植物病原体抗性基因及其应用

植物病原体抗性基因及其应用

本发明涉及植物的病原体抗性，更具体地说是涉及病原体抗性基因的鉴别和应用。本发明是基于蕃茄Cf-2基因的克隆。

植物经常受到潜在致病微生物的侵害。种植作物特别容易致病，因为它们通常是作为遗传学上均一的单培养物生长的；当受到疾病攻击时，损失很严重，然而大部份植物能抵抗大部份植物病原体。为保卫其自身，植物已进化有预先存在的以及可诱导的防卫阵营。病原体，尤其是那些从紧密相连的活植物细胞得到营养的活体营养性病原体，必定专门化规避宿主的防卫机制。假如病原体可以引起疾病，该相互作用被称为相容的，而如果植物有抵抗力，则该相互作用称为不相容的。种特异性抵抗力与超敏感反应(HR)密切相关，所说的超敏感反应，即为一种诱导的通过在病原体试图进入的位点处使细胞死亡局部化，从而使植物剥离活宿主细胞上的致病体的反应(其为假设的)。

长期以来就已知HR相关的疾病抗性(虽并不是专一的)是由显性基因(R基因)限定的。Flor证明当病原体突变以战胜此种R基因时，这些突变是隐性的。Flor得出结论是，为使R基因发挥功能，病原体中也必需存在相应基因，即所谓的无毒力基因(Avr基因)。为变成有毒力的，病原体必需因此而停止制造激活R基因依赖性防卫机制的产物(Flor，1971)。一项被广泛接纳的工作假说，即通常所谓的激发体/受体模型，是R基因编码能使植物检测出病原体存在的产物，其条件是所述病原体携带相应的Avr基因(Gabriel和Rolfe，1990)。然后此种识别被转导成防御反应的激活作用。

某些相互作用表现出不同的遗传学特性。表达毒素(Hc毒素)的Helminthosporium Carbonum品种感染缺失Hml抗性基因的玉米系。失去Hc毒素表达所需的突变是隐性的，并且与毒力丧失有关、与其中基因-基因之相互作用形成对照，其中为产生毒力所需的突变也是隐性的。1992年报导了借助标记Hml基因进行分离的一项主要的成就(Johal和Briggs，1992)。对于为什么能从毒素依赖性毒力引发出基因与基因相互作用的问题，已作出过似是而非的论证。例如，其产物是毒素靶的植物基因，可发生突变而赋于甚至对毒素更大的敏感性，产生HR，且使敏感性基因转化为抗性基因。然而，这似乎并不是Hml(其基因产物使Hc毒素失活)的作用方式。

人们对无毒力病原体基因仍然了解不多。几种细菌Avr基因编码与其他类型蛋白无同源性的亲水蛋白质，而其他的基因则携带其数量可修改以变化出一系列植物，使之表现出无毒力的重复单元(Keen，1992；Long和Staskawicz，1993)。其他的细菌基因(hrp基因)是诱导HR的细菌Avr基因所要求的，也是致病性所需要的(Keen，1992；Longand  Staskawicz，1993)。尚不清楚为什么病原体能产生供植物检测出它们的产物。普遍认为某些容易丢弃的Avr基因对致病性有作用，但也并不是必需的，而其他Avr基因则有较少的必要性(Keen，1992；Longand Staskawicz，1993)已报导过一种真菌无毒力基因的特征；Cladosporuum fulvum的Avr9基因(它可使那些试图攻击携带Cf-9基因蕃茄变种的C.fulvum无毒力)编码分泌的富胱氨酸肽(该肽的最后处理大小是28个氨基酸)，但其在相容性相互反应中的作用尚不明了(De Wit，1992)。

近年来，主要根据遗传准则进行基因分离的技术得到极大改善，而且许多研究人员目前正试图克隆各种R基因。目标包括(在其他一些作物中)玉米、金鱼草和亚麻的锈病抗性基因(借助转座子标记)；莴苣和南芥菜中的茸毛霉病抗性基因(借助组建图为基础的克隆和T-DNA标记)；蕃茄中的Cladosprium fulvum(cf)抗性基因(借助标记，以基因图谱为基础的克隆，及用无毒力基因产物进行的亲合标记)；蕃茄和烟草中的病毒抗性基因(借助于以基因图谱和标记为基础的克隆)，蕃茄中的线虫抗性基因(借助以图谱为基础的克隆)；以及南芥菜和蕃茄中的抗细菌病原体抗性基因(借助于以基因图谱为基础的克隆)。

已报导了基于蕃茄pto基因(赋予抗细菌斑致病菌丁香假单胞菌pv蕃茄(Pst)基因-基因抗性)克隆的图谱(Martin等人，1993)。YAC(酵母人工染色体)克隆被鉴定为携带与基因非常紧密相连的限制性片段长度多型性(RFLP)标志。该YAC克隆被用于分离同源性cDNA克隆。这些cDNA中的两个与强启动子融合，在转化疾病敏感性蕃茄变种之后，这些基因融合体之一显示可赋于携带相应无毒力基因(AvrPto)的Pst菌株以抗性。这两个cDNA显示彼此同源。实际上，Pto cDNA探针揭示出至少有六个成员的小基因家族，可发现其中五个是在分离出Pto的YAC上，因此该家族确实包括从对其他R基因座位的遗传分析中推导的局部多基因家族类型。

Pto基因cDNA顺序因支持简单的激发体/受体模式而令人迷惑不解。它清楚地揭示与丝氨酸/苏氨酸激酶同源，与信号转导中的作用一致。令人迷惑的是，与芥属中的自身不相容性相关联的激酶有强的同源性，起到类似的作用，即它们是防止基因型上定义的不相容性花粉管的生长所需要的。但与芥属SRK激酶(Stein等人，1991)相反，Pto基因似乎编码与激酶催化区和可以促进与膜结合的潜在N末端肉豆蔻酰基化位点稍大的区域。如果这样的基因产物可以单独作用，只有当AvrPto基因在入侵微生物中被检测出来时，才能完成为激发防御反应所需的特异性识别，那将是令人惊异的。由携带AvrPto的Pst菌株制得的种特异性激发体分子仍然是未知的，并且需要在该分子通过Pto基因产物可能的识别作用可被研究以前鉴定其特征。

因为分离Pto基因，而已分离了很多其他抗性基因。Whitham等人报导了(1994)从烟草中分离出烟草嵌合体抗性基因N。Bent等人(1994)，和Mindrinos等人(1994)报导了对丁香假单胞菌RPS2有抗性的拟南芥属thaliana基因的分离。这些基因可能编码携带P-环和富亮氨酸重复单元的胞质蛋白质。它们与之相互作用的配体尚未鉴定，也不知道它们与什么其它植物蛋白质相互作用来实现防御反应。我们自己的实验室已报导过赋予抗真菌Cladosporium fulvum抗性的蕃茄Cf-9的分离，这是以前专利申请(作为WO 95/18230公开的PCT/GB94/02812)的主题，并且Jones等人也作过报导(1994)。有关Cf-9和Avr9 顺序，以及所编码的多肽顺序在WO95/18320中和Jones等人(1994)的文章中都作过报导。

我们现已克隆了Cf-2基因。

WO93/11241报导了编码与Cf-9，以及我们现已讨论的Cf-2(本发明的主题)有某些同源性的多聚半乳糖醛酸酶抑制剂蛋白(PGIP)。Cf-9、Cf-2及其他的(Cf-4，5等)，由本领域技术人员称为“病原体抗性基因”或“疾病抗性基因”。编码PGIP的基因不是病原体抗性基因。病原体抗性基因(R)能使植物检测出表达相应无毒力基因(Avr)之病原体的存在。如病原体被检出，超敏感反应(HR)等防御反应即被激活。这就意味着可借助使病原体在其试图入侵的位点处局部化细胞死亡这种方式使植物剥脱活细胞的病原体。另一方面，WO93/11241的PGIP基因(例如)是一种在由R基因检测病原体所造成的植物防御反应中被诱导的基因。

因此，病原体抗性基因可被设想为编码病原体衍生的和Avr依赖性分子之受体的基因。以这种方式，它可被比作为检测病原体的植物雷达，而PGIP则参予病原体一旦检测出来，防止使植物固着于病原体上，而不是病原体抗性基因。病原体抗性基因在植物中的表达，造成该植物中防御反应的激活。这可能依赖于植物与病原体或相应的激发体分子的接触，尽管已有报导说在没有激发体的条件下、存在有通过表达抗性基因引起激活的可能性。防御反应可被局部激活，例如在植物与病原体或激发体分子接触的部位，或者可以被系统性激活。在表达病原体抗性基因的植物中激活防御反应，可以由于植物与适当的，相应的激发体分子，例如前面讨论的由Cladosporium fulvum avr基因产生的分子接触而引起。激发体可以包含在Cladosprium fulvum等病原体的提取物中，或可以整个地或部份地提纯，并且可以是整个地或部份地合成的。如果它是能激活防御反应的R基因产物的适当配体，则该激发体分子可以说是“相配的”。

“Cf-x”/“Avrx”这一术语在本领域是标准术语。Cf抗性基因和相应的真菌无毒力基因(Avr)原来按遗传学定义为基因的相互作用对，其可以检测的活性属于彼此共同专有的相互作用对。Avr9可对含Cf-9的蕃茄引发坏死反应，但对含Cf-2的蕃茄则无反应，即由Cf-2识别的部份不同于由Cf-9识别的部份。Cf-2功能在植物中的表达经研究各种C.fulvum种相容性来确定。

携带所有已知Avr基因之功能性拷贝的C.fulvum种(第0种)只在缺失所有Cf基因的蕃茄上生长(相容的)。它不在携带任何功能性Cf基因的植物上生长(不相容的)。如果C.fulvum种缺失功能性Avr2基因(第2种)，它将不仅能在缺失任何Cf基因的植物上生长，而且能在携带Cf-2基因的植物上生长。若同时还缺失功能性Avr4基因的种(第2，4种)也能在携带Cf-4基因的植物上生长。只缺失功能性Avr 4基因的种(第4种)将不能在携带Cf-2的植物上生长。同样，C.fulvum第5种(缺失功能性Avr 5基因)将不能在携带Cf-2基团的植物上生长。第4种和第2，4种都不能在携带任何其它Cf基因的植物上生长。各个种在本技术领域内一般都能获得，例如可从植保研究所(IPO-DLO)，PO Box 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlands获得。第4种可按入藏号IPO 10379获得，而第2，4种可按入藏号IPO50379获得。

我们现已分离出两种几乎相同的蕃茄基因，即Cf-2.1和Cf-2.2，两基因赋予抗真菌Cladosporium fulvum抗性，并已测定了其DNA顺序，而且根据这些基因推导出氨基酸顺序(两种基因几乎相同，本文中关于其中一种的任何说明应考虑为适用于二者，除非上下文有例外的要求)。蕃茄Cf-2.1基因组基因的DNA顺序示于图2(SEQ ID NO1)，而推断的氨基酸顺序(对两种基因而言)则示于图3A和B(SEQID NO.2和NO.3)中。

正如下面更详细介绍的，蕃茄Cf-2基因是由以图谱为基础的克隆进行分离的。该技术中，赋予抗性的基因座，是以相对于连接于抗性基因上的限制性片段长度多型性(RFLP)标记的高分辨率的方式组建图谱。我们鉴定出似乎绝对连接于抗性基因上的标志，并使用相应于该标志的探针从携带Cf-2基因座的原种中分离双载体装配型质粒克隆。两种独立重叠克隆赋于疾病抗性，并且重叠区域含有结构显著相似于Cf-9基因的阅读框架。因为该顺序是重叠两个互补克隆的DNA基本成份，所以我们确信该顺序必定相应于Cf-2基因。装配型质粒之一上的第二个几乎完全相同区也能赋予疾病抗性，故表明存在两个功能性Cf-2基因。

根据本发明的一个方面，本发明提供编码病原体抗性基因的核酸分离物，其特征在于该基因含有示于SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或其片段的编码氨基酸顺序的核酸。该核酸分离物可以含有DNA，并且可含有示于SEQ ID NO.1的顺序，或编码所需多肽的足够部份(例如从起始的蛋氨酸密码子到框架下游终止密码子中的第一个核苷酸)。一个实施方案中，DNA含有SEQ ID NO.1的第1677到5012位的核苷酸顺序，或其突变体、衍生物或其等位基因。本发明的另一方面提供编码病原体抗性基因的核酸分离物，或其片段，由含SEQ ID NO.1的核苷酸1677至5012的探针或其片段、衍生物、突变体或等位基因筛选核酸文库而获得，编码多肽的分离DNA能赋予植物以致病体抗性，例如抗Cladosporium fulvum(例如表达Avr 2)。所述植物可以是蕃茄。适用的技术是本领域已知的。

根据本发明的核酸，可以编码示于SEQ ID NO.2，或例如SEQID NO.3提供的顺序的突变体、衍生物、或等位基因。优选的突变体、衍生物和等位基因保留由野生型基因编码之蛋白质的功能特征者，较好是能赋予病原体抗性能力，尤其是能赋予抗表达Avr 2激发体分子之病原体抗性的能力。通过核酸中一个或多个核苷酸的加入、插入、删除或取代可以改变顺序，产生突变体或衍生物，导致一个或多个氨基酸的加入、插入或取代。当然，也包括不使编码的氨基酸顺序有所差别的核酸改变。

编码示于图3(SEQ ID NO.2和NO.3)中之氨基酸顺序的核酸的优选实例，分别包括示于图2和图4的编码顺序。为编码氨基酸SEQID NO.3(图3b)，DNA可以包含示于图4(SEQ ID NO.5)的核苷酸顺序。

本发明的一个方面还提供含有互补于可与本文提供的任何编码顺序杂交之核苷酸顺序的核苷酸顺序的核酸。从另一角度来看，根据本发明这一方面的核酸应是可与互补于本文提供之任何编码顺序的核苷酸顺序杂交的核酸。当然，DNA一般是双链的，并且印迹技术，例如Southern杂交技术，通常是在没有划清正杂交各链间的区别时，分离各链之后进行的。优选的可杂交核酸或其互补链能编码对宿主赋予病原体抗性(即包括病原体抗性基因)的多肽。杂交反应的优选条件是本领域专业人员熟知的，但这些条件一般足够严格以使所研究的顺序之间有阳性杂交而排除其他顺序。

虽然由Cf-2和Cf-9基因编码的多肽分享高度同源性，但基因本身对于使用2×SSC并于60℃严格条件下的基因组Southern印迹试验来看，两者并没有相互同一的足够同源性。在BLASTN检索中，Cf-2和Cf-9 DNA顺序之间的最高同一性水平是在428碱基区域内为69％。

根据本发明的核酸，例如本文公开的特定顺序的突变体、衍生物和等位基因，可根据下述的一种或多种条件与Cf-9区别开：

-与Cf-9没有足够同源性，不足以在使用2×SSC、60℃严格条件下进行的Southern印迹试验中证明本发明核酸与Cf-9彼此同一；-与示于图2的核苷酸1677-5012的编码顺序的同源性为高于约70％、较好高于约75％、高于约80％、高于约90％、或高于约95％；-当植物与Avr 2激发体分子(例如由表达Avr 2的Cladosporiumfulvum种所提供的)接触时，在表达该核酸的植物中引发防御反应；-当植物与C.fulvum第4种(寄存于并可得自于植保研究所(IPO-DLO)，PO Box 9060，6700 GW Wageningen，The Netherlands入藏号为IPO 10379)，或其提取物相接触后，可在表达该核酸的植物中引发防御反应，但当与C.fulvum第2、4种(寄存于并可得自于植保研究所，入藏号为IPO 50379)，或其提取物接触后，则不会在该植物中引发防御反应；-在植物与Avr 9激发体分子(例如由表达Avr 9(de Wit，1992)的Cladosporium fulvum种或其他生物体提供的，其氨基酸及其嵌合形式的编码核酸顺序，例如在WO95/18230中以SEQ ID NO.3和在WO95/31564中以SEQ ID NO.4给出)接触后，在表达核酸的植物中并不引发防御反应；-含38个富亮氨酸重复序列(LRR′s)。

该核酸分离物(其可含有作为基因组DNA或cDNA的编码SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3之氨基酸顺序的DNA)，可以是重组载体，例如噬菌体或装配型质粒载体形式的。该DNA为在宿主细胞，例如植物细胞中表达，可处于适当启动子或调节元件的控制之下。在使用基因组DNA的情况下，其可含有它自已的启动子和调节元件，如果是cDNA，其可处于在宿主细胞中表达所需的适当启动子和调节元件控制之下。

本领域技术人员能很好地构建载体并设计使重组基因表达的方案。可以选择或构建含有适当调节顺序，包括启动子顺序、终止子片段、多腺苷酸化顺序、增强子顺序、标志基因，以及其它适当顺序的适宜载体。为更详尽了解有关内容，例如可参见Molecular Cloning：a LaboratoryManual：2nd edition，Sambrook et al，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。

根据本发明的核酸分子和载体，可从其天然环境中，以基本上纯的或均一形式，或没有或基本上没有除编码有所需功能之多肽以外的所研究的种属或来源的核酸或基因的形式分离或纯化出。本发明的核酸可包括cDNA、RNA、基因组DNA、并且可以是整个或部份合成的。所谓“分离物”包括所有这些可能性的来源。

当将挑选的基因构建体引入细胞中时，某些因素必需予以考虑，这是本领域技术人员熟知的。被插入的核酸可组装在含有能驱动转录的有效调节元件的构建体之中。这里必需能利用一种将该构建体输送到细胞中的方法。一旦该构建体进入细胞膜内，即根据本发明不同实施方案可以，或者不可以整合到内源性染色体材料中。最后，就植物靶细胞类型而言，必需是可以再生成整株植物的细胞。

可用植物基因操作领域已知的标准技术产生用含有该序列的DNA片段转化的植物。可使用任何适当技术将DNA转化到植物细胞中，例如可利用发挥其天然基因转移能力的土壤杆菌携带的失去毒力的Ti-质粒载体(EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR12(22)8711-87215 1984)、微粒或微弹轰击(US5100792、EP-A444882、EP-A-434616)、微量注射(WO 92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966)、电穿孔(EP290395、WO8706614)或其他形式的DNA直接摄入技术(DE4005152、WO9012096、US4684611)。土壤杆菌转化技术是本领域技术人员广泛用于转化双子叶植物的技术。虽然已有报道土壤杆菌能将外源DNA转化到某些单子叶植物中(WO92/14828)，但微弹轰击、电穿孔和直接DNA摄入优选用于土壤杆菌无效或无能力的情况下。此外，将不同技术结合，也可用于提高转化过程的效率，例如用涂敷土壤杆菌的微颗粒(EP-A-486234)或微弹轰击以诱发伤口，接着再与土壤杆菌共培养(EP-A-486233)。

转化技术的具体选择，将根据转化某些植物种的效率和经验，以及采用具体选定的方法以实施本发明个人的喜好来决定。很明显，对于熟练技术人员来说，对将核酸导入植物细胞之转化系统的具体选择并不重要，或者说不构成对本发明的限制。

可以使用Cf-2基因和其修饰体(其等位基因、突变体和衍生物)、以及本文提供的其他核酸，对植物，特别是蕃茄赋予对抗病原体，例如C.fulvum的抗性。这可包括从具有与Cf-2基因或其任何亚克隆片段有相同染色体定位的蕃茄茴芹属中克隆的DNA。为此目的，可用前述载体产生转基因植物。此种植物可具有由Cf-2基因赋予的抗病原体抗性。

因此，本发明进一步包括由此种载体转化的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。从而，提供含本发明核酸的宿主细胞，例如植物细胞。在这样的细胞中，核酸可被掺入染色体内。

特别是在如果为重组进基因组内而使用该载体将核酸导入细胞的情况下，含本发明核酸的载体不必包含启动子。

本发明还提供将本发明提供的，为控制所编码的多肽表达而处于启动子人工操作地控制之下的核苷酸序列掺入到基因组中的植物细胞。本发明还进一步提供制造此种细胞之方法，所述的方法涉及将含有该核苷酸顺序的载体导入到植物细胞中。此种导入方法可以通过载体和植物细胞基因组之间的重组而将核苷酸顺序导入基因组中来进行。然后由被导入核酸编码的多肽即可得以表达。

还提供含本发明植物细胞的植物，同时包括此种植物的任何部份或克隆、种子、自花授粉的或杂交的后代及派生体，以及如插条、种子等的任何部份。本发明提供任何植物繁殖体、即可用于有性或无性再生或增殖的任何部份，包括插条、种子等。

本发明还提供从编码氨基酸顺序SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的核酸或各顺序的突变体、等位体，或衍生物开始在植物细胞内表达(从而产生所编码多肽)的方法，该方法遵循上面指出的将核酸导入植物细胞或其始祖中的步骤。该方法可以赋于植物以抗病原体抗性。根据WO91/15585所述任何方法(Mogen)，其可以与Avr 2基因相结合的方式使用，或优选PCT/GB95/01075(以WO95/31564公开)所介绍的方式，或者与涉及赋予抗病原体抗性的任何其他基因结合的方式使用。

Cf-2和Cf-9基因以相似的方式发挥作用，即二者均赋于蕃茄以抗性，阻止蕃茄叶霉菌C.fulvum的生长。但是，由于识别不同的Avr产物，它们在停止病原体生长和刺激抗性反应方面，其速度稍有差别(Hammond-Kosack和Jones 1994；Ashfield等人，1994)。这些差别对于本文所公开的最优化应用很有开发价值。稳定掺入到植物基因组的基因，一代一代地传给植物后代，其后代细胞可以表达所编码的多肽，这样可以提高抗病原体抗性。评估病原体(例如Cladosporium fulvum)的相容性，或可使用病原体无毒力基因(例如Avr-2)的重组表达或Avr-2基因产物的释放，来测定病原体抗性。

对Cf-2基因测序表明，像Cf-9基因一样，它包括编码富亮氨酸重复(LRR)区的DNA顺序，并且同源性探索揭示其与含LRRs的其他基因有很强同源性。Cf-2和Cf-9基因包含所有相同的一般性特征，并作为此种形成，可将一类新的抗病基因与目前已验明特征的其他抗病基因分离开来。如WO95/18230所讨论，及本文所证实的，LRRs的存在可能是许多抗病原体基因的特征，并且LRRs的存在可用于鉴定其他抗病原体抗性基因。

再者，Cf-9和Cf-2之间还存在某些明显的同源性。这些同源性也可以用于进一步鉴定这类抗性基因，例如使用根据Cf-9和Cf-2基因之间保守的顺序(优选在氨基酸水平上)所设计的寡核苷酸(例如简并汇集物)进行鉴定。

根据另一方面，本发明提供鉴定植物病原体抗性基因的方法，其包括使用含有病原体抗性基因例如Cf-9和Cf-2之间保守顺序的寡核苷酸以探索新的抗性基因。因此，本发明提供获得含病原体抗性基因之核酸(其编码能赋于病原体抗性的多肽)的方法，该方法包括使寡核苷酸(其细节将在本文中讨论)，或含该寡核苷酸的核酸分子与靶/候选核酸进行杂交。靶或候选核酸，例如可包括从已知编码病原体抗性基因的生物体获得的基因组或cDNA文库。可鉴定成功的杂交，并为进一步研究和/或应用而分离出靶/候选核酸。

杂交可涉及探针核酸，并在适当的严格条件下(按照已知技术)鉴定阳性杂交，和/或在核酸扩增(例如PCR)方法中使用寡核苷酸作为引物。对于探查来说，优选条件应精确到足以使之成为一种简单图形，该图形带有小数目的鉴定为阳性(可对其进一步研究)的杂交带。逐渐提高杂交的严格性，直至仅保留少数几个阳性克隆，这是本领域已知的。

作为另一种探查方法，虽然仍然采用核酸杂交技术，但可使用常规程序设计用于扩增DNA顺序的寡核苷酸以用于PCR反应，或涉及核酸扩增的其它方法中。例如参见“PCR Protocols；A Guide to Methodsand Applications”，Eds Innis et al.，1990，Academic Press，NewYork。

适用于设计探针或PCR引物的优选氨基酸顺序，是在能赋予病原体抗性(例如由Cf-2和Cf-9编码的病原体抗性)的多肽之间保守的顺序(完全的，基本完全的或部份的)。

根据氨基酸顺序信息，可以设计寡核苷酸探针或引物，并考虑到遗传密码子的简并性，以及必要时考虑到由之衍生候选核酸之生物体的密码子用法。优选的核酸顺序可以包括下面这些：包含或带有编码氨基酸(i)SGEIPOO；(ii)YE/OGNDG；(iii)FEGHIPS；或(iv)SGEIPOOLASLTSLE的顺序，或与这些编码顺序互补的顺序。可以采用这些顺序的适当片段。

优选寡核苷酸顺序包括：(i)  TCX-GGX-GAA/G-AAT.C.A-CCX-CAA/G-CA；(ii) TAT/C-G/CAA/G-GGX-AAT/C-GAT/C-GGX-CTX-CG；和(iii)CG-XAG-XCC-A/GTC-A/GTT-XCC-T/CTC/G-A/GTA。

(所有顺序均以5′- 3′端给出；见图6)。顺序(ii)和(iii)互补；(iii)在PCR中用作反向引物。

本发明的优选寡核苷酸中，例如用于核酸扩增的寡核苷酸，有大约10个或更少的密码子(如6、7或8个)，即在长度上约为30个核苷酸或更少(例如18、21或24个)。

可用多种方法估测PCR产物是否与抗性基因相对应。PCR谱带可含有产物的复合混合物。个别产物可以被克隆并可筛选出与已知抗病基因相连系的各克隆、所述抗病基因在显示该探针之多型性的子代中被分离开。此外，PCR产物可以按能使之在变性聚丙烯酰胺DNA测序凝胶上，以特定谱带显示多型性的方式得以处理，所述特定谱带是在克隆之前被预先选定的。一旦候选PCR带被克隆，并显示与已知抗性基因相关联，它即可被用于分离能检验其他特性和与Cf-9、Cf-2或其他相关基因同源性的克隆。随后可通过转化分析之，以估价其在导入所研究的疾病敏感性植物品种后所发挥的功能。或者，也可使用PCR产物或通过分析得到的顺序，协助植物培育者监测有用抗性基因的分离。

这些技术一般可应用于鉴定植物中的抗病原体抗性基因。可用该方法鉴定的基因类型例子包括马铃薯中的疫霉属抗性、大麦和玉米等谷物中的霉病抗性和锈病抗性、莴苣和拟南芥属植物中的茸毛霉菌抗性、马铃薯、蕃茄和烟草中的病毒抗性、蕃茄中的线虫抗性、拟南芥属和蕃茄中的细菌病原体抗性，以及胡椒属植物中的黄单胞菌属抗性等。一旦抗病原体基因被鉴定出来，即可使用本领域技术人员熟知的技术，将其再导入植物细胞中，以产生转基因植物。另一方面，本发明提供编码植物病原体抗性基因蛋白质产物的DNA分离物，所述的病原体抗性基因已根据其中LRRs的存在得以鉴定，特别是可使用上文限定的技术。再一方面，本发明提供转基因植物，尤其是种植植物，可根据被改造为携带有病原体抗性基因的植物，可根据如上介绍的LRRs的存在，或以核酸杂交技术来鉴定所述的抗性基因。适当的植物的例子包括烟草、胡芦科植物、胡萝卜、芸苔属植物、莴苣、草莓、油菜芸苔属植物、甜菜、小麦、大麦、玉米、稻谷、大豆、碗豆、高粱、向日葵、蕃茄、马铃薯、胡椒科、菊属、麝香石竹、杨属植物、桉属及松属树木等。

对以上所述的及其他方面，以及本发明实施方案的修改，对本领域技术人员来说是显而易见的。所有上面提到的文献均列入本文作为参考。

正如已经指出的，本发明是基于蕃茄Cf-2基因的克隆和测序，该实验工作参考下述的附图作更详细的描述。

图1显示由Cf-2/Cf-9装配质粒文库分离出的重叠装配质粒(38，82，89，90，92，94，96和141)产生的蕃茄Cf-2基因座位的物理图谱。还包括含有由装配型质粒94(也称为2.2)之衍生顺序的修饰的装配型质粒(112B1和112B2)。图中示出了各装配型质粒的长度和Cf-2基因的定位。还指明了预期的转录方向(箭头所示)。方框区域代表Cf-2基因编码区的展开图。空心方框表示未测序区域、阴影线方框显示已测序的区域。

图2显示Cf-2.1基因的基因组DNA顺序(SEQ ID NO.1)。特点：核酸顺序-转译起始位在第1677位核苷酸；转译终止于第5012位核苷酸；共有聚腺苷化信号(AATAAA)存在于开始在第3586位核苷酸之转译终止位点特征化顺序下游。预测的蛋白质顺序-初级转译产物有1112个氨基酸；信号肽顺序是氨基酸1-26；成熟肽为氨基酸27-1112。

图3A显示Cf-2蛋白质的氨基酸顺序，其称为Cf-2，1(SEQ IDNO.2)。图3B显示由Cf-2.2基因编码的氨基酸顺序(SEQ ID NO.3)。两种Cf-2基因间不同的氨基酸以下划线表示。

图4显示相应于Cf2-2基因的几乎全长度cDNA克隆(SEQ IDNO.4)的顺序。

图5显示Cf-2和Cf-9基因羧基末端区域(分别如SEQ ID NO.5和NO.6所示)的比较。按照预期的蛋白质区对准排列好蛋白质顺序。相同的氨基酸残基由黑体字表示。图6显示Cf-2和Cf-9蛋白质(分别为SEQ ID NO.7和NO.8)的部份对准排列。两相同区域以黑体字表示，并且也分别表示为PEP SEQ 1(SEQ ID NO.9)和PEP SEQ2(SEQ ID NO.10)。OLIGO1(SEQ ID NO.11)和OLIGO2(SEQ ID NO.12)表示编码这些蛋白质相似区域的简并寡核苷酸顺序。

图7显示分成预测有不同功能之区域的Cf-2的一级氨基酸顺序(SEQ ID NO.2)。

蕃茄Cf-2基因的克隆使用原则上与前面简述的分离蕃茄Pto基因相似的以图谱为基础的克隆策略来克隆Cf-2基因。

(i)Cf-基因图定位的排布我们已经组建出几种Cf基因(包括Cf-2基因)的染色体位置图(Dickinson等人1993；Jones等人1993；Balint-Kurti等人1994)。我们证明Cf-4和Cf-9基因图在染色体1短臂上有大致相同的定位，而Cf-2和Cf-5基因在染色体6上有大致相同的定位。

(ii)Cf-2基因物理定位的高分辨率图谱通过检测从重组蕃茄植物分离的DNA，我们整理出很多限制性片段长度多型性(RFLP)标志。以这种方法，我们组构了Cf-2基因在蕃茄染色体6上的详细位置连接图(Dixon等人，1995)。我们还确定RFLP标志MG 112A和CT 119之间的Cf-2基因图谱。这些RFLP标志从S.Tanksley(Cornell)实验室可获取。使用可获得的YACs(也可从Tanksley实验室得到)，我们也证明在蕃茄中(L.esculentum)，标志基因MG 112A和CT 119之间的物理距离只有40kb。我们也分离出另外两个对该区域作图并因而代表了候选Cf-2基因的RFLP标志，即MG 112B(MG 112A的弱同系物)和SC 3-8。

为更精确地确定Cf-2基因的位置，使蕃茄杂交以寻求Cf-2和Cf-5抗性基因之间的重组。使作为Cf-2和Cf-5杂合体的植物与C.fulvum敏感性蕃茄系杂交。筛选约12000个所得F1子代以观察其对C.fulvum的抗性，并鉴定出单个敏感性植物。用其图谱靠近Cf-2基因的分子标志分析来自该植物的DNA，并发现该植物携带作为MG 112A和CT 119间之重组体的染色体。该分析强有力表明，RFLP标志MG112B鉴定其图谱与Cf-2基因紧密相连的DNA或是Cf-2基因本身(Dixon等人，1996)。

(iii)携带基因组Cf-2基因之双装配型质粒载体克隆的分离为测定是否可由携带Cf-2基因的分子标志MG 112B鉴定DNA，将DNA顺序从携带Cf-2基因的植物中分离出来，并转化到Cf-0蕃茄植物中。从携带染色体1上之Cf-9基因以及携带染色体6上之Cf-2基因的种子培养物构建基因组DNA文库，以便用该文库分离该两个基因。以获自Dr.C.Dean，John Innes Centre，Colney Lane，Norwich处的双装配型质粒克隆载体pCLD 04541构建文库(也参见Bent等人的文献，1994)。该载体基本相似于pOCA 18(Olszewski等人，1988)。它含有λ噬菌体cos位点，以使该载体可由λ包装提取物包装，因此是一种装配型质粒(Hohn and Collis，1980)。它也是一种复体载体(Vanden Elzen等人，1985)，这样，被分离出的任何装配型质粒克隆均可被直接导入植物，以试验克隆之基因的功能。

采用本领域技术人员熟知的技术，从6周龄温室生长植物的叶片中分离出高分子量DNA(Thomas等人，1994)，并用MboI限制性内切酶部份消化之。用蔗糖梯度液，使该部份消化产物按大小分级，并采用本领域技术人员熟知的方法将大小在20-25kb的DNA与BamHI消化的pCLD 04541 DNA连接。使用Stratagene包装提取物进行体外包装之后，将该装配型质粒导入Stratagene埃希氏大肠杆菌菌株SURETM的四环素敏感性模型(获自Stratagene)中。使用pCLD 04541上的四环素抗性基因选择重组体。

将该文库随机分配于144个各含1500个克隆的集合池中，使细胞于各池内生长，将10ml细胞中9ml用于大批量质粒DNA提取，另1ml在加入0.2ml甘油之后用于制备冷冻贮存液。用碱溶解法(Birnboim和Doly，1979)将质粒DNA从集合池中分离出来，并用分子标志MG112B，通过所谓“缝隙印迹”杂交来分析DNA样品。由该检测法证明第38、82、89、90、92、94、96和141号集合池是阳性的。“94”也称为“2.2”。

各集合池中，铺板长出约10000个菌落，并以放射性MG 112B探针，通过菌落杂交检查MG 112B同源性，然后从各池中分离带有此种同源性的单个克隆。这些技术对本领域技术人员都是已知的。

使用MG 112B探针，通过Southern blot杂交和通过绘制限制性内切酶谱，进一步鉴定这些克隆的特征。如由这些交迭装配型质粒限定的，我们目前对围绕MG 112B的相邻DNA长度的估计，示于图1中。这些装配型质粒揭示出两个与MG 112B杂交的具有非常相似的限制性酶切谱的区域(此处分别为标记的MG 112B1和B2)。随后将这些装配型质粒中的四个(82，89，94，141)用于植物转化实验，采用本领域专业人员熟知的技术选择出转化为卡那霉素抗性的植物细胞。以装配型质粒82，89，94和141中的至少一个生产转基因蕃茄和土豆植物(Fillatti等人，1987；Horsch等人，1985)。

(iv)对转基因植物中装配型质粒功能的估价经试验抗携带Avr 2的C.fulvum菌转化子以估测被转化的蕃茄中推定克隆的Cf-2基因的功能。

含装配型质粒94(16个中的11个)或装配型质粒82(所有4个)的大部份转基因植物均对携带Avr 2的C.fulvum有抗性。而含装配型质粒89或141的所有转基因植物则对C.fulvum敏感。这些资料表明，携带Cf-2基因的基因组DNA是与装配型质粒82和94之间重叠区相对应的片段。因此该Cf-2基因落入由标志MG 112B1鉴定的一个区域之中。

由MG 112B2鉴定的装配型质粒94上的区域与装配型质粒82/94重叠区有许多相似性。将该区域亚克隆后产生装配型质粒112B2(图1)，该质粒也被转化到敏感的蕃茄系中。携带装配型质粒112B2的转基因蕃茄植物18株中有16株对携带Avr 2的C.fulvum有抗性。装配型质粒82和112B2之间的重叠区很小，不大可能携带Cf-2基因。另外，将验明为MG112B1的区域亚克隆后产生装配型质粒112B1(图1)，将该质粒转化到敏感性蕃茄系中。所述的装配型质粒112B1只含有图2中所表征的顺序(SEQ ID NO.1)。所有携带装配型质粒112B1的转基因蕃茄(所有5株)均对携带Avr 2的C.fulvum有抗性。因此，这些资料表明，存在由分子探针MG 112B鉴定特征的2个功能性Cf-2基因(分别为Cf-2.1和Cf-2.2)(Dixon等人，1996)。所有转化实验的结果总结于表1中。

采用携带或缺少Avr 2的C.fulvum匹配种(第5、9种与第2、5、9种对比)从所有具有抗性的非多倍体转化的植物中筛选后代。C.fulvum种依据其可以产生对抗的抗性基因命名。所有子代均易感缺失Avr2的C.fulvum(第2、5、9种)，而来自各转化子的后代中约75％对携带Avr2的C.fulvum有抗性(第5、9种)。这些资料确证克隆为Cf-2的抗性基因的种特异性性质。

(v)根据MG 112B鉴定之区域的DNA顺序分析已确定了代表装配型质粒82/94重叠区之中央核心的6.5kb区域的DNA顺序。相当于装配型质粒重叠区之两端的2.3kb和1.1kb两小区域尚未定序(图1)。

该中央核心顺序携带单一主要开放阅读框架，在设想转译后，揭示了所研究的基序(富亮氨酸重复区，或称LRR)，正如以前对Cf-9基因所指出的(WO95/18320)其可以诊断其他抗性基因。该开放阅读框架以第1677位的转译起始密码子(ATG)开始，以第5012位的转译终止密码子TAG完成，并带有编码1112个氨基酸蛋白的3336bp间插顺序。这就是所述Cf-2.1基因。

也已测定了携带于装配型质粒112B2上的标记MG 112B2区域的顺序。该顺序也携带一个与Cf-2.1基因顺序只有3个核苷酸差别的单一开放阅读框架。当设想性转译后，它也编码与Cf-2.1蛋白质只有3个氨基酸差异的含1112个氨基酸蛋白质。这些氨基酸差别均聚集在蛋白质的羧基末端区，并在图3B中(SEQ ID NO.3)以下划线的残基形式表示之。因此我们称其为Cf-2.2。

已分离出相应于Cf-2基因(图4)的几乎全长度cDNA克隆(SEQID NO.4)。因为它与基因组顺序在整个阅读框架中是线性对应的，故可确证Cf-2基因的预期氨基酸顺序。该cDNA克隆缺失包括任何未转译的前导顺序和编码起始蛋氨酸的密码子的最5′端顺序。该cDNA的第一个全密码子编码缬氨酸，它是第4号氨基酸。182个碱基的单一内含子存在于3′未转译顺序中(Dixon等人，1996)。

所报导顺序在基因库中的入藏号是U 42444(Cf-2.1)和U 42445(Cf-2.2)。

(vi)Cf-2中富含亮氨酸重复区的鉴定Cf-2.1基因的基因组DNA顺序示于图2(SEQ ID NO.1)中。该Cf-2蛋白质的推断的氨基酸顺序示于图3A(SEQ ID NO.2)中。

将所得顺序对美国国家生物信息中心(NCBI)的数据库中的顺序进行同源性检索，表明其与富含亮氨酸重复区域(LRRs)的其他基因有很强同源性。Cf-2基因与Cf-9基因的同一性有高达483的blastscore。其他同源基因包括拟南芥属基因TMK1(Chang等人，1992)，TMKL1(Valon等人，1993)，RLK5(Walker，1993)，以及带有不完全顺序和未知功能的表达顺序(例如拟南芥属thaliana转录顺序[ATTS]1447)。在其他基因中也观察到有LRRs的存在，它们中有许多可能有受体的功能(参见Chang等人，