[0001] 本发明属于农业病原体控制的领域。

[0002] 更具体地，本发明涉及能够抑制肉桂酸‑4‑羟化酶的化合物及其用于保护植物抵抗植物病原体，特别是线虫、真菌和/或细菌侵害的用途。本发明还提供了包括该化合物的
组合物、其制备方法以及控制植物病害的方法。

[0003] 植物会遭受到包括植物病原性细菌、真菌和植物寄生线虫在内的多种潜在致病因素。

[0004] 细菌是单细胞原核微生物，通常具有1μm至2μm的尺寸，存在于所有植物表面(附生菌)和植物内部(内生菌)，并且，可能对宿主是有益的或使宿主致病。在世界范围内，植物病
原性细菌导致许多严重的植物病害，其症状包括叶片和果实上的斑点、花斑(mosaic 
pattern)或锈斑(pustule)，或块茎腐烂、冠瘿瘤和植物死亡。在1878年，首次证实了致病性
细菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)是导致苹果和梨的火疫病的罪魁祸首，其如今
为大部分的温带地区的普见病害。病原性根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在许
多宿主中导致冠瘿病。大多数植物病原性细菌是归类于放线菌门(Phylum 
Actinobacteria)的革兰氏阳性细菌，或者是归类于变形菌门(Phylum Proteobacteria)的
革兰氏阴性细菌。

[0005] 真菌是异养真核微生物，其可以通过产生孢子和其他结构进行有性和无性繁殖。大多数植物病原性真菌属于子囊菌纲(Ascomycetes)和担子菌纲(Basidiomycetes)。孢子
可以通过空气或水传播很远的距离，也可以通过土壤传播。

[0006] 卵菌是类真菌生物。其囊括一些最具破坏性的植物病原体，包括疫霉菌(Phytophthora)属，该疫霉菌属包括马铃薯晚疫病和橡树猝死的致病因素。特定种类的卵
菌导致根腐。

[0007] 线虫(Nematodes)是活跃可弯曲的细长形生物体，生存在潮湿的表面或液体环境中，包括土壤中的水膜和其它生物体内的潮湿组织。存在有种类繁多的植物寄生线虫，包括
各种根结(root knot)线虫(例如，益智根结线虫Meloidogyne sp.)、根斑(lesion)线虫(例
如，短体线虫Pratylenchus sp.)、胞囊(cyst)线虫(例如，异皮属Heterodera sp.)、剑属
(dagger)线虫(例如剑线虫Xiphinema sp.)以及鳞球茎线虫(stem and bulb nematodes)
(例如，茎线虫Ditylenchus sp.)等等。垫刃(Tylenchid)线虫(垫刃目(Tylenchida)的成
员)包括异皮线虫科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)和短体线虫科
(Pratylenchidae)，是植物寄生线虫中最大和最重要的经济类群。线虫物种经过一系列生
命周期阶段和蜕皮而生长。典型地，经历五个阶段和四次蜕皮：卵阶段；J1(即第一期幼虫)；
M1(即第一次蜕皮)；J2(第二期幼虫；有时从卵中孵化)；M2；J3；M3；J4；M4；A(成虫)。幼虫
(“J”)阶段有时也称为幼体(larval)(“L”)阶段。

[0008] 植物特有的和动物特有的线虫物种都已经进化成非常成功的寄生虫，对农业和畜牧业造成了重大的经济损失，并且人类中导致发病和死亡。植物的细菌和真菌病原体或线
虫寄生虫会攻击或栖息在植物的所有部分，包括根、发育中的花蕾、叶、种子和茎。植物寄生
线虫根据其摄食习性被归为迁移性外寄生虫、迁移性内寄生虫和定居性内寄生虫。定居性
内寄生虫包括根结线虫spp.(Meloidogyne spp.)和胞囊线虫(Globodera和Heterodera)，
能够感应摄食部位(在根结线虫的情况下，为“巨型细胞”；在胞囊线虫的情况下，为“合体
胞”)，并在根内形成长期感染，这通常对作物造成极大损害。病原性真菌和细菌被分类为活
体营养型(biotrophs)或死体营养型(necrotrophs)，其中活体营养型定居于活的植物组织
并从活的宿主细胞中获取营养，而死体营养型感染并杀死宿主组织并从死的宿主细胞中摄
取营养。

[0009] 已经提供了若干形式的用于控制线虫和真菌或细菌病原体侵染的组合物、方法和药剂。已经在很多情况下尝试了生物和培养控制方法，包括植物检疫。在一些作物中，已经
识别了能够抗病或耐病的植物抗性基因。化学组合物，如杀线虫剂、杀真菌剂或杀细菌剂通
常被施用到存在植物病原体/寄生虫的土壤。然而，经常进化出病原体的新种族而破坏抗性
基因和/或获得对各种化学品的抗性。

[0010] 迫切需要安全且有效的控制措施。与当前控制策略的劣势相关的因素包括对可持续性农业的高度关注，以及新的政府法规，这些可能会阻止或严格限制许多现有的农用化
学驱虫剂、抗真菌剂或抗细菌剂的使用。

[0011] 化学试剂通常没有选择性，并且在施用该试剂后的一段时间内会对非目标生物发挥作用而有效地破坏有益微生物和线虫的种群。化学试剂可能会在环境中存留，并且只能
被缓慢代谢。杀线虫的土壤熏蒸剂，如氯化苦(chloropicrin)和甲基溴(methyl bromide)
及相关化合物具有剧毒性。此外，杀真菌剂也可能对人体健康造成危害，诸如二甲酰亚胺类
乙烯菌核利现已停止使用，以及二甲基二硫代氨基甲酸锌(Ziram)，其被认为在长期接触后
对人体有毒。同样地，农用抗菌剂(诸如链霉素)受到越来越多的挑战，部分原因是它们会加
速耐抗生素性在细菌种群中的进化和传播，由此威胁到牲畜和人类健康。

[0012] 这些试剂也可能在地下水或食物链中积累，以及在较高营养等级的物种中积累。这些试剂还可能充当诱变剂和/或致癌剂，导致不可逆且有害的遗传修饰。

[0013] 因此，需要用于控制植物和作物中的线虫、真菌或细菌的替代性方法。

[0014] 本发明提供了激活植物中的免疫响应的化合物和方法，以增强植物的免疫性，从而最终引起对病原体的抗性增加。该方法包括以下步骤：与缺乏抑制的对照植物细胞或或
植物或其部分相比，抑制植物中参与苯丙酸类(phenylpropanoid)途径的酶，且更尤其为肉
桂酸‑4‑羟化酶(C4H)的活性。

[0015] 在一个实施方式中，本发明提供了通过抑制植物中的C4H来促进/增强植物对寄生线虫、真菌和/或细菌的抗性的方法，所述方法包括施用能够在所述植物中抑制C4H活性的
外源化合物。该化合物可以通过抑制C4H在植物中“直接”起作用，或者，该化合物在施用至
植物后可以在植物中转化/加工成有效的C4H抑制剂，并因此发挥其活性。

[0016] 在一具体实施方式中，本发明的化合物是小分子(可有助于调节生物过程的低分子量(<900道尔顿)有机化合物)，甚至更具体地是具有末端炔官能团的芳族羧酸或苯甲酸
衍生物。在一具体实施方式中，小分子的特征在于存在含羧酸基团的苯并二噁茂。所述化合
物能够抑制或降低植物中C4H的活性。具体地，本发明的化合物具有如本文所公开的通式I、
Ie、II、III或IV，或亚组Ia‑e和IIa‑e的任一式，或其立体异构体、互变异构体、水合物、盐、酯、溶剂化物和/或功能类似物。甚至更具体地，该化合物选自由以下项组成的组：哌呢酸
(PA)(或其任选的前体，如3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)、胡椒酸或胡椒碱；特别是MDCA)；
4‑碘苯甲酸(4‑IBA)；4‑三氟甲基苯甲酸；4‑丙炔氧基苯甲酸(4‑PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)；或它们的立体异构体、互变异构体、水合物、盐、酯、溶剂化物和/或功能类似物。在本
文提供的方法和用途中，化合物的合适浓度为约10μM至约1000μM，尤其是10μM至500μM。

[0017] 本发明涵盖本文所述化合物用于预防、治疗和/或减少细菌/真菌病原体和/或寄生线虫对植物的感染，和/或控制(例如预防或减少)由此引起的植物损害的用途。

[0018] 本发明进一步公开了本文所述化合物用于增加植物对病原体，尤其是对细菌/真菌病原体或寄生线虫的抗性的用途，其中寄生线虫诸如为根结线虫、根腐(root‑lesion)线
虫或/和胞囊线虫，甚至更尤其是属于下述属的线虫，所述下述属选自由以下项组成的组：
根结线虫属(Meloidogyne)、异皮线虫属(Heterodera)、球异皮线虫属(Globodera)、短体线
虫属(Pratylenchus)、滑刃线虫属(Aphelenchoides)、剑线虫属(Xiphinema)、穿孔线虫属
(Radopholus)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)、肾状线虫属(Rotylenchulus)、珍珠线虫
属(Nacobbus)、长针线虫属(Longidorus)、茎线虫属(Ditylenchus)和毛刺线虫属
(Trichodorus)。在进一步的实施方式中，病原体是植物性病原真菌，选自稻瘟病菌
(Magnaporthe)属、葡萄孢属(Botrytis)、柄锈菌属(Puccinia)、镰孢菌属(Fusarium)、布氏
白粉菌属(Blumeria)、球腔菌属(Mycosphaerella)、炭疽菌属(Colletrotrichum)、黑粉菌
属(Ustilago)、栅锈菌属(Melampsora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、层锈菌属(Phaksora)、链
格孢属(Alternaria)、核盘菌属(Sclerotinia)和枝孢菌属(Cladosporium)。在更进一步的
实施方式中，病原体是植物性病原细菌，选自假单胞菌属(Pseudomonas)、青枯菌属
(Ralstonia)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、欧文氏菌属
(Erwinia)、木杆菌属(Xylella)、狄克氏菌属(Dickeya)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、棒
形杆菌属(Clavibacter)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状
杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)和韧皮杆菌属(Candidatus 
Liberibacter)。

[0019] 在进一步的实施方式中，本发明公开了一种组合物或制剂，包括本文所述的化合物以及稀释剂、添加剂、植物(微量)营养物、乳液稳定剂、表面活性剂、缓冲剂、作物油、漂移
抑制剂和/或(惰性)基质。特别地，该组合物是叶面喷雾或种衣剂。此外，所述化合物或组合
物可进一步包括，或与一种或多种肥料、生物刺激剂、除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀螨剂、
杀线虫剂和/或杀昆虫剂组合使用。特别地，该组合物是一种农用化学组合物，包括式I、Ia‑
e、II、IIa‑e、III或IV的任一种或多种化合物以及至少一种赋形剂。

[0020] 在另一实施方式中，化合物或组合物被施用至植物或其部分、施用至植物周围的土壤或用于植物生长的基质中。优选的施用方法是叶面处理(例如通过喷洒)、种子处理(例
如通过种子包衣)或土壤处理(例如通过土壤淋洗)。植物部分可以是种子、果实、子实体、
叶、柄、茎(shoot)、梗、花、根、块茎或根茎。

[0021] 本发明进一步涉及一种种子，该种子包括本文提供的化合物的包衣或包含该化合物，以及涉及一种控制(例如，预防、抑制或处理植物感染)诸如寄生线虫、真菌和/或细菌的
植物病原体的方法，所述方法包括向所述植物施用化合物(或包括其的组合物)，具体地其
中，所述化合物能够降低所述植物中C4H的活性。

[0022] 图1：用哌呢酸(PA)、胡椒碱(PIP)或对照处理(CON)处理的小麦植株的平均穗数、种子质量和堆积密度，其中误差条表示标准差。N＝24(共72株，每盆3株植物)。

[0023] 图2：在室温下，在湿纸上用哌呢酸(PA)、胡椒碱(PIP)或对照处理(CON)处理的来自植株的小麦种子的发芽率，误差条表示标准差。N＝64(每盆八粒种子，每次处理八盆)。

[0024] 图3：用100μM哌呢酸(PA 100)、100μM 3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA 100)或对照处理(对照)处理的水稻植株的表型性状的方框图，其中圆点表示离群值。样本量＝24(每次
处理8个个体)。J2表示第二期幼虫，J3+J4是第三期幼虫和第四期幼虫的总和(视觉上区分
J3和J4几乎是不可能的)。成年雌虫是没有卵块的成熟雌虫，产卵雌虫是有卵块的成熟雌
虫。非空瘿分为小、中、大或非常大；小瘿的百分比是指小瘿的比例。AR：不定根。

[0025] 图4：用PA、MDCA或模拟处理来处理的拟禾本科根结线虫(M.graminicola)感染的水稻植株的生长的三次样条混合模型(4节)。左面：主体层面的回归曲线。右面：数量层面模
型预测。0小时对应于测量的开始(转移到生长基质后10天)；拟禾本科根结线虫
(M.graminicola)接种第在82小时时进行。样本量：29(对照：10，PA：10，MDCA：9)。接种时刻
用垂直黑条表示。

[0026] 图5：感染拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)的水稻表型性状的方框图，其中圆点表示离群值。样本量＝29(对照：10，PA：10，MDCA：9)。J2表示第二期幼虫，J3+J4是第三期幼虫和第四期幼虫的总和。成年雌虫是没有卵块的成熟雌虫，产卵雌虫是有卵块
的成熟雌虫。非空瘿分为小、中、大或非常大；小瘿的百分比是指小瘿的比例。‘AR’代表不定
根。

[0027] 图6：与对照组(对照)相比，哌呢酸(PA)、4‑碘苯甲酸(IBA)和3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)以及防御诱导子脂多糖(LPS)对小麦茎长、叶面积、根长、不定根数和每个根系和
每个根的拟禾本科根结线虫(M.graminicola)瘿数的影响。条形图表示平均值；误差条表示
标准差。N＝9。

[0028] 图7：与对照组(CON)相比，哌呢酸(PA)、胡椒碱(PIP)、4‑丙炔氧基苯甲酸(4PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)对水稻的发育阶段、茎和根生长以及每个根系的拟禾本科根结
线虫(M.graminicola)的瘿数的影响。条形图表示平均值，误差条表示标准差。N＝8。

[0029] 图8：与对照(CON)相比，浓度为100μM、400μM和700μM(分别为PA100、PA400和PA700)的哌呢酸对BBCH的发育阶段、茎的干量、初生根长度和每个根系的瘿数的影响。条形
图表示平均值；误差条表示标准差。N＝8。

[0030] 图9：哌呢酸(PA)的不同施用途径对水稻中拟禾本科根结线虫(M.graminicola)感染的影响：含有300μM：哌呢酸的羧甲基纤维素种子包衣(PA包衣)、每周重复三次的100μM叶
面喷洒(PA连续)、接种前一天单次300μM叶面喷洒(PA‑1d)、七天后的单次300μM叶面喷洒
(PA+7d)或对照(对照，Control)。条形图表示平均值；误差条表示标准差。N＝8。

[0031] 图10：感染甜菜孢囊线虫(H.schachtii)的五个性状平均值的条形图，其中标准差表示为用10ml哌呢酸(PA)处理后或对照处理后的误差条。“成熟胞囊”是指干燥、充满卵的
胞囊。N＝8。

[0032] 图11：与对照组(CON)相比，哌呢酸(PA)对小麦的根系长度、茎的干重、每个根系的病变数和每个根系的穿刺短体线虫(P.penetrans nematodes)数的影响。条形图表示平均
值；误差条表示标准差。N＝8。

[0033] 图12：拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)(12a)和甜菜孢囊线虫(Heterodera schachtii)(12b)的J2幼虫存活率的混合效应逻辑回归图，其中显示了预测
带。“PA”是指100μM的PA溶液，而“vertimec(阿维菌素)”是0.02v/v％的阿维菌素溶液。N＝
300(6孔，每孔处理50个J2)。

[0034] 图13：与对照(CON)和杀线虫剂阿维菌素(VERT，0.02v/v％阿维菌素)相比，哌呢酸(PA)、胡椒碱(PIP)、4‑丙炔氧基苯甲酸(4PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)对拟禾本科根结
线虫(Meloidogyne graminicol)J2幼虫的毒性。N＝300(6孔，每孔50个线虫，对于每个化合
物)。

[0035] 图14：在被土传病原体腐皮镰刀菌(Fusarium solani)(分离物Fso18)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(分离物Foc26)和层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)(分离物
Fpr18)改性的土壤中，模拟包衣(CON)或含哌呢酸(PA)的包衣的洋葱种子的发芽率随时间
的逻辑回归曲线。N＝60(每次处理3盆，每盆20粒种子)。

[0036] 图15：接种后4天，在用对照处理(CON)或含300μM哌呢酸(PA)的喷雾处理的番茄叶中，表现出病变成功发展(左)和病变成功建立的平均面积(右)的接种斑点所占的部分。条
形图表示平均值，误差条表示标准差。N＝36(每次处理6片叶，每片叶6个接种点)。

[0037] 图16：属于三个真菌物种的四种真菌分离物(番茄早疫病菌(Alternaria solani)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)分离物
PH1和GFP)在菌丝体区域的生长。误差条表示标准差。N＝6。

[0038] 图17：经处理的野生型水稻植株(A)和OsWRKY45敲除植株植株(B)的生长曲线。零小时对应于转移到生长基质后8天开始测量。

[0039] 图18：表型性状的方框图，点表示离群值。样本量＝63(10个野生型+对照、10个OsWRKY45敲除+对照、8个野生型+MDCA、10个OsWRKY45敲除+MDCA、9个野生型+PA、10个
OsWRKY45敲除+PA)。非空瘿分为小、中、大或非常大；小瘿的份数为小瘿的比例。

[0040] 图19：与对照组(CON)相比，哌呢酸(PA)对野生型番茄植株(WT)和表达NahG的转基因番茄植株(NahG，SA缺陷系)的茎的干量、根长、每个根系的瘿数和每cm初生根的瘿数的影
响。条形图表示平均值；误差条表示标准差。N＝8。

[0041] 图20：与对照组(CON)相比，哌呢酸(PA)对经和未经JA‑生物合成抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸(DIECA)处理的两种野生型番茄植物(WT)的茎的干重、根长、每个根系的瘿数
和每cm初生根的瘿数的影响。条形图表示平均值；误差条表示标准差。N＝8。

[0042] 图21：相对于对照植株，水稻植株经PA处理后若干基因基于qRT‑PCR的表达。水平虚线表示未处理的对照植物的基线水平，设置为1.0。点表示平均相对表达，误差条表示
95％的置信区间。N＝3(每次处理三池植物组)。

[0043] 图22：与对照组(CON)相比，接种后三天哌呢酸(PA)对番茄的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)病变数的影响(22a)，以及七天后这些病变覆盖的叶片面积百分
比(22b)。条形图表示平均值；误差条表示标准差。‘叶1’是指第一片真叶；子叶未被考虑在
内。N＝8。

[0044] 图23：与对照组(CON)相比，接种丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)后三天，哌呢酸(PA)对番茄中平均病害指数的影响；整株病害指数是四个每片叶子得分的中位数。
条形图表示平均值；误差条表示标准差。N＝9。

[0045] 图24：与对照组(CON)相比，接种后五天，哌呢酸(PA)对番茄中的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)病变数的影响。条形图表示平均值；误差条表示标准差。“叶1”是
指的是第一片真叶；子叶未被考虑在内。N＝10。

[0046] 图25：(a)，在有或没有华丽腐霉菌(Pythium splendens)的土壤中，500μM哌呢酸包衣与模拟包衣相比对发芽率的影响(PA：哌呢酸包衣，无腐霉(Pythium)；CON：模拟包衣，
无腐霉(Pythium)；PA+Ps，哌呢酸包衣，华丽腐霉菌(Pythium splendens)；CON+Ps：模拟包
衣，华丽腐霉菌(Pythium splendens)；N＝45。(b)，实验开始后14天出苗的植物健康评分。
分数：0＝出苗后幼苗死亡；1＝幼苗存活但发育不良；2＝幼苗健康。(c)试验开始后14天的
初生根长度，条形图表示平均值，误差条表示标准差。

[0047] 如本文所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括单数和复数指代物，除非上下文另有明确规定。本文所用的术语“包括(comprising)”、“包括
(comprises)”和“由……组成(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”
或“包含(containing)”、“包含(contains)”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除
附加的、未列举的成员、元素或方法步骤。本文所用的术语“约”，当涉及例如参数、量、持续
时间等是可测量值，意在涵盖包含特定值的+/‑20％或更小，优选+/‑10％或更小，更优选为
+/‑5％或更小的变化，只要这些变化适合于在公开的发明中进行。应当理解，修饰语“约”所
涉及的值本身也是具体的，并且是优选公开的。尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(例如
一组成员中的一个或多个或至少一个成员)本身是清楚的，但是通过进一步的举例说明，该
术语还包括提及任何一个所述成员，或任何两个或多个所述成员，例如，任何>3、>4、>5、>6
或>7等所述成员，以及直至所有所述成员。本说明书中引用的所有参考文献和特别提到的
的教导均以引用的方式全部并入本文。除非另有限定，公开本发明的所有术语(包括技术和
科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括
术语定义部分以更好地理解本发明的教导。在以下段落中，更详细地限定了本发明的不同
方面。如此限定的每个方面可以与任何一个或多个其它方面相结合，除非明确指出相反的
情况。特别地，被指明为优选或有利的任何特征可以与被指明为优选或有利的任何一个或
多个其它特征相结合。本整个说明书，提及“一个实施方式”或“一实施方式”是指结合该实
施方式描述的具体特征、结构或特性被括在本发明的至少一个实施方式中。

[0048] 本发明涉及可用于刺激植物抵御和/或免疫响应病原体(如线虫、细菌和/或真菌)的方法和化合物。通过植物的作用，这些化合物对有益的土壤生物的影响极小，从而使它们
更合适用作作物保护剂。此外，已经证明这些化合物对植物生长有积极的作用，并且更具体
地是，例如在被线虫感染的条件下对根和茎的发育有积极的作用(例如增加数量和/或高
度)。因此，本发明的化合物可用于提高对病原体，特别是线虫、病原真菌和/或细菌的耐受
性。本发明证明，该化合物抑制植物寄生线虫的引诱、侵袭、迁移、取食部位的建立、取食增
殖和/或成熟，和/或减少病变部位和取食部位的数目，例如由这种线虫产生的瘿或合胞体。
进一步表明，本发明的化合物改善镰孢菌(Fusarium)侵染的土壤中的幼苗出苗，并抑制由
诸如葡萄孢菌(Botrytis)和假单胞菌(Pseudomonas)的植物病原真菌和细菌导致的病变形
成和扩散。

[0049] 本发明化合物是肉桂酸‑4‑羟化酶(C4H)(NCBI参考序列号：NP_180607.1)的抑制剂/灭活剂，肉桂酸‑4‑羟化酶是苯丙酸类途径的第二种酶，并且是细胞色素P450血红素‑硫
醇蛋白超家族的成员(Schalk等人，1998)。因此，这些化合物通过选择性干扰苯丙酸类途径
来刺激植物防御机制而发挥作用。这是出乎意料的，因为苯丙酸类途径在植物防御中起着
关键作用，并且用于例如在病原体侵袭时增强细胞壁，用于生物合成对线虫有毒或具有抑
制作用的类黄酮等分子，以及葱郁在病原体侵袭时改变植物内植物激素的平衡，从而将资
源从生长转移到防御。令人惊讶地发现，(暂时性)抑制所述途径，并且特别是抑制C4H带来
抵抗植物病原体，尤其是植物寄生线虫、真菌和/或细菌的保护性作用。

[0050] 在一具体实施方式中，本发明提供了一种尤其通过抑制或灭活C4H酶来增强植物免疫力的方法，所述方法包括向植物施用能够通过结合C4H来破坏C4H的功能或活性的(外
源)化合物，例如小分子化合物的步骤。如本文所用，“肉桂酸‑4‑羟化酶(C4H)抑制剂”涉及
能够降低或抑制植物中C4H活性的化合物。如本文所用，术语“抑制C4H的活性”或“抑制C4H”
应解释为意指功能性C4H酶的合成水平或C4H生物学活性的任何变化，可包括植物细胞中存
在的功能性C4H酶的水平降低、C4H酶的功效降低、或影响C4H酶的一个或多个生物特性的任
何其它手段，例如在植物中使反式‑肉桂酸转化为4‑羟基肉桂酸的作用。

[0051] 用于测定和确定C4H活性(对C4H的影响)的技术是本领域普通技术人员公知的。用于确定对C4H活性的抑制的有用方法如下(通过引用来并入)：

[0052] 在潜在的C4H抑制剂存在的情况下，表达CYP73A1的植物细胞培养物或酵母微粒体13 14
中，通过用 C或 C标记来测量反式肉桂酸的转化效率(记载于Schoch et al.2002；Van de 
Wouwer et al.2016；Schalk et al.1998)。在Schoch等人(2002)的表1中列出了竞争性和
不可逆C4H抑制剂在细胞悬浮液中获得的代表性抑制动力学值(通过引用并入本文)。

[0053] C4H酶的抑制增加了游离反式肉桂酸的浓度，这种游离反式肉桂酸在植物中快速结合。可用HPLC‑MS来量化反式肉桂酸氨基酸缀合物的积累，并且可用作植物中C4H抑制的
替代量度(proxy measure)。该方法概述在Steenackers et al.2016中。简而言之，在含10M
可疑C4H抑制剂的培养基上体外培养拟南芥(A.thaliana)幼苗，然后收集、合并并进行HPLC
分析。在Steenackers et al.2016的补充图2中示出了反式肉桂酸缀合物量的增加的代表
性值(通过引用并入本文)。

[0054] C4H酶的抑制引起C4H基因的补偿性上调，如实施例20所示。在收获前24小时和3小时分别用100μM的PA和MDCA进行叶面处理的十四天龄水稻植株(Oryza sativa cv.Bomba)
表明根系中C4H表达分别增加了10倍和3倍。

[0055] 连续暴露至C4H抑制剂后，拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗的初生根的伸长大大降低。IC50‑根，即将初生根伸长降低50％所需的候选抑制剂的剂量，可以作为C4H抑制
剂活性的另一间接量度。Steenackers et al.2016中对该过程进行了描述。对于MDCA，C4H
抑制剂的参考IC50‑根值为5.07μM(Steenackers et al.2016)，而对于PA，则为40.0μM(未
公开的数据)。

[0056] 当拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗在体连续暴露于10μM的可疑似C4H抑制剂下进行体外生长时，在五天龄幼苗的凯氏(Casparian)带中，木质化明显损伤(木质化细胞
较少)。作为对比，PA、MDCA和4‑IBA使凯氏带区域中非木质化内皮细胞的数量分别增加了
134％、104％和57％(Van de Wouwer et al.,2016)。

[0057] 在植物中，进行测定以确定本文提供的化合物的结构类似物和“C4H抑制剂前体”(在植物中转化为有效C4H抑制剂的化合物)的抑制活性是特别有用的。在本发明的上下文
中，哌呢酸(PA)的前体的实例是3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)、胡椒酸和胡椒碱。因此，本
发明还涉及在如本文所述的方法、组合物和应用/用途中使用C4H抑制剂前体。

[0058] 在具体实施方式中，C4H抑制剂是小分子。在一个实施方式中，该化合物是芳族羧酸，或特征在于存在含羧酸基团的苯并二噁茂。

[0059] 具体地，本发明的化合物为具有通式I的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、盐或溶剂化物：

[0060]

[0061] 其中，n是0、1、2、3或4。

[0062] 更具体地，n是0。

[0063] 在进一步的实施方式中，本发明的化合物为具有通式II的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、盐或溶剂化物：

[0064]

[0065] 其中，X是卤素或‑R，其中，R选自‑CF3或‑O‑C1‑6炔基。在具体实施方式中，X是‑I，并且R是‑4‑O‑丙炔基，‑3‑O‑丙炔基或‑4‑CF3。

[0066] 在另一实施方式中，本发明的化合物具有式III的化合物或其立体异构体、互变异构体、水合物、盐或溶剂化物：

[0067]

[0068] 其中，n是0、1、2、3或4。

[0069] 更具体地，n是1。

[0070] 本文所用的术语“卤素”包括氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)，特别是碘(I)。本文所用的术语“炔基”是指含有至少一个碳‑碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括乙炔基、
丙炔基、丁炔基、异丁炔基以及戊炔基、己炔基等。在具体实施方式中，炔基是丙炔基。“任选
取代的炔基”是指任选地在任何可用的连接点处具有一个或多个取代基(例如1、2、3或4)的
炔基。这些取代基的非限制性实例包括卤素、羟基、羰基、硝基、氨基、肟、亚氨基、叠氮基、肼基、氰基、芳基、杂芳基、环烷基、酰基、烷基氨基、烷氧基、巯基、烷硫基、羧酸、酰氨基、烷基酯、氨基甲酸酯、硫代氨基、脲、磺酰氨基(sullfonamido)等。

[0071] 在一个具体实施方式中，本发明的化合物选自表1所示的化合物组。

[0072] 表1

[0073]

[0074]

[0075] 甚至更具体地，本发明的化合物或C4H抑制剂选自由以下项组成的组：哌呢酸(PA)(或任选其前体，如3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)、胡椒酸或胡椒碱；特别是MDCA)；4‑碘苯
甲酸(4‑IBA)；4‑三氟甲基苯甲酸；4‑丙炔氧基苯甲酸(4‑PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)；
或它们的立体异构体、互变异构体、水合物、盐、酯和/或溶剂化物。在进一步的实施方式中，
化合物选自由以下项组成的组：哌呢酸(PA)、3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)、胡椒酸和胡椒
碱，或它们的立体异构体、互变异构体、水合物、盐、酯和/或溶剂化物。在其它实施方式中，
化合物选自由以下项组成的组：4‑碘苯甲酸(4‑IBA)、4‑三氟甲基苯甲酸、4‑丙炔氧基甲基
苯甲酸、4‑丙炔氧基苯甲酸(4‑PB)和3‑丙炔氧基苯甲酸，或它们的立体异构体、互变异构
体、水合物、盐、酯和/或溶剂化物。在又一实施方式中，化合物是3‑(4‑吡啶基)丙烯酸
(3PA)，或其立体异构体、互变异构体、水合物、盐、酯和/或溶剂化物。优选的化合物是哌呢
酸(PA)。通过使用本文所提供的测定，可以评价其它化合物与本发明的化合物，特别是PA的
功能等同性，例如，可以发现该化合物在本文记载的至少1、2或3种测定方法中具有类似于
参考化合物(例如PA)的效果。因此，本发明还预期了本文提供的化合物的“功能等同物或类
似物”，即与参考化合物的结构差异细微(所谓的结构类似物)但具有相同预期功能或性质
的化合物。在一个实施方式中，功能类似物是特征在于存在芳族羧酸或存在含羧酸基团的
苯并二噁茂的小分子。

[0076] 除非另有说明，术语“本发明的化合物”和等同表述意在涵盖该化合物的前药、药学上可接受的盐、氧化物、溶剂化物(例如水合物)和包合物(在上下文允许的情况下)以及
该化合物的任意立体异构或互变异构形式，或任意此类形式的任意比例的混合物。此外，由
于本发明的化合物带有酸性部分，因此其合适的农用化学上可接受的盐可以包括碱金属
盐，例如钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如钙盐或镁盐；和与合适的有机配体形成的盐，例如季
铵盐。盐可以是通过本文提供的酸性化合物和碱的中和反应形成的任意离子化合物。实例
包括但不限于铵盐、钾盐或异丙胺盐。在另一实施方式中，碱性盐由形成无毒盐的碱形成，
包括铝盐、精氨酸盐、苄星盐(benzathine)、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨
酸盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、氨丁三醇盐和锌盐。在一个实施方式中，还可形成酸和碱的半
盐，例如半硫酸盐和半钙盐。在具体实施方式中，本发明还涵盖衍生自本发明化合物的酯，
即其中羧酸的‑OH(羟基)被‑O‑烷基(烷氧基)或其它有机基团取代。因此，式I、式II、式III
和式IV中的羧酸(‑COOH)(包括子组的各个化合物)被R1‑O‑C＝O取代，其中R1是C1‑C4‑烷
基。实例包括但不限于甲基酯、乙基己基酯或乙基酯。考虑到增强的渗透性能，所述酯类对
于叶面施用特别有意义。

[0077] 本发明提供了用于控制植物病原体，诸如细菌、病毒、真菌和线虫，并且尤其是用于控制寄生线虫、真菌和/或细菌，更尤其是用于线虫的方法、化合物和组合物。术语“控制
植物病原体和寄生线虫”是指降低植物病原细菌和真菌或寄生线虫对植物的总体负面影
响，从而与未用该化合物处理的植物相比，使该植物受到所述病原体/线虫的负面影响的量
减少。植物病原细菌/真菌或寄生线虫的总体负面影响可例如通过减少植物或土壤中植物
寄生线虫的总数或密度(即线虫种群的减少)，或者通过降低病原体不利影响(例如病斑、斑
点的数目，枯萎、瘿的形成、腐烂、幼苗死亡、生长减弱、产量损失等)的严重性或程度或者降
低植物寄生线虫的严重性或程度(即，线虫数量保持不变，但表现出较少的有害作用，例如
胞囊或瘿形成、病斑数、生长减弱、产量损失等)来降低。对于真菌和细菌，使用本发明的化
合物处理过的植物的积极效果在于减少了根、叶、茎或果实中的病斑的数目、大小和蔓延，
降低了维管枯萎病的影响，改善了被土传真菌侵染的土壤中的出苗率，提高产量，改善了收
获后的感官和贮藏性能等。

[0078] 如本文所用，术语“线虫(nematode)”指线虫门中的多细胞动物。“植物寄生线虫”是指可以在植物的根、种子、花、叶、茎或植物生长的土壤中发现的植物的线虫寄生虫。植物
寄生线虫以植物的所有部分为食，包括根、茎、叶、花和种子。

[0079] 具体地，“胞囊(Cyst)线虫”(Heterodera属和Globodera属)和“根结线虫”(Meloidogyne属)导致植物，尤其是农作物的重大经济损失。胞囊线虫的实例包括甜菜异皮
线虫(H.schachtii)(甜菜胞囊线虫)、燕麦异皮线虫(H.avenae)(谷类胞囊线虫)、大豆异皮
线虫(H.glycines)(大豆胞囊线虫)、甘蔗异皮线虫(H.sacchari)(甘蔗胞囊线虫)、胡萝卜
异皮线虫(H.carotae)(胡萝卜胞囊线虫)、苍白球异皮线虫(G.pallida)(白马铃薯胞囊线
虫)和马铃薯金线虫(G.rostochiensis)(黄马铃薯胞囊线虫)。根结线虫包括，例如拟禾本
科根结线虫(M.graminicola)、爪哇根结线虫(M.javanica)、南方根结线虫(M.incognita)、
花生根结线虫(M.arenaria)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、不列颠根结线虫
(M.artiellia)、伪短体线虫(M.fallax)、北方根结线虫(M.hapla)、小突根结线虫
(M.microtyla)、山核桃根结线虫(M.partityla)、番禺根结线虫(M.panyuensis)、谷类根结
线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、象耳豆根结线虫(M.enterolobii)和巴拉那根
结线虫(M.paranaensis)。这些病原体通过使植物细胞的形态转变为巨型细胞或合胞体而
在植物中建立“进食部位”，从而阻断营养物质和光合作用产物的流动。因此，线虫“感染”是
指对宿主植物组织的侵袭并以其为食。造成重大损害的其它线虫包括“根病斑”线虫，诸如
短体线虫(Pratylenchus)，特别是穿刺短体线虫(P.penetrans)，其感染玉米、水稻和蔬菜；
短尾短体线虫(P.brachyurus)，其感染菠萝；玉米短体线虫(P.zeae)，其感染谷物、糖烛树
和咖啡；咖啡短体线虫(P.coffeae)，其感染咖啡和香蕉；以及索氏短体线虫(P.thornei)，
其感染小麦。

[0080] 在一个方面，“植物寄生线虫”包括来自以下的微生物：根结线虫属(Meloidogyne)、异皮线虫属(Heterodera)、球异皮线虫属(Globodera)、短体线虫属
(Pratylenchus)、滑刃线虫属(Aphelenchoides)、剑线虫属(Xiphinema)、穿孔线虫属
(Radopholus)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)、肾状线虫属(Rotylenchulus)、珍珠线虫
属(Nacobbus)、长针线虫属(Longidorus)、双垫刃线虫属(Ditylenchus)和毛刺线虫属
(Trichodorus)，并且尤其选自以下的微生物：根结线虫属(Meloidogyne)、异皮线虫属
(Heterodera)和短体线虫属(Pratylenchus)。在一具体实施方式中，线虫是垫刃目
(Tylenchida)的成员。

[0081] 特别地，线虫物种选自由以下组成的组：大豆异皮线虫(Heterodera glycines)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、南方
根结线虫(Meloidogyne incognita)、拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)、穿
刺短体线虫(Pratelynchus penetrans)、苍白球异皮线虫(Globodera pallida)、燕麦异皮
线虫(Heterodera avenae)、甘蔗异皮线虫(Heterodera sacchari)、玉米异皮线虫
(Heterodera zeae)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、咖啡短体线虫
(Pratylenchus coffeae)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、玉米短体线虫
(Pratylenchus zeae)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、爪哇根结线虫(Meloidogyne 
javanica)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、
伪短体线虫(Meloidogyne fallax)、奇氏根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、短小根结线
虫(Meloidogyne exigua)、稻叶牙滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)、草莓滑刃线虫
(Aphelenchoides fragariae)、剑线虫(Xiphinema index)、香蕉穿孔线虫(Radopholus 
similis)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus 
reniformis)、异常珍珠线虫(Nacobbus abberans)、横带长针线虫(Longidorus 
elongatus)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus 
dipsaci)、水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)和Tricochodorus minor.

[0082] 植物性病原细菌的实例包括以下属：假单胞菌属(Pseudomonas)、青枯菌属(Ralstonia)、根瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄单胞菌属
(Xanthomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、木杆菌属(Xyllela)、狄克氏菌属(Dickeya)、果胶
杆菌属(Pectobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、棒形杆菌属(Clavibacter)、韧皮部
杆菌属(Candidatus Liberibacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属
(Corynebacterium)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。植物性病原病毒的实例包括马铃
薯X病毒(Potato Virus X)、马铃薯Y病毒(Potato Virus Y)、烟草花叶病毒(Tobacco 
Mosaic Virus)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato 
Yellow Leaf Curl Virus)、番茄斑点枯萎病病毒(Tomato Spotted Wilt Virus)和柑橘速
衰病毒(Citrus Tristeza Virus)。真菌植物病原物种主要存在于子囊菌门(phyla 
Ascomycota)和担子菌门(phyla Basidiomycota)中。在子囊菌中，植物病原体属于不同的
种类，如座囊菌纲(Dothideomycetes)(例如枝孢霉属spp.，Cladosporium spp.)、粪壳菌纲
(Sordariomycetes)(例如，稻瘟病菌属spp.，Magnaporthe  spp.)或锤舌菌纲
(Leotiomycetes)(如葡萄孢菌属spp.，Botrytis spp.)。担子菌以两个最大的植物病原体
群为代表：锈菌(Pucciniomycetes)和黑穗(smuts)(分布在黑粉菌(Ustilaginomycotina)
亚门中)。植物病原真菌的实例包括稻瘟病菌属(Magnaporthe)、葡萄孢霉属(Botrytis)、柄
锈菌属(Puccinia)、镰孢菌属(Fusarium)、布氏白粉菌属(Blumeria)、球腔菌属
(Mycosphaerella)、炭疽菌属(Colletotrichum)、黑粉菌属(Ustilago)、层锈菌属
(Phakopsora)、链格孢属(Alternaria)、核盘菌属(Sclerotinia)、枝孢菌属
(Cladosporium)和丝核菌属(Rhizoctonia)。

[0083] 植物性病原卵菌(以前被归类为真菌)的实例是腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophtora)的物种。腐霉(Pythium)导致的根腐病是一种常见的农作物病害。

[0084] 在具体实施方式中，对植物寄生线虫、真菌和/或细菌的控制通过以下来实现：提高对病原体和寄生虫(尤其是线虫)的有害作用的抗性，并使受试植物的整体健康状况得以
改善，例如得到一些更理想的参数，诸如收获的作物产量。

[0085] 本文使用的术语“提高对病害的抗性”是指健康植物中植物防御能力的提高，或植物或植物群体中的病害严重程度的降低，或植物群体中病害植物的数量降低。

[0086] 一个特别的优点是，本发明的化合物没有(显著的)毒性，因此在适于施用至植物的工作浓度下对非目标生物没有有害影响。例如，据证明，本文提供的化合物对小鼠、蝇、线
虫、细菌和真菌没有毒性。因此，在具体的实施方式中，本发明的化合物不被认为是杀线虫
的、杀真菌的或杀细菌的。根据定义，杀线虫剂是杀死线虫的化学物质。所述特征可以通过
本领域已知的方法来确定，例如在实施例部分中提供的方法或者例如Faske&Hurd 2015所
述通过直接接触生物测定法方法来确定。在所述测定中，与对照组相比，在暴露于100μM测
试化合物的水溶液24小时后，如果线虫存活率低于60％，特别是低于50％，更特别是低于
40％，甚至更特别是低于30％，则该化合物被认为是杀线虫的。

[0087] 同样，杀真菌剂和杀细菌剂是分别能杀死真菌和细菌的化学物质。所述特征可以通过本领域技术人员已知的方法来确定，或者例如如本实施例中所提供的方法来确定。

[0088] 特别有利的是，本发明的化合物可以预先使用(例如施用至幼苗)以及治疗性使用，仅需要简单的配制并且在室温下是高度稳定的。当用作延迟剂时将延迟或甚至防止受
感染时对植物的损害。

[0089] 在进一步的实施方式中，本发明的化合物是被分离的(例如，以基本上纯化的形式)或使用标准技术合成来制备的，或者是可商购的。在一具体实施方式中，该化合物不是
通过通常使用诸如乙醇或水的溶剂提取原料的一部分而制成的天然提取物的一部分(例如
种子或植物的水性或乙醇提取物；油状物)。更具体地，化合物(作为组合物的一部分)以
90％至100％，优选95％至100％的纯度(根据它们的NMR谱)使用。

[0090] 本发明还涵盖包含本发明化合物的组合物或制剂(及用途)。本文所用的“农业化学组合物”是指用于农业化学用途的组合物，例如用于在农业化学工业(包括农业、园艺、花
卉栽培)以及家庭和花园中保护如本文所定义的植物或植物的一部分、作物、球茎、块茎、果
实(例如免受有害生物、病害或害虫的侵害)，其包含至少一种本文所限定的化合物的活性
物质，任选含有一种或多种有利于农业化学物质的最佳分散、雾化、沉积、叶片润湿、分布、
保留和/或吸收的添加剂。通常，这种组合物或制剂进一步包含至少一种额外的成分或赋形
剂，例如表面活性剂、(固体或液体的)稀释剂和/或乳液稳定剂，其用作载体。(农用化学)制
剂通常包含0.01wt％至95wt％，优选0.1wt％至90wt％，最优选0.5wt％至90wt％的活性物
质。本文中“表面活性剂”是指减小液体表面张力，使得其能够更容易铺展的化合物。表面活
性剂可以是洗涤剂、乳化剂(包括烷基聚葡糖苷甘油酯或聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂
酸酯)、分散剂(包括氯化钠、氯化钾、硝酸钾、氯化钙或玉米淀粉)、发泡剂(包括酒石酸、苹
果酸或醇的衍生物)、渗透促进剂、保湿剂(包括硫酸铵、甘油或尿素)、离子型或非离子型湿
润剂，或者这些表面活性剂的混合物。具体地，在本文限定的组合物中使用的表面活性剂是
渗透促进剂、分散剂或乳化剂。在本文中术语“渗透促进剂”被理解为使活性成分加速穿过
植物的表皮而被吸收到植物中，即促进吸收速率，和/或增加被吸收到植物中的活性成分的
量的化合物。被称为渗透促进剂的物质类别包括磷酸烷基酯(如磷酸三丁酯和磷酸三丙
酯)，以及萘磺酸盐。“分散剂”是指添加到悬浮液中的一种物质，该物质通常是胶体，用于改
善颗粒的间隔并防止沉降或结块。本文所用的术语“乳化剂”是指使乳液稳定的物质，即两
种或多种液体的混合物。可以提及以商品名 20(主要包含聚氧乙烯(20)脱水山梨醇
单月桂酸酯(聚山梨醇酯20))和 (主要包含烷基聚糖苷)出售的乳化剂。

[0091] 作为实例，表面活性剂包含一种或多种以下组分：蓖麻油乙氧基化物、油菜籽甲酯、烷基磷酸酯/盐、磷酸三丁酯、磷酸三丙酯、萘磺酸盐、有机磺酸盐/值/2‑甲基戊烷‑2,4‑二醇、烷基多糖苷、硅氧烷衍生物、烷基磺酸酯/酯、聚羧酸酯、木质素磺酸酯/盐、烷氧基化
甘油三酯、脂肪胺聚合物、二辛基磺基琥珀酸盐或聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(聚
山梨醇酯20)。

[0092] 添加剂、植物(微量)营养物、缓冲剂、作物油、漂移抑制剂和/或(惰性)基质也可以是组合物的一部分。典型地，本发明的化合物可以以合适的农业上可接受的制剂形式施用
至植物，包括但不限于生长介质(例如土培或水培液体介质)、粉剂、颗粒、溶液浓缩物、可乳
化浓缩物和可湿性粉末。术语“农业上可接受的”表示无论是在室内(例如在封闭环境中)还
是在室外(例如在暴露于其他植物、动物和人类生活的非封闭环境中)，该制剂是无毒的并
且可施用至植物是可接受的。该制剂可以包括添加剂，例如溶剂(例如酮、醇、脂族醚)、填料
和载体(例如粘土和矿物质)。固体组合物的常见类型是粉剂、粉末、颗粒、丸粒、球粒、锭剂、
片剂、填充膜(包括种衣剂)等，它们可以是水可分散的(“可润湿的”)或水溶性的。由成膜溶
液或可流动的悬浮液形成的膜和包衣特别适用于处理种子。可喷雾制剂通常在喷雾前在合
适的介质中扩展。这种液体和固体制剂被配制成易于在喷雾介质(通常是水)中稀释，但偶
尔也可在另一种合适的介质(如芳烃、链烷烃或植物油)中稀释。每公顷的喷洒量可以在约
一升至几千升的范围内，但更通常在每公顷约十至几百升的范围内。可喷雾的制剂可以与
水或其他合适的介质相混合，通过空中或地面施用来进行叶面处理，或者施用到植物的生
长介质上。液体制剂和干制剂可以直接计量到滴灌系统中，或者在种植期间计量到犁沟中。

[0093] 液体稀释剂包括例如水、N,N‑二甲基烷基酰胺(例如N,N‑二甲基甲酰胺)、柠檬烯、二甲基亚砜、N‑烷基吡咯烷酮(例如N‑甲基吡咯烷酮)、磷酸烷基酯(例如磷酸三乙酯)、乙二
醇、三甘醇、丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、碳酸丙烯酯、碳酸丁二醇酯、石蜡烃(例如白色矿
物油、正链烷烃、异链烷烃)、烷基苯、烷基萘、甘油、三乙酸甘油酯、山梨醇、芳烃、脱芳烃脂肪族化合物、烷基苯、烷基萘、酮类(例如环己酮，2‑庚酮，异佛尔酮和4‑羟基‑4‑甲基‑2‑戊酮)、乙酸酯(例如乙酸异戊酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸壬酯、乙酸十三烷基酯
和乙酸异冰片酯)、其它酯(例如烷基化的乳酸酯、二元酯、苯甲酸烷基酯和芳基酯以及γ‑
丁内酯)，以及醇类，该醇类可以是直链、支链、饱和或不饱和的，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇、2‑乙基己醇、正辛醇、癸醇、异癸醇、异十八醇、鲸蜡醇、月桂醇、十三烷基醇、油醇、环己醇、四氢糠醇、二丙酮醇、甲酚和苯甲醇。液体稀释剂还包括饱和
和不饱和的脂肪酸(通常为C6‑C22)的甘油酯，如植物种子和果实的油(如橄榄油、蓖麻油、
亚麻子油、芝麻油、玉米油(玉蜀黍油)、花生油、葵花油、葡萄籽油、红花油、棉籽油、大豆油、油菜籽油、椰子油和棕榈仁油)，动物来源的脂肪(如牛油、猪牛油、猪油、鱼肝油、鱼油)及它
们的混合物。液体稀释剂还包括烷基化(例如甲基化、乙基化、丁基化)的脂肪酸，其中，脂肪
酸可以通过水解植物和动物来源的甘油酯，并且可以通过蒸馏进行纯化而获得。典型的液
体稀释剂记载于Marsden,Solvents Guide,2nd Ed.,Interscience,New York,1950中。

[0094] 在具体实施方式中，本发明提供了一种纤维组合物，其包含非织造纤维和有效量的至少一种如本文所提供的化合物，所述化合物共价附着或稳定吸附到纤维上。

[0095] 该组合物或制剂通常包含有效量的本文所述的化合物。“有效量”是指它们的使用量能够获得期望的效果，但不会对被处理的植物产生任何植物毒性症状。一个具体实施方
式使用本发明的化合物，其可以有利地以高达500μM、600μM、700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度施用；或者以约0.1μM至约1000μM的浓度范围施用，更具体地以约1μM至约800μM的浓
度范围施用，甚至更具体地，以约1μM至约500μM的浓度范围施用，更具体地在至少或约5μM、
10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、150μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM至900μM的浓度范围施用。具体地，所使用的量是非杀线虫的和/或非杀真菌的。

[0096] 本发明的化合物可以单独使用，或者彼此部分或完全混合以制备根据本发明的组合物来使用。还可以将它们包装并进一步用作组合组合物，例如成套的部分。根据本发明的
方法，可将根据本发明的化合物或组合物施用到土壤/植物(部分)/作物一次，或者可以施
用两次或多次，其中每两次施用之间存在一间隔。

[0097] 可处理任何植物/作物。术语“植物(或多种植物)”是术语“作物”的同义词，其被理解为具有经济意义的植物和/或人工种植的植物。取决于所需的病原体(例如线虫)的控制，
本发明的方法、化合物和组合物可以应用于任何单子叶植物或双子叶植物。本发明保护的
具有植物寄生(线虫、真菌或细菌)物种的示例性植物包括但不限于，苜蓿：北方根结线虫
(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫
(Meloidogyne javanica)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus dipsaci)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、针线虫属spp.(Paratylenchus spp.)、剑线虫属spp.(Xiphinema 
spp.)；香蕉：南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫
(M.javanica)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、香蕉螺旋线虫(Helicotylenchus 
multicinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus 
reniformis)；豆类和豌豆：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、异皮线虫属spp.
(Heterodera  spp.)、刺线虫属spp.(Belonolaimus  spp.)、螺旋线虫属spp.
(Helicotylenchus spp.)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、银链花类毛刺线
虫(Paratrichodorus anemones)、毛刺线虫属spp.(Trichodorus spp.)；木薯：根结线虫属
spp.(Meloidogyne spp.)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)；谷类：谷类根结线
虫(Meloidogyne naasi)(大麦、小麦、黑麦)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)；鹰嘴豆：
根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、肾形肾状线虫
(Rotylenchulus reniformis)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、短体线虫属
spp.(Pratylenchus spp.)；柑橘：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、半穿刺线虫
(Tylenchulus semipenetrans)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫
(Radopholus citrophilus)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、长尾刺线虫(Bolonolaimus longicaudatus)、毛刺线虫属spp.
(Trichodorus spp.)、拟毛刺线虫属spp.(Paratrichodorus spp.)、剑线虫属spp.
(Xiphinema spp.)；三叶草：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、三叶草异线虫
(Heterodera trifolii)；玉米：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、较小类毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、长针线虫属spp.
(Longidorus spp.)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)；棉花：南方根结线虫
(Meloidogyne incognita)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、肾形肾状线虫
(Rotylenchulus reniformis)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、矮化线虫属spp.(Tylenchorhynchus spp.)、较小类毛刺线虫
(Paratrichodorus minor)；葡萄：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、剑线虫属spp.
(Xiphinema spp.)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、半穿刺线虫(Tylenchulus 
semipenetrans)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)；草：短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、长针线虫属spp.(Longidorus spp.)、次拟毛刺线虫
(Paratrichodorus christiei)、剑线虫属spp.(Xiphinema spp.)、茎线虫属spp.
(Ditylenchus spp.)；花生：北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、花生根结线虫
(Meloidogyne arenaria)、茎线虫属spp.(Ditylenchus spp.)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、小环线虫属spp.(Criconemella spp.)、长尾刺线虫(Belonolaimus 
longicaudatus)；木豆：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、木豆异皮线虫(Heterodera 
cajani)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、塞氏纽带线虫(Hoplolaimus 
seinhorsti)、短体线虫属spp.(Pratylenchus spp.)；马铃薯：根结线虫属spp.
(Meloidogyne spp.)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、苍白球异皮线虫
(Globodera  pallida)、短体线虫属spp.(Pratylenchus  spp.)、原始毛刺线虫
(Trichodorus primitives)、茎线虫属spp.(Ditylenchus spp.)、拟毛刺线虫属spp.
(Paratrichodorus spp.)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)；水稻：根结线虫属spp.
(Meloidogyne spp.)、稻叶牙滑刃线虫(Aphelenchiodes besseyi)、水稻茎线虫
(Ditylenchus angustus)、潜根线虫spp.(Hirchmanniella spp.)、异皮线虫属spp.
(Heterodera spp.)；小水果：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)；短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、剑线虫属spp.(Xiphinema spp.)、长针线虫属spp.(Longidorus 
spp.)、次拟毛刺线虫(Paratrichodorus christiei)、滑刃线虫属spp.(Aphelenchoides 
spp.)；大豆：南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogyne 
javanica)、大豆异皮线虫(Heterodera glycines)、刺线虫属spp.(Belonolaimus spp.)、
哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)；甜菜：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、
甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus dipsaci)、异常珍
珠线虫(Nacobbus aberrans)、毛刺线虫属spp.(Trichodorus spp.)、长针线虫属spp.
(Longidorus spp.)、拟毛刺线虫属spp.(Paratrichodorus spp.)；甘蔗：根结线虫属spp.
(Meloidogyne spp.)、短体线虫属spp.(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属spp.
(Radopholus spp.)、异皮线虫属spp.(Heterodera spp.)、纽带线虫属spp.(Hoplolaimus 
spp.)、螺旋线虫属spp.(Helicotylenchus spp.)、盾线虫属spp.(Scutellonema spp.)、刺
线虫属spp.(Belonolaimus spp.)、矮化线虫属spp.(Tylenchorhynchus spp.)、剑线虫属
spp.(Xiphinema spp.)、长针线虫属spp.(Longidorus spp.)、拟毛刺线虫属spp.
(Paratrichodorus spp.)；烟草：根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)、烟草矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、烟草胞囊线虫
(Globodera tabacum)、毛刺线虫属spp.(Trichodorus spp.)、美洲剑线虫(Xiphinema 
americanum)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus  dipsaci)、拟毛刺线虫spp.
(Paratrichodorus spp.)；番茄：根结线虫属spp.(Meloidogyne spp.)、短体线虫属spp.
(Pratylenchus spp.)。

[0098] 在具体实施方式中，待处理的植物是由于病原体和线虫寄生而估计损失最大的作物，即玉米、棉花、瓜类、豆类蔬菜、花生、茄科蔬菜(例如番茄、马铃薯、茄子、青椒和辣椒)、莴苣、草莓、马铃薯、洋葱、小麦、水稻、香蕉、树果(例如苹果、柑橘)、咖啡、大豆、甘蔗、甜菜和烟草，特别是番茄、小麦、甜菜、洋葱和水稻。

[0099] 在本发明进一步的实施方式中，将化合物或包含该化合物的组合物直接或间接施用至植物。可以处理或使用任何合适的植物部分，包括植物器官(例如，叶、茎、根等)；种子
和植物细胞及其后代。或者，该化合物或组合物可以施用至植物周围的土壤。化合物的施用
可在种植前、种植时或种植后进行。在一个实施方式中，接触包括直接施用到植物上。可以
使整株植物或部分，包括但不限于叶、茎、种子、根、繁殖体(如插条)、果实等与本文所述的
一种或多种化合物相接触。接触也可以通过例如施用到土壤或其他植物基质上。

[0100] 合适的施用方法包括高压或低压喷雾、浸渍、雾化、发泡、雾化、包衣和包壳(encrusting)。本领域技术人员可以设想其它合适的施用方法。在具体实施方式中，通过喷
雾，例如通过使用机械喷雾器，将本发明的化合物施用到植物的地上部分或植物的叶子上。
喷雾器将与液体载体(诸如水)或肥料混合的本发明制剂转化成液滴。液滴可以是任意大
小。臂式喷雾器和鼓风式喷雾器也可用于将本发明的制剂施用于出芽前或出芽后的作物。
鼓风式喷雾器将与液体载体混合的本发明制剂注入到快速流动的气流中。还可使用臂式喷
雾器、空中喷雾器、超低容量喷雾器、滴灌、喷灌和雾化器来施用本发明的制剂。当本发明的
制剂是固体、粉末或颗粒形式时，它们可通过颗粒或施用设备来施用。本发明的制剂也可以
作为熏蒸剂施用于土壤、植物介质、植物、植物组织或种子。

[0101] 在另一实施方式中，用本发明的化合物包衣植物的种子(“包衣的种子”)。可以使用技术人员已知的任何合适的种子包衣方法。例如可以用本发明的化合物以多种方式处理
种子，包括但不限于喷雾或滴淋、浸湿或丸粒施用。喷雾和滴淋处理可以通过以下来进行：
例如在农学上可接受的载体(通常是水性的)中配制有效量的化合物，并且通过诸如滚筒式
处理器的连续处理系统(其被校准为以与种子的连续流动成比例的预定速率施加处理)将
组合物喷雾或滴淋到种子上。这些方法包括那些可以有利地使用相对小体积载体的方法，
以便能够相对快速地干燥处理过的种子。可以有效地处理大量的种子。也可以使用批量系
统，其中预定批量的种子和信号分子组合物被输送到混合器中。用于执行这些过程的系统
和设备可从众多供应商处购得。本发明还提供了经一种或多种本发明的化合物/组合物包
衣的种子。

[0102] 在另一方面，化合物或组合物可以直接施用到土壤上，例如通过淋施(土壤淋施)。土壤淋施将可选混合有水的化合物施用于植物根部周围的土壤，从而使其根部能够吸收该
化合物。

[0103] 在具体实施方式中，本发明的化合物可以单独、组合或与其它化合物的混合物的形式施用于本文提供的植物。合适的其它化合物包括有效量的其它农业或园艺化学品，例
如除草剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀细菌剂、杀螨剂、杀真菌剂和/或植物生长
调节剂或肥料。

[0104] 在另一实施方式中，本发明提供了一种制备(“生产”，其中“生产”是措辞)根据本发明的(农用化学品)组合物的方法，包括将本发明的化合物，尤其是前文限定的式I、II、
III或IV的分子(包括表1的任何子组和化合物)与至少一种常用的农业化学助剂配制在一
起。合适的制备方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于高剪切混合或低剪切混合、湿
研磨或干研磨、滴灌、包覆、乳化、包衣、包壳、造丸(pilling)、挤出造粒、流化床造粒、共挤出、喷雾干燥、喷雾冷却、雾化、加成或缩聚、界面聚合、原位聚合、凝聚、喷雾包覆、冷却熔融分散、溶剂蒸发、相分离、溶剂萃取、溶胶‑凝胶聚合、流化床涂覆、盘式涂覆、熔融、被动或主动吸收或吸附。常规的农业化学助剂在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于水性或
有机溶剂、缓冲剂、酸化剂、表面活性剂、湿润剂、铺展剂、增粘剂、粘着剂、载体、填料、增稠剂、乳化剂、分散剂、螯合剂、抗沉降剂、聚结剂、流变改性剂、消泡剂、光保护剂、防冻剂、杀生物剂、渗透剂、矿物油或植物油、颜料和漂移控制剂或它们任何合适的组合。

[0105] 下面，列出了以下实施例以说明根据所公开主题的方法、组合物和结果。这些实施例并不用于囊括本文公开的主题的所有方面，而是为了说明代表性的方法、组合物和结果。
这些实施例并不用于排除本发明的等同方案和变型，这对本领域技术人员来说是显而易见
的。

[0106] 实施例

[0107] 材料和方法

[0108] 植物材料

[0109] 水稻(Oryza sativa)

[0110] 所有的实验均在粳稻品种Nipponbare、Bomba或Kitaake上进行。实施例3、4、18和19使用Bomba，实施例6使用Kitaake，实施例8和15使用Nipponbare。Kitaake、Bomba和突变
种子得自于Flemish Institute for Agriculture and Fisheries Research(ILVO 
Plant,Melle,Belgium)在UGent温室中生长的温室植物。野生型Nipponbare种子得自于
Dale Bumpers National Rice Research Center(Stuttgart,United States)。

[0111] 使种子在潮湿的组织纸上在黑暗中于30℃下发芽3天，然后转移到容纳有SAP的单独PVC管中(用于线虫感染)(Reversat等人，1999)。SAP(sand‑absorbent polymer，砂吸收
性聚合物)是细硅砂和超吸收性丙烯酸共聚物(DCM AquaPerla,DSM,Grobbendonk,
Belgium)以1kg砂对1.5g干共聚物的比例存在的混合物。

[0112] 使用前，将每个管在肥皂水中清洗，并在烘箱中于70℃下干燥两天。将生长管以完全随机的方式放置在塑料盒中，以最大程度减少环境引起的偏差，并转移到28℃且16小时
光照的生长室。转移后的前两天，在管上覆盖聚乙烯膜(Saran Film,Dow Chemicals,
Midland,USA)，以防止过度蒸发。每周用8ml霍格兰溶液(Hoagland，1938)浇灌幼苗三次。

[0113] Beta vulgaris(甜菜)

[0114] 将甜菜种子(栽培种Jolgeh)于25℃下在蒸馏水饱和的无菌盆栽土壤上萌发五天。将幼苗转移到SAP管中，将其置于24℃的生长室中(每天16小时荧光光照)。转移后的前两
天，在管上覆盖聚乙烯膜(Saran Film，Dow Chemicals，Midland，USA)，以防止过度蒸发。每
周用8ml霍格兰溶液浇灌幼苗三次。

[0115] Triticum aestivum(小麦)

[0116] 对于实施例1、5和10，使用冬小麦栽培种Sahara(Aveve Agrarisch，Landen，Belgium)的种子。在10％乙醇溶液中洗涤种子以除去任何残留的杀真菌剂，并随后在湿纸
上于室温下萌发四天；将种子转移到SAP管中，并置于生长室(25℃，每天16小时光照)。在最
初的十天中，每两天用8ml的半强度霍格兰溶液给植物浇水，之后每两天用8ml的全浓度霍
格兰溶液浇灌植物。

[0117] 对于实施例2，使用春小麦栽培种Fielder。种子得自于在VIB(Zwijnaarde，Belgium)的温室综合设施生长的植物。种子直接播种在盆栽土壤中(每盆四粒种子，出苗后
每盆稀苗至三株)，并置于21℃且每天16小时光照的生长室中。使这些植物生长直到收获；
使用化学品小节中描述的方案，用本发明的化合物以300μM的浓度对它们进行喷雾三次。喷
雾在出苗后的第14天和第21天，以及最后一次抽穗时进行。

[0118] 番茄(Solanum lycopersicum)

[0119] 将番茄种子cv.Moneymaker(Vreeken’s Zaden，Dordrecht，the Netherlands)播种在覆盖有聚乙烯薄膜的高压灭菌盆栽土壤上，并在24℃下放置8天。然后将幼苗转移到各
个装有SAP的花盆中，并置于24℃的生长室中。在最初两周，每周用25ml放入四分之一浓度
的霍格兰溶液浇灌植物三次，然后以半浓度进行浇灌。

[0120] 胡萝卜(Daucus carota)

[0121] 将胡萝卜种子cv.Nantes 2(Vreeken’s Zaden，Dordrecht，the Netherlands)在湿纸上于21℃下萌发7天。萌发后，将幼苗转移到装满盆栽土壤的各个盆中，并置于21℃的
生长室中。

[0122] 线虫培养

[0123] 拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)培养

[0124] 从在25℃的盆栽土壤中生长的受感染的稻田稗草(Echinocloa crus‑galli)根中提取拟禾本科根结线虫(M.graminicola)。对根进行清洗直到已去除大部分土壤，然后将它
们切成短段(要特别注意切开任何在外可见的瘿)。将切下的材料放入200μM孔径的筛中，然
后放入自来水浴中于室温下保持三天。然后将水倒在20μM目的筛上。用约50ml的未脱矿质
水清洗筛面，在渗过筛前，将其收集到烧杯中。

[0125] 在立体显微镜下计数取自线虫悬浮液的五个100μl样品中的线虫数，并取平均以确定接种浓度。然后用微量移液管将所需的线虫数注射到根系周围的SAP中来对每株植物
(按照前一小节概述的方案生长)进行接种。

[0126] 南方根结线虫(Meloidogyne incognitia)培养

[0127] 从在24℃的盆栽土壤中生长的受感染的番茄植物(cv.Moneymaker)根中提取南方根结线虫(M.incognita)。使用上文针对拟禾本科根结线虫(M.graminicola)相同的步骤对
线虫进行收集、计数和接种。

[0128] 甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)培养

[0129] 通过浮选方案从保持在21℃的生长室中的甜菜(cv.Jolgeh)中收集胞囊。将植物的根和它们周围的土壤置于室温下的水浴中，并轻轻搅动，然后倾析并筛分以收集胞囊。将
胞囊干燥两天，并储存直至使用。

[0130] 在25℃下，将胞囊暴露于氯化锌溶液(3mM，在蒸馏水中)中3天，以诱导胞囊孵化。从悬浮液取五个100μl样品。对每个样本中J2幼体的数目进行计数，并取平均值作为结果。
将甜菜植株转移到SAP后14天，用所需体积的悬浮液接种以使每株植株平均接种250个J2线
虫。

[0131] 穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)培养

[0132] 生长在胡萝卜片(carrot disk)上的穿刺短体线虫(P.penetrans)的纯培养物由Giuseppi Lucarelli(Horto Service,Noicattaro,Italy)提供。通过将约100个线虫接种
在一灭菌的胡萝卜片上，将该片放入到密封的培养皿中，并在黑暗中于24℃下孵育该片6
周，以使线虫繁殖。将胡萝卜洗净并去皮，然后浸泡入乙醇中，最后在本生灯(Bunsen 
burner)中燃烧掉乙醇，从而对其进行灭菌。

[0133] 真菌培养

[0134] 所有的真菌分离物均由Ghent University的Kris Audenaert教授无私提供。通过在马铃薯葡萄糖琼脂(Sigma‑Aldrich)板上接种保存在‑80℃冰箱中的20μl甘油孢子原液
来获得接种物。将板在室温下保持在黑暗中，每天暴露于紫外线下八小时。10天后，通过用
含0.01％Tween20表面活性剂的15ml无菌PBS缓冲液浸没平板并轻轻刮去孢子和菌丝体来
收获孢子。通过无菌MiraCloth(VWR)过滤所得悬浮液，并通过在Bürker室(Marienfeld)中
计数来确定每ml的孢子数。然后根据需要对孢子进行稀释或浓缩，以达到所需的接种密度。
通过以4000rpm离心来浓缩孢子，随后除去上清液并进行小体积替换。

[0135] 化学品

[0136] 除非另有说明，否则用于线虫实验的所有化学品都是以叶面喷雾的形式来施用，该叶面喷雾由浓度为300μM的目标化合物和在蒸馏中的0.1％(v/v)的Tween 20表面活性剂
(Calbiochem)组成。再次除非另有说明，否则线虫实验的所有处理均进行三次：病原体接种
前一天和八天以及病原体接种后七天。在所有情况下，均用喷雾器来对植物进行喷雾，直到
滴落为止。

[0137] 大多数C4H抑制剂和LPS获自于Sigma‑Aldrich(Saint Louis，USA)。从3‑(4‑吡啶基)丙烯酸和4‑丙炔氧基苯甲酸获自于Enamine(Kiev，Ukraine)。将所有化合物溶解在二甲
基亚砜(Duchefa Biochemie，Haarlem，the Netherlands)中，以形成100mM的原液，然后将
其用于进行喷雾处理。对照处理包括添加了与处理组浓度相同的Tween 20和二甲基亚砜的
蒸馏水。

[0138] 通过将种子浸泡在含在蒸馏水中的20g/l高粘度羧甲基纤维素(Sigma‑Aldrich，Saint Louis，USA)和300μM目标化合物的包衣溶液中来进行种子包衣。然后将种子在室温
下干燥过夜。

[0139] 线虫感染实验

[0140] 在转移至SAP 14天后，使用微量移液管将所需量的J2幼虫引入至在根系附近来对宿主植物进行接种，以进行拟禾本科根结线虫(M.graminicola)的感染实验。每株水稻植株
(cv.Nipponbare或Kitaake)接种250个J2幼虫；每株小麦植株(cv.Sahara)接种600个J2幼
虫。接种后14天收获植株。这时，通过用尺子测量茎长和根长，计数不定根的数量，并且在一
些实验中通过EasyLeafArea软件(Easlon和Bloom，2014)测量叶面积，并且通过在烘箱中于
70℃下干燥72小时后确定茎的干重，来对植物进行表型分类。然后如(Byrd等人，1983)中所
述的在酸性品红中对根系进行染色，并且置于加入有1ml/l发烟HCl的甘油中脱色约十天。
然后用双目显微镜来对瘿数和线虫数进行计数。

[0141] 除了在接种后31天来代替接种后14天收获植株之外，以与拟禾本科根结线虫(M.graminicola)相同的方式来进行南方根结线虫(M.incognita)的感染实验。在此，通过
用尺子测量根长，并且在一些实验中使用EasyLeafArea软件(Easlon和Bloom，2014)测量叶
面积，并且通过在烘箱中于70℃下干燥72小时后确定茎的干重，来对植物进行表型分类。按
如上所述的方式对瘿进行染色和计数。

[0142] 在转移到SAP中14天后，使用微量移液管250个J2幼虫引入到宿主植物的根系中来对宿主植物进行接种，以进行甜菜异皮线虫(H.schachtii)的感染实验。接种后31天收获植
株。在此，通过用尺子测量根长和茎长来对植物进行表型分类。通过蔗糖浮选方案收集胞
囊，然后计数并通过显微镜评估成熟度。

[0143] 在转移到SAP 14天后，使用微量移液管将500个线虫引入到宿主植物的根系中来对宿主植物进行接种，以进行穿刺短体线虫(P.penetrans)的感染实验。接种后31天收获植
株。在此，对植物进行表型分类。冲洗并展开根系后，用放大镜人工计数病斑。通过以下方式
来计数线虫：用厨用搅拌器浸渍根系，将根系置于30ml高压灭菌的自来水中24小时，最后在
双目显微镜下计数得自于30ml的根悬浮液的四个500μl等份样品中的线虫数。

[0144] 真菌感染实验

[0145] 镰孢菌属(Fusarium)‑洋葱

[0146] 如化学处理小节中所述，洋葱种子用300μM  PA溶液包衣。尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(分离物Foc26)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)(分离物Fso18)和层生镰刀
菌(Fusarium proliferatum)(分离物Fpr18)最初提取自越南洋葱的土地里。根据真菌培养
7
小节中所述，来获得接种物。用无菌PBS缓冲液将接种物稀释至1.0×10 孢子/ml的浓度。然
后将包衣的种子在孢子溶液中浸泡一小时。为了避免过多的PA从PA包衣中浸出，在孢子溶
液中加入100μM的PA。

[0147] 在PA溶液中浸泡后，使种子干燥30分钟。然后以每盆20颗种子的方式播种在盆栽土壤中；每个处理且每种真菌分离物使用三个盆(对于每个处理‑分离物组合共计60颗种
子)。用保鲜膜覆盖这些盆，室温下放在窗台上。8天和10天后，对每盆发芽的幼苗的数量进
行计数。

[0148] 灰霉病菌(Botrytis)‑番茄

[0149] 如植物材料小节所述，使番茄植株(cv.Moneymaker)在盆栽土壤中生长四周。接种前六小时，使每株番茄植株的第三片叶子脱落。用湿纸巾包裹叶柄，将叶子放在培养皿上。
然后将装有叶子的培养皿放在盛有水的塑料托盘中，使叶子不与水接触。最后，用一个塑料
高压袋覆盖托盘，使湿度保持100％。

[0150] 如真菌培养小节中所述来获得灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(R16系)孢子，以6
3000rpm离心5分钟，并用0.01M葡萄糖和0.0067M KH2PO4溶液重悬至1.0×10 孢子/ml的浓
度。将孢子悬浮液于室温下放置1小时以触发萌发。在此，在孢子溶液中加入10μM的PA或等
量的DMSO(作为对照)，以模拟在所有其他实验中接种后施用的最终叶面喷雾。

[0151] 将6滴分别为5μl的孢子悬浮液滴加至每片脱落的番茄叶，然后再次覆盖托盘。将托盘置于室温下，避免阳光直射，放置四天。此时，进行叶绿素荧光测量以评估感染的成功
率。评估了以下两个参数：灰葡萄孢菌(B.cinerea)病斑是否已经扩散到滴液区域之外(侵
袭成功)和成功建立的病斑的总表面积(侵袭后生长)。

[0152] 线虫毒性测定

[0153] 从稻田稗草(Echinocloa cruss‑galli)的根和甜菜的根中分别分离出拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)和甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)的J2幼
虫。根据处理和物种的组合，分离出300个线虫，并将其分在含有1.5ml灭菌自来水、100μM 
C4H抑制剂溶液或0.02v/v％杀线虫剂阿维菌素( Syngenta AG)溶液的6个孔中。
在缓慢移动的旋转摇动器(50rpm)上于黑暗中孵育线虫，并且用双目显微镜定期计数活线
虫的数量。

[0154] 真菌毒性测定

[0155] 将5微升孢子溶液(真菌孢子在30％甘油和70％水的混合物中，在‑80℃下储存)点样在含有25ml马铃薯葡萄糖琼脂的培养皿中间，该培养皿含有300μM PA或对照溶液。每个
真菌物种使用10个板(5个PA和5个对照)。每个板都标记有穿过板中心的x轴和y轴。

[0156] 在室温下孵育该板。点样后24小时开始，每天测量沿x轴和y轴的生长并使用椭圆面积公式(A＝πab)来计算菌落表面积。还对该板进行异常表型(如空气菌丝体或早期孢子
形成)的目视检查。

[0157] 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)感染实验

[0158] 根据植物材料小节所述，使番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)植株在盆栽土壤中生长直到第四叶期。根据化学小节所述，用哌呢酸或对照喷雾处理植株。接种前
二十四小时，将番茄植株置于密封的罩中，使湿度保持100％。

[0159] 将保存在‑80℃下的丁香假单胞菌(P.syringae)pv.DC3000的甘油原液点样在含有用75μg/ml利福平(rifampicine)(Duchefa Biochemie，Haarlem，the Netherlands)改性
的金氏B琼脂(King’s B agar)的培养皿上。将板于28℃下在黑暗中孵育一周。此时，用板上
的细胞接种含有5ml液体金氏B(不含利福平)的玻璃试管，并在28℃下于200rpm的轨道摇床
上放置24小时。将100μl这种液体接种物转移至每支含有5ml液体金氏B(不含利福平)的新
鲜玻璃试管中，在28℃下于200rpm的轨道摇床上放置24小时。

[0160] 此时，用新鲜的金氏B培养基(King's B medium)将液体培养物稀释至OD值为1.0。然后将该培养基以3000rpm离心10分钟；弃去上清液，将细胞重悬于10mM MgSO4中使OD为
0.2。向该接种物中加入0.01v/v％Silwet 77表面活性剂。

[0161] 将整株番茄植株短暂浸入装有上述接种物的烧杯中进行接种。浸入后，将植株放回密封的罩中12小时。这时，移开覆盖物，使植物暴露在生长室的正常湿度水平下。

[0162] 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)毒性实验

[0163] 将保存在‑80℃下的P.syringae pv.DC3000的甘油原液点样在含有用75μg/ml利福平(rifampicine)(Duchefa Biochemie，Haarlem，the Netherlands)改性的金氏B琼脂
(King’s B agar)的培养皿上。将板于28℃下在黑暗中孵育一周。此时，用板上的细胞接种
含有5ml液体金氏B(不含利福平)的玻璃试管，并在28℃于200rpm的轨道摇床上放置24小
时。将100μl这种液体接种物转移至每支含有5ml经100μM的PA或相应的对照品改性的液体
金氏B(不含利福平)的新鲜玻璃试管中，在28℃下于200rpm的轨道摇床上放置24小时。此
时，用液体金氏B培养基将细胞稀释十倍，用分光光度计(BioRad SmartSpec Plus)测定所
得悬浮液的OD600，其中用无菌King's B作为空白。

[0164] qRT‑PCR(定量逆转录酶PCR)

[0165] 在发芽后13天收获cultivar Bomba的水稻植株。植物在浸泡在普通自来水或100μM MDCA或PA溶液中的纸上萌发。转移到SAP后，每两天用MDCA、PA或模拟处理物对植物进行
喷雾。每个处理组包括九株植株，分成三组，每组三株，以用于提取RNA。由于实际条件限制，
未对根和茎进行分析，因此仅使用根组织。

[0166] 在使用前将样品冷冻在液氮中，使用时用RNAse抑制剂处理的冷冻杵臼中研磨。将磨碎的根组织悬浮在提取缓冲液中并超声处理3次，每次15秒，然后用Qiagen RNeasy 
Plant Mini试剂盒(Qiagen，Venlo，the Netherlands)提取RNA。使用NanoDrop 2000分光光
度计(ThermoFisher Scientific，Waltham，USA)测量RNA纯度和质量(quality)；如果质量
不够，则重复提取步骤。

[0167] 将1微克的总RNA与DNAse I(ThermoFisher Scientific,Waltham,USA)一起孵育。用Bioline Tetro cDNA合成试剂盒(Meridian Life Sciences,Cincinnati,USA)产生总
cDNA。通过用OsEIF5C参比基因的引物进行PCR反应来测试cDNA的质量。

[0168] 在对质量进行控制后，进行qPCR。包括两个参比基因(OsEXP和OsEXPNarsai)；每个样品被分成两个技术性样本。每个基因也包括一个阴性对照。qPCR引物从ThermoFisher 
Scientific订购；Bioline SensiMix SYBR既可用作PCR主混合物，也可用作荧光染料。在
BioRad CFX连接系统上进行qPCR反应；通过熔融曲线分析进行质量控制。

[0169] 统计分析

[0170] 除了qPCR结果外，所有的统计分析都在Microsoft Open R(v.3.5.0)中进行，其中，qPCR结果使用在Rest 2009软件(Pfaffl,Horgan and Dempfle,2002)中实施置换检验
来进行分析。所有分析均在α＝0.05显著性水平下进行。使用ggplot2软件包(Wickham，
2009)创建统计图形。

[0171] 使用非参数方法对短期植物毒性实验(实施例1)进行分析。对于每个变量，使用克鲁斯卡尔‑沃利斯(Kruskal‑Wallis)检验确定总体显著性(Kruskal and Wallis,1952)，如
果克鲁斯卡尔‑沃利斯检验具有显著性，则随后进行事后康弗‑伊曼(posthoc Conover‑
Iman)检验(Conover and Iman，1981)和Hommel多重性校正(Hommel，1988)。当只存在两个
组时，使用威尔科森‑曼‑惠特尼(Wilcoxon‑Mann‑Whitney)检验(Mann and Whitney，
1947)。

[0172] 使用广义线性模型对感染实验以及实施例2中的长期产量实验进行分析(对于连续数据和比率，例如每个不定根的根长或瘿数，采用正态分布；对于计数数据，例如瘿数，采
用过度离散的准泊松模型；以及对于二元数据，例如病斑扩散或线虫存活率，采用二项式模
型)。在所有情况下，都使用诊断图(残差图、QQ图、比例‑位置图和残差‑杠杆图)对模型假设
进行验证。仅在统计意义上且在生物学上有剔除的理由(例如植物发育迟缓或出现二次感
染)时，才将异常值剔除。根据上述诊断图，对于偏离参数法要求的变量，采用上段所述的非
参数法。

[0173] 除了线性模型外，还采用事后检验获得配对比较。对于全对对照(all‑vs‑control)分析采用邓尼特检验(Dunnett's test)(Dunnett，1955)，对于全对全(all‑vs‑
all)比较中，使用图基检验(Tukey's test)(Bretz，Hothorn and Westfall，2011)。BBCH发
展期采用克鲁斯卡尔‑沃利斯(Kruskal‑Wallis)检验和康弗‑伊曼事后(Conover‑Iman 
posthoc)检验通过Hommel多重性校正进行非参数分析。

[0174] 实验过程中构建的生长曲线是通过R nlme包(Pinheiro等人，2017)中实施的线性混合模型生成的。使用三个诊断图来验证模型假设：QQ图、学生化残差图和杠杆图。为了说
明时间点之间的自相关，基于AIC准则检验并选择了不同的相关结构。考虑了两种类型的模
型：多项式样条或三次回归样条(通过基数为R的bs函数)。对于样条回归，通过AIC确定最佳
节点数。最终模型始终使用REML进行拟合，但按照建议(Zuur等人，2009)，在基于AIC的初始
模型选择使用ML。

[0175] 通过拟合R drc软件包中实现的三参数对数逻辑模型对萌发实验进行分析。

[0176] 使用Pfafl方法和REST 2009软件中实施的具有统计学意义的置换检验对实施例5中的qPCR数据进行分析(Pfaffl,Horgan and Dempfle，2002)。

[0177] 实施例1：抑制C4H对未感染作物生长和发育的影响

[0178] 为了测试C4H抑制剂是否在作物中产生植物毒性作用，通过叶面喷施向未感染的番茄、小麦和胡萝卜施用浓度为500μM的哌呢酸(PA)、4‑碘苯甲酸(4‑IBA)和胡椒酸(PIA)。
收获时，记录叶面积(或小麦的茎长)和初生根长。BBCH发育阶段(Lancashire等人，1991)是
一种发育迟缓的测量方法，用于测量对发育的影响。最后，记录可见的植物毒性迹象，如萎
黄、变色或坏死。

[0179] 与对照处理相比，没有任何的受试化合物对任一受试作物的生长或发育造成任何影响。数据汇总在表2、表3和表4中。

[0180] 表2：用500μM PA、4‑IBA或PIA叶面喷施处理后，胡萝卜和番茄的平均叶面积与标准差，以及BBCH发育阶段的中位数与四分位数的范围。样本量：每次处理8株植株。

[0181]

[0182] 表3：用500μM PA、4‑IBA或PIA叶面喷施处理后，小麦的平均芽长与标准差，以及BBCH发育阶段的中位数与四分位数的范围。样本量：每次处理8株植株。

[0183]

[0184] 表4：用500μM PA、4‑IBA或PIA叶面喷施处理后，小麦和番茄的平均根系长度与标准差。样本量：每次处理8株植株。

[0185]

[0186]

[0187] 这些结果表明，这些化合物在生物相关浓度下被植物很好地耐受，并且不会对植物生长造成不利影响。

[0188] 实施例2：C4H抑制剂对小麦的产量和育性没有影响

[0189] 为了确定C4H抑制对产量和育性的影响，将春小麦(Triticum aestivum cv.Fielder)在无病原体的生长室中生长直至成熟，并定期用对照或含C4H抑制剂进行叶面
喷施处理。在收获时，测量每株植物的穗数、种子质量、种子大小和新收获的种子的萌发能
力。使用种子的堆积密度作为替代量度来测量种子大小；如果给定的种子质量占据较大的
体积，那么单个种子一定是较大的。

[0190] 虽然没有明确测量，但三种处理中的任一种在抽穗期或开花期均没有明显差异。类似地，在所有处理中，每株植株的平均穗数是相同的(PA相对对照：p＝0.738；胡椒碱相对
对照：p＝0.208)。

[0191] 对种子大小也没有影响(PA相对对照：p＝0.362；胡椒碱相对对照：p＝0.766)。在PA处理后，总产量(种子质量)没有显著差异(p＝0.08812)，但是胡椒碱使每株植物种子质
量小幅但具有统计学意义(p＝0.00107)的增加。最后，14天后的萌发率在任何处理中均没
有显著差异(PA相对对照：p＝0.1004；胡椒碱相对对照：p＝0.1643)。该实验的结果汇总在
图1和图2中。

[0192] 实施例3：早期苯丙酸类途径和水稻防御

[0193] 测定MDCA和PA对于水稻防御线虫的效果

[0194] 使水稻植株萌发三天，然后转移到SAP并生长十二天。12天后，平均向每株植物中施加240个拟禾本科根结线虫(M.graminicola)J2线虫。感染12天后，收获植物，用酸性品红
对根进行染色以观察瘿和线虫。结果示出在表5和图3中。

[0195] 表5：各种表型性状(芽长、根长、不定根数、每个根系的瘿数、每个不定根的瘿数、J2幼虫数、J3/J4幼虫数、带卵和不带卵的成年雌虫数、线虫总数、空瘿数和小瘿数占总瘿数
的比例)的中位数和四分位范围。当多类检验不显著时，不提供事后p值。缩写：AR＝不定根，
J2＝第二期幼虫，J3/J4＝第三期/第四期幼虫。

[0196]

[0197]

[0198] 感染前，经MDCA和PA处理的植物似乎具有比对照组短的芽。然而，在线虫接种后，MDCA和PA赶上了对照组，并且其长度在实验结束时与对照组没有显著差异。

[0199] 经MDCA/PA处理的组显示出防御增强的证据。首先也是最重要的，无论是基于绝对数量上还是基于每个根，瘿的计数都显著减少了。此外，两组都有被坏死组织偶尔围绕的空
瘿。在根的内部，也有坏死的斑块，看起来像是迁移过程中死亡的线虫。而这种明显的超敏
响应在对照中未观察到。

[0200] 然而，在任意的处理组中，较低的瘿数似乎并不妨碍线虫的发育。经过处理的植物和对照组之间的线虫总数和达到成熟期的线虫比例没有显著差异。尽管经MDCA/PA处理的
植株含有更少且更小的瘿，但平均而言，每个瘿中的线虫数比照组中的多。

[0201] 尽管线虫的数量相似，但MDCA和PA确实能减少线虫的危害。虽然MDCA和PA减小未感染植物的茎的大小时，但在线虫感染下，用这些化合物处理的植株似乎赶上了对照组。

[0202] 实施例4：水稻中的第二感染实验

[0203] 第二实验在方法上与第一实验相似。这次，在使植物生长15天后，平均接种210种线虫，然后在接种后13天收获。

[0204] 在此前的实验中，注意到MDCA和PA处理的植物在感染前较小，但在感染后赶上了。在该实验中，使用生长曲线来更正式地验证这一假设。

[0205] 在转移到SAP后十天开始，每天评估植株高度和BBCH发育阶段，并使用非参数三次回归样条构建生长曲线(Poirier，1973)。发现最佳模型有四个结点，并显示了三个不同的
区域(图4)。在第一区域，大致相当于测量开始后的前140小时，经MDCA/PA处理的植物略小，
但在统计学上显著地更小(分别为p＝0.011和p＝0.003)。在第二区域，没有治疗组显著高
于其他组(PA：p＝0.891；MDCA：p＝0.237)。在最后一区域，相当于最后的140小时，经MDCA/
PA处理的组显著高于对照组(PA：p＝0.043；MDCA：p＝0.039)。

[0206] 各组间的BBCH量级始终没有任何显著差异，因此表明在线虫感染条件下，MDCA和PA会积极影响水稻植株的生长，但对其发育没有影响。在感染后13天收获后，测量与在先实
验中评估的表型相同的参数(见表6和图5)。

[0207] 表6：各种表型性状的中位值和四分位数的范围。CWR(细胞壁残余物)是细胞壁质量与总干重的比率(单位为％)

[0208]

[0209] 如生长曲线所表明的，受感染的MDCA或PA处理的植株的茎比受感染的对照处理的植株高的多。有趣的是，根系表现出较低的差异性：在不同处理之间不定根的长度和数量都
没有差异。根长也与茎长无关(斯皮尔曼相关系数＝0.06)。

[0210] 各组间茎的干重没有显著差异，尽管经PA和MDCA处理的感染组表现出比对照处理的感染组更高的干重。这种测量存在很大的技术误差，因此用小样本量很难获得显著的差
异。任一处理组间的细胞壁质量占总茎干重的百分比也没有显著差异。

[0211] 在MDCA/PA处理的植物中，每个不定根的瘿的绝对数量和瘿数都显著减少。与未处理的对照组相比，经PA处理的组中，瘿的中位数降低了36％，经MDCA/PA处理的组中，瘿的中
位数降低了28％。经MDCA/PA处理的植物中，寄生线虫总数明显减少，但每个瘿中线虫的中
位数不受影响。

[0212] 比较每个发育阶段的线虫数量是困难的，因为结果是混合的，并且技术误差相对较大。然而，MDCA/PA降低的幼虫数似乎远远多于成虫数。根据在前的实验，表明这些化合物
抑制侵袭和瘿形成，而不是抑制发育。

[0213] 最后，在MDCA/PA处理后，空瘿的百分比明显更高。对照组没有空瘿。相比之下，在经MDCA/PA处理的植物中，约十分之一的瘿是空的。为了证实可疑空的瘿确实是空的，用解
剖刀将其切开。这些空瘿与坏死密切相关。约75％的经MDCA/PA处理的植株中出现坏死，而
对照植株则没有出现坏死。不同植株之间以及各个根之间坏死的程度差异很大。其一般在
空瘿或非常小的瘿附近最为广泛，但在远离瘿的地方以离散的斑点出现。这些斑点中有几
个似乎围绕着已经死亡的入侵J2线虫，但在没有可见线虫存在的区域也出现了坏死斑点。

[0214] 实施例5：小麦中抑制CH4抵抗根结线虫

[0215] 在本实验中，在单子叶作物小麦(Triticum aestivum,cv.Sahara)通过叶面喷施来测试化合物PA、MDCA和4‑IBA对拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)的抵抗。
本实验还包括细菌化合物LPS(lipopolysaccharide，脂多糖)，一种植物免疫系统的有效诱
导剂和已知的引发剂(Desaki等人，2006)作为阳性对照。

[0216] 实验结果汇总在表7和图6中。PA、MDCA、4‑IBA和LPS都使得瘿数减少，尽管对于LPS来说这种减少在绝对数量上还是在对根数的归一化上都没有统计学意义。

[0217] 表7：用C4H抑制剂哌呢酸(PA)、3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)、4‑碘苯甲酸(4‑IBA)、诱导子脂多糖(LPS)或对照处理中处理的植物中各种表型性状的汇总。“AR”表示“不
定根”。

[0218]

[0219] 与前述在水稻进行的实验一致，小麦实验再次显示，用C4H抑制剂处理后，瘿数显著减少(对于PA，‑33％，对于MDCA，‑35％，对于4‑IBA，‑27％)。再一次地，没有对小麦的生长或发育产生不利的影响。该实验证明了C4H抑制剂在小麦中的适用性，并再次证明了当通过
叶面喷施时，所有这三种化合物均对线虫都有效。

[0220] 实施例6：测定额外的C4H抑制剂在水稻(Oryza sativa cv.Kitaake)中对拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)的抵抗

[0221] 在该实施例中，证实了叶面喷施C4H抑制剂能够控制水稻(cv.Kitaake)中根结线虫的拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)。使用了四种不同的C4H抑制剂：哌呢
酸(PA)、胡椒碱(PIP)、4‑丙炔氧基苯甲酸(4PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)。

[0222] 与对照组相比，所有测试化合物使得瘿数显著减少(PA：‑40％，p<0.0001；4PB：‑44％，p<0.0001；3PA：‑47％，p<0.0001；PIP：‑33％，p＝0.00013)。测试化合物均未表现出任何植物毒性：在发育、茎的质量或或根系大小方面，各处理之间没有显著差异。任意处理组
中也没有出现萎黄或其他不良反应的迹象。实验结果汇总在图7中。

[0223] 实施例7：C4H抑制剂降低番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)中南方根结线虫(Meloidogyne incognita)病害的压力

[0224] 本实验中，证实了叶面喷施C4H抑制剂哌呢酸(PA)能够控制番茄(Solanum lycopersicumcv.Moneymaker)中的根结线虫—南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。
此外，通过施用三种浓度的PA(100μM、400μM和700μM)来研究可能的剂量响应效应。

[0225] 实验结果汇总在图8和表8中。PA在所有浓度下都能使每个根系的瘿数显著减少；浓度之间没有显著差异。与水稻和小麦一样，没有观察到对番茄植株生长或发育的不利影
响。

[0226] 表8：根据图基事后检验(Tukey's post‑hoc test)，用p值对处理的每个根系的平均瘿数进行成对比较。

[0227]

[0228] 实施例8：测定针对C4H抑制剂的不同施用方案

[0229] 在水稻‑拟禾本科根结线虫相互作用(rice‑Meloidogyne graminicola interaction)上对PA的四种施用方案进行比较：种子包衣处理、感染前单次高剂量叶面喷
施、感染后单次高剂量叶面喷施和整个生长期内重复低剂量叶面喷施。所有四种处理都表
现出了相当程度的保护作用。这证明了在不同的农业生产系统中使用C4H抑制剂的实用性。

[0230] 将一百粒水稻(cv.Nipponbare)种子随机分为五组，每组20粒种子：对照组，用含300μM PA的羧甲基纤维素包衣的种子(PA包衣)，每周进行三次叶面喷施100μM PA溶液的组
(PA连续)，在线虫接种前一天喷施300μM PA溶液一次的组(PA‑1dpi)，以及在线虫接种后七
天喷施300μM PA溶液一次的组(PA+7dpi)。

[0231] 该实验根据材料与方法部分中Oryza sativa(水稻)和拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)培养小节中描述的方式进行。

[0232] 实验结果汇总在表9和图9中。就绝对值方面和基于每个根的归一化而言，所有四种处理都减少了平均瘿数，尽管由于所使用的样本量相当小(对照：n＝8；PA连续：n＝9；PA‑
1dpi：n＝8；PA+7dpi：n＝8；PA包衣：n＝7)，这种差异不总是具有统计学意义。虽然所有组中
都有10株幼苗被转移到生长管中，但所有组在转移到SAP后不久出现了一些死亡。为了确保
有代表性的结果，决定在实验开始后不更换这些幼苗。

[0233] 所有的处理都减少了瘿数，其中瘿数是病害严重程度的良好替代。此外，所有的处理都使更高比例的瘿被归类为“小”(而不是“中等”或“大”)。没有任何处理对植物发育有任
何影响(如BBCH评分所证明)，也没有对茎生长有任何影响(如茎长所证明)。

[0234] 表9：表型性状汇总。“AR”代表“不定根”。处理：“PA连续”是指每周用100μM PA溶液喷施三次的植株，“PA‑1dpi”是指在接种前一天用300μM PA溶液喷施一次的植株。“PA+7dpi”是接种后7天用300μM PA溶液喷施一次的植株。“PA包衣”是指用含300μM·PA的羧甲
基纤维素溶液包衣的种子。“小瘿的比例”是指通过与一系列参考点进行比较，被归类为
“小”瘿的比例。

[0235]

[0236] 根据之前的结果，所有的处理似乎对瘿的数量和大小都有有益的影响。尤其令人惊讶的是，接种后7天的处理仍然有效。这种处理效果极大地促进了这些化合物在实践中的
使用，因为线虫问题有时在感染发生后很久才被诊断出来。

[0237] 在PA包衣的种子中观察到较高的死亡率(10个中有4个，而对照组中10个中有2个)，但是采用Yates校正(Yates'correction)的卡方检验，该差异无统计学意义(p＝
0.626)。在其它作物上进行的重复实验证实，在PA种子包衣后没有增加死亡率(数据未示
出)。

[0238] 实施例9：PA降低甜菜抵抗胞囊线虫的病害压力

[0239] 为了测试本发明的化合物对其它线虫和其它植物物种是否有效，测试PA在双子叶作物甜菜(Beta vulgaris)和胞囊线虫甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)之间的相互
作用。此时，尚不清楚双子叶植物是否能像单子叶植物一样耐受PA，因此使用了低得多的剂
量(10μM)。

[0240] 实验结果汇总在表10和图10中。PA处理使甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)的数量减少了20％，这在统计学上无意义。然而，成熟胞囊的数量减少(‑52％)，这在统计学
上很有意义，表明了对线虫的发育和繁殖产生了强烈的抑制。PA处理后，根长显著增加，而
茎长度不受影响。

[0241] 表10：经哌呢酸(PA)处理和经模拟处理(对照)的甜菜植株感染甜菜异皮线虫(H.schachtii)的五个性状的比较，示出了平均值和标准差

[0242]

[0243] 即使以非常低(10μM)剂量单次施用，PA也能显著抑制甜菜胞囊线虫甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)的发育和繁殖。该实验证实了本发明的化合物不仅能控制单子叶
植物中的根结线虫，而且能增强双子叶植物对胞囊线虫的防御。

[0244] 有趣的是，观察到根长在统计学上显著增加。考虑到甜菜将大部分可利用的能量用于初生根的发育，其中初生根起着储存器官的作用，这种增加表明PA处理显著减少了由
线虫感染引起的能量消耗。

[0245] 实施例10：C4H抑制剂降低小麦(Triticum aestivum cv.Sahara)的穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)病害压力。

[0246] 在本实验中，证实了叶面喷施哌呢酸(PA)能够在小麦(Triticum aestivum cv.Sahara)中控制迁移性线虫穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)。

[0247] 实验结果汇总在表11和图11中。PA处理减少了在根系中存在的穿刺短体线虫(P.penetrans nematodes)的平均数量(‑32％，p＝0.0246)，以及在宿主植株中根病斑的平
均数量(‑39％，p＝0.0072)。

[0248] 表11：经哌呢酸(PA)处理和经模拟处理(对照)的感染有穿刺短体线虫(P.penetrans)的小麦植株的五个性状的比较，示出了平均值和标准差

[0249]

[0250] 总之，实施例3至实施例10证实了，本发明的化合物使用不同的施用方案，能够控制广泛的作物的主要植物寄生线虫群体(根结线虫、胞囊线虫和迁移性线虫)。

[0251] 实施例11：C4H抑制剂对线虫毒性的体外试验

[0252] 为了明确排除本发明的化合物通过对线虫的直接毒性而发挥作用，对线虫拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)和甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)的J2幼
虫进行了体外毒性试验。

[0253] 首先，比较暴露于C4H抑制剂哌呢酸(PA)、阴性对照(自来水)和阳性对照，即商业杀线虫剂Vertimec(0.02％阿维菌素)中的存活率。图12a(M.graminicola)和图12b
(H.schachtii)示出了详细的存活曲线。对于拟禾本科根结线虫(Meloidogyne 
graminicola)来说，对照组和Vertimec组之间的存活率存在显著差异(p<2e‑16)，而对照组
和PA组之间的存活率没有显著差异(p＝0.1340)。对甜菜异皮线虫(Heterodera 
schachtii)来说，对照组和Vertimec组的差异再次达到显著水平(p<0.0001)，而对照组和
PA组的差异不显著(p＝0.3310)。

[0254] 对于拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)来说，暴露24小时后，对照组的存活率为(94.2±2.4)％，PA处理组的存活率为(97.1±1.8)％，而用Vertimec处理的组
的存活率为(3.7±3.5)％。对于甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)来说，存活率分别
为(83.1±7.6)％、(92.8±2.5)％和(4.4±7.8)％。

[0255] 这些数据确凿地表明化合物PA不具有杀线虫作用，从而支持了这样的理论，即该化合物刺激植物的免疫系统而不是对线虫的毒性来增强了C4H抑制剂针对线虫的保护性作
用。

[0256] 在第二个实验中，以同样的方式对更大范围的C4H抑制剂进行了试验。将哌呢酸(PA)、胡椒碱(PIP)、4‑丙炔氧基苯甲酸(4PB)和3‑(4‑吡啶基)丙烯酸(3PA)对拟禾本科根结
线虫(Meloidogyne graminicola)的J2幼虫的毒性与阴性对照(自来水)和现有杀线虫剂
(Vertimec，活性成分阿维菌素)进行了比较。该试验的结果如图13所示。

[0257] 实验结束时，暴露于Vertimec产生0％的存活率，与作为对照组的水产生的93％存活率存在显著差异(p<0.0001)。相比之下，暴露于C4H抑制剂后的存活率与阴性对照组相同
(PA：95％，p＝0.9867；3PA：93％，p＝0.9999；4PB：91％，p＝0.7661；IBA：89％，p＝0.3519；
PIP：p＝91％，p＝0.8108)。

[0258] 实施例12：C4H抑制剂降低洋葱(Allium cepa)幼苗中镰孢菌(Fusarium spp.)的病害压力

[0259] 在本实验中，证实了含哌呢酸(PA)的种衣剂对洋葱幼苗中的土传真菌病原体尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(分离物Foc26)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)(分离物
Fso18)和层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)(分离物Fpr18)的控制能力。

[0260] 实验结果汇总在图14中。PA包衣可以改善在被这三种测试分离物改性的土壤中的出苗率(Fso18：+27％，p＝0.0086；Foc26：+42％，p＝0.0021；Fpr18：+79％，p<0.0001)。这证实了，在镰孢菌属(Fusarium spp.)侵染的土壤中，PA种子包衣能提高幼苗的出苗率。

[0261] 实施例13：C4H抑制剂降低番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)中灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的病害压力。

[0262] 在该实验中，证实了叶面喷施含哌呢酸(PA)能够在番茄中控制叶面真菌病原体灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(分离物R16)。

[0263] 实验结果汇总在图15中。用哌呢酸处理减少了真菌病斑发展的接种点的数量(‑50％，p＝0.0006)，并且减少了成功建立/扩散病斑的平均大小(‑62％，p＝0.0073)。这些数
据表明，PA处理抑制了由葡萄孢菌(Botrytis)感染引起的病斑的建立和扩展。

[0264] 实施例14：C4H抑制剂对真菌毒性的体外测定

[0265] 为了支持C4H抑制剂的病害控制作用是由于这些分子对植物免疫系统的作用而不是直接的杀真菌作用这一假设，研究哌呢酸(PA)对四种真菌分离物中的毒性：番茄早疫病
菌(Alternaria solani)、灰葡萄孢菌R16(Botrytis cinerea R16)、禾谷镰孢菌PH1
(Fusarium graminearum PH1)和禾谷镰孢菌GFP(Fusarium graminearum GFP)。实验结果
汇总在图16中。

[0266] 真菌孢子接种在含有浓度为300μM的琼脂上8天后正常发芽，但与在对照琼脂上生长的真菌孢子相比，表现出轻微的(物种特异性)生长迟缓。尽管在某些分离物中，这种影响
具有统计学意义(番茄早疫病菌(A.solani)：p<0.0001；灰葡萄孢菌(B.cinerea)：p＝
0.7740；禾谷镰孢菌PH1(F.graminearum PH1)：p<0.0001；禾谷镰孢菌GFP(F.graminearum 
GFP)：p<0.0001)，但这些数据表明，当用作叶面喷施时，PA的杀真菌作用不够显著。毕竟，考
虑到植物中PA的快速截存(Steenackers等人，2016)，经PA处理的植物中的真菌不会长时间
暴露于PA。

[0267] 实施例15：测试4‑碘苯甲酸类似物的C4H抑制剂活性

[0268] 在酵母异源表达测定中来测试C4H抑制剂4‑碘苯甲酸(IBA)的其它结构类似物抑制C4H酶的能力。除了4‑丙炔氧基苯甲酸之外，4‑碘苯甲酸的另外一种结构类似物(没有卤
素原子作为4‑取代基)表现出显著的C4H抑制剂活性：4‑三氟甲基苯甲酸(CF3‑BA)。

[0269] 在对拟南芥(Arabidopsis thaliana)(生态型Col‑0)生长的体外测定中进行测试时，生长在CF3‑BA改性的培养基上的幼苗表现出与那些生长在含IBA的培养基上的幼苗相
同的表型：明显更短的不定根、诱导侧生根和不定根、显著的无向重力性(agravitropy)(初
生根远离垂轴弯曲)和减少的莲座化生长。实验结果汇总在表12中。

[0270] 这些数据表明CF3‑BA拟表型化IBA的效果；结合其与IBA在结构上的相似性及其在异源表达测定中的相似效果，可以得出CF3‑BA是C4H抑制剂的结论。

[0271] 表12：暴露于浓度为50μM或100μM的4‑碘代苯甲酸(IBA)或4‑三氟甲基苯甲酸(CF3‑BA)的14天龄A.thaliana生态型Col‑0幼苗的平均莲座面积、初生根长、无向重力比
(初生根尖和基部之间的距离除以总初生根长的比值；重力干扰的替代)和萌发率，其中示
出了标准差。

[0272]

[0273] 实施例16：MDCA/PA对OsWRKY45水稻敲除系中拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)感染的影响

[0274] 为了测试水杨酸(SA)在MDCA/PA防御增强中的潜在作用，检测OsWRKY45中MDCA/PA处理的RNAi‑敲除突变体对线虫感染的响应。OsWRKY蛋白形成了一个水稻转录因子家族，调
节广泛的细胞过程，其中大多数与非生物和生物应激响应有关(Jimmy和Babu，2015)。为了
保持它们在防御中的重要作用，许多OsWRKY基因受植物防御激素茉莉酸和SA的控制(Ryu等
人，2006；Jimmy和Babu，2015)。

[0275] OsWRKY45是SA诱导的防御响应的主要调节因子。该基因中的敲除系可用于检测MDCA/PA的防御增强是否依赖于SA信号传导，因为OsWRKY45(不同于大多数其他防御基因)
被认为仅由SA触发(Ryu等人，2006；通过引用并入本文)。

[0276] 如果OsWRKY45敲除系在MDCA/PA处理后没有表现出防御增强，则这将为SA是MDCA/PA介导的防御增强的诱因提供有力的证据。反之，这将为证明SA不是MDCA/PA相关的防御增
强的主要诱因提供有力的证据。

[0277] 根系的表型参数示出在表13和图18。根据瘿的大小以及是否为空，对其进行计数和分类。还记录根系是否存在坏死。

[0278] 与之前的实验一样，就绝对值方面和每个根来看，MDCA/PA处理均极大地减少了瘿计数。值得注意的是，与未处理的WT植株和未处理的OsWRKY45 RNAi植株相比，MDCA/PA处理
增加了野生型和OsWRKY45敲除系的根数。再者，经MDCA/PA处理的植株表示出空瘿，这在受
感染的未处理的对照植株中并未观察到。

[0279] 无论采用何种处理方式，OsWRKY45敲除系相对于野生型具有更多的瘿。然而，在野生型和OsWRKY45中，瘿计数成比例的减少是相似的，这表明MDCA/PA在两种遗传背景下都同
样有效。这与SA信号传导是MDCA/PA介导的防御增强的主要因素这一假设相矛盾。

[0280] 与对照相比，敲除WRKY45转录因子(并因此抑制水杨酸响应)中，拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)瘿的数量略微增加，尽管不显著(+12％，p＝0.5415)。然而，
C4H抑制剂哌呢酸(PA)和3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)均能显著减少野生型和WRKY45‑
RNAi植株中每个根系的瘿数(WT+PA相对WT+CON：‑42％，p<0.0001；WT+MDCA相对WT+CON：‑
42％，p<0.0001；WRKY45+PA相对WRKY45+CON：‑41％，p＝0.0006；WRKY45+MDCA相对WRKY45+
MDCA：‑23％，p＝0.0420)。这强烈表明，水杨酸的积累不能解释C4H抑制剂诱导的抵抗力。

[0281] 表13：感染有拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)并用对照溶液或MDCA/PA喷雾处理的野生型和WRKY45‑RNAi敲除植株的各种表型性状的中位数和四分位范
围(括号内)。使用图基字母显示来表示显著差异(p≤0.05)。

[0282]

[0283] 实施例17：C4H抑制剂在番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)中对根结线虫的活性与水杨酸无关

[0284] 此前已有报道称，C4H抑制剂哌呢酸(PA)在烟草细胞培养物(Nicotinium tabacum BY2)中诱导防御激素水杨酸的积累(Schoch等人，2002)。

[0285] 为了评估该方面，用PA处理分别缺乏水杨酸生物合成和信号传导的番茄品系。番茄品系表达NahG转基因构建体，其将水杨酸转化为无活性的儿茶酚(Brading等人，2000)。
如果该品系仍然对PA有响应，则进一步支撑了水杨酸积累不是C4H抑制剂诱导的线虫抗性
原因这一观点，其中实施例16中已经提供了在水稻中的证据。

[0286] 该实验的结果示出在图19中。根据测量的瘿数，表达NahG的番茄植株比野生型明显更易感南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的影响(+23％，p＝0.0357)。然而，它们
仍然对PA处理有响应：经PA处理的NahG植株比未经处理的野生型植株表现出明显更少的瘿
(‑36％，p＝0.0012)，并且在瘿数方面，与经PA处理的野生型植株没有明显差异(+9％，p＝
0.9499)。这些数据表明，PA的防御诱导活性不依赖于水杨酸的积累。

[0287] 在实施例16中，已经表明C4H抑制哌呢酸(PA)和3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)都能显著减少野生型和WRKY45‑RNAi植株的每个根系的瘿数(WT+PA相对WT+CON：‑42％，p<
0.0001；WT+MDCA相对WT+CON：‑42％，p<0.0001；WRKY45+PA相对WRKY45+CON：‑41％，p＝
0.0006；WRKY45+MDCA相对WRKY45+MDCA：‑23％，p＝0.0420)。实施例16和17的数据清楚地表
明，水杨酸积累不能解释C4H抑制剂诱导的抗性。

[0288] 实施例18：C4H抑制剂在番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)中对根结线虫的活性与茉莉酸无关

[0289] 虽然C4H抑制和防御激素茉莉酸的积累之间没有明显的联系，但此前已经观察到其他防御诱导剂确实引起这种积累，并且茉莉酸酯/盐本身在施用于植物时可以诱导对根
结线虫的一定程度的抗性(Cooper，Jia和Goggin，2005；Nahar等人，2011；Martínez‑Medina
等人，2017)。

[0290] 为确定C4H抑制剂是否依赖于这种激素途径，测试了用茉莉酸生物合成化学抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸酯(DIECA)(Farmer等人，1994)处理的番茄植物是否仍然对PA处
理有响应。

[0291] 该实验的结果示出在图20中。根据测量的瘿数，根据经DIECA处理的番茄植株比野生型明显更易感南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(+26％，p＝0.0357)。然而，它们
仍然对PA处理有强烈的响应：经PA和DIECA处理的番茄植株比未处理的野生型植株表现出
明显更少的瘿(‑31％，p＝0.0014)，并且与经PA处理的野生型植株没有显著差异(+14％，p
＝0.5760)。这些数据表明，PA的防御诱导活性不依赖于茉莉酸的积累。

[0292] 实施例19：MDCA/PA处理后的SA相关基因的qPCR分析

[0293] MDCA/PA‑处理增强了水稻对线虫的防御，并诱发与SA信号传导增强的各种症状(超敏响应、轻度生长迟缓和减轻的病害压力)。然而，实施例16和17证明了SA的积累不可能
是C4H抑制剂诱导的防御增强的唯一或甚至主要原因。为了进一步探讨这一点，进行了qRT‑
PCR实验，以测试MDCA/PA对参与SA体内稳态的六个基因表达的影响：参与苯丙酸类SA生物
合成的四个基因(OsPAL2/4/6和OsC4H)，参与基于异分支酸合成酶的SA生物合成的一个基
因(OsICS1)和一个SA响应性基因(OsWRKY45)。

[0294] 三个OsPAL基因是临时选择的，因为这三个基因是唯一可用的选择性qPCR引物的基因(Tonnessen等人，2014)。在根样本中评估这些基因的表达。

[0295] 在C4H抑制剂处理的植物中观察到OsPAL4的显著上调；这与文献观察结果相关，即OsPAL4的诱导与水稻的防御有关(Tonnessen等，2014)。观察到更明显的OsC4H基因的上调。
这表明C4H基因对C4H抑制的响应有很强的补偿性上调，这可能是C4H抑制剂介导的防御增
强的根源，也解释了为什么C4H抑制剂在健康植物中没有引起显著的表型效应。同时还观察
到的OsPAL4的上调，这些qPCR结果表明，C4H抑制剂触发苯丙酸类途径，这是植物基础免疫
中的一个重要角色。

[0296] 对于其他基因，包括SA敏感的OsWRKY45转录因子，没有观察到明显的上调。这提供了进一步的证据来证明SA积累不是PA/MDCA诱导水稻根部免疫响应的主要原因。

[0297] 结果汇总在表14和图21中。

[0298] 表14：用哌呢酸(PA)或3,4‑亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)处理后，参与SA生物合成和信号传导以及基础防御的6个水稻基因的表达变化。对数倍数变化值通过Pffafl方法获得；
p值使用置换检验来计算。

[0299]

[0300] 实施例20：C4H抑制剂处理后额外防御基因的qPCR分析

[0301] 如前面的实施例所证实的，基因表达分析未发现C4H抑制剂处理过的整个植株中水杨酸显著积累的证据。为了测试是否可能涉及其他防御激素，研究了对茉莉酸(生物合成
基因OsAOS2)和生长素(生长素结合酶OsGH3.1)有响应的基因。此外，还研究了胼胝质降解
酶OsGNS5，其下调与基础防御有关。对前一实施例中使用的相同样品进行qRT‑PCR分析。

[0302] 生长素和茉莉酸响应基因都没有表现出显著的差异性表达。相比之下，OsGNS5基因显著下调——这一结果此前与胼胝体沉积增加相关，并因此增强了基础免疫(Ji等人，
2015)。结果汇总在图21和表15中。

[0303] 表15：用哌呢酸(PA)处理后另外三个水稻基因表达的变化：茉莉酸生物合成基因OsAOS2、生长素响应性基因OsGH3.1和胼胝质降解基因OsGNS5。对数倍数变化值通过Pffafl
方法获得；p值使用置换检验来计算。

[0304]

[0305]

[0306] 实施例21：C4H抑制剂在番茄(Solanum lycopersicum cv.Moneymaker)中减轻丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)DC3000病害压力。

[0307] 在该实验中，证实了含哌呢酸(PA)的叶面喷剂能够在番茄中控制叶面细菌病原体丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(pv.DC3000)。

[0308] 由于细菌接种实验的固有变异性(由于细菌依赖于开放的气孔或伤口进入)，在此该实验重复进行三次。第一种导致相对适度的感染压力，而第二种导致极高的病害压力，导
致许多番茄叶片在短短三天后死亡。

[0309] 由于病害发展的不同，使用两种不同的评分系统。在第一个实验中，接种后三天计数每株植物的病斑数量，七天后使用ImageJ软件量化病斑覆盖的叶面积的百分比。在第二
个实验中，每个完全发育的叶子按0和4之间的病害程度进行评分：0＝没有可见症状；1＝离
散的病斑；2＝大的病斑，覆盖<50％的叶面积；3＝覆盖一半以上叶面积的病斑；4＝叶子不
可逆地枯萎或脱落。然后给每株植株一个总病害指数得分，即每片叶子的单个病害得分的
中位数。

[0310] 第一个实验的结果如图22a和图22b所示。PA处理既减少每株植物的病斑总数(‑25％，p＝0.0011)，也减少了病斑覆盖的叶面积的平均百分比。在图23示出的第二个实验
中，PA处理使平均植物病害指数降低了20％(p＝0.0317)。

[0311] 在接种之前，胡椒基酸对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)DC3000本身的效果还通过在用胡椒基酸或相应的对照物改性的液体培养物上培养细菌并测量OD600(如材
料和方法部分所述)来验证。在100μM的浓度下，在连续暴露24小时后，哌呢酸对细菌生长没
有影响(OD600 0.737相对0.757,p＝0.4857)。

[0312] 在所有实验中，哌呢酸(PA)处理均以统计学上显著的方式减轻了病害压力，尽管其效果程度低于线虫或真菌。PA对丁香假单胞菌(P.syringae)感染的效果不能用PA对细菌
的直接毒性来解释，因为即使长时间暴露于PA也不会导致生长迟缓。综上所述，这些实验证
实了C4H抑制剂针对作物中的细菌性病害提供了保护性作用。

[0313] 实施例22：C4H抑制剂减轻绿豆(Phaseolus vulgaris cv.Prelude)中的腐霉菌(Pythium splendens)病害压力。

[0314] 本实验，证实了含哌呢酸(PA)的种衣剂能够在豆类控制卵菌病原体华丽腐霉(Pythium splendens)。

[0315] 在含华丽腐霉(P.splendens)的土壤中，PA种衣剂不能提高出苗率(见图25a)，但显著改善了出苗后幼苗的健康状况(见图25b)。茎更茁壮，与华丽腐霉(P.splendens)侵染
的土壤中的对照包衣的种子相比，PA包衣的种子在华丽腐霉(P.splendens)侵染的土壤中
的初生根更长(p＝0.043，见图25c)。然而，腐霉(Pythium)的症状在不同处理之间没有明显
的差异。无论是对照包衣的种子还是PA包衣的种子，根系的大部分都变成了淡褐色，这种褐
色的程度没有明显的不同。

[0316] 对萌发没有影响是C4H抑制剂作用机制的合理结果。它们通过刺激植物的免疫响应来发挥作用，而这种免疫响应在极幼小的植物中很少出现。然而，在存活时间足够长到无
法发育的植物中，增强免疫力的效果以增强幼苗活力的形式显现出来。

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