCys2肽(有箭头的)存在于用pHEX112转染的子叶样品中。图8B是举例说明在用pHEX116或pBIN19空载体瞬时表达后的由棉花子叶制备的提取物中通过ELISA检测出的NaCys2的条形图。样品进行1:20稀释。
[0057] 详述
[0058] 本文使用的各种术语具有其一般公认的含义。为了清楚起见，进一步解释且定义了下述术语。
[0059] “敏感真菌”是可以通过本发明的系统的每种组分分开或通过2种组分的组合抑制的真菌菌株。参见例如，图3B，当在不存在NaCys2的情况下0.5μM NaD1对于禾谷镰刀菌的毒性极低时，但当与0.5μM/mLNaCys2相组合时，这得到显著增强。上述例子还证实当防御素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合应用时可观察的协同作用。可以被例如NaD1抑制的任何真菌菌株都可以是敏感真菌，如果该真菌还可以被半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制。NaD1已显示抑制一批代表性丝状真菌的生长，包括但不限于禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)、禾生刺盘孢、十字花科小球腔菌、甘蓝链格孢、链格孢、构巢曲霉菌、灰葡萄孢菌、甜菜生尾孢、玉米尾孢、异旋孢腔菌、大斑凸脐蠕孢、大刀镰刀菌、尖孢镰刀菌、尖孢镰刀菌石竹专化型、尖镰孢菌番茄专化型、茄腐镰刀菌、Fusarium pseudograminearum、轮枝样镰刀菌、禾顶囊壳小麦变种、芸苔根肿菌、核盘菌、Stenocarpella(Diplodia)maydis、烟草根串珠霉、大丽轮枝菌、玉米瘤黑粉菌、高粱柄锈菌、Macrophomina phaseolina、Phialophora gregata、Diaporthe phaseolorum、大豆尾孢菌、大豆疫霉、立枯丝核菌、Phakopsora pachyrhizi、大孢链格孢、棉尾孢、短小茎点霉、Puccinia schedonnardii、Puccinia cacabata、Phymatotrichopsis omnivora、燕麦镰刀菌、芸苔链格孢、萝卜链格孢、禾白粉菌(布氏白粉菌)、小麦壳针孢、狗牙根壳针孢、Mycosphaerella zeae、禾谷丝核菌、Ustilago tritici、禾柄锈菌、小麦叶锈菌、印度腥黑粉菌、网腥黑粉菌和腥黑粉菌属(Tilletia)。相关防御素已显示在抑制尖孢镰刀菌物种中是有活性的，包括ZmESR6、PhD1A、PhD2和Tomdef2。因此，植物防御素和蛋白酶抑制剂的大量协同组合可用于针对许多真菌病特别是由丝状真菌引起的那些的植物保护。
[0060] 提及“变体”包括特定序列的衍生物以及天然变体例如多态变体。
[0061] 在某些情况下，在所采用的测试条件下，给定蛋白酶抑制剂或防御素的抑制效应可能低于关于给定测定法的检测极限，但发现当与其他组分组合时显著促成毒性。Greco等人，1995已限定了协同作用的不同范畴，根据在不存在另一种组分的情况下进行测定时，2种组分之一、两者还是无一具有可测量的活性。本文采用的定义包括所有此类情况，前提是2种组分一起作用的组合效应大于个体组分单独作用的总和。应当理解可以产生超过仅在特定条件下的加和活性的2种或更多种组分的协同作用组合，例如当组分中的一种或多种以低于对于个体功效最大的浓度存在时。组分的组合被视为协同作用的(如该术语在本文中预期的)，如果存在一组条件(包括但不限于浓度)，其中组分一起作用的组合效应大于个体组分单独作用的总和。Richer，1987描述了确定协同作用证明的数学方法。这种方法使用Limpel公式，所述Limpel公式在Richer，同上1987中定义，并且由Harman等人，美国专利号US 6,512,166B1用于证明在真菌细胞壁降解酶和真菌细胞膜影响化合物之间对植物致病性真菌生长的协同作用。
[0062] “真菌抑制”包括杀真菌和抑制真菌活性，如通过与对照相比较，真菌生长(或活力丧失)的减少所测量的。真菌生长可以通过本领域已知的许多不同方法进行测量。测量丝状真菌生长的常用方法需要在合适 的生长培养基使孢子发芽，温育足以达到可测量生长的时间，并且在指定温育时间后测量在培养物中增加的光密度。光密度随着增加的生长而增加。一般地，真菌生长是发病机理所需的。因此，真菌生长的抑制提供关于保护不受真菌病的合适指示剂，即抑制越大，保护就越有效。
[0063] 在本文背景中，“预防感染”意指当与未表达防御素或蛋白酶抑制剂转基因或用防御素或蛋白酶抑制剂处理的植物相比较时，用本发明的系统处理的植物避免病原体感染或疾病症状或上述全部，或显示出减少或降到最低或更不频繁的病原体感染或疾病症状或上述全部，这些是植物-病原体相互作用的天然结果。即，病原体被预防或减少不引起疾病和/或相关疾病症状。与未用本文教导的系统如此处理的植物相比较，感染和/或症状减少至少约10％、20％、30％、40％、50、60％、70％或80％或更多。在备选方案中，本发明的系统导致对蛋白酶抑制剂和防御素敏感的植物致病性真菌的孢子形成减少。
[0064] 因此，在其他抑制活性中，防御素和蛋白酶抑制剂的组合作用是抑制真菌生长、复制、感染和/或维持。
[0065] 植物保护(疾病抗性或减少)可以通过本领域已知的方法进行估计。参见，Uknes等人，1993；Gorlach等人，1996；Alexander等人，1993。技术人员应认识到用于测定经由植物病原体的植物感染和疾病的方法依赖于待测试的病原体和植物。
[0066] 术语“植物防御素”已是文献中定义明确的(参见例如Lay等人，2005)。植物防御素是小的富含半胱氨酸的蛋白质，一般具有45-54个氨基酸。半胱氨酸残基形成特征性的、确定的二硫键模式。NaD1是从花烟草的花组织中分离出的植物防御素。NaD1的氨基酸和编码序列公开于美国专利号7,041,877中，所述专利通过引用合并入本文。其他抗真菌防御素是本领域众所周知的，包括但不限于来自萝卜的NaD1、PhD1A、PhD2、Tomdef2、RsAFP2、RsAFP1、RsAFP3和RsAFP4，来自大丽花的DmAMP1，来自Aesculus hippocatanum(七叶树)的MsDef1、MtDef2、CtAMP1、PsD1、HsAFP1、VaD1、VrD2、ZmESR6、AhAMP1和AhAMP4，来自苜蓿的AflAFP，来自豌豆的NaD2、AX1、AX2、BSD1、EGAD1、HvAMP1、 JI-2、PgD1、SD2、SoD2、WT1、pl39和pl230。植物防御素的结构域功能在美国专利申请号12/105,956中公开，所述专利于2008年4月18日提交，并且通过引用合并入本文。NaD1或具有C末端尾部的另一种防御素的C末端尾部可以经由重组DNA技术掺入其他防御素的结构内，以便减少对表达转基因的植物的(潜在)毒性。此外，另一种防御素或来自另一种植物蛋白质的液泡靶向序列的C末端尾部可以取代NaD1的那种。
[0067] 术语“蛋白酶抑制剂”在本文中用于包括用于抑制真菌蛋白酶的活性且保护植物不受真菌病的蛋白质或肽。本文还包括了蛋白酶抑制剂的化学类似物或功能等价物。
[0068] 蛋白酶抑制剂还可以以在生效前被加工成活性形式的前体形式。
[0069] 半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitors)或半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystains)是半胱氨酸蛋白酶的紧密且可逆结合的抑制剂。它们包括再分成3个家族的超家族：stefins、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和激肽原(Turk和Bode，1991)。
[0070] 当在系统内的2种或更多种组分产生大于每种组分单独作用的个体效应的总和的组合效应时，协同效应发生。该效应可以是功效、稳定性、速率和/或毒性水平中的一种或多种。如本文所描述的，在其他方面等同的条件下，在至少一种植物防御素和至少一种蛋白酶抑制剂的组合存在下测量的协同真菌生长抑制大于在特定浓度范围的每种组分(防御素和蛋白酶抑制剂)单独地存在下测量的抑制总和。应当理解无需用2种组分的每一种浓度组合观察到超过加和效应，以便视为协同作用的。可以在特定浓度组合而不在其他中观察到2种组分的协同效应。例如，如果进入真菌细胞内的入口限制毒性，那么防御素的存在可以导致协同作用，特别是如果蛋白酶抑制剂的浓度就抑制而言是次于最大的。在一个实施方案中，防御素或蛋白酶抑制剂中的一种或两种的浓度是次于最大的。同样，如果一种或两种组分以如此高的水平(最大限度水平)存在，以便导致最大可观察的抑制，那么协同作用可以被掩蔽。关于防御素蛋白酶抑制剂组合的一般系统因此被称为“协同作用的”，因为存在关于 协同作用的可能性，即使协同作用在所有条件下都未观察到。对于至少某些剂量，植物防御素和蛋白酶抑制剂之间的协同作用提供比通过任一组分单独作用可以获得的更大的真菌抑制。在某些情况下，并非可测量地有效针对特定病原体的蛋白酶抑制剂在防御素的存在下变得有效。因此，本发明提供了不受真菌病的增加的植物保护，这伴随对化学杀真菌剂减少的依赖性。这意味着对种植者的输入成本减少，针对植物病原体的更广泛的活性谱，和对于环境损害的可能性减少。此外，关于杀真菌剂抗性的真菌菌株发展的选择压力极大减少，这允许市场寿命延长以及抗性真菌菌株的增殖减少和多重抗性菌株出现的可能性减少。
[0071] 因此，本发明的系统对于减少由于真菌感染的经济损失有用。
[0072] 在本发明的一个方面，提供了用于保护植物不受与病原体例如真菌因子相关的疾病的系统，并且预防或处理导致关于植物或植物部分的杀病原体剂(pathogenicide)处理的需要减少，因此降低材料成本、劳动力和环境污染，或延长此类植物的产物(例如，果实、种子等)的保存期。术语“植物”包括完整植物及其部分，包括但不限于枝条营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其后代。可以使用本发明的系统加以保护的植物包括高等和低等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物和多细胞藻类。用于在本发明的系统中使用的植物可以包括任何维管植物，例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于，苜蓿、苹果、拟南芥属(Arabidopsis)、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米(玉蜀黍)、海甘蓝、越桔、黄瓜、石斛、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、liliacea(百合)、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油料种子油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、油菜籽、稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日 葵、草莓、烟草、番茄、草坪草、小麦和蔬菜作物，例如莴苣、芹菜、椰菜、花椰菜、葫芦、洋葱(包括大蒜、分葱、韭和细香葱)；果树和坚果树，例如苹果、梨、桃、橙、葡萄柚、柠檬、酸橙、杏树、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，例如葡萄、猕猴桃、蛇麻草；果实灌木和荆棘，例如覆盆子、黑莓、醋栗；森林树，例如岑树、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、白杨；其中优选苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油料种子油菜、花生、马铃薯、稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄和小麦。更优选地，用于在本发明的方法中使用的植物包括任何农作物植物，例如饲料作物、油料种子作物、谷类作物、果实作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草皮作物、糖料作物、饮料作物和森林作物。农作物植物可以是大豆、小麦、玉米、棉花、苜蓿、卡诺拉油菜、甜菜、稻、马铃薯、番茄、洋葱、豆类或豌豆植物。在一个方面，提及“植物”包括其后代。
[0073] 提及“真菌病原体”包括下述门的真菌：粘菌门(Myxomycota)、根肿菌门(Plasmodiophoromycota)、丝壶菌门(Hyphochytriomycota)、网粘菌门(Labyrinthulomycota)、卵菌门(Oomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。
[0074] “转基因植物”指包含在相同物种、变种或栽培变种的野生型植物中未发现的遗传材料(即，“外源的)的植物或其种子。遗传材料可以包括转基因、插入诱变事件(例如通过转座子或T-DNA插入诱变)、活化加标签序列、突变序列、同源重组事件或通过嵌合修复术(chimeraplasty)修饰的序列。一般地，外来遗传材料已通过人为操作引入植物内，但如本领域技术人员认识到的，可以使用任何方法。
[0075] 转基因植物可以包含表达载体或盒。表达盒一般包括与允许多肽表达的合适的诱导或组成性调节序列可操作地连接(即，在其调节控制下)的编码多肽的序列。表达盒可以通过转化或通过在亲本植物转化后的育种引入植物内。合适的表达盒的例子公开于美国专利申请号 11/753,072[PCT/AU2007/000712的等价物]中，所述专利的内容通过引用合并入本文。
[0076] 用于在本发明的系统中使用的植物或植物部分包括植物发育的任何阶段的植物。方便地，应用在发芽、幼苗生长、营养生长和生殖生长的阶段过程中发生。更优选地，本发明的应用在营养和生殖生长的阶段过程中发生。营养和生殖生长的阶段在本文中也称为“成年”或“成熟”植物。
[0077] 虽然本公开内容提供了使用在植物防御素和蛋白酶抑制剂之间的协同作用，用于保护植物不受真菌感染的系统，但应当理解另外材料可以加入组合中，以达到就植物健康而言甚至更多的利益，例如通过掺入杀真菌、杀昆虫或杀线虫化合物，或通过利用超过一种防御素和/或超过一种蛋白酶抑制剂。例如，针对植物病原体的活性谱可以潜在地通过使用另外试剂得到扩展。
[0078] 防御素和蛋白酶抑制剂组分方便地由待保护的植物供应，尽管本发明延伸至表面喷雾或种子包被以及掺入肥料和植物食物中。在特定实施方案中，使用本领域众所周知的方法使植物进行遗传修饰，以表达所需防御素和蛋白酶抑制剂。在待保护不受由尖孢镰刀菌萎蔫专化型引起的疾病的棉花的例子中，通常对Fov感染敏感的棉花变种已进行遗传转化，以表达防御素NaD1。在田间试验中已显示，与未经转化的亲本变种相比较，表达NaD1的转基因棉花变种被明显保护不受Fov感染的病理效应(于2008年4月18日提交的美国专利申请号12/105,956，引入本文作为参考至与本公开内容不矛盾性的程度)。结果确定Fov对NaD1敏感，并且如本文所描述的，当与蛋白酶抑制剂相组合时，可以由转基因植物表达的防御素例如NaD1的量足以促成协同效应。
[0079] 需要时，经纯化的防御素蛋白质可以与蛋白酶抑制剂直接作为混合物相组合，前提是它们可以通过分开的应用方式一起或顺次配制。在一个进一步的实施方案中，使用其中组分之一经改造为由植物产生且另一种组分外源供应的多路方法。
[0080] 膜透化已报告为某些植物防御素的作用方式，尽管透化的机制仍未 得到研究。
[0081] 就针对丝状真菌尖孢镰刀菌(Fov)、大丽轮枝菌、烟草根串珠霉、构巢曲霉菌和十字花科小球腔菌的抗真菌活性在体外测试NaD1(美国专利号7,041,877、美国专利申请号12/105,956和美国专利申请号12/362,657)。在1μM时，NaD1使Fov和十字花科小球腔菌的生长延迟50％，而大丽轮枝菌、烟草根串珠霉和构巢曲霉菌全被抑制约65％。在5μM NaD1时，所有5个物种的生长都被抑制超过80％。这5个真菌物种都是子囊菌门的成员，并且分布在亚门盘菌亚门(pezizomycotiria)的3个纲中。这些真菌是农业上重要的真菌性病原体。迄今为止所测试的所有丝状真菌对经由NaD1的抑制敏感。
[0082] 表3
[0083] NaD1对各种细胞类型的生长抑制作用
[0084]
[0085] 通过使半胱氨酸残基还原和烷化来研究NaD1中的4个二硫键的重要性。经还原和烷化的NaD1(NaD1R&A)在用Fov的生长抑制测定法中是完全无活性的，即使在比关于NaD1的IC50高10倍的浓度下。
[0086] 许多抗微生物肽的活性通过培养基中阳离子特别是二价阳离子的存在而减弱；因此在二价阳离子Ca2+和Mg2+的存在下测量NaD1(10μM)对Fov生长的作用，以测定其对NaD1活性的作用。2种阳离子都以浓度依赖性方式减少NaD1的抗真菌活性。在<2mM CaCl2下观察到NaD1的完全灭活，然而，需要50mM MgCl2以达到相同效应，这指出Ca2+的拮抗性大于20倍。这指出效应不仅仅涉及电荷，并且可能涉及特异性相互作用的阻断。相比之下，烟草蛋白质逆渗透蛋白的活性通过Ca2+的存 在得到增强，推测是通过促进与真菌细胞表面上的磷酸甘露聚糖的相互作用(Salzman等人，2004)。
[0087] 本发明的另一个实施方案是鉴定增强蛋白酶抑制剂的抗真菌活性的防御素的方法，无需执行抗真菌活性测定法。该方法需要测量防御素允许透性指示剂化合物进入真菌细胞内的能力。合适的透化指示剂化合物是可以检测出其定位的化合物，无论是细胞内还是细胞外。在正常条件下，指示剂化合物保留在细胞外，并且无法自由经过细胞壁和膜。在特定防御素例如NaD1的存在下，指示剂化合物可以在给定真菌的细胞内部检测出(美国专利申请号12/367,657)。如果发现当与真菌一起存在时，待测试的防御素(测试防御素)通过增加指示剂化合物的细胞内的量而增加给定真菌的透性，那么该防御素从而被鉴定为当防御素和蛋白酶抑制剂在真菌的存在下相组合时，增强蛋白酶抑制剂的抗真菌活性的防御素。
[0088] 通过使用 绿(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA，USA)作为关于在NaD1的存在下观察到的真菌细胞透性增加的指示剂，提供关于适合于在本发明中使用的透性指示剂化合物的标准依据，如下文所述。鉴定增强蛋白酶抑制剂功效的防御素的方法并不限于绿的使用，而是可以通过当与NaD1一起测试时产生相似透性数据的任何透性指示剂化合物的任何使用来执行。
[0089] 所述方法使用下文描述的方法来执行，或伴随本领域技术人员应当理解为等价的适应。该方法的步骤包括：在测试防御素的存在下和分开地作为对照在不存在测试防御素的情况下，使真菌与透性指示剂化合物相组合；随后比较在测试防御素的存在和不存在下，真菌中透性指示剂化合物的任何可检测的细胞内的量。如果测试防御素的存在的效应是这样的，使得与对照相比较，在真菌中检测出增加量的细胞内指示剂化合物，那么测试防御素被鉴定为当防御素和蛋白酶抑制剂在真菌的存在下相组合时，可以增强蛋白酶抑制剂的功效的防御素。通过刚刚描述的方法鉴定的植物防御素应理解为作为系统的防御素组分有用(所述系统如本文所公开的用于保护植物不受真菌病)，无论防御素是否已知具有抗 真菌活性。
[0090] 使用荧光染料 绿测量Fov菌丝膜经由NaD1的透化。 绿荧光在与核酸结合后增加超过1000倍，但该染料仅在质膜妥协时才进入细胞。在 绿的存在下，菌丝用0.1、2或10μM NaD1或10μM NaD1R&A(还原和烷化的)进行处理。NaD1使菌丝透化，并且这种透化与生长抑制相关，除了在最低的NaD1浓度(0.1μM)下外(其中发生少量绿摄取，但未观察到生长抑制)。透化在用NaD1R&A处理的菌丝中未观察到，对于未经处理的菌丝也未观察到，与生长抑制的缺乏一致。
[0091] 在极低的非抑制性NaD1浓度(0.1μM)下， 绿进入某些但不是全部菌丝，反映NaD1介导的透化。已摄取 绿的菌丝细胞的核看起来是完整的，并且细胞质看起来是未改变的。在更高的抑制性NaD1浓度下， 绿进入大多数菌丝并且形成跨越细胞的荧光分散模式。核不再完整，并且在NaD1处理后，所有经透化的菌丝的细胞质看起来是颗粒状的。
[0092] 为了测定NaD1是形成独特大小的开口还是仅使质膜失稳，使NaD1处理的菌丝与4kDa(平均球形直径 )或10kDa(平均球形直径  )FITC标记的右旋糖酐(Sigma-
Aldrich)一起温育。4kDa的FITC-右旋糖酐在导致 绿摄取(MW～650Da)的相同
NaD1浓度下进入菌丝，而即使在极高的NaD1浓度下，10kDa FITC-右旋糖酐也被排除。为了检查由NaD1形成的开口是瞬时的还是相对稳定的，测定法以2种方式执行。与NaD1同时或在通过充分洗涤去除未结合的NaD1后加入FITC-右旋糖酐。4kDa FITC-右旋糖酐在2种情况下都能够进入。
[0093] NaD1以与生长抑制相关的剂量依赖性方式使敏感菌丝的质膜透化；然而，在非抑制的NaD1浓度下，仍检测出某些透化。在这些低浓度下，经透化的菌丝的细胞质在光学显微镜下看起来是正常的，并且 绿集中至核。在更高的抑制性NaD1浓度下，经透化的菌丝显示出明显的细胞质粒化，并且 绿荧光模式跨越细胞分散得多，这指示核不再完整。不希望受理论束缚，认为NaD1诱导的真菌膜的透化是生长 抑制所需的，尽管这可能不足以诱导细胞死亡。
[0094] 膜脂质的脂肪酰链的流动性随着温度下降而下降，导致膜稳定性的总体增加。假定这使得肽更难以插入双层，从而减少通过直接脂质相互作用发生的肽诱导的透化的量。这导致温度对NaD1诱导的透化的作用的评估。在10℃下，NaD1诱导 绿的大量摄
取，尽管这小于在25℃下观察到的那种。在4℃下，仅少量透化可见，并且这在0℃下甚至进一步减少。
[0095] 不希望受任何理论或运作机制束缚，假定NaD1看起来通过凹桶(barrel-stave)或环形孔形成起作用。在跨越许多NaD1浓度下4kDa而不是10kDa右旋糖酐摄取的一致性不同于其他成孔抗微生物肽例如蜂毒肽，所述其它成孔抗微生物肽引起从人工脂质体中释放的右旋糖酐大小以浓度依赖性增加(Ladokhin和White，2001)，指出孔径的增加。NaD1孔的预测大小也足够大，以允许NaD1其自身经过进入细胞内。它还足够大以允许特定蛋白酶抑制剂进入。
[0096] 通过测量随着时间过去的 绿摄取来监控Fov菌丝通过各种NaD1浓度的透化比率。在所有浓度下，透化仅在约20分钟的时滞后观察到，并且荧光看起来在90分钟后开始达到稳定水平。透化的比率是部分浓度依赖性的，随着NaD1浓度直到3μM渐进地增加。在超过3μM的浓度(直到50μM)下，在透化的动力学中存在极少差异。这在Vmax(荧光增加的最大速率)数据中反映，这显示摄取在低浓度(低于显著生长抑制所需的那些)下的稳态，随后为直到6.25μM NaD1的荧光的线性增加。超过这个浓度，反应速率无显著改变，指示该过程是可饱和的。
[0097] 在暴露于NaD1后细胞器的外观丧失指示细胞处于细胞死亡中。为了进一步检查这点，在用NaD1处理的菌丝中研究活性氧种类(ROS)的产生。将非荧光分子二氢罗丹明123(DHR123)预装载到菌丝内，所述菌丝随后用NaD1(0.1、2和10μM)或10μM NaD1R&A进行处理。在ROS的存在下，DHR123被氧化成荧光分子罗丹明123。在对于生长抑制足够的NaD1浓度下暴露于NaD1后，在Fov菌丝中观察到荧光中的浓度依赖 性增加。在用NaD1R&A处理后未观察到荧光，这与其抗真菌活性的丧失一致。
[0098] 抗坏血酸和2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧(TEMPO)(Sigma-Aldrich)都是ROS的有效的细胞渗透清除剂。为了研究NaD1诱导的ROS产生的关联性，在这2种分子的存在下监控经由NaD1的DHR123氧化。抗坏血酸或TEMPO的存在不改变荧光水平，10mM抗坏血酸的存在也不影响Fov经由NaD1的生长抑制。
[0099] 总的来说，NaD1看起来经由假定环形或凹桶型孔的形成破坏膜，所述孔允许直径的分子进入。NaD1看起来不与人工双分子层相互作用，包括由从敏感真菌的菌丝中分离出的脂质形成的那些，指示它不与脂质直接相互作用，尽管毒性的温度依赖性支持它的确插入膜内的想法。 绿摄取的动力学暗示受体涉及膜透化。
[0100] 免疫金电子显微镜检查用于测定NaD1是否能够跨越细胞膜且进入经处理的菌丝的细胞质。对用或未用NaD1(10μM)处理2小时的菌丝进行洗涤，固定且切片用于使用α-NaD1抗体的免疫金电子显微镜检查。许多但并非全部NaD1处理的菌丝都具有粒化细胞质，伴随许多异常空泡。这些菌丝中的细胞质是用α-NaD1抗体重标记的，尽管NaD1不与特定细胞内细胞器结合。NaD1处理的菌丝中的粒化细胞质看起来已向内坍塌，远离细胞壁。还在细胞壁上观察到金标记。
[0101] 未摄取大量NaD1的许多菌丝也存在于NaD1处理的样品中。这些菌丝的细胞质不是粒状的，暗示NaD1摄取是细胞杀死过程必需的。为支持这点，还可以鉴定具有部分粒化的细胞质的菌丝，并且NaD1在这些区域中而不是在看起来正常的细胞区域中浓缩。这可以代表细胞死亡的早期阶段。
[0102] 在足以引起>90％生长抑制的浓度下NaD1不存在于几个菌丝中可能给出关于NaD1摄取模式的某些信息。生长抑制测定法从孢子开始，因此NaD1存在经过细胞周期的所有阶段。相比之下，对可能已处于细胞周期的不同阶段的菌丝执行显微镜检查。因为免疫印迹分析揭示NaD1在3小时后保留在上清液中，所以NaD1通过某些菌丝的内在化的缺乏 不是由于使用的浓度不够。可能NaD1无法影响处于细胞周期的特定阶段中的细胞。这与关于昆虫抗真菌肽tenecin 3的观察一致，所述tenecin 3在对数期生长过程中而不是在静止期过程中摄取到酵母细胞内(Kim等人，2001)。在显微镜检查测定法中不摄取NaD1的菌丝可能代表处于对NaD1有抵抗力的不同生长阶段中的那些。这可以通过在进入静止期后发生的阻止肽摄取的预测细胞壁改变加以解释(Klis等人，2002)。为支持这点，能够抑制出芽而不是非出芽曲霉菌属菌丝的生长的抗微生物肽杀菌肽仅与出芽菌丝的细胞表面结合(Ekengren和Hultmark，1999)。
[0103] 为了进一步证实NaD1摄取和排除NaD1在细胞质中的存在是固定过程的假象的可能性，用荧光团bimane标记NaD1。选择这种荧光团是因为它很小、不带电的性质和使分子与NaD1上的羧基共价附着的能力。以这种方式标记的NaD1保留完全抗真菌活性。相比之下，经由反应胺基团用FITC标记的NaD1不是生物活性的，可能是由于分子在生理学pH下携带2个负电荷的事实。单个FITC分子与NaD1中的反应胺的附着因此将使蛋白质的总电荷减少3。因为提出正电荷对于抗微生物活性是至关重要的，所以NaD1可能无法耐受这种处理。此外，NaD1上将与FITC反应的2个赖氨酸定位于环区域上，所述环区域已描述为对于另一种植物防御素RsAFP2的抗真菌活性是必需的(De Samblanx等人，1997)。
[0104] 将NaD1-bimane加入活菌丝中，并且通过荧光显微镜检查监控摄取。在20-30分钟后观察到内在化，这与 绿透化动力学一致。在这个时间点上，已摄取NaD1的菌丝看起来仍是健康的，然而，随着时间过去，这些菌丝的细胞质变成粒状，并且它们看起来死亡。NaD1看起来在摄取后不与特定细胞器相互作用而是证实细胞质定位。这不同于植物防御素Psd1，其转运至经处理的粗糙链孢霉(N.crassa)细胞的核(Lobo等人，2007)。Psd1与核定位的细胞周期蛋白的相互作用也已得到验证，并且它的抗真菌活性被认为是细胞周期停滞的结果(Lobo等人，2007同上)。另一方面，来自产黄青霉素(P.chrysogenum)的抗真菌蛋白质PAF在进入构巢曲霉菌菌丝内后显示出细胞质定位(Oberparleiter 等人，2003)。在进入后，PAF诱导凋亡表型，可能通过G蛋白信号传导(Leiter等人，2005)。
[0105] 还通过细胞质内含物的SDS-PAGE和免疫印迹监控摄取到Fov菌丝的细胞质内的NaD1量。这些数据指出NaD1摄取在20分钟后发生，这与用显微镜检查一致。在Fov细胞质中的NaD1量增加直至60分钟时，在这个时间后它轻微下降。这可能是细胞破坏和某些内在化的NaD1后续释放回到上清液内的结果。
[0106] 目前确定了许多抗微生物肽能够进入细胞并且其作用机制涉及细胞内靶的证据。NaD1处理的菌丝的细胞质看起来是‘萎缩的’并且收缩远离细胞壁。在用来自巨曲霉(Aspergillus giganteus)的抗真菌蛋白质AFP处理的构巢曲霉菌菌丝中观察到相似形态。
AFP在低浓度下是抑制真菌的，引起膜透化且与细胞壁结合；而在高浓度下该蛋白质是内在化的并且引起菌丝细胞质的粒化(Theis等人，2003；Theis等人，2005)。
[0107] 用于鉴定增强化学杀真菌剂的抗病原体活性的防御素的方法，其包括步骤：在测试防御素的存在下和分开地在不存在测试防御素的情况下，使病原体与透性指示剂化合物相组合；比较在所述测试防御素的存在和不存在下，所述真菌中透性指示剂化合物的任何可检测的细胞内的量，由此与在不存在所述测试防御素的情况下检测出的指示剂化合物的细胞内的量相比较，其的存在增加细胞内透性指示剂化合物的量的测试防御素，被鉴定为增强蛋白酶抑制剂的抗真菌活性的防御素。
[0108] 本申请自始至终的所有参考文献，例如专利文件包括颁发或授权的专利或等价物；专利申请公开；和非专利文献文件或其他资源材料；在此通过引用整体合并入本文，如分别通过引用合并一样，所述合并是以每个参考文献与本申请中的公开内容至少部分不矛盾的程度(例如，部分矛盾的参考文献引入作为参考，但除了参考文献的部分矛盾部分外)。
[0109] 说明书中提及的所有专利和出版物反映本发明所属领域的技术人员的技术水平。本文引用的参考文献通过引用整体合并入本文，以指出技术水平(在某些情况下为其提交日期之前的技术水平)，并且需要时， 预期这个信息可以在本文中采用，以排除(例如，放弃)可能在现有技术中的特定实施方案。
[0110] 当本文公开一组取代物时，应当理解分别公开了那些组的所有个体成员和所有亚组，包括具有相同生物活性的组成员的任何同分异构体和对映异构体，以及使用取代基可以形成的化合物的类型。当请求保护化合物时，应当理解不预期包括本领域已知的化合物，所述本领域已知的化合物包括在本文公开的参考文献中公开的化合物。当本文使用Markush组或其他分组时，该组的所有个体成员以及可能的组的所有组合和亚组合预期都包括在公开内容中。
[0111] 除非另有说明，否则所述或例示或提及的组分的每一种组合可以用于实践本发明。化合物的特定名称预期是示例性的，如本领域普通技术人员已知的，可以不同命名相同化合物。本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法、原材料、合成方法和重组方法而无需过度实验。任何此类方法、原材料、合成方法和重组方法的所有领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。每当在说明书中给出范围时，例如温度范围、时间范围或组成范围，所有中间范围和子范围以及范围中包括的所有个体值都预期包括在公开内容中。
[0112] 如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。如本文所使用的，“由……组成”排除在权利要求元件中未指定的任何元件、步骤或成分。如本文所使用的，“基本上由……组成”不排除实际上不影响权利要求的基本和新型特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何陈述，特别是在描述组合物、方法或系统的组分时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些组合物、方法和系统。本文举例说明性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
[0113] 本领域技术人员应当理解本发明充分适合于执行所述目的且获得目标和优点，以及本发明固有的那些。本文描述的作为优选实施方案的目 前代表的方法、组分、材料和尺度被作为例子提供，并且不预期作为关于本发明的范围的限制。包括在本发明的精神内的其中的改变和其他用途对于本领域技术人员是显而易见的，且包括在权利要求的范围内。尽管本文的说明书包含某些特定信息和例子，但这些不应解释为限制本发明的范围，而是仅仅提供本发明的某些实施方案的举例说明。因此，另外的实施方案在本发明的范围内且在下述权利要求内。
[0114] 应当指出农作物科学家、农学家或植物学家将知道如何且何时终止、中断或调整施用，这是由于对待保护的植物的性能的毒性或有害作用。相反，如果应答不足够(排除毒性)，那么技术人员也将知道使处理调整至更高水平。蛋白酶抑制剂和/或防御素所施用剂量的量级或重组表达蛋白酶抑制剂或防御素的表达水平，可以通过相关领域技术人员已知的方法进行调整，或当应用于植物或种子时，可以改变关于蛋白酶抑制剂和/或防御素的施用方法或制剂，以改善植物不受真菌性病原体的保护。状况的严重度可以例如部分通过标准预后评价方法进行评价。此外，剂量和可能地剂量频率也将根据年龄、大小、土壤和/或气候情况和个别植物的应答而改变。
[0115] 使用农学上可接受的载体将本文公开用于实践本发明的一种或多种化合物配制成适合于系统和表面施用的剂量在本发明的范围内，并且在本领域普通技术水平内。通过适当选择载体和合适的制造实践，本发明的组合物(特别是配制为溶液的那些)，可以施用于植物表面包括地上部分和/或根，或作为包衣应用于种子的表面。
[0116] 适合于在本文公开的系统中使用的农学上有用的组合物包括这样的组合物，其中一种或多种活性成分以有效量包含以达到预期目的。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
[0117] 除活性成分外，用于在抗真菌方法中使用的这些组合物还可以包含合适的农学上可接受的载体，包括促进活性化合物加工成制剂的赋形剂和助剂，所述制剂可以在田间、温室或实验室背景中使用。
[0118] 抗真菌制剂包括活性化合物以水溶性形式的水溶液。另外，活性化 合物的悬浮液可以适当地制备为油悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。注射水悬浮液可以包含增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解性的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。进一步的组分尤其可以包括增粘剂、凝胶、湿润剂、紫外线保护剂。
[0119] 用于表面应用的制剂可以这样获得：使活性化合物与固体赋形剂相组合，任选地磨碎所得到的混合物，并且需要时，在加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得用于直接应用或用于在喷射到待保护的植物上之前溶解的粉末。合适的赋形剂特别是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。
[0120] 本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
[0121] 本发明在下述非限制性实施例中进一步描述。这些实施例中采用的材料和方法在下文提供。
[0122] 来自巴斯德毕赤酵母和花烟草的NaD1的纯化
[0123] 巴斯德毕赤酵母表达系统是众所周知的，并且从Invitrogen(Carlsbad，CA；参见公开pPIC9表达载体的序列的供应商的Pichia Expression Manual)商购可得的。
[0124] 单个pPIC9-NaD1巴斯德毕赤酵母GS115菌落用于接种在100mL烧瓶中的10mL BMG培养基(在Invitrogen Pichia Expression Manual中描述)，并且在30℃振荡温箱(140rpm)中温育过夜。培养物用于 接种在2L带挡板的烧瓶中的500mL BMG，将所述带挡板的烧瓶置于30℃振荡温箱(140rpm)中。在OD600达到2.0(～18小时)后，通过离心(2,500x g，10分钟)收获细胞，并且重悬浮于在5L带挡板的烧瓶中的1L BMM培养基(OD600＝1.0)中，并且在28℃振荡温箱中温育3天。通过离心(4750rpm，20分钟)使表达培养基与细胞分离，并且用等体积的20mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)稀释。在培养基施加于用10mM磷酸钾缓冲液，pH 
6.0预平衡的SP Sepharose柱(1cm x 1cm，Amersham Biosciences)前，用NaOH使其调整至pH 6.0。随后用100mL10mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0洗涤柱，并且在包含500mM NaCl的
10mL10mM磷酸钾缓冲液中洗脱结合蛋白质。对洗脱蛋白质实施RP-HPLC，使用40分钟线性梯度，如本文下文描述的。收集蛋白质峰并且通过SDS-PAGE和用α-NaD1抗体的免疫印迹分析。
使包含NaD1的部分冻干并且重悬浮于无菌milli Q超纯水中。使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定法(Pierce Chemical Co.)测定毕赤酵母属表达的NaD1的蛋白质浓度，用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准。
[0125] 为了从其天然来源中分离NaD1，使直到花发育的花瓣着色阶段的完整花烟草花磨碎至细粉，并且如先前所述在稀硫酸中提取(Lay等人，2003)。简言之，使花(760g湿重)在液氮中冷冻，以研钵和研棒磨碎至细粉，并且使用Ultra-Turrax匀浆器(Janke和Kunkel)在50mM硫酸(3mL/g鲜重)中匀浆化5分钟。在4℃下搅拌1小时后，通过经过Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)过滤和离心(25,000x g，15分钟，4℃)去除细胞碎片。随后通过添加10M NaOH使pH调整至7.0，并且在离心(25,000x g，15分钟，4℃)以去除沉淀蛋白质前，使提取物在4℃下搅拌1小时。将上清液(1.8L)应用于由10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0预平衡的SP SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare Bio-Sciences)柱(2.5x 2.5cm)。通过用
20柱体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)洗涤来去除未结合的蛋白质，并且用包含500mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)在3x 10mL馏分中洗脱结合蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和用α-NaD1抗体的免疫印 迹，分析来自每个纯化步骤的样品。对来自SP Sepharose柱包含NaD1的馏分实施反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。
[0126] 反相高效液相层析法
[0127] 使用附着保护柱的制备型C8柱(22x 250mm，Vydac)，在与检测器(型号166，Beckman)偶联的System Gold HPLC(Beckman)上执行反相高效液相色谱法(RP-HPLC)。将蛋白质样品装载到缓冲液A(0.1％[v/v]三氟乙酸)中，并且用1-100％(v/v)缓冲液B(在0.089％[v/v]三氟乙酸中的60％[v/v]乙腈)的线性梯度，以10mL/分钟的流速经过40分钟进行洗脱。通过监控在215nm处的吸光度检测蛋白质。收集蛋白质峰并且通过SDS-PAGE分析。
[0128] 将来自NaD1纯化(30μL)的每个阶段的样品加入NuPAGE(经注册的)LDS加样缓冲液(10μL，Invitrogen)中，并且加热至70℃共10分钟。随后将样品装载到NuPAGE(经注册的)预铸4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上，并且使用在200V下运行的XCell-Surelock电泳仪(Invitrogen)分离蛋白质。蛋白质通过考马斯蓝染色进行显现，或转移到硝酸纤维素上用于用α-NaD1抗体的免疫印迹。
[0129] 经还原且烷化的NaD1的制备
[0130] 使冻干的NaD1(500μg)溶解于400μL储备缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.0、2mM EDTA、6M胍-HCl、0.02％[v/v]Tween-20)中。加入还原缓冲液(具有15mM二硫苏糖醇[DTT]的储备缓冲液)(44μL)，随后为在40℃下的4.5小时温育。在加入碘乙酸(在1M NaOH中0.5M，55μL)前，使反应混合物冷却至RT，并且温育在黑暗中在RT下继续30分钟。Nanosep omega(经注册的)旋转柱(3K分子量截止，PALL Life Sciences)用于去除盐、DTT和碘乙酸，并且使用BCA蛋白质测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。如本文所述测量经还原且烷化的NaD1(NaD1R&A)对尖孢镰刀菌(Fov)生长的作用。
[0131] 免疫印迹分析
[0132] 对于免疫印迹分析，将蛋白质转移至硝酸纤维素，并且用蛋白质A 纯化的α-NaD1抗体(7.5μM的1:3000稀释度)探测，随后为与辣根过氧化物酶缀合的山羊α-兔IgG(1:3500稀释度；Amersham Pharmacia Biotech)。增强化学发光(ECL)检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech)与ChemiGenius(商标)生物成像系统(Syngene)一起用于显现结合抗体。
[0133] 为了产生抗NaD1抗血清，用戊二醛使经纯化的NaD1(1.5mg)与钥孔血蓝蛋白(0.5mg，Sigma)缀合，如由Harlow和Lane，1998描述的。用在等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)中的1.5mL蛋白质(150μg NaD1)注射兔。4和8周后施用经缀合的蛋白质(100μg NaD1)和弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的加强免疫接种。在注射前收集免疫前血清，并且在第三次和第四次免疫接种后14天收集免疫血清。使用蛋白质ASepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech)纯化来自免疫前和免疫血清的IgG部分，并且分别以3.4μM和7.5μM的浓度贮藏于-80℃下。
[0134] 针对丝状真菌的活性分析
[0135] 基本上如Broekaert等人，1990中所述，评估针对尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov，从棉花中分离出的澳大利亚分离物VCG01111；来自Wayne O’Neill，Farming Systems Institute，DPI，Queensland，澳大利亚)、烟草根串珠霉(来自David Nehl，NSW DPI，Narrabri，澳大利亚的赠予)、大丽轮枝菌(来自Helen McFadden，CSIRO Plant Industry，Black Mountain，澳大利亚)、十字花科小球腔菌(来自Barbara Howlett，University of Melbourne，Victoria，澳大利亚)和构巢曲霉菌(来自Michael Hynes，University of Melbourne)。通过经由无菌细棉布过滤，从在半强度马铃薯右旋糖肉汤(PDB)(Fov和烟草根串珠霉)、Czapeck-Dox Broth(大丽轮枝菌)(Difco Laboratories)或10％(v/v)澄清的V8培养基(十字花科小球腔菌和构巢曲霉菌)中生长的孢子生成培养物中分离出孢子。使用血球计数器测定孢子浓度，并且在合适的生长培养基中调整至5x 104孢子/mL。将孢子悬浮液(80μL)加入无菌96孔平底微量滴定板的孔中，连同20μL过滤灭菌(0.22μm 注射器式滤器；Millipore)的NaD1或水，以得到0-10μM的蛋白质终浓度。使平板短暂振荡并且置于黑暗中在25℃下不伴随振荡，直到水对照在595nm处的光密度达到约0.2(依赖于生长速率24-72小时)时。通过使用微量滴定板平板阅读器(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量在
595nm处的光密度估计菌丝生长。每种测试一式四份地执行。
[0136] 金属离子对NaD1活性的作用
[0137] 如所述的用培养基中存在的各种浓度的CaCl2(0.1、0.2、0.5、1.0和2.0μM)或MgCl2(1.0、2.0、10、20和50μM)检查NaD1针对Fov的活性，以测定二价阳离子对NaD1活性的作用。
[0138] NaD1和膜透化
[0139] Fov菌丝在半强度PDB(在50mL管中的10mL)中从5x 104孢子/mL的起始浓度开始在25℃下伴随恒定振荡生长18小时。随后去除样品(1mL)，并且在RT下伴随轻轻搅动温育2小时前，加入NaD1(终浓度2μM)、NaD1R&A(终浓度2μM)或等体积的水。加入 绿
(Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR)至0.5μM的终浓度，并且允许菌丝静置10分钟。随后将菌丝(20μL)转移至显微镜载玻片(SuperFrost(经注册的)Plus，Menzel-Glaser)，并且用玻璃盖玻片覆盖，用于使用Olympus BX51荧光显微镜显现 绿摄
取。使用MWIB滤波器(激发波长460-490nm)检测 绿荧光。使用SPOT RT 3CCD数码相机(Diagnostic Instruments)捕获图像，并且使用Adobe Photoshop进行加工。通过使用荧光计(SpectraMax M2；Molecular Devices)测量微量滴定盘中菌丝的荧光来定量
绿摄取，其中激发和发射波长分别为488nm和538nm。
[0140] 还研究在真菌菌丝的NaD1处理后FITC标记的右旋糖酐的摄取。Fov菌丝如上所述进行生长，并且与NaD1(终浓度0.1、2、10或50μM)或等体积的水一起在RT下伴随轻轻搅动温育2小时。菌丝用半强度PDB洗涤2次共10分钟，以在加入4kDa(FD-4，Sigma-Aldrich)或10kDa(FD-10，Sigma-Aldrich)的FITC右旋糖酐至1μM的终浓度前，去除 过量NaD1。使菌丝在RT下进一步温育30分钟，并且随后用半强度PDB洗涤2次以去除过量右旋糖酐。荧光显微镜检查用于显现菌丝，如对于  绿描述的。在相同条件下执行第二种测定法，除了右旋糖酐与NaD1同时加入外。
[0141] 如所述的监控温度对Fov菌丝经由NaD1的膜透化的作用，除了在加入NaD1前菌丝在10、4或0℃下预平衡60分钟，并且所有后续步骤在这些温度下执行外。
[0142] 研究经由NaD1的膜透化的动力学。Fov菌丝在半强度PDB中从5x 104孢子/mL的起始浓度开始在25℃下生长18小时。随后将菌丝(80μL)转移至96孔微量滴定板，并且在加入20μL肽溶液得到0.2、0.4、0.8、1.6、3.12、6.25、12.5、25、50或100μM的蛋白质终浓度前，与绿(0.5μM)一起温育10分钟。随后使用荧光计(SpectraMax M2)每2分钟获取荧光
读数(Ex；488nm，Em；538nm)，共3小时。
[0143] 从经处理的菌丝中分离NaD1
[0144] 在向1mL培养物中加入NaD1(10μM终浓度)前，Fov菌丝如上所述进行生长。在0、5、10、30、60、90和120分钟后收集样品(100μL)。通过离心(10分钟，10,000x g)收集菌丝，并且将上清液贮藏于-20℃下用于分析。在它们重悬浮于包含10mM DTT的50mM CAPS缓冲液(pH10.0)中之前，用KCl(0.6M)洗涤菌丝(2x 10分钟)以去除任何离子结合的蛋白质，共20分钟。通过离心收集菌丝，并且收集包含细胞壁蛋白质的上清液用于分析。使团块(包含细胞)重悬浮于水中，并且使用玻璃珠(Sigma，60mg)和涡旋(3x 10分钟)使细胞裂解。通过离心(16,000x g，10分钟)去除细胞碎片，并且收集上清液用于分析。随后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析所有样品。
[0145] 电子显微镜检查
[0146] Fov菌丝在半强度PDB(5mL)中从5x 104/ml的起始孢子悬浮液开始伴随剧烈振荡在25℃下生长18小时。在PBS中的4％(w/v)多聚甲醛中在4℃下固定1小时前，菌丝随后用2μM NaD1或等体积的水在RT下伴随轻轻搅动处理2小时，并且在0.6M KCl中洗涤2次且在PBS 中洗涤3次。在标准乙醇系列中脱水前(50％、70％和90％乙醇各15分钟，100％乙醇3x 15分钟)，菌丝再次在PBS中洗涤3次。菌丝随后用LR White树脂(ProSciTech)在RT下浸润1小时，随后为在4℃下18小时，在RT下1小时和在60℃下24小时。在每个步骤时使用新鲜的LR White树脂。切割超薄切片并且置于Formvar包被的金格栅上。
[0147] 格栅用包含8％(w/v)BSA和1％(v/v)Triton X-100的PBS封闭1小时，并且用α-NaD1抗体(在封闭缓冲液中2μg/mL)标记1小时。格栅在封闭缓冲液中洗涤(3x 10分钟)，并且用1:20稀释的15nm金颗粒标记的山羊α-兔IgG抗体(ProSciTech)标记1小时。在风干前，格栅再次在封闭缓冲液中洗涤(3x 10分钟)，随后为水(15分钟)。JEOL JEM2010HC x e80KV透射电子显微镜用于检查经标记的格栅。在Kodak EM胶片(ProSciTech)上获取照片，并且在Hewlett Packard Scanjet 5P扫描仪上扫描前，在暗室中显影。
[0148] 监控荧光标记的NaD1的摄取
[0149] 如由制造商描述的，使用EZ-label(商标)FITC蛋白质标记试剂盒(Pierce)，使异硫氰酸荧光素(FITC)与NaD1缀合。
[0150] 为了产生bimane胺标记的NaD1，使冻干的NaD1溶解于0.1M MES缓冲液(pH 5.0)中至2mM的终浓度。加入荧光标签bimane胺(Invitrogen-Molecular Probes)至10mM的终浓度，连同1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC，2mM的终浓度)。在离心(13,000rpm，10分钟)前，使反应在RT下伴随轻轻搅拌温育2小时，以去除任何沉淀蛋白质。
NanosepΩ3K旋转柱(PALL life sciences)用于去除盐、未结合的bimane胺和EDC。使bimane标记的NaD1重悬浮于水中，并且使用BCA蛋白质测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。
[0151] 如上所述生长18小时的菌丝用NaD1-bimane(2μM)处理10分钟到6小时。随后使用MWU滤波器(330-385nm的激发波长)通过荧光显微镜检查显现菌丝。
[0152] 响应NaD1处理的活性氧种类的检测
[0153] Fov菌丝如本文所述进行生长，并且与5μg/mL二氢罗丹明123 (Sigma-Aldrich)一起温育2小时，随后用生长培养基充分洗涤。在用0.6M KCl洗涤前，菌丝随后用NaD1(2μM)或水处理1小时。随后在荧光计上测量荧光，其中激发和发射波长分别为488nm和538nm，或通过荧光显微镜检查显现荧光。在抗坏血酸(10mM)或2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧(TEMPO，3mM)的存在下重复实验。
[0154] 转基因植物细胞和/或组织的产生
[0155] 用于在植物细胞和/或组织中引入且选择异源DNA的存在的技术和试剂是众所周知的。允许选择植物细胞中的异源DNA的遗传标记是众所周知的，例如携带针对抗生素例如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博来霉素的抗性的基因。标记允许选择在包含合适抗生素的培养基中生长的成功转化的植物细胞，因为它们将携带相对应的抗性基因。在大多数情况下，插入植物细胞内的异源DNA包含编码可选标记例如抗生素抗性标记的基因，但这不是强制性的。示例性药物抗性标记是其表达导致卡那霉素抗性的基因，即由Rogers等人，1988描述的，包含胭脂碱合成酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶3'非翻译区的嵌合基因。
[0156] 关于用表达盒遗传改造植物细胞和/或组织的技术通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、电穿孔、显微注射、粒子轰击或本领域已知的其他技术引入植物细胞或组织内，所述表达盒包括与异源编码序列和转录终止序列融合的诱导型启动子或嵌合型启动子。表达盒有利地进一步包含允许选择植物细胞中的异源DNA的标记，例如，携带针对抗生素例如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博来霉素的抗性的基因。
[0157] 携带植物可表达基因或其他目的DNA的DNA构建体可以通过任何合适方法插入植物的基因组内。此类方法可以涉及例如脂质体的使用、电穿孔、扩散、粒子轰击、显微注射、基因枪、增加游离DNA摄取的化学制品例如磷酸钙共沉淀、病毒载体和本领域中实践的其他技术。合适的植物转化载体包括衍生自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒的那些，例如由Herrera-Estrella等人，1983，Bevan等人，1983；Klee等人，1985和EPO公开120,516(Schilperoort等人，欧 洲专利公开120,516)公开的那些。除衍生自土壤杆菌属的Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，备选方法也可以用于将本发明的DNA构建体插入植物细胞内。
[0158] 如本领域众所周知的，其中目的DNA可操作地连接的载体的选择直接依赖于所需的功能性质，例如复制、蛋白质表达和待转化的宿主细胞，这些是构建重组DNA分子领域中固有的限制。载体希望地包括原核复制子，即当引入原核宿主细胞内例如细菌宿主细胞时，具有指导重组DNA分子染色体外自主复制和维持能力的DNA序列。此类复制子是本领域众所周知的。此外，包括原核复制子的优选实施方案还包括这样的基因，当引入这些经转化的细胞内时，其表达对细菌宿主细胞赋予选择优势例如药物抗性。一般的细菌药物抗性基因是在其他选择剂中例如赋予针对氨苄青霉素或四环素的抗性的那些。新霉素磷酸转移酶基因具有它在真核以及原核细胞中表达的优点。
[0159] 包括原核复制子的那些载体还一般包括用于插入本发明的重组DNA分子的方便的限制位点。此类载体质粒的典型例子是可从BioRad Laboratories(Richmond，CA)获得的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329，和可从Pharmacia(Piscataway，NJ)获得的pPL、pK和K223，以及可从Stratagene(La Jolla，CA)获得的pBLUESCRIPT tm和pBS。本发明的载体还可以是如本领域已知的λ噬菌体载体或λZAP载体(可从Stratagene La Jolla，CA获得)。另一种载体包括例如pCMU(Nilsson 等人，1989)。其他合适的载体也可以根据已知方法进行合成；例如在本文的各种应用中使用的载体pCMU/Kb和pCMUII是pCMUIV(Nilsson等人，1989)的修饰。
[0160] 能够在植物细胞中表达重组核酸序列且能够指导在宿主植物细胞内的稳定整合的一般表达载体包括衍生自根瘤土壤杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体。
[0161] 转基因植物可以通过本领域已知的任何标准方法产生，包括但不限于根瘤土壤杆菌介导的DNA转移，优选用卸甲(disarmed)T-DNA载体、电穿孔、直接DNA转移和粒子轰击。用于将DNA引入单子叶植物以及双 子叶植物内的技术是本领域众所周知的，如用于培养此类植物组织且再生这些组织的技术一样。
[0162] 与目的多肽或蛋白质特异性反应的单克隆或多克隆抗体，优选单克隆，可以通过本领域已知的标准方法进行制备。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，关于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应，以及各种分离技术是本领域技术人员已知且常用的那些。采用的缩写和命名法被认为是在本领域中标准的且在专业杂志例如本文引用的那些中常用的。
[0163] 实施例1
[0164] 克隆且重组表达来自花烟草的半胱氨酸蛋白酶抑制剂
[0165] 使用标准分子生物学方法从观赏烟草花烟草中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂cDNAs。
[0166] RNA提取
[0167] 使来自花烟草的未成熟叶、成熟叶和花柱(各～100mg)在液氮中磨碎。加入Trizol试剂(Invitrogen)至1mL的最终体积，并且使样品在室温下温育5分钟。随后使样品离心(在4℃下18,000g共10分钟)，并且将上清液取出至新鲜管。加入氯仿(200uL)并且使管涡旋15秒，在室温下温育3分钟，并且随后离心(在4℃下18,000g共15分钟)。取出水层至新鲜管，并且加入异丙醇(500uL)。使样品涡旋，在室温下温育10分钟，随后离心(在4℃下18,000g共10分钟)。弃去上清液并且用乙醇(75％v/v，1mL)洗涤团块，离心(在4℃下18,000g共5分钟)，并且弃去上清液。使RNA团块风干10分钟，并且随后重悬浮于无菌蒸馏水(20uL)中。
[0168] cDNA合成
[0169] 将RNA(1ug)加入DNA酶I(1uL，1U/uL，Invitrogen)、10XDNA酶I反应缓冲液(1uL)和DEPC处理的水(至10uL)，并且在室温下温育15分钟。随后加入EDTA(25mM，1uL)，并且使样品在65℃下加热10分钟。加入寡核苷酸(dT)20引物(50uM，1uL)和dNTP混 合物(各10mM dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1uL)，使样品在65℃下温育5分钟，并且随后置于冰上。加入5X First-Strand缓冲液(4uL，Invitrogen)、DTT(0.1M，1uL)、RNaseOUT重组RNA酶抑制剂(1uL，Invitrogen)和Superscript III RT(200U/uL，1uL，Invitrogen)，并且使样品在50℃下温育30分钟。随后通过在70℃下加热15分钟灭活反应。
[0170] PCR扩增和半胱氨酸蛋白酶抑制剂cDNAs的克隆
[0171] 用于扩增来自花烟草的半胱氨酸蛋白酶抑制剂cDNAs的寡核苷酸引物基于来自Nicotiana lansgdorfii x Nicotiana sanderae杂交的成熟叶的EST序列(GenBank登记号EB699598)。2个正向引物的5'末端包含Bam HI限制位点，而反向引物的3'末端包含Sal I限制位点。引物序列是：JRF1：5’AAG GAT CCA TGG CAA CAC TAG GAG G 3’(SEQ ID NO:26)；JRF2：5’AAG GAT CCA TGG CAA ATC TAG GAG G 3’(SEQ ID NO:27)；JRR1：5’AAG TGC ACT TAA GCA CTA GYG GCA TC 3’(SEQ ID NO:28)。PCR反应包含10X PCR缓冲液(5uL，Invi trogen)、MgSO4(50mM，2uL)、dNTP混合物(各2.5mM，4uL)、JRF1或JRF2引物(10uM，1uL)、JRR1引物(10uM，1uL)、铂HiFi Taq DNA聚合酶(5U/uL，0.2uL，Invitrogen)、无菌蒸馏水(34.8uL)和cDNA(2uL)。起始变性在94℃下发生2分钟，随后为94℃30秒、50℃30秒和68℃30秒的35个循环，随后为68℃5分钟的最终延伸步骤。将所得到的来自成熟叶cDNA(也得自未成熟叶和花柱cDNA)的～300bp PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)内，这随后根据制造商的说明书用于转化化学感受态大肠杆菌细胞(TOP10，Invitrogen)。使用Wizard Plus SV Miniprep试剂盒(Promega)分离质粒DNA，并且使用TOPO特异性M13正向和反向引物测序(Macrogen)载体插入片段。
[0172] 重组蛋白质表达和纯化
[0173] NaCys1(SEQ ID NO:1)、NaCys2(SEQ ID NO:3)、NaCys3(SEQ ID NO:5)和NaCys4(SEQ ID NO:7)进行PCR扩增，用于亚克隆到pHUE内用于在大肠杆菌中的重组蛋白质表达(Baker等人，2005， Cantanzariti等人，2004)。使用下述引物：JRF3：5’CTC CGC GGT GGT ATG GCA ACA CTA GGA GG 3’(SEQ ID NO:29)；JRF4：5’CTC CGC GGT ATG GCA AAT CTA GGA GG 3’(SEQ ID NO:30)。PCR反应包含10X PCR缓冲液(5uL，Invitrogen)、MgSO4(50mM，2uL)、dNTP混合物(各2.5mM，4uL)、JRF3或JRF4引物(10uM，1uL)、JRR1(SEQ ID NO:26)引物(10uM，1uL)、铂HiFi Taq DNA聚合酶(5U/uL，0.2uL，Invitrogen)、无菌蒸馏水(34.8uL)和来自分别TOPO克隆的质粒DNA(～1mg/uL，2uL)。起始变性在94℃下发生2分钟，随后为94℃
30秒、50℃30秒和68℃30秒的30个循环，随后为68℃5分钟的最终延伸步骤。如上所述将PCR产物克隆到TOPO内。使用Sac II和Sac I切割插入片段，使用Perfectprep试剂盒
(Eppendorf)从琼脂糖凝胶中切割，并且连接到pHUE内，所述pHUE随后用于转化TOP10大肠杆菌细胞。对于具有内部、天然的Sac II位点的NaCys4，使用在TOPO中内部、天然的Eco RI位点和Sal I位点，从TOPO载体中克隆的NaCys4 cDNA中切割插入片段。将这连接到包含NaCys2的pHUE内，所述pHUE已用Eco RI和Sal I进行消化；所得到的DNA用于转化TOP10大肠杆菌细胞。分离关于包含NaCys1、NaCys2、NaCys3和NaCys4的pHUE的质粒DNA，并且随后用于转化大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus细胞(Invitrogen)。
[0174] 大肠杆菌(BL21(DE3))的单个菌落用于接种包含氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)和四环素(0.1mg/mL)的2YT培养基(10mL，16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl)，并且伴随振荡在37℃下生长过夜。这种培养物用于接种包含氨苄青霉素(0.1mg/mL)的2YT培养基(500mL)，这随后生长4小时至～1.0的光密度(600nm)。随后加入IPTG(0.5mM终浓度)，并且使培养物生长另外3小时。通过离心(在4℃下4,000g共20分钟)收获细胞，重悬浮于天然裂解缓冲液(20mL/升细胞培养物、50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)中，并且在-80℃下冷冻。随后使细胞解冻，并且用溶菌酶(5mg/25mL重悬浮细胞)在4℃下处理20分钟。随后加入DNA酶I(125uL，在20％甘油、75mM NaCl中2mg/mL) 和MgCl2(125uL，1M)，并且使样品在室温下在振动平台上温育40分钟。随后使样品在冰上超声处理2x 30秒(80％功率，Branson超声波仪450)且离心(在4℃下20,000g共30分钟)。随后根据制造商的说明书通过固定金属亲和层析(IMAC)在天然条件下使用Ni-NTA树脂(1.5mL至～25mL天然蛋白质提取物，Qiagen)，从蛋白质提取物中纯化六组氨酸标记的泛素-融合蛋白(His6-Ub-NaCys1,2,3)。使用洗脱缓冲液(250mM咪唑、200mM NaCl、50mM NaH2PO4，pH 
8.0)洗脱重组蛋白质。通过将洗脱蛋白质施加于用50mM Tris.Cl，100mM NaCl，pH 8.0平衡的预装Sephadex G50凝胶过滤柱(PD-10，Amersham)去除咪唑。
[0175] 使用去泛素化酶6H.Usp2-cc(Cantanzariti等人2004)从重组蛋白质中切割六组氨酸标记的泛素。使His6-Ub-NaCys1、2或3(在50mM Tris.Cl、100mM NaCl，pH 8.0中～75mg)与6H.Usp2-cc(～0.6mg)和DTT(1mM终浓度)混合，并且在37℃下温育2小时。通过另一轮IMAC用去泛素化的半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为未结合的蛋白质去除经切割的标记。随后将这应用于另一个PD-10柱，用水洗脱且冻干。用胰蛋白酶消化后，通过SDS-PAGE、反相HPLC和MALDI-TOF质谱法表征半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
[0176] 使用酶木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L(Sigma)测定细菌表达的NaCys1、NaCys3和NaCys4的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。测定混合物(最终体积250uL)包含木瓜蛋白酶或组织蛋白酶L(50nM终浓度)、100uL ZFR-MCA底物(0.2mM，Bachem，Melo等人，2001)、100uL反应缓冲液(0.2M乙酸钠、4mM EDTA、8mM DTT，pH 5.5)和50uL半胱氨酸蛋白酶抑制剂(共0-20uM终浓度)。对于木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L，分别在37℃下温育10或50分钟后在460nm下(在340nm下激发)测量释放的荧光。
[0177] 通过使经纯化的NaCys1与钥孔血蓝蛋白缀合产生针对NaCys1(SEQ ID NO:2)的多克隆抗体。在经过5分钟伴随搅拌向蛋白质溶液中逐滴加入等体积的0.4％(v/v)戊二醛(I级)前，使经纯化的NaCys1(1mg) 与0.5mg钥孔血蓝蛋白(Sigma)在水中混合至2mL的最终体积。在通过加入1mL 1M甘氨酸(在PBS中)，pH 7.5终止反应前，允许溶液在RT下搅拌另外1小时。在RT下搅拌另外1小时后，使用3500MWCO SlideAlyzer(Pierce)，使缀合蛋白质在4℃下在1x PBS中透析过夜。经透析的缀合蛋白质用1x PBS补足至10mL，等分成1mL批次，并且贮存于-20℃直至使用。用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma)乳化蛋白质缀合物(125μg，1mL)，并且皮下注射到兔内。每月施用加强免疫接种，并且由与弗氏不完全佐剂(Sigma)混合的蛋白质缀合物(125μg)组成。在注射前收集免疫前血清，同时在免疫接种后2周收集免疫血清。根据制造商的说明书，来自免疫前和免疫血清的IgG馏分在Protein-A Sepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech)上进行纯化，并且贮存于-80℃。
[0178] 结果
[0179] 从观赏烟草花烟草中分离出编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys1(SEQ ID NO:2)、NaCys2(SEQ ID NO:4)、NaCys3(SEQ ID NO:6)和NaCys4(SEQ ID NO:8)的4种cDNAs。4种氨基酸序列的比对显示于图1A中。大麦和玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列显示于图1B中。在细菌表达系统中产生由cDNAs编码的蛋白质，并且通过金属亲和层析和RP-HPLC进行纯化。纯化蛋白质作为单个峰洗脱，并且质谱法用于证实蛋白质具有由cDNA克隆预测的质量。每升培养物获得约40mg纯化蛋白质。针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys1产生的多克隆抗体可以在蛋白质印迹上检测出少至1ng 3种细菌表达的花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂(NaCys1-3)中的每一种(图1C)。预期在抗体和所有3种半胱氨酸蛋白酶抑制剂之间的交叉反应性，因为它们共享在氨基酸水平下的97-99％序列同一性。在实施例3中所述的真菌生物测定法中，这些纯化蛋白质与防御素NaD1组合进行测试。
[0180] 细菌表达的NaCys1和NaCys3是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶的强抑制剂，而NaCys4是相对较弱的抑制剂(图1D)。类似地，NaCys1和NaCys3是比NaCys4更佳的组织蛋白酶L抑制剂(图1E)。NaCys4的低半胱氨 酸蛋白酶活性归于在位置80上的色氨酸至精氨酸置换。这个色氨酸是蛋白酶结合必需的(Bjork等人，1996)。
[0181] 实施例2
[0182] 克隆且重组表达来自大麦(Hordeum vulgare)和玉蜀黍(Zea may)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂
[0183] 使用标准分子生物学方法从大麦(barley)和玉蜀黍(maize)中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。
[0184] DNA提取
[0185] 使来自大麦(大麦cv Golden Promise)和玉蜀黍(玉蜀黍cv SR73)幼苗的叶组织样品(～100mg)在液氮中磨碎。根据制造商的说明书，使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取基因组DNA。
[0186] PCR扩增和半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆
[0187] 用于扩增大麦和玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的寡核苷酸引物分别基于关于Hv-CPI6(Abraham等人2006)和CC6(Massoneau等人2005)公开的序列。对于Hv-CPI6，引物序列是：HvCys6F：5’GCT CCG CGG TGG TAT GCA GAA GAA CTC GAC CAT GG 3’(SEQ ID NO:31)和HvCys6R：5’GGA GCT CTT AGC CGC CGG CAG C 3’(SEQ ID NO:32)；对于CC6，引物序列是：CC6F：5’GCT CCG CGG TGG TAT GTC CGC GAG AGC TCT TCT C 3’(SEQ ID NO:33)和CC6R：5’GGA GCT CTC AGC TGG CCG GCG CGA AG 3’(SEQ ID NO:34)。PCR反应包含5X Phus ion HF缓冲液(10uL，Finnzymes)、dNTP混合物(各2.5mM，4uL)、正向和反向引物(10uM，各
2.5uL)、Phusion DNA聚合酶(2U/uL，0.5uL)、无菌蒸馏水(29.5uL)和基因组DNA(1uL)。起始变性在98℃下发生30秒，随后为98℃10秒、69℃15秒和72℃20秒的30个循环，随后为72℃5分钟的最终延伸步骤。通过使经纯化的PCR产物(6uL)与10X Taq PCR缓冲液(1uL，Scientifix)、Taq DNA聚合酶(1uL，Scientifix)和dATP(2uL，1mM)在72℃下温育20分钟，将
5’脱氧腺苷加入所得到的～400bp PCR产物中。随后将有A尾的PCR产物 克隆到载体pGEM-T Easy(Promega)内，所述pGEM-T Easy随后根据制造商的说明书用于转化电感受态大肠杆菌细胞(TOP10，Invitrogen)。使用Wizard Plus SV Miniprep试剂盒(Promega)分离质粒DNA，并且使用pGEM-T Easy特异性SP6和T7引物测序(Macrogen)载体插入片段。
[0188] 重组蛋白质表达和纯化
[0189] 编码Hv-CPI6(SEQ ID NO:14)和CC6(SEQ ID NO:16)的DNA进行PCR扩增，用于亚克隆到pHUE内用于在大肠杆菌中的重组蛋白质表达(Cantanzariti等人，2004)。对于Hv-CPI6，使用与HvCys6R(SEQ ID NO:32)组合的引物MHvCys6F2：5’GCC ACC TCG GCC CTC GGC CGG CGC GGC 3’(SEQ ID NO:35)(置换碱基加下划线)，通过单碱基置换(C至G)去除编码成熟蛋白质的基因5'末端附近的天然Sac II限制位点。所得到的PCR产物随后用作模板用于巢式PCR反应，其中使用与HvCys6R(SEQ ID NO:32)组合的引物MHvCys6F：5’GCT CCG CGG TGG TGC CAC CTC GGC CCT C 3’(SEQ ID NO:36)。对于CC6，使用引物MCC6：5’GCT CCG CGG TGG TGG GCA GCC GCT CGC 3’(SEQ ID NO:37)和CC6R2：5’GGG TAC CTC AGC TGG CCG GCG 3’(SEQ ID NO:38)PCR扩增编码成熟蛋白质的DNA。基本上如上所述执行PCR反应。所得到的PCR产物是有A尾的，并且克隆到pGEM-T Easy内；对于Hv-CPI6使用Sac II和Sac I且对于CC6使用Sac II和Kpn I切割插入片段，使用MinElute Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中切割，并且连接到pHUE内。这用于转化TOP10大肠杆菌细胞，从其中分离出质粒DNA，并且用于转化BL21(DE3)Star大肠杆菌细胞(Invitrogen)。
[0190] 如对于来自花烟草的半胱氨酸蛋白酶抑制剂所述执行Hv-CPI6(SEQ ID NO:14)和CC6(SEQ ID NO:16)的重组表达和纯化。
[0191] 结果
[0192] 克隆来自Hv-CPI6和CC6基因的编码区。关于Hv-CPI6的DNA序列匹配公开序列(GenBank登记号AJ748341)。与公开序列(GenBank登 记号AM055635)相比较，关于CC6的DNA序列具有沉默碱基改变。使编码成熟Hv-CPI6和CC6的DNA进行PCR扩增，并且亚克隆到pHUE内。在细菌表达系统中生产蛋白质，并且通过金属亲和层析进行纯化。在实施例3中所述的真菌生物测定法中，纯化蛋白质与防御素NaD1组合进行测试。
[0193] ATGCAGAAGAACTCGACCATGGGGAGACCGCTCCTCCTGCTCGCCCTCCTGGCCACGGCC
[0194] M Q K N S T M G R P L L L L A L L A T A
[0195] CTCGCAGCCACCTCGGCCCTCGGCCGCCGCGGCGTGCTTCTGGGCGGGTGGAGCCCCGTC
[0196] L A A T S A L G R R G V L L G G W S P V
[0197] AAGGACGTGAACGACCCGCACGTCCAGGAGCTAGGCGGGTGGGCGGTGGCCCAGCACGCC
[0198] K D V N D P H V Q E L G G W A V A Q H A
[0199] AGCCTAGCCAAGGACGGGCTGCTCTTCCGCCGGGTGACGCGCGGCGAGCAGCAGGTGGTG
[0200] S L A K D G L L F R R V T R G E Q Q V V
[0201] TCCGGGATGAACTACCGCCTCTTCGTGGTCGCGGCGGACGGCTCCGGCAAGAGGGTGACC
[0202] S G M N Y R L F V V A A D G S G K R V T
[0203] TATCTCGCGCAGATCTACGAGCACTGGAGCAGGACCCGCAAGCTCACGTCCTTCAAGCCG
[0204] Y L A Q I Y E H W S R T R K L T S F K P
[0205] GCTGCCGGCGGCTAA
[0206] A A G G-
[0207] 克隆Hv-CPI6(SEQ ID NO:13)的全长DNA序列，并且推导氨基酸序列。加下划线的氨基酸序列代表信号肽。对于成熟蛋白质的重组表达，改变加下划线的碱基(C至G沉默改变)，以便去除天然Sac II位点，允许直接亚克隆至pHUE内。
[0208] ATGTCCGCGAGAGCTCTTCTCCTGACGACCGCGACGCTGCTCCTGCTCGTCGCCGCTGCG
[0209] M S A R A L L L T T A T L L L L V A A A
[0210] CGTGCGGGGCAGCCGCTCGCCGGCGGGTGGAGCCCGATCAGGAACGTCAGCGACCCGCAC
[0211] R A G Q P L A G G W S P I R N V S D P H
[0212] ATCCAGGAGCTCGGCGGCTGGGCGGTGACGGAGCACGTCAGGCGGGCCAACGACGGGCTG
[0213] I Q E L G G W A V T E H V R R A N D G L
[0214] CGGTTCGGCGAGGTGACGGGCGGCGAGGAGCAGGTGGTGTCCGGGATGAACTACAAGCTC
[0215] R F G E V T G G E E Q V V S G M N Y K L
[0216] GTCCTTGACGCCACGGACGCCGACGGCAAGGTCGCGGCGTACGGGGCCTTCGTGTACGAG
[0217] V L D A T D A D G K V A A Y G A F V Y E
[0218] CAGTCGTGGACCAACACCCGCGAGCTCGTGTCCTTCGCGCCGGCCAGCTGA
[0219] Q S W T N T R E L V S F A P A S-
[0220] 克隆CC6(SEQ ID NO:15)的全长DNA序列，并且推导氨基酸序列。沉默碱基改变(C至T)是加下划线的。加下划线的氨基酸序列代表信号肽。
[0221] 实施例3
[0222] StPin1A的重组表达
[0223] 从马铃薯(Solanum tuberosum)中分离丝氨酸蛋白酶抑制剂StPin1A(SEQ ID NO:10)先前在美国专利号7,462,695"Insect chymotrypsin and inhibitors thereof"和11/
753,072"Multi-Gene Expression Vehicle"中描述(作为Pot1A)，并且通过引用合并入本文。
[0224] 如实施例1中所述使用pHUE表达系统在大肠杆菌中生产重组StPin1A(SEQ ID NO:10)，伴随下述修饰。引物是：Sac2StPin1A5’：5’CTC CGC GGT GGT AAG GAA TCG GAA TCT GAA TCT TG 3’(SEQ ID NO:39)；PotISalI3’：5’GGT CGA CTT AAG CCA CCC TAG GAA TTT GTA CAA CAT C 3’(SEQ ID NO:40)。PCR反应包含2x GoTaq Mastermix(25μL，Promega)、Sac2PotI5’引物(10μM，2μL)、PotISalI3’引物(10μM，2μL)、无菌蒸馏水(16μL)和pGEM-T Easy-StPot1A质粒DNA(～20ng，5μL)作为模板。起始变性在94℃下发生2分钟，随后为94℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟的30个循环，随后为72℃10分钟的最终延伸步骤。
[0225] 经转化的大肠杆菌(BL21(DE3)CodonPlus)的单个菌落用于接种包含氨苄青霉素(0.1mg/mL)、氯霉素(0.34mg/mL)和四环素(0.1mg/mL)的20mL 2YT培养基(10mL，16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl)，并且伴随振荡在37℃下生长过夜。这种培养物用于接种 包含抗生素的新鲜2YT培养基(1L)，这随后在37℃下伴随振荡温育直至～0.8的光密度(600nm)。随后加入IPTG(1mM终浓度)，并且使培养物生长另外3小时。收获细胞，并且如实施例1中所述提取蛋白质，除在包含50mM Tris-HCl和100mM NaCl，pH 8.0的缓冲液中通过0.22μm硝酸纤维素透析管透析，从洗脱蛋白质馏分中去除咪唑。如实施例1中所述从重组蛋白质中切割六组氨酸标记的泛素。随后使用与检测器(型号166，Beckman)和制备型C8柱(22x 250mm，Vydac)偶联的System Gold HPLC(Beckman)，纯化经切割的蛋白质。将蛋白质样品装载到缓冲液A(0.1％[v/v]三氟乙酸)中，并且用0-60％(v/v)缓冲液B(在0.089％[v/v]三氟乙酸中的60％[v/v]乙腈)经过5分钟和60-100％缓冲液B经过20分钟用10mL/分钟的流速的不连续梯度洗脱。通过监控在215nm下的吸光度检测蛋白质。手工收集蛋白质峰并且通过SDS-PAGE进行分析。
[0226] 如实施例1中所述制备针对StPin1A的多克隆抗体。
[0227] 结果
[0228] 将编码马铃薯I型蛋白酶抑制剂StPin1A的cDNA克隆到pHUE细菌表达载体内，并且通过金属亲和层析和RP-HPLC纯化经表达的蛋白质。经纯化的StPin1A作为单个峰洗脱，并且质谱法用于证实蛋白质具有由cDNA克隆预测的序列，不含翻译后修饰。每升培养物获得约15mg经纯化的StPin1A。针对细菌表达的StPin1A产生的多克隆抗体在蛋白质印迹上容易地检测出50ng StPin1A(图2)。在实施例4中所述的真菌生物测定法中，经纯化的StPin1A与防御素NaD1组合进行测试。
[0229] 实施例4
[0230] 在NaD1和丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在下在体外禾谷镰刀菌生长的抑制
[0231] 基本上如由Broekaert等人，1990描述的测量与丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合的防御素(NaD1)对禾谷镰刀菌(由CSIRO Plant Industry，St.Lucia，Queensland，澳大利亚提供的澳大利亚分离物 CS3005)生长的抑制作用。从在合成营养素弱肉汤(SNPB)中生长的孢子生成培养物中分离出孢子。在通过使培养物经过无菌面巾纸以去除菌丝物质收集孢子前，使培养物在半强度马铃薯右旋糖肉汤(PDB)中在室温下生长1-2周。使用血球计数器测定孢子浓度。
[0232] 使如详述中所述制备的NaD1稀释，以提供具有图3A中所示的10X终浓度的一系列母液。如实施例1中所述制备重组NaCys1(SEQ ID NO:2)、NaCys2(SEQ ID NO:4)、NaCys3(SEQ ID NO:6)和NaCys4(SEQ ID NO:8)，并且在H2O中制备母液(10X)。来自牛胰腺的胰蛋白酶抑制剂I-P型(Anderson和Kingston、1983)购自Sigma(T0256)。如实施例3中所述制备重组StPin1A、NaPin1A和NaPin1B。用于克隆到pHUE表达载体内的用于扩增NaPin1A和NaPin1B的引物分别是NaPin1Afw(SEQ ID NO:41)和NaPin1Arv(SEQ ID NO:42)、NaPin1Bfw(SEQ ID NO:43)和NaPin1Brv(SEQ ID NO:44)。大豆胰蛋白酶抑制剂II-S型、大豆Bowman-Birk抑制剂、来自鸡蛋清的半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64购自Sigma(分别为目录号T9128、T9777、C8917和E3132)。
[0233] 基本上如详述(抗真菌活性的分析)中所述，在96孔微量滴定盘中进行抗真菌测定法。使孔装载有10μL过滤灭菌的(0.22μm注射器式滤器，Millipore)NaD1(关于每种终浓度的10X原液)或水、10μL过滤灭菌(0.22μm注射器式滤器，Millipore)的蛋白酶抑制剂(关于每种终浓度的10X原液)或水、和在1/2强度PDB中的80μL 5X 104孢子/mL。使平板在25℃下温育。通过使用微量滴定板平板阅读器(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量在595nm(A595)处的光密度测定真菌生长。每种测试一式四份地执行。
[0234] 免疫荧光显微镜检查用于确定NaCys1是否可以进入已用NaD1处理的禾谷镰刀菌菌丝的细胞质。NaCys1用荧光标记异硫氰酸荧光素(FITC)进行标记。使冻干的NaCys1(1mg)溶解于500μL 50mM HEPES缓冲液(pH 8.0)中。加入荧光标记异硫氰酸荧光素(FITC，Invitrogen)至5mM的终浓度。在离心(13,000rpm，10分钟)以去除任何沉淀蛋 白质前，使反应在RT下伴随轻轻搅拌温育2小时。Ultracell 3K MWCO旋转柱(Millipore)用于去除任何未结合的FITC。使FITC标记的NaCys1重悬浮于水中，并且使用BCA蛋白质测定法(Pierce)确定蛋白质浓度。
[0235] 禾谷镰刀菌菌丝在半强度PDB(10mL)中伴随剧烈震荡在25℃下从5x 104/mL的起始孢子悬浮液开始生长18小时。随后在NaD1(0.5μM)的存在或不存在下连同或不连同NaCys1-FITC(4μM)处理菌丝(100μL)。在1小时后，通过离心(13,000rpm，10分钟)使菌丝形成团块，并且通过在0.6M KCl中洗涤1次和在PBS中洗涤2次去除未结合的NaCys1-FITC。随后使用Olympus BX51荧光显微镜，通过荧光显微镜检查显现菌丝。使用MWIB滤波器(激发波长460-490nm)检测荧光。使用SPOT RT 3CCD相机(Diagnostic Instruments)捕获图像，并且使用Adobe Photoshop进行加工。
[0236] 结果
[0237] NaD1防御素对所有4种花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂(～10.8kDa)以及来自大麦(11.1kDa)和玉蜀黍(10.1kDa)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(图3A-3F)的抑制活性具有协同作用，以及对牛胰蛋白酶抑制剂I-P型(6.5kDa)(图4A)和马铃薯1型蛋白酶抑制剂StPin1A、NaPin1A和NaPin1B(～8.5kDa)(图4B-4D)的抑制活性具有协同作用。除大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂外，当它们不与NaD1组合时，这些蛋白酶抑制剂无一具有任何杀真菌活性。事实上，花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys1、NaCys2和NaCys3在不存在NaD1的情况下在高达18.5uM的浓度下对菌丝生长没有作用。
[0238] 关于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的协同作用计算在图3G中呈现，并且关于丝氨酸蛋白酶抑制剂在4E中呈现，其中Ee是表示为抑制百分比的根据Limpel的公式(Richer，1987)来自加和应答的预期效应，并且Io是观察到的抑制百分比。对于所有4种花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及来自大麦和玉蜀黍的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(图3G)，以及丝氨酸蛋白酶抑制剂、牛胰蛋白酶抑制剂I-P型、StPin1A、NaPin1A和NaPin1B(图4E)，获得协同作用，即Io值高于Ee值。
[0239] 具有某些抗真菌活性的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(phytocystatins))先前已得到报道(Joshi等人，1998，Martinez等人，2003)。它们不同于在本申请中测试的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，因为它们具有直接抗真菌活性，而除大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂外，在本申请中测试的PIs在不存在防御素的情况下对真菌生长没有影响。然而，大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗真菌活性在NaD1防御素的存在下增强许多。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制活性对于其抗真菌活性可能不是必需的。我们观察到细菌表达的NaCys1和NaCys3是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶的强抑制剂，而NaCys4是相对较弱的抑制剂(图1D)。类似地，NaCys1和NaCys3是比NaCys4更佳的组织蛋白酶L抑制剂(图1E)。NaCys4的低半胱氨酸蛋白酶活性归于在位置80上的色氨酸至精氨酸置换。这个色氨酸是蛋白酶结合必需的(Bjork等人，1996)。Martinez和同事(2003)也已观察到大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂Hv-CPI的抗真菌活性与其蛋白酶抑制活性无关。
[0240] 丝氨酸蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂II-S型(21kDa)和大豆Bowman-Birk抑制剂(7.9kDa)，以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂鸡蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂(12.7kDa)和E64(357Da)，在用于真菌生物测定法的条件下独立地或与NaD1组合不具有杀真菌活性。并非所有蛋白酶抑制剂都与防御素协同作用的观察可能是其大小的反映，即，它们太大或具有不合适的物理性质(例如，电荷)以经由通过防御素制造的孔进入菌丝细胞质。大豆胰蛋白酶抑制剂II-S型(21kDa)将属于这个组。备选地，在防御素的存在下它们可能进入菌丝，但无法与影响菌丝生长的任何靶结合。
[0241] 实施例5
[0242] 在来自番茄或矮牵牛的防御素和丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在下在体外禾谷镰刀菌生长的抑制
[0243] 如详述中对于花烟草防御素NaD1所述，从番茄(Tomdef2，SEQ ID NO:22)，美国专利申请12/362,657)和矮牵牛(PhD1A，SEQ ID NO:24)花中分离出防御素。通过质谱法、N末端测序和分离编码DNA确定它们 的特性和序列。如实施例4中对于NaD1防御素所述，与丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合测量它们对禾谷镰刀菌生长的作用。
[0244] 结果
[0245] NaD1、Tomdef2和PhD1A的氨基酸序列比对显示于图5A中。总的来说，它们共享约60％序列同一性(图5A)。番茄和矮牵牛防御素对花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys2(10.8kDa)(图5B、5F)和玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6(图5C、5G)的抑制活性具有协同作用，以及对牛胰蛋白酶抑制剂I-P型(6.5kDa)(图5D、5H)和1型蛋白酶抑制剂StPin1A(图
5E、5I)的抑制活性具有协同作用。当它们不与防御素组合时，这些蛋白酶抑制剂无一具有任何抗真菌活性。
[0246] 协同作用计算在图5J和5K中呈现，其中Ee是表示为抑制百分比的根据Limpel的公式(Richer，1987)来自加和应答的预期效应，并且Io是观察到的抑制百分比。对于NaD1和所有4种蛋白酶抑制剂获得协同作用，即Io值高于Ee值。当获得协同作用时，数目用星号进行标记。
[0247] 实施例6
[0248] 在NaD1以及丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在下在体外尖孢镰刀菌生长的抑制
[0249] 基本上如由Broekaert等人，同上1990描述的测量防御素(NaD1)和蛋白酶抑制剂对尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)(从棉花中分离出的澳大利亚分离物VCG01111，并且由Farming Systems Institute，DPI，Queensland，澳大利亚提供)生长的抑制作用。从在1/2强度马铃薯右旋糖肉汤(PDB)中生长的孢子生成培养物中分离出孢子。在通过经过无菌面巾纸过滤使孢子与菌丝物质分离前，使Fov培养物在1/2PDB中在室温下生长1-2周。使用血球计数器测量滤液中的孢子浓度。NaD1和蛋白酶抑制剂如实施例4中所述进行制备。用于真菌生长测定法的条件与实施例4中所述的那些相同。在25℃下40小时后，通过测量在595nm(A595)下的光密度评估真菌生长。
[0250] 结果
[0251] 在用尖孢镰刀菌的测定法中，当NaD1与牛胰蛋白酶抑制剂I-P(6.5kDa)组合时，NaD1和蛋白酶抑制剂之间的协同作用是最明显的(图6)。对于NaD1和花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys2或StPot1A抑制剂的组合，观察到较少但显著的协同作用。对于半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6，协同作用不明显。(图6)。协同作用计算在图6中呈现，其中Ee是表示为抑制百分比的根据Limpel的公式(Richer，1987)来自加和应答的预期效应，并且Io是观察到的抑制百分比。当获得协同作用时，数目用星号进行标记。
[0252] 实施例7
[0253] 在表达NaD1和NaCys2的转基因棉花幼苗中尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov)感染的抑制
[0254] 产生在植物启动子例如CaMV35S和植物终止子例如nos终止子控制下编码NaD1防御素和蛋白酶抑制剂的基因构建体。将基因构建体连接到具有卡那霉素可选标记的二元(binary)载体例如pBin19内，并且经由土壤杆菌属介导的转化递送到棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum)，栽培变种315)内。通过ELISA使用抗体例如实施例1和2中所述的那些，就NaD1和蛋白酶抑制剂的表达筛选转基因植物。
[0255] 在尖孢镰刀菌萎蔫专化型感染的土壤中转基因和非转基因棉花种子的温室生物测定法。
[0256] 具有受感染土壤的温室生物测定法用于评估在非转基因柯克棉315和表达NaD1和蛋白酶抑制剂的转基因柯克棉315中对于Fov的抗性水平。Fov(分离物#24500 VCG 01111)的培养物在粟中进行制备，并且掺入土壤混合物内。受感染土壤用于生长转基因品系和非转基因柯克棉315。Fov的培养物在1/2强度PDB(12g/L马铃薯右旋糖)中进行制备，并且在26℃下生长约1周。培养物(5-10mL)用于感染高压灭菌的脱壳的粟，所述粟随后在室温下生长2-3周。通过在200L堆肥转筒中充分混合，将受感染的粟以1％(v/v)掺入巴氏灭菌的基于泥煤的土 壤混合物内。将受感染土壤转移至塑料容器(10L混合物/13.5L容器)。
[0257] 对于每种测试种植48粒种子。种子直接播种到容器内，12粒种子/盒，以3X 4排列。在每个盒中随机种植关于每种测试的3粒种子。
[0258] 使植物生长7周。试验自始至终测量叶的症状发展，并且通过在试验结束时的破坏性取样测定疾病得分。下述等级评定用于测定疾病得分：0＝无症状，1＝维管褐变至茎底部，2＝维管褐变至子叶，3＝维管褐变经过子叶，4＝维管褐变至真叶，5＝死亡。平均疾病得分是关于发芽的所有种子的平均值。
[0259] 实施例8
[0260] 在NaD1和丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在下在体外禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)生长的抑制
[0261] 测定防御素(NaD1)和丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂对禾生刺盘孢(玉蜀黍分离物)生长的抑制作用。
[0262] 从在与实施例4中用于禾谷镰刀菌的相同培养基上和在相同条件下生长的孢子生成培养物中分离出禾生刺盘孢的孢子。NaD1和蛋白酶抑制剂的制备，以及用于真菌生长测定法的条件，也与实施例4中概述的相同。在25℃下40小时后，通过测量在595nm(A595)下的光密度评估真菌生长。
[0263] 结果
[0264] NaD1防御素对花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂NaCys2的抑制活性具有协同作用(图7A)。对于丝氨酸蛋白酶抑制剂StPin1A(图7D)且特别是牛胰腺胰蛋白酶抑制剂I-P型(图
7C)获得更高或更佳的协同作用。在所使用的条件下，对于玉蜀黍半胱氨酸蛋白酶抑制剂CC6，没有明显的协同作用(图7B)。协同作用计算在图7E中呈现，其中Ee是表示为抑制百分比的根据Limpel的公式(Richer，1987)来自加和应答的预期效应，并且Io是观察到的抑制百分比。当Io不大于Ee(这是协同作用的量度)时，数目用星号进行标记。
[0265] 实施例9
[0266] 在NaD1和丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂的存在下在体外十字花科小球腔菌感染的抑制
[0267] 基本上如由Broekaert等人，1990描述的测量与丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂组合的防御素(NaD1)对十字花科小球腔菌(澳大利亚分离物IBCN18，Prof.B.Howlett)生长的抑制作用。十字花科小球腔菌在10％(v/v)V8培养基中生长约2周。通过经过无菌细棉布过滤收集孢子，并且调整至5X 104孢子/mL的终浓度。用于真菌生长测定法的条件与实施例4中所述的那些相同，除了使用10％(v/v)V8培养基外。
[0268] NaD1和蛋白酶抑制剂如实施例4中所述进行制备。基本上如详述(抗真菌活性的分析)中所述，在96孔微量滴定盘中进行抗真菌测定法。使孔装载有10μL过滤灭菌的(0.22μm注射器式滤器，Millipore)NaD1(关于每种终浓度的10X原液)或水、10μL过滤灭菌(0.22μm注射器式滤器，Millipore)的蛋白酶抑制剂(关于每种终浓度的10X原液)或水、和在1/2强度PDB中的80μL 5X 104孢子/mL。使平板在25℃下温育。通过使用微量滴定板平板阅读器(SpectraMax Pro M2；Molecular Devices)测量在595nm(A595)处的光密度测定真菌生长。每种测试一式四份地执行。
[0269] 实施例10
[0270] 在表达NaD1和NaCys2的转基因卡诺拉油菜幼苗中十字花科小球腔菌感染的抑制[0271] NaCys2二元载体(pHEX116)的构建
[0272] 使用BamH I和Sal I从包含NaCys2的pCR2.1-TOPO质粒中切割编码花烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂2(NaCys2，SEQ ID NO:4)的DNA，并且克隆到包含35S CaMV启动子和终止子的pAM9(pAM9由pDHA进行修饰，Tabe等人，Journal of Animal Science，73：2752-2759，1995)内。EcoR I随后用于切割植物转录单位，将所述植物转录单位克隆到pBIN19二元载体内，以产生pHEX116。随后将这种载体引入根瘤土壤杆 菌内LBA4404。
[0273] NaCys2在棉花子叶中的瞬时表达
[0274] 使包含pHEX116的根瘤土壤杆菌涂布在选择性平板上，并且在黑暗中在30℃下生长3天。随后使细菌在浸润缓冲液(10mM氯化镁和10uM乙酰丁香酮(在DMSO中的0.1M原液))中重悬浮至OD6001.0，并且在室温下温育2小时。棉花植物(cv柯克棉315)在控温生长橱(25℃，16小时/8小时光/暗循环)中生长8天。通过将1mL注射器针对叶轻轻按压且使叶腔充满土壤杆菌属悬浮液，使子叶的下侧浸润。浸润区域(通过变暗指示)在叶顶侧上注明。植物生长另外4天。随后切下浸润区域，称重并且冷冻在液氮中。通过ELISA和免疫印迹确定蛋白质表达。通过免疫印迹(图8A)和ELISA(图8B)检测在用pHEX116转染的棉花子叶中的NaCys2。
[0275] 在转基因植物组织中NaCys2的检测
[0276] 免疫印迹分析
[0277] 使组织(100mg)冷冻在液氮中，并且在混合磨(Retsch MM300)中磨成细粉，在频率30下共2x 15秒。将粉末加入1ml丙酮中，充分涡旋，并且在14,000rpm(18,000g)下离心2分钟，并且弃去上清液。通过充分涡旋使风干的团块重悬浮于120μl含3％(w/v)PVPP的PBS/
0.05％(v/v) 20中，并且在14,000rpm下离心10分钟后收集上清液。对于通过SDS-PAGE分析，使用在1X样品缓冲液(Novex NuPAGE LDS样品缓冲液)和5％v/vβ-巯基乙醇中的
30μl样品。
[0278] 通过SDS-PAGE在Novex X Cell mini-cell电泳仪中在200V下35分钟，在预制4-12％w/v聚丙烯酰胺梯度凝胶(Novex，NuPAGE bis-tris，MES缓冲液)上，分离经提取的蛋白质。包括预染色的分子大小标记(Novex SeeBlue Plus 2)作为标准。使用Novex X Cell mini-cell电泳仪在30V下60分钟，用包含10％v/v甲醇的NuPAGE转移缓冲液，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Osmonics 0.22micron NitroBind)。在转移后，将膜浸泡在异丙醇中1分钟，随后在TBS中5分钟洗涤。
[0279] 膜在3％w/v BSA中在RT下封闭1小时，随后与一抗一起在RT下 过夜温育(NaCys1抗体：1mg/ml原液在TBS/1％BSA中1:2500稀释)。在与和辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(Pierce，在TBS中1:100,000稀释)一起在RT下温育60分钟前，膜在TBST中洗涤5x 10分钟。根据制造商的说明书，在膜与SuperSignal West Pico化学发光底物(Pierce)一起温育前，执行5次进一步的10分钟TBST洗涤。使膜暴露于ECL Hyperfilm(Amersham)。
[0280] ELISA
[0281] 用100μL/孔在PBS中的一抗(通过标准方法响应重组表达的NaCys1(SEQ ID NO:2)产生的150ng/孔蛋白质A纯化的多克隆兔抗体)包被ELISA平板(Nunc MaxisorpTM(In Vitro，Noble Park VIC 3174)#442404)，并且在4℃下在湿盒中温育过夜。第二天，平板用PBS/0.05％(v/v) 20洗涤2分钟x 4。平板随后用在PBS中的200μL/孔3％(w/v)BSA(Sigma(Castle Hill，NSW澳大利亚1765)A-7030：98％ELISA级别)封闭，并且在25℃下温育2小时，并且随后用PBS/0.05％(v/v) 20洗涤，2分钟x 4。
[0282] 对于样品的制备，使用混合磨，使100mg冷冻的卡诺拉油菜叶或棉花子叶组织在液氮中研磨，在频率30下共2x 10秒。将1mL 2％(w/v)不溶性PVPP(Polyclar)/PBS/0.05％(v/v) 20加入每种样品中，并且使混合物涡旋，离心10分钟并且收集上清液。在PBS/0.05％(v/v) 20中制备蛋白质提取物的稀释物，并应用于每个孔(100μL/孔)，并且在25℃下温育2小时。
[0283] 平板用PBS/0.05％(v/v) 20洗涤(2分钟x 4)。将在PBS中的二抗(150ng/孔生物素标记的抗NaCys1)以100μL/孔应用于每个孔，并且在25℃下温育1小时。平板随后用PBS/0.05％(v/v)  20洗涤(2分钟x 4)。这之后，将在PBS中的NeutriAvidin 
HRP-缀合物(Pierce，Rockford，Il 61105)#31001；1:1000稀释度；0.1μL/孔)以100μL/孔应用于每个孔。在25℃下温育1小时后，平板用PBS/0.05％ 20洗涤(2分钟x 4)，随后为用H2O的2分钟洗涤。通过使1片ImmunoPure OPD(过氧化物酶底物)(Pierce，Rockford， Il 61105#34006)溶解于9mL水中，随后加入1mL稳定的过氧化物缓冲液(10x，Pierce，Rockford，Il 61105#34062)，制备新鲜底物。将底物(100μL/孔)加入每个孔中，并且在25℃下温育。用50μL 2.5M硫酸终止反应，并且在平板阅读器中测量在490nm处的吸光度。
[0284] 表达NaCys2和NaD1的转基因卡诺拉油菜的产生
[0285] 通过根瘤土壤杆菌介导的转化生产表达NaCys2的转基因卡诺拉油菜(欧洲油菜，cv RI64)。用于转化的DNA二元载体(pHEX116)在上文描述。通过电穿孔将二元载体转移到根瘤土壤杆菌菌株AGL 1内，并且通过凝胶电泳证实质粒的存在。土壤杆菌属的培养物用于感染卡诺拉油菜cv RI64的下胚轴部分。转基因枝条在以25mg/L的抗生素卡那霉素上进行选择。使用ELISA和/或免疫印迹选择表达NaD1的转基因植物，以检测从叶中提取的可溶性蛋白质。
[0286] 用十字花科小球腔菌的温室生物测定法
[0287] 病原体十字花科小球腔菌(澳大利亚分离物ICBN18)在10％(v/v)V8琼脂平板上在室温下生长1-2周。通过用无菌水(5mL)覆盖平板并且刮取琼脂表面以取出孢子来分离器孢子。通过经过无菌薄纸(例如Kleenex)过滤，使孢子与菌丝物质分离。使用血球计数器测量滤液中的孢子浓度，并且用水将终浓度调整至106器孢子/mL。
[0288] 幼苗(30粒种子/测试)在温室中在小种植盘中于22℃生长。播种后10天，每个幼苗的2片子叶用26计量针穿刺2次(2个叶片各1次)，并且用孢子微滴(5μL，106孢子/mL)接种创伤区域。对照用水进行接种。使植物维持在高湿度条件下3天，以促进孢子出芽。
[0289] 在接种后10、14和17天时评估疾病症状。测量每个损伤的直径，并且基于由Williams和Delwiche(1979)描述的系统评分疾病。未变暗的伤口评分为0，直径0.5-1.5mm的损伤评分为1，直径1.5-3.0mm的损伤评分为3，直径3.0-6.0mm的损伤评分为5，直径超过6mm或具有完全子叶坏死的损伤评分为7。通过有序回归在统计上分析疾病得分。使用数字图像的计算机软件分析(ImageJ)以mm2定量损伤大小。通过转化数据(log10)且执行t检验，在统计上分析平均损伤大小数据。
[0290] 为了测试NaD1和NaCys2之间的协同作用，使表达NaD1的转基因品系CAT13.26与表达NaCys2的转基因卡诺拉油菜品系杂交。品系CAT13.26在通过引用合并入本文的美国专利申请12/362,657中描述。随后在上文描述的幼苗生物测定法中评估3种品系(表达NaD1、表达NaCys2以及表达NaD1和NaCys2的)。
[0291] 本领域技术人员应当理解本文描述的本发明易受除本文具体描述那些外的变动和修饰影响。应当理解本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
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