[0001] 本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法。

[0002] 背景

[0003] 生物学中最基本的原则之一是DNA、RNA和蛋白质之间的关系。通常，在真核生物中，DNA包含可以转录成信使RNA(mRNA)分子的基因，并且这些mRNA分子随后被翻译成蛋白质。这些不同的步骤发生在真核细胞的不同位置：DNA包含在细胞器内，细胞器位于真核细胞的细胞质(即细胞核、线粒体或叶绿体)内。然而，mRNA转录物需要从该细胞器输出，因为翻译通常发生在细胞的细胞质中，这是翻译所需的核糖体所在的位置。

[0004] 因此，对于生物系统的正常功能而言，mRNA转录物通过细胞器膜从一个亚细胞区室迁移到另一个亚细胞区室是至关重要的。通过这种方式，细胞的遗传信息被有效地转化为大量不同的蛋白质，这些蛋白质一起工作以使细胞能够维持其自身的功能和新陈代谢，并对其环境和来自生物内其他细胞的信号以及来自生物环境的信号作出充分的反应。因此，这种所谓的细胞自主性导致细胞的表型和行为与多细胞生物中的细胞自身遗传信息直接相关的情况。

[0005] 然而，研究人员还观察到非细胞自主性的情况，其中一个细胞影响另一个细胞的表型。在多细胞生物中，不同的细胞相互通信，因此它们影响和协调彼此的行为和表型。在一些情况下，存在于一个细胞的基因组中的突变甚至可能影响在其基因组中没有所述突变的另一个细胞的表型。

[0006] 在植物中已观察到非细胞自主性的好实例。在植物的韧皮部液中，已经检测到许多编码蛋白质的mRNA转录物、小RNA分子和蛋白质，它们可以从植物中的一个位置迁移到另一个位置。因此，在一些情况下，一个细胞产生mRNA转录物，然后将其输出到另一个细胞，其中mRNA转录物可以翻译成蛋白质，并且蛋白质在其中实现其功能。这种通过脉管组织从一种细胞类型、组织或器官到另一种细胞、组织或器官的长距离信息交换是知之甚少的，但它为植物如何发挥作用、它们如何协调自身的发育和生长以及它们的器官如何对植物的环境做出协调一致的反应提供了新的复杂程度。它揭示了生物不同部位的细胞和器官彼此之间的交流，不仅通过激素等小信号分子，而且通过协调的方式交换大分子。然而，该系统的作用模式(触发迁移的RNA基序，它们的转运程度以及它们在转运后转化为功能蛋白的可能性)在现有技术中是未知的。

[0007] 在导致本发明的研究中，观察到存在于植物韧皮部液中的许多mRNA转录物(并且富含在嵌合嫁接连接处迁移的mRNA转录物库中)包含tRNA样结构(TLS)。通过显示当野生型和转基因植物相互嫁接时，携带独特TLS的mRNA从转基因根迁移到野生型叶和从转基因叶迁移到野生型花或根中，证明tRNA样结构足以赋予mRNA转录物迁移性。进一步显示这些可迁移的mRNA转录物在其转运后被翻译成蛋白质。还发现双顺反子mRNA::tRNA转录物(即携带TLS的mRNA转录物)经常在拟南芥中产生，并且它们富集在嫁接可迁移的mRNA的群体中。“嫁接可迁移的mRNA”是能够移动通过嫁接连接处的mRNA。

[0008] RNA分子可以说是在细胞中发现的功能最多样的生物大分子，它们的多种作用由它们复杂的三维结构和它们的一级序列决定。现在已经在植物中发现了tRNA序列(或tRNA样结构，TLS)的另外的生物学作用：它们具有介导mRNA运输到远处植物细胞的基序。有趣的是，转录物的迁移性是由tRNAMet和tRNAGly诱导的，而不是由一种特定的tRNAIle诱导，这与南瓜韧皮部液中缺乏这种tRNAIle相关。由于目前的结果表明转录物的迁移性是由特定的RNA结构介导的，因此tRNA基序扫描算法确实揭示了大量已鉴定的可迁移的mRNA含有TLS基序或被似乎经常产生双顺反子多聚(A)-RNA::tRNA的经注释的tRNA基因附近的基因转录。

[0009] 虽然许多可迁移的mRNA在远处组织中的功能作用仍有待阐明，但有证据支持这样的观点，即通过韧皮部运输小si/miRNA和大mRNA在调节植物发育中起重要作用。韧皮部渗出物中存在令人惊讶的大量mRNA，并且显示其跨嫁接连接处迁移，但是在嫁接可迁移的转录物群体中没有鉴定出介导迁移性的通用且易于预测的RNA基序或保守序列。然而，本发明现在证明，显著部分的可迁移mRNA携带TLS基序，其介导跨嫁接连接处的迁移性。

[0010] 信使RNA迁移并不严格遵循源(source)到汇(sink)的韧皮部流动，因为可以证明GUS::tRNA融合体不仅从芽(源)迁移到根(汇)，而且反之亦然。发现存在两种运输途径用于递送mRNA分子。一种是基于通过韧皮部脉管从源到汇的被动、非选择性递送。然而，根据本发明，还发现了靶向和主动转运系统形式的另一种途径。该途径尤其介导mRNA从根到芽的递送。根据本发明的两个发现(即来自TLS的序列足以赋予异源mRNA迁移性，并且在植物内源性CK1::tRNAGly双顺反子转录物(其是天然可迁移的)中缺失TLS使它不能迁移)支持活性mRNA递送机制的存在。

[0011] 根据本发明显示，TLS或密切相关的RNA结构介导许多嫁接可迁移的转录物的转运，并且特定tRNA序列如tRNAGly-、tRNAMet-和tRNAMet-衍生的序列触发其他非迁移性转录物的转运，并且大量的可迁移mRNA具有TLS基序。

[0012] 因此，本发明基于以下事实：该结构基序(TLS，具有与tRNA相同或非常相似的预测的茎-凸起-环结构)在mRNA转录物的协调的长距离转运中起作用。

[0013] 在动物中，也存在长距离细胞间mRNA转运的证据。例如，在人血浆中，已发现hTERT和MUC1基因的无细胞mRNA的存在与胃癌相关(Tani等人，2007，Anticancer Res.27：1207-1212)。这两种基因都与人类的肿瘤发生有关。可以想象，血浆中这些基因的无细胞mRNA的出现代表癌细胞和健康细胞之间的通信模式。如果健康细胞具有摄取这些mRNA转录物的方法，它们可能开始产生编码的蛋白质。据报道，哺乳动物细胞能够摄取外源mRNA(参见，例如，Probst等人，2007，Gene Ther.14：1175-1180)。hTERT中的各种突变与各种癌症的风险增加有关，并且通过发送包含这种突变的mRNA转录物，在其基因组中携带致癌突变(例如，由于非遗传的从头突变)的一个单个细胞可能有能力将其突变形式的mRNA转录物分发到许多其他细胞中，这些细胞可能在其自身基因组中不具有所述突变，但是它们可接受从细胞外基质中摄取所述转录物。以这种方式，健康细胞将产生编码蛋白质的突变(并且可能是致癌的)形式，即使它们自己的编码该蛋白质的内源基因未发生突变。在MUC1的情况下，已经显示该基因的上调与癌症相关(Zaretsky等人，2006，Mol.Cancer 5：57)。同样，该基因的mRNA转录物在血浆中的存在将为细胞提供获取这些无细胞mRNA转录物并产生由其编码的蛋白质的机会，而与其自身的内源性MUC1基因的启动子活性无关。这可能导致血浆中许多细胞中该蛋白质的产生高于正常，这进而可能与肿瘤发生有关。

[0014] 在例如患有神经退行性疾病阿尔茨海默氏病的患者中也观察到血液中疾病特异性mRNA转录物的出现(Koh等人，2014，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 111：7361-7366)。来自神经元的这种mRNA分泌可以代表这种病症在患者的神经元之间进展和扩散的方式。

[0015] 在动物细胞中，蛋白质和RNA可以通过囊泡以非常规分泌机制从细胞分泌，这与内质网(ER)/高尔基体途径不同。TLS可能在mRNA转录物选择性加载到囊泡中和/或从细胞中特异性分泌mRNA到细胞外基质(例如血液、血浆)中起作用。如果TLS的存在也使得mRNA转录物能够被其他细胞摄取，则所述TLS将基本上介导动物中mRNA转录物的细胞间迁移，类似于在导致本发明的研究中于植物中观察到的。

[0016] 因此，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，包括：

[0017] -通过突变mRNA所转录自的基因来修饰mRNA中存在的tRNA样结构(TLS)，或[0018] –在基因的转录部分中包含tRNA样结构(TLS)的序列。

[0019] 基本上有三种方法可以应用本发明来改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性。一方面，通过修饰所述mRNA转录物中天然存在的tRNA样结构，可以防止可在野生型生物中迁移的mRNA转录物的迁移性，使得其不再促进mRNA转录物的迁移性。

[0020] 另一方面，通过向所述mRNA转录物提供具有促进mRNA转录物的迁移性的能力的一种或多种tRNA样结构，可以使在野生型生物中不可迁移的mRNA转录物可迁移。该实施方案可以应用于来自生物内源的基因的mRNA转录物，但也可以应用于来自生物非内源的基因的mRNA转录物，例如已通过遗传修饰引入生物基因组的基因，或者已以瞬时方式引入生物中的基因，例如通过注射、摄取、转染或通过在生物表面上外源施用包含TLS的mRNA分子，随后在生物内进一步运输并通过所述TLS的存在导入细胞。

[0021] 在第三个实施方案中，mRNA转录物的迁移性可以在生物内转录物的目的地(即mRNA转录物在野生型生物中向其迁移的细胞类型、组织或器官)由于TLS的修饰而发生变化的意义上改变。如果生物中的不同目的地与不同的TLS相关联，则修饰mRNA的原始TLS可以将转录物引导至生物内的不同目的地，这导致编码蛋白质的异位产生。

[0022] 可以通过遗传修饰实现TLS的修饰和这些TLS在转录物中的包含。遗传修饰包括转基因修饰或转基因，使用来自不可杂交物种的基因或合成基因，和顺式修饰或顺式发生，使用编码来自生物本身或来自性相容的供体生物的性状的天然基因。

[0023] 在一个实施方案中，待改变的基因的mRNA的细胞间迁移性的生物是多细胞真核生物，例如植物，真菌或动物。在进一步的实施方案中，生物是双子叶植物，单子叶植物，裸子植物，苔藓植物，藻类，哺乳动物，非哺乳动物脊椎动物或无脊椎动物。

[0024] 在本发明的上下文中，术语“生物”不仅包括活的多细胞植物、动物和真菌，还包括源自活的多细胞植物、动物和真菌的组织培养物和细胞培养物。就像活的生物一样，所述组织培养物或细胞培养物由多个细胞组成，细胞之间可以交换mRNA。

[0025] 根据本发明的第一方面，所述生物是植物。在一个实施方案中，所述生物是属于以下植物属之一的植物，或由其衍生的细胞培养物或组织培养物：葱属(Allium)，芹菜属(Apium)，甜菜属(Beta)，芸苔属(Brassica)，辣椒属(Capsicum)，菊苣属(Cichorium)，西瓜属(Citrullus)，黄瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，冬瓜属(Benincasa)，胡萝卜属(Daucus)，芝麻菜属(Eruca)，莴苣属(Lactuca)，葫芦属(Lagenaria)，丝瓜属(Luffa)，菜豆属(Phaseolus)，豌豆属(Pisum)，兵豆属(Lens)，萝卜属(Raphanus)，茄属(Solanum)，菠菜属(Spinacia)，缬草烷属(Valerianella)，烟草属(Nicotiana)，矮牵牛属(Petunia)，拟南芥属(Arabidopsis)，荠菜属(Capsella)，南芥属(Arabis)，碎米荠属(Cardamine)，苹果属(Malus)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，葡萄属(Vitis)，蔷薇属(Rosa)，草莓属(Fragaria)，杨属(Populus)，山毛榉属(Fagus)，松属(Pinus)，云杉属(Picea)，银杏属(Ginkgo)，落叶松属(Larix)，桦属(Betula)，栎属(Quercus)，柳属(Salix)，桤木属(Alnus)，榛属(Corylus)，桃属(Amygdalus)，越橘属(Vaccinium)，悬钩子属(Rubus)，鳄梨属(Persea)，柑橘属(Citrus)，栗属(Castanea)，槭属(Acer)，梣属(Fraxinus)，咖啡属(Coffea)，山茶属(Camellia)，可可属(Theobroma)，洋橄榄属(Olea)，鹰嘴豆属(Cicer)，胡桃属(Juglans)，黄连木属(Pistacia)，花生属(Arachis)，腰果属(Anacardium)，澳洲坚果属(Macadamia)，榕属(Ficus)，荔枝属(Litchi)，猕猴桃属(Actinidia)，九重葛属(Bougainvillea)，向日葵属(Helianthus)，木槿属(Hibiscus)，锦葵属(Malva)，大豆属(Glycine)，棉属(Gossypium)，大麻属(Cannabis)，甜叶菊属(Stevia)，仙人掌属(Opuntia)，番薯属(Ipomoea)，木薯属(Manihot)，葎草属(Humulus)，金合欢属(Acacia)，苜蓿属(Medicago)，三叶草属(Trifolium)，莲属(Lotus)，蚕豆属(Vicia)，亚麻属(Linum)，荞麦属(Fagopyrum)，玉蜀黍属(Zea)，小麦属(Triticum)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，稻属(Oryza)，菰属(Zizania)，黑麦属(Secale)，小黑麦属(Triticosecale)，高粱属(Sorghum)，刺竹属(Bambusa)，牡竹属(Dendrocalamus)，甘蔗属(Saccharum)，香茅属(Cymbopogon)，狼尾草属(Pennisetum)，黍属(Panicum)，羊茅属(Festuca)，黑麦草属(Lolium)，梯牧草属(Phleum)，早熟禾属(Poa)，芒属(Miscanthus)，天门冬属(Asparagus)，龙舌兰属(Agave)，丝兰属(Yucca)，椰子属(Cocos)，油棕属(Elaeis)，刺葵属(Phoenix)，孤挺花属(Amaryllis)，水仙属(Narcissus)，芦荟属(Aloe)，美人蕉属(Canna)，鸢尾属(Iris)，秋水仙属(Colchicum)，番红花属(Crocus)，唐菖蒲属(Gladiolus)，灯心草属(Juncus)，百合属(Lilium)，郁金香属(Tulipa)，芭蕉属(Musa)，石斛属(Dendrobium)，蝴蝶兰属(Phalaenopsis)，香荚兰属(Vanilla)，香蒲属(Typha)，姜属(Zingiber)，姜黄属(Curcuma)，浮萍属(Lemna)。源自植物的细胞培养物和组织培养物包括例如小孢子培养物，花粉培养物，愈伤组织培养物，根培养物，分生组织培养物，原生质体培养物，叶肉细胞培养物，组织或器官外植体和BY-2细胞培养物。

[0026] 根据本发明的第二方面，所述生物是动物。在一个实施方案中，所述生物是哺乳动物、非哺乳动物脊椎动物或无脊椎动物。在进一步的实施方案中，所述生物是属于以下属之一的哺乳动物，或由其衍生的细胞培养物或组织培养物：小鼠属(Mus)，人属(Homo)，大鼠属(Rattus)，羊属(Pan)，原仓鼠属(Cricetus)，金仓鼠属(Mesocricetus)，天竺鼠属(Cavia)，犬属(Canis)，兔属(Oryctolagus)。经常用于研究的哺乳动物细胞培养物是例如CHO，HeLa，HEK293，HL-60，J558L，JY，K562，KBM-7，RBL和COS-1。

[0027] 在一个实施方案中，细胞间迁移性是在生物的相同器官中的细胞之间，或在相同组织培养物或细胞培养物中的细胞之间。在这种情况下，“器官”的概念还包括例如动物的血液和淋巴。在另一个实施方案中，细胞间迁移性是在生物的不同器官中的细胞之间。

[0028] 生物中基因的mRNA的细胞间迁移性可以发生在组织中相邻细胞的质膜上，或者可以发生在组织中彼此不相邻的细胞的质膜上。在后一实施方案中，所述迁移性可利用生物自身的用于长距离运输和细胞间通信的手段和/或细胞外基质，例如植物中的脉管组织(韧皮部和/或木质部)或质外体，或动物的血流或淋巴系统。在组织中彼此不相邻的细胞可以是例如属于生物中不同组织或器官的细胞，或者不附着或连接到其他细胞的细胞，例如动物中的血细胞，植物的花药中的花粉粒，等。

[0029] 在正常发育和生长的过程中，细胞之间mRNA转录物的交换似乎是常见的。然而，它也可能是在疾病的建立和/或进展或生物对疾病的防御中起重要作用的现象，因为它允许从一个细胞转运遗传物质(以已转录的mRNA的形式)到其他细胞，甚至跨越生物内的很远距离。这意味着在生物中存在单个细胞(其在基因组中的基因中携带由对所述基因编码的蛋白质产生某种效应的突变)可能导致包含所述突变的mRNA输出到生物中的许多其他细胞(其在他们自己的基因组中缺乏所述突变)。因此，这可能导致这样的情况：其自身遗传物质中缺乏突变的细胞导入包含所述突变的mRNA分子，并随后将该mRNA分子翻译成由所述mRNA分子编码的蛋白质。其效果是缺乏所述突变的细胞可以产生并含有包含所述突变的蛋白质。因此，如果由所述突变细胞发出的mRNA分子是可迁移的并且能够从产生其的细胞迁移到同一生物中的另一个细胞，在那里它们可以被翻译成蛋白质，则一个突变细胞的mRNA转录物可以影响同一生物中的多个非突变细胞的行为和/或表型。这种机制可以例如是与动物的血流中相关的，其中基本上所有细胞都能够通过血液中存在的分子相互通信，和与植物相关的，其中所有器官通过脉管组织相互连接。

[0030] 或者，一个细胞可以不突变，但可以经受刺激，这使其产生特异性mRNA转录物或mRNA转录物的特异性剪接形式。随后可以将该特定转录物或其剪接形式转运至生物中的其他细胞，其尚未(尚未)接受该刺激或者不能响应刺激。例如，在植物中，叶的细胞可以响应光质的变化，并将这种感知发信号至根。根细胞可以检测土壤中水可用性的变化，并将其传达给例如气孔细胞。可迁移的mRNA转录物可以构成生物的不同部分之间的这种细胞间通信信号的一部分。

[0031] 在一个实施方案中，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，包括通过突变mRNA转录自的基因来修饰mRNA中存在的tRNA样结构。突变基因可以包括从基因中缺失tRNA样结构的序列、突变tRNA样结构的序列以改变其三维构型、或插入遗传元件(例如，转座子，逆转录转座子，T-DNA插入或逆转录病毒重复序列)至基因中以从基因的转录部分去除tRNA样结构，使得编码TLS的序列不再转录为它最初属于的mRNA的一部分，因此改变了该mRNA的迁移性。

[0032] 例如，可以通过使用基因组编辑工具(例如CRISPR-Cas)来完成从基因中缺失tRNA样结构的序列，其使用设计为分别靶向基因中tRNA样结构的编码序列的上游和下游的两个引导RNA，从而在基因中tRNA样结构的编码序列的上游和下游导致基因的双链断裂，这可能导致所述tRNA样结构的编码序列从所述基因去除。或者，可以在体外完成从基因中缺失tRNA样结构的序列，其使用标准分子生物学技术或基因合成技术，随后引入编码tRNA::mRNA双顺反子转录物的DNA构建体或体外转录的转录物本身至生物中。

[0033] tRNA的三维构型通常包括茎-环结构：从5'到3'，这些是D臂(或D茎-环)，A或反密码子臂(或A茎-环或反密码子茎-环)，和T臂(或TψC臂，TψC臂或TψC茎-环)。在A和T臂之间可以存在可变环。突变tRNA样结构的序列以改变其三维构型可以包括缺失其转录序列的一部分，突变参与形成tRNA样结构中的茎-环结构的一个或多个核苷酸，或在tRNA样结构的茎-环中插入一个或多个核苷酸。

[0034] 可以使用现有技术中已知的各种诱变方法随机或以靶向方式诱导突变。体外诱变方法包括例如定点诱变，PCR介导的诱变和总基因合成。体内诱变可以例如通过一种或多种化学化合物随机实现，例如甲磺酸乙酯，亚硝基甲基脲，羟胺，原黄素，N-甲基-N-亚硝基胍，N-乙基-N-亚硝基脲，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍，硫酸二乙酯，乙烯亚胺，叠氮化钠，甲醛，氨基甲酸乙酯，苯酚，环氧乙烷，和/或通过物理方法随机实现，如紫外线照射，快中子照射，X射线，γ照射，和/或通过插入遗传元件实现，例如转座子，T-DNA，逆转录病毒元件。还可以通过同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导或靶向基因组编辑方法(例如TALEN，锌指技术或CRISPR-Cas)特异性地引入突变。

[0035] 在一个实施方案中，缺失基因中tRNA样结构的转录序列的一部分包括从tRNA样结构中缺失A和/或T茎-环。如实施例2中所示，去除A和T茎-环结构导致当存在A和T茎-环结构时可迁移的mRNA转录物的迁移性的消除。去除来自基因的D茎-环、D和T茎-环、或D和A茎-环不会消除相同mRNA转录物的迁移性。

[0036] 应当注意，本申请中使用的术语“tRNA样结构”不仅包括存在于基因的mRNA转录物中的完整tRNA结构(并且其可以被筛选用于使用tRNA基序扫描方法，如在实施例2中解释的)，还包括不完整的tRNA结构，其缺乏一个或多个茎-环结构但仍保留了使所述基因的mRNA转录物能够进行细胞间迁移的能力。因此，在本发明的上下文中使用的术语“tRNA样结构”还包括缺乏D茎-环、D和T茎-环、或D和A茎-环的tRNA结构。在实施例2和图4C中显示了这种不完整结构赋予mRNA转录物迁移性的功效。

[0037] 在一个实施方案中，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，其中迁移性的变化导致基因功能的丧失。对于其mRNA转录物在生物的一种细胞类型、组织或器官中转录但其基因产物(编码的蛋白质)在生物的至少一种其他细胞类型、组织或器官(其中不产生其mRNA转录物)中起作用的基因的情况是这样的。对于这样的基因，其mRNA转录物的细胞间迁移性因此对于生物中基因的正常功能是必需的。这种基因的mRNA转录物的细胞间迁移性的丧失导致基因在细胞、组织或器官(mRNA转录物在生物的正常生长、发育和/或发挥功能期间向其迁移并且其中它通常被翻译成蛋白质)中丧失功能。因此，mRNA转录物的细胞间迁移性的丧失导致mRNA转录物在生物的正常生长、发育和/或发挥功能期间向其迁移的细胞、组织或器官中基因产物(即编码的蛋白质)的不存在或减少的存在。所述细胞、组织或器官的表型可能受到这种不存在或减少的存在的影响，并且由此可能影响所述细胞、组织或器官的形态、反应性和/或功能性。这种情况在实施例3中说明，其显示植物中CK1基因的转录物迁移性的丧失导致韧皮部中缺乏CK1转录物，并且在完全缺乏CK1转录物的敲除突变体中观察到非常相似的表型。

[0038] 在另一个实施方案中，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，包括在基因的转录部分中包含tRNA样结构的编码序列。

[0039] 在一个实施方案中，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，其中迁移性的变化导致生物中基因产物的异位存在。以这种方式，通过在所述转录物中包含tRNA样结构，可以使不显示细胞间迁移性的mRNA转录物变为可迁移的。

[0040] 在另一个实施方案中，本发明涉及改变生物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，其中所述基因在生物的至少一部分中是非内源基因。这种情况在实施例2中说明，其中向β-葡萄糖醛酸酶编码基因(GUS)的3'UTR添加TLS使得GUS转录物可迁移，并导致蛋白质在植物的远端部分翻译，跨过嫁接连接处。这种情况也在实施例1中说明，其中DMC1的修饰形式以转基因砧木中DNA构建体的形式提供。该修饰包括在基因的3'UTR中TLS的添加，以及将编码的蛋白质转变为干扰野生型DMC1的功能的显性负效形式的基因截短。证明了所述修饰的转录物在嫁接的接穗中向雄性孢子转运，其中编码的蛋白质(其是DMC1的显性负效形式)随后影响发育。

[0041] 适当地，通过在包含mRNA的互补序列的DNA构建体中引入tRNA样结构的互补序列，或通过在内源基因中引入tRNA样结构的互补序列(通过例如基因组编辑工具如CRISPR-Cas)，实现在基因的转录部分中包含tRNA样结构的编码序列。

[0042] 在一个实施方案中，将tRNA样结构的编码序列引入基因的mRNA的3'非翻译区(3'UTR)。优选地，然后在基因的终止密码子之后引入tRNA样结构的编码序列，使得其存在于基因的转录部分中，但不影响基因的开放阅读框。或者，也可以将tRNA样结构的编码序列引入基因的mRNA的5'非翻译区(5'UTR)，或基因的开放阅读框中，使得编码序列没有被中断或阅读框没有被移位。

[0043] DNA构建体可以稳定整合到生物的基因组中，在生物中瞬时表达，或体外转录。所述DNA构建体包含能够在合适的环境中驱动基因表达的合适启动子。例如，存在普遍存在的、具有器官、组织或细胞类型特异性的启动子，以及组成型或由环境(物理或生物)或内源(发育)条件调节或由化学物质调节的启动子。

[0044] 适用于哺乳动物的组成型启动子控制序列包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)，猿猴病毒(SV40)启动子，腺病毒主要晚期启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，延伸因子(ED1)-α启动子，遍在蛋白启动子，肌动蛋白启动子，微管蛋白启动子，免疫球蛋白启动子，其片段或任何前述的组合。

[0045] 用于植物的合适的组成型启动子控制序列包括但不限于35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子，opine启动子，遍在蛋白启动子，肌动蛋白启动子，微管蛋白启动子，醇脱氢酶启动子，其片段或任何前述的组合。

[0046] 用于动物或植物的合适的受调节的启动子控制序列的实例包括但不限于由热休克、冷、干旱、重金属、类固醇(例如地塞米松，β-雌二醇)、抗生素或醇(例如乙醇)调节的那些。

[0047] 组织特异性哺乳动物启动子的非限制性实例包括B29启动子，CD14启动子，CD43启动子，CD45启动子，CD68启动子，结蛋白启动子，弹性蛋白酶-1启动子，内皮糖蛋白启动子，纤连蛋白启动子，Flt-1启动子，GFAP启动子，GPllb启动子，ICAM-2启动子，INF-13启动子，Mb启动子，Nphs1启动子，OG-2启动子，SP-B启动子，SYN1启动子和WASP启动子。

[0048] 组织特异性植物启动子的非限制性实例包括β-菜豆素，谷蛋白，α-Kaf，玉米醇溶蛋白，β-伴大豆球蛋白和AGP酶启动子(用于种子特异性表达)，LAT52，GEX2，MAN5和FRK4启动子(用于花粉特异性表达)，rolD，REO，Prx和Tip2启动子(用于根特异性表达)，和Zmglp1，PnGLP和PDX1启动子(用于叶特异性表达)。

[0049] 启动子序列可以是野生型，或者可以进行修饰以更高效或更有效地表达。在一个示例性实施方案中，编码DNA可以与CMV启动子可操作地连接，用于在哺乳动物细胞中组成型表达。

[0050] 在某些实施方案中，内源或非内源基因的序列可以与噬菌体RNA聚合酶识别的启动子序列可操作地连接，用于体外mRNA合成。在此类实施方案中，可以纯化体外转录的RNA用于施用于生物。例如，启动子序列可以是T7、T3或SP6启动子序列或T7、T3或SP6启动子序列的变体。在一个示例性实施方案中，编码融合蛋白的DNA与T7启动子可操作地连接，用于使用T7RNA聚合酶进行体外mRNA合成。

[0051] 在替代实施方案中，内源或非内源基因的序列可以与启动子序列可操作地连接，用于在细菌或真核细胞中体外表达。

[0052] 可以通过现有技术中已知的各种方法将DNA构建体或体外合成的RNA转录物引入至生物中。

[0053] 当DNA构建体用于在生物的基因组中稳定整合或用于在生物中瞬时表达时，可以通过(微)注射、摄取、转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂质转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导、病毒介导的基因递送、PEG介导的原生质体转染、用合适的病毒或细菌感染(例如用于植物的农杆菌)等将其引入至所述生物或由其衍生的细胞中。

[0054] 当DNA构建体用于体外转录编码的mRNA时，可以使用本领域已知的任何体外转录系统实现体外转录。或者，转录也可以在异源生物中进行，之后将目标转录物纯化以供进一步使用。

[0055] 体外合成的RNA转录物可以通过上面列出的方法引入至生物或由其衍生的细胞中(例如注射到哺乳动物的血流中或注入植物的韧皮部中)，也可以通过例如外源性施用于生物表面来引入。外源施用可以例如根据专利申请WO2015/200539中的公开内容进行。向细胞培养物或组织培养物的外源应用可以例如使用电穿孔、转染等进行。

[0056] 当将体外合成的RNA转录物引入生物时，不需要合适的启动子，因为转录不需要在生物的细胞内发生。所述转录物可以立即被翻译，和/或它可以迁移到生物的细胞中并且从生物的一个细胞迁移到生物的其他细胞。根据本发明，转录物的迁移是由于TLS的存在。

[0057] 另一个应用是使用产生携带TLS的mRNA转录物的培养细胞，用于体内应用于生物。例如，携带基因的培养细胞(当转录时产生含有TLS的mRNA转录物)可以被注射(或以其他方式施用)到哺乳动物的血流中，其中所述细胞分泌携带TLS的mRNA转录物进入细胞外基质中。由于TLS的存在，该mRNA转录物随后可被生物中的其他细胞摄取。这构成了体内递送mRNA转录物的有效方式。所述mRNA转录物可以编码可以施用于生物的任何蛋白质。在进一步的实施方案中，所述mRNA转录物编码治疗性蛋白质、内源性蛋白质或其修饰形式、或非内源性蛋白质。适当地，将所述细胞施用于生物用于治疗疾病或用于基因治疗。

[0058] 在一个实施方案中，将tRNA样结构的互补序列引入DNA构建体中基因的转录部分，并且在体外转录包含tRNA样结构的基因。随后将包含tRNA样结构的mRNA转录物引入生物、细胞培养物或组织培养物中，使得其可以迁移到细胞中，并从一个细胞迁移到其他细胞中。该实施方案代表了本发明的不需要在体内使用DNA构建体的应用。将包含tRNA样结构的mRNA转录物引入生物、细胞培养物或组织培养物中的方式取决于所使用的生物、细胞培养物或组织培养物的类型。可以实现引入的方法包括，例如，注入动物血流、注入植物的脉管组织或质外体，或在生物表面上外源施用。细胞穿透肽的使用可以例如促进mRNA转录物进入生物。

[0059] 如上所述，本申请中使用的术语“tRNA样结构”不仅包括存在于基因的mRNA转录物中的完整tRNA结构(并且其可以被筛选用于使用tRNA基序扫描方法，如在实施例2中解释的)，而且包括不完整的tRNA结构，其缺乏一个或多个茎-环结构但仍保留使得所述基因的mRNA转录物能够细胞间迁移的能力。因此，在本发明的上下文中使用的术语“tRNA样结构”还包括缺乏D茎-环、D和T茎-环、或D和A茎-环的tRNA结构。因此，本申请中使用的术语“tRNA样结构”包括完整的tRNA结构和至少包含A茎-环和/或T茎-环的tRNA结构。

[0060] 在实施例2和图4C中显示了这种不完整结构赋予mRNA转录物迁移性的功效。在一个实施方案中，tRNA样结构选自tRNAAla,tRNAArg,tRNAAsn,tRNAAsp,tRNACys,tRNAGln,tRNAGlu,tRNAGly,tRNAHis,tRNAIle,tRNALeu,tRNALys,tRNAMet,tRNAPhe,tRNAPro,tRNASer,tRNAThr,tRNATrp,Tyr ValtRNA ,tRNA 。在另一实施方案中，tRNA样结构选自tRNAAla,tRNAArg,tRNAAsn,tRNAAsp,tRNACys,tRNAGln,tRNAGlu,tRNAGly,tRNAHis,tRNAIle,tRNALeu,tRNALys,tRNAMet,tRNAPhe,tRNAPro,tRNASer,tRNAThr,tRNATrp,tRNATyr,tRNAVal，并且其缺乏D茎-环、D和T茎-环、或D和A茎-环。

[0061] 在进一步的实施方案中，tRNA样结构包含tRNA反密码子，其在转录的mRNA中从5'至3'具有选自以下的序列：AGC,CGC,UGC,ACG,CCG,CCU,UCG,UCU,GUU,GUC,GCA,CUG,UUG,CUC,UUC,ACC,CCC,GCC,UCC,GUG,AAU,AAG,CAA,CAG,GAG,UAA,UAG,CUU,UUU,CAU,GAA,AGG,CGG,UGG,AGA,CGA,GCU,GGA,UGA,AGU,CGU,UGU,CCA,GUA,AAC,CAC,UAC。在另一个实施方案中，tRNA样结构包含tRNA反密码子，其在转录的mRNA中从5'至3'具有选自以下的序列：AGC,CGC,UGC,ACG,CCG,CCU,UCG,UCU,GUU,GUC,GCA,CUG,UUG,CUC,UUC,ACC,CCC,GCC,UCC,GUG,AAU,AAG,CAA,CAG,GAG,UAA,UAG,CUU,UUU,CAU,GAA,AGG,CGG,UGG,AGA,CGA,GCU,GGA,UGA,AGU,CGU,UGU,CCA,GUA,AAC,CAC,UAC，并且其缺少D茎-环，或D和T茎-环。

[0062] 如实施例2中所示，存在一些具有三维结构的tRNA样结构，其不促进mRNA转录物的细胞间迁移，例如具有反密码子UAU的tRNAIle。

[0063] 在一个实施方案中，本发明涉及改变植物中基因的mRNA的细胞间迁移性的方法，其中所述植物由其上已嫁接第二植物的接穗的第一植物的砧木组成，和其中第一和/或第二植物中基因的mRNA的细胞间迁移性已经改变。该实施方案已在实施例1-3中使用拟南芥属(Arabidopsis)和烟草属(Nicotiana)(烟草)举例说明。

[0064] 该实施方案可以用任何可以嫁接的植物物种进行。可以嫁接的商业上相关的植物是例如属于以下属的植物：芹菜属(Apium)，甜菜属(Beta)，芸苔属(Brassica)，辣椒属(Capsicum)，菊苣属(Cichorium)，西瓜属(Citrullus)，黄瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，冬瓜属(Benincasa)，胡萝卜属(Daucus)，芝麻菜属(Eruca)，莴苣属(Lactuca)，葫芦属(Lagenaria)，丝瓜属(Luffa)，菜豆属(Phaseolus)，豌豆属(Pisum)，兵豆属(Lens)，萝卜属(Raphanus)，茄属(Solanum)，菠菜属(Spinacia)，缬草烷属(Valerianella)，烟草属(Nicotiana)，矮牵牛属(Petunia)，拟南芥属(Arabidopsis)，荠菜属(Capsella)，南芥属(Arabis)，碎米荠属(Cardamine)，苹果属(Malus)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，葡萄属(Vitis)，蔷薇属(Rosa)，草莓属(Fragaria)，杨属(Populus)，山毛榉属(Fagus)，松属(Pinus)，云杉属(Picea)，银杏属(Ginkgo)，落叶松属(Larix)，桦属(Betula)，栎属(Quercus)，柳属(Salix)，桤木属(Alnus)，榛属(Corylus)，桃属(Amygdalus)，越橘属(Vaccinium)，悬钩子属(Rubus)，鳄梨属(Persea)，柑橘属(Citrus)，栗属(Castanea)，槭属(Acer)，梣属(Fraxinus)，咖啡属(Coffea)，山茶属(Camellia)，可可属(Theobroma)，洋橄榄属(Olea)，鹰嘴豆属(Cicer)，胡桃属(Juglans)，黄连木属(Pistacia)，花生属(Arachis)，腰果属(Anacardium)，澳洲坚果属(Macadamia)，榕属(Ficus)，荔枝属(Litchi)，猕猴桃属(Actinidia)，九重葛属(Bougainvillea)，向日葵属(Helianthus)，木槿属(Hibiscus)，锦葵属(Malva)，棉属(Gossypium)，大麻属(Cannabis)，甜叶菊属(Stevia)，仙人掌属(Opuntia)，和番薯属(Ipomoea)。这当然是一个非排他的列表。

[0065] 通常，可以嫁接许多双子叶植物，而不能嫁接单子叶植物。然而，最近开发了一种方法来嫁接难嫁接的物种，例如大豆(Glycine max)和禾本科的商业重要物种，例如玉米(Zea mays)，水稻(Oryza sativa)，小麦(Triticum aestivum)等等(T.Harada，欧洲专利申请EP2918161)。因此，对于那些物种，也可以应用本发明方法的这个实施方案。

[0066] 该实施方案具有各种不同的应用。首先，可以改变内源基因的mRNA的细胞间迁移性。这可以通过改变砧木或嫁接植物接穗中的编码基因来实现，并且其可能导致植物中天然可迁移的mRNA转录物的迁移性丧失，或者导致在植物中天然不可迁移的mRNA转录物的迁移性增加。在迁移性增加的情况下，mRNA转录物可以迁移跨过嫁接连接处。在失去迁移性的情况下，砧木或接穗可能缺失mRNA转录物，这可能导致表型效应。改变编码基因可以以上文所述的所有方式进行，例如诱变、基因组编辑和/或转基因的使用。

[0067] 在另一个实施方案中，改变砧木和/或接穗的表型。这可以例如通过可迁移mRNA转录物跨过嫁接连接处的迁移来实现，其中它补充了由于突变导致的砧木或接穗中该mRNA转录物的缺失。因此，这代表通过将突变植物嫁接到野生型植物上并通过可迁移的mRNA转录物挽救突变体表型来实现突变体互补的方法，所述可迁移的mRNA转录物补偿相应的内源mRNA转录物的缺失。

[0068] 除了改变内源基因的mRNA的细胞间迁移性之外，当然可以在所述mRNA转录物中诱导额外的突变，例如点突变，或诱导所述mRNA转录物中的其他修饰，例如插入或缺失。此类额外的突变或修饰可以例如对编码的蛋白质的一级序列以及编码的蛋白质的结构和/或功能产生影响。实施例1中给出了该实施方案的一个实例，其中使用修饰(显性-阴性)形式的DMC1来干扰雄性孢子中的DMC1功能。

[0069] 其次，在另一个实施方案中，非内源基因可以在生物中迁移。非内源基因如报告基因的使用在分子生物学中是常见的做法，但这种非内源基因的表达模式完全取决于能够驱动基因在生物中的表达的合适的启动子的使用。上文已在此背景下讨论了合适的启动子。这种情况在实施例2中使用β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)举例说明。

[0070] 另一个非内源基因的例子是Cas9，针对其有趣的是使其mRNA转录物在生物中可迁移。Cas9是RNA引导的内切核酸酶，其在体外和体内以及在真核细胞中都具有在DNA中产生双链断裂的能力。它是RNA介导的适应性防御系统的一部分，该系统在细菌和古细菌中被称为聚集的规则间隙短回文重复序列(CRISPR)。Cas9与引导RNA分子结合时获得序列特异性，该引导RNA分子可以基于其序列靶向生物DNA中存在的靶序列。Cas9需要在引导RNA靶向的DNA序列之后紧接着存在前间隔序列邻近基序(PAM)。Cas9酶首先从化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)中分离，但已报道了来自许多其他细菌物种(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)，齿垢密螺旋体(Treponema denticola)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等)的功能同源物。对于SpCas9，PAM序列是5'-NGG-3'，而来自其他细菌的各种Cas9蛋白已经显示出识别不同的PAM序列。在自然界中，引导RNA是crRNA和tracrRNA之间的双链体，但是已经显示包含crRNA和tracrRNA的单一引导RNA(sgRNA)分子同样良好地起作用(Jinek等人，2012，Science 337：816-821)。使用sgRNA的优势在于它将CRISPR-Cas9系统的复杂性降低到两个组分，而不是三个组分。为了在实验背景(体外或体内)下使用，这是一个重要的简化。

[0071] Cas9的替代方案是例如Cpf1，其不需要tracrRNA来起作用，其识别不同的PAM序列，并且在DNA中产生粘性末端切割，而Cas9产生平末端。

[0072] 一方面，遗传修饰技术可用于在真核细胞中表达RNA引导的内切核酸酶和/或引导RNA。编码RNA引导的内切核酸酶和至少一种引导RNA的一种或多种DNA构建体可以通过稳定转化(其中DNA构建体整合到基因组中)或通过瞬时表达(其中DNA构建体未整合到基因组中，但它以瞬时方式表达RNA引导的内切核酸酶和至少一种引导RNA)引入到细胞或生物中。该方法需要使用转化载体和合适的启动子用于在所述细胞或生物中表达。引入了外源DNA的生物被认为是遗传修饰的生物(GMO)，并同样适用于由其衍生的细胞和这些生物的后代。
在全球食品市场的重要部分中，转基因食品不允许供人食用，也不被公众赞赏。因此，存在对将CRISPR-Cas组分递送到完整植物中的替代性“无DNA”递送方法的需要，其不涉及将DNA构建体引入到细胞或生物中。

[0073] 在现有技术中，已经描述了在编码RNA引导的内切核酸酶的DNA构建体与至少一种引导RNA的体外转录后，将编码Cas9的mRNA导入细胞或生物中。该方法不需要使用转化载体和合适的启动子在所述细胞或生物中表达。

[0074] 另一种已知的方法是核糖核蛋白(RNP)复合物的体外装配，其包含RNA引导的内切核酸酶蛋白(例如Cas9)和至少一种引导RNA，随后将RNP复合物引入细胞或生物中。这种方法的GMO状态尚不清楚，但将RNP复合物引入至完整生物在技术上具有挑战性。在动物和动物细胞和组织培养物中，已经通过例如注射、电穿孔、纳米颗粒、囊泡和在细胞穿透肽的帮助下引入RNP复合物。然而，RNP复合物只能在它们被引入的细胞中发挥作用，这限制了这种方法的功效。需要一种自我传播系统，其中CRISPR-Cas组分在细胞之间迁移。

[0075] 在植物中，已经在原生质体中证明了RNP的使用，例如用聚乙二醇(PEG)转染(Woo等人，2015，Nat.Biotech.33：1162-1164)。然而，该技术的适用性完全取决于从原生质体再生整个植物的方案的可用性。这些方案不适用于所有植物，因此需要在植物细胞和完整植物中的CRISPR-Cas组分的替代递送方法。

[0076] 本发明的具体应用涉及在植物中使得编码RNA引导的内切核酸酶的mRNA可迁移。如使用编码DMC1的mRNA的实施例1中所示，存在于植物韧皮部中的mRNA转录物能够到达植物的雄性孢子。当用编码RNA引导的内切核酸酶的mRNA进行类似的方法时，因此不仅可以在至少一种合适的引导RNA的存在下修饰植物体细胞的基因组，而且还可以修饰其雄性种系的基因组。后一类基因组修饰是可遗传的，因为它们可以传播给下一代。

[0077] 适当地，在一个实施方案中，RNA引导的内切核酸酶基因可以由整合到一种植物的基因组中的DNA构建体编码，随后另一种植物被移植到该植物的基因组上。以这种方式，砧木的细胞具有转基因构建体，但接穗的细胞不具有。然而，当编码RNA引导的内切核酸酶的mRNA转录物包含TLS时，它被赋予迁移性并且能够跨过嫁接连接处，并且编码RNA引导的内切核酸酶的转录物可以被递送到接穗的细胞中，在其中可以翻译RNA引导的内切核酸酶蛋白。在这种情况下，接穗的细胞产生不在其自身基因组中编码的蛋白质，并且当所述细胞中存在至少一种合适的引导RNA时，该蛋白质能够修饰所述细胞中的染色体序列。

[0078] 或者，可以通过直接注射，例如在脉管组织至，或通过外源施用，将编码RNA引导的内切核酸酶并包含TLS的mRNA转录物引入植物中，如上所述。然后，所述转录物将表现得好像它已经在植物内产生，并且它将被递送到植物的细胞中，其中编码的蛋白质将被翻译并且其将在其中发挥其功能。在该实施方案中，不需要嫁接。

[0079] 在染色体序列的所述修饰已经发生之后，可以使用本领域已知的任何植物再生方法(例如体外组织培养)将细胞用于产生在其基因组中具有所述修饰的植物。

[0080] 在一个优选的实施方案中，编码RNA引导的内切核酸酶的mRNA转录物在植物雄性孢子内被翻译成编码的蛋白质，其中编码的蛋白质可以在至少一种合适的引导RNA存在下修饰染色体序列。例如，可以通过注射入花药、韧皮部或植物的其他部分、农杆菌介导的转化或外源施用将至少一种引导RNA引入细胞中，或者它可以由存在于产生所述雄性孢子的植物细胞中的DNA构建体编码。所述孢子可以由嫁接植物的接穗产生。已经表明，许多小RNA分子(与典型的引导RNA大小相当)在韧皮部中是可迁移的并且能够在整个植物中和跨过嫁接连接处全身迁移。还已经表明，当这些小RNA分子在砧木中转录时，它们能够到达接穗的雄性孢子(参见例如专利申请WO2013017683)。

[0081] 在一个具体实施方案中，本发明因此提供了修饰植物细胞或孢子中的染色体序列的方法，包括：

[0082] a)组合包含砧木的第一植物(其携带编码经修饰的非天然存在的RNA引导的内切核酸酶的蛋白质的核酸序列)与来自第二植物的嫁接到所述第一植物的砧木上的接穗，由此所述核酸序列在第一植物的砧木中产生转录物，该转录物跨过嫁接连接处全身地转运进入第二植物的接穗，并且该转录物被导入到第二植物的接穗的细胞中，在那里它被翻译成功能蛋白质；

[0083] b)向第二植物的接穗的至少一个细胞或孢子提供至少一种引导RNA或编码至少一种引导RNA的DNA，其中所述至少一种引导RNA是包含与所述第二植物的染色体序列中的靶位点互补的5'区域的单个分子。

[0084] c)使每个引导RNA引导RNA引导的内切核酸酶蛋白到染色体序列中的靶位点，其中所述RNA引导的内切核酸酶蛋白在靶位点引起双链断裂，以及允许细胞通过DNA修复过程修复双链断裂，使得染色体序列在第二植物的接穗的至少一个细胞或孢子中被修饰。

[0085] 编码经修饰的非天然存在的RNA引导的内切核酸酶蛋白的核酸序列可以是稳定整合或瞬时表达的转基因。

[0086] 在一个具体实施方案中，RNA引导的内切核酸酶蛋白衍生自Cas蛋白。Cas蛋白适合为Cas9或其变体。Cas蛋白例如来源于链球菌属(Streptococcus)。

[0087] 在一个具体实施方案中，编码经修饰的非天然存在的RNA引导的内切核酸酶蛋白的核酸序列包含tRNA样结构，其允许转录物全身性地跨过嫁接连接处从第一植物的砧木迁移到第二植物的接穗中。编码经修饰的非天然存在的RNA引导的内切核酸酶蛋白的核酸序列可以进一步包含靶向含有DNA的细胞器的至少一种定位信号和任选标记结构域。标记结构域的非限制性实例是荧光标记(例如绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，mCherry)，表位标签(例如FLAG，His，HA，钙调蛋白)等。

[0088] 定位信号适当地选自包括核定位信号、叶绿体靶向信号、线粒体靶向信号的组。

[0089] 编码经修饰的非天然存在的RNA引导的内切核酸酶蛋白的核酸序列可任选地进一步包含FokI内切核酸酶结构域或另一蛋白结构域。

[0090] tRNA样结构可以是tRNAAla,tRNAArg,tRNAAsn,tRNAAsp,tRNACys,tRNAGln,tRNAGlu,tRNAGly,tRNAHis,tRNAIle,tRNALeu,tRNALys,tRNAMet,tRNAPhe,tRNAPro,tRNASer,tRNAThr,tRNATrp,tRNATyr,tRNAVal。在本发明的上下文中使用的术语“tRNA样结构”还包括缺乏D茎-环、D和T茎-环、或D和A茎-环的tRNA结构。

[0091] tRNA样结构位于转录物的3'UTR、转录物的5'UTR或转录物的编码序列中。

[0092] 在一个实施方案中，引导RNA是单链引导RNA，其中引导RNA是靶向DNA的RNA，其包含a)第一区段，其包含与植物细胞或孢子中的染色体序列互补的核苷酸序列，和b)与RNA引导的内切核酸酶蛋白相互作用的第二区段。合适地，引导RNA是包含crRNA和tracrRNA的单链引导RNA。

[0093] 第一植物中转基因核酸序列的表达适当地通过将所述核酸序列与赋予转基因核酸序列普遍的表达特征或组织或细胞类型特异性表达特征的启动子序列和/或诱导型启动子可操作地连接来实现。上面已经讨论了合适的启动子。

[0094] 在一个实施方案中，启动子序列赋予转基因核酸序列涵盖根的表达特征。

[0095] 当第一植物中转基因核酸序列的表达是瞬时的时，通过使用诱导型启动子适当地实现瞬时表达，所述诱导型启动子选自包括热诱导型启动子、冷诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和醇诱导型启动子的组。上面已经讨论了合适的启动子。

[0096] 将至少一种引导RNA或编码至少一种引导RNA的DNA提供给第二植物的接穗的至少一种细胞或孢子适当地通过注射、农杆菌介导的转化、外源施用或DNA构建体的稳定整合或瞬时表达来实现。

[0097] 本发明进一步涉及这样的方法，其中至少一种引导RNA或编码至少一种引导RNA的DNA的外源施用包括在第二植物或其部分的接穗上施用包含以下物质的混合物：

[0098] a)阳离子聚电解质；

[0099] b)渗透剂；和

[0100] c)至少一种引导RNA或编码至少一种引导RNA的DNA，其中所述至少一种引导RNA是包含与所述第二植物的染色体序列中的靶位点互补的5'区域的单个分子。可以根据专利申请WO2015/200539中的公开内容进行外源施用。

[0101] 在后一种方法的一个实施方案中，对第二植物的至少一种细胞或孢子的染色体序列进行遗传修饰而不插入外部遗传物质。

[0102] 在后一种方法的一个具体实施方案中，第一植物和第二植物属于同一植物科。适当地，第一植物和第二植物属于相同的属，特别是属于相同的植物物种。

[0103] 在进一步的实施方案中，该植物属于以下属之一：甜菜属(Beta)，芸苔属(Brassica)，辣椒属(Capsicum)，菊苣属(Cichorium)，西瓜属(Citrullus)，黄瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，冬瓜属(Benincasa)，胡萝卜属(Daucus)，芝麻菜属(Eruca)，莴苣属(Lactuca)，葫芦属(Lagenaria)，丝瓜属(Luffa)，菜豆属(Phaseolus)，豌豆属(Pisum)，萝卜属(Raphanus)，茄属(Solanum)，菠菜属(Spinacia)，缬草烷属(Valerianella)，烟草属(Nicotiana)，矮牵牛属(Petunia)，拟南芥属(Arabidopsis)，荠菜属(Capsella)，南芥属(Arabis)，苹果属(Malus)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，葡萄属(Vitis)，蔷薇属(Rosa)，草莓属(Fragaria)，杨属(Populus)，山毛榉属(Fagus)，松属(Pinus)，云杉属(Picea)，银杏属(Ginkgo)，落叶松属(Larix)，桦属(Betula)，栎属(Quercus)，柳属(Salix)，桤木属(Alnus)，榛属(Corylus)，桃属(Amygdalus)，越橘属(Vaccinium)，悬钩子属(Rubus)，鳄梨属(Persea)，柑橘属(Citrus)，栗属(Castanea)，槭属(Acer)，梣属(Fraxinus)，咖啡属(Coffea)，山茶属(Camellia)，可可属(Theobroma)，洋橄榄属(Olea)，鹰嘴豆属(Cicer)，胡桃属(Juglans)，黄连木属(Pistacia)，花生属(Arachis)，腰果属(Anacardium)，澳洲坚果属(Macadamia)，榕属(Ficus)，荔枝属(Litchi)，猕猴桃属(Actinidia)，九重葛属(Bougainvillea)，向日葵属(Helianthus)，木槿属(Hibiscus)，锦葵属(Malva)，大豆属(Glycine)，棉属(Gossypium)，大麻属(Cannabis)，甜叶菊属(Stevia)，仙人掌属(Opuntia)，或番薯属(Ipomoea)。

[0104] 在其中不进行嫁接的本发明的一个实施方案中(例如当引导RNA和编码RNA引导的内切核酸酶的转录物通过无DNA递送方法(例如注射引导RNA和编码RNA引导的内切核酸酶的mRNA转录物进入植物的韧皮部)施用于植物时)，该植物可属于以下属之一：葱属(Allium)，芹菜属(Apium)，甜菜属(Beta)，芸苔属(Brassica)，辣椒属(Capsicum)，菊苣属(Cichorium)，西瓜属(Citrullus)，黄瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，冬瓜属(Benincasa)，胡萝卜属(Daucus)，芝麻菜属(Eruca)，莴苣属(Lactuca)，葫芦属(Lagenaria)，丝瓜属(Luffa)，菜豆属(Phaseolus)，豌豆属(Pisum)，兵豆属(Lens)，萝卜属(Raphanus)，茄属(Solanum)，菠菜属(Spinacia)，缬草烷属(Valerianella)，烟草属(Nicotiana)，矮牵牛属(Petunia)，拟南芥属(Arabidopsis)，荠菜属(Capsella)，南芥属(Arabis)，碎米荠属(Cardamine)，苹果属(Malus)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，葡萄属(Vitis)，蔷薇属(Rosa)，草莓属(Fragaria)，杨属(Populus)，山毛榉属(Fagus)，松属(Pinus)，云杉属(Picea)，银杏属(Ginkgo)，落叶松属(Larix)，桦属(Betula)，栎属(Quercus)，柳属(Salix)，桤木属(Alnus)，榛属(Corylus)，桃属(Amygdalus)，越橘属(Vaccinium)，悬钩子属(Rubus)，鳄梨属(Persea)，柑橘属(Citrus)，栗属(Castanea)，槭属(Acer)，梣属(Fraxinus)，咖啡属(Coffea)，山茶属(Camellia)，可可属(Theobroma)，洋橄榄属(Olea)，鹰嘴豆属(Cicer)，胡桃属(Juglans)，黄连木属(Pistacia)，花生属(Arachis)，腰果属(Anacardium)，澳洲坚果属(Macadamia)，榕属(Ficus)，荔枝属(Litchi)，猕猴桃属(Actinidia)，九重葛属(Bougainvillea)，向日葵属(Helianthus)，木槿属(Hibiscus)，锦葵属(Malva)，大豆属(Glycine)，棉属(Gossypium)，大麻属(Cannabis)，甜叶菊属(Stevia)，仙人掌属(Opuntia)，番薯属(Ipomoea)，木薯属(Manihot)，葎草属(Humulus)，金合欢属(Acacia)，苜蓿属(Medicago)，三叶草属(Trifolium)，莲属(Lotus)，蚕豆属(Vicia)，亚麻属(Linum)，荞麦属(Fagopyrum)，玉蜀黍属(Zea)，小麦属(Triticum)，燕麦属(Avena)，大麦属(Hordeum)，稻属(Oryza)，菰属(Zizania)，黑麦属(Secale)，小黑麦属(Triticosecale)，高粱属(Sorghum)，刺竹属(Bambusa)，牡竹属(Dendrocalamus)，甘蔗属(Saccharum)，香茅属(Cymbopogon)，狼尾草属(Pennisetum)，黍属(Panicum)，羊茅属(Festuca)，黑麦草属(Lolium)，梯牧草属(Phleum)，早熟禾属(Poa)，芒属(Miscanthus)，天门冬属(Asparagus)，龙舌兰属(Agave)，丝兰属(Yucca)，椰子属(Cocos)，油棕属(Elaeis)，刺葵属(Phoenix)，孤挺花属(Amaryllis)，水仙属(Narcissus)，芦荟属(Aloe)，美人蕉属(Canna)，鸢尾属(Iris)，秋水仙属(Colchicum)，番红花属(Crocus)，唐菖蒲属(Gladiolus)，灯心草属(Juncus)，百合属(Lilium)，郁金香属(Tulipa)，芭蕉属(Musa)，石斛属(Dendrobium)，蝴蝶兰属(Phalaenopsis)，香荚兰属(Vanilla)，香蒲属(Typha)，姜属(Zingiber)，姜黄属(Curcuma)，浮萍属(Lemna)。

[0105] 本发明将在以下实施例中进一步举例说明，但不以任何方式限制本发明。在实施例中，参考以下附图。

[0106] 图1.作为报告构建体的显性负效DMC1导致花中的雄性不育。

[0107] (A)使用的DNDMC1RNA融合构建体的示意图。拟南芥DNDMC1编码截短的蛋白质，其缺少N末端92个氨基酸并且显性干扰减数分裂，导致畸形花粉和部分雄性不育。将DNDMC1编码序列与嫁接可迁移的StBEL5序列或韧皮部tRNAMet在3'UTR处融合，以评估它们触发跨嫁接连接处的DNDMC mRNA转运的可能性。

[0108] (B)至(E)野生型烟草植物的可育花药显示出规则的花粉产生，具有极少异常形状的花粉(2-3％)，而hpDMC1siRNA转基因烟草植物产生大量异常形状的花粉并且如前所述是不育的(Zhang等人，2014)。YFP-DNDMC1转基因植物具有与野生型相似的正常花粉产生。表达在3'UTR处与tRNAMet或StBEL5融合的DNDMC1的转基因植物表现出增加的雄性不育性。

[0109] (C)和(E)通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对从转基因植物收获的碘化丙啶染色的花粉粒进行成像，并通过自动成像分析算法评估以计数异常形状的花粉(Zhang等人，2014)，以％数字指示。箭号指示正常的花粉；箭头指示异常形状的花粉。比例尺：30μm。

[0110] (F)和(G)进行茎嫁接以评估mRNA向野生型花的转运的方案。

[0111] 图2.DNDMC1融合转录物转运诱导异常的花粉形成。

[0112] (A)由35Spro:YFP-DNDMC1转基因接穗和相互嫁接物支持的嫁接的野生型砧木(stock)植物的花是可育的。

[0113] (B)上图：嫁接的野生型/野生型或野生型/DNDMC1::tRNAMet植物在模拟处理时显示正常的花粉产生。下图：雌二醇诱导的接穗或砧木植物部分中DNDMC1::tRNAMet的表达导致转基因和野生型花中的部分不育花药。后者表明DNDMC1::tRNAMet mRNA转运到野生型雄性母细胞中并在其中表达截短的DMC1蛋白。

[0114] (C)嫁接的DNDMC1::StBEL5转基因植物的花。上图：模拟处理的野生型/雌二醇>>DNDMC1::StBEL5嫁接物显示弱雄性不育。下图：用雌二醇处理的嫁接植物的花表现出部分雄性不育。

[0115] (D)来自嫁接的野生型组织的RNA样品的RT-PCR测定显示，YFP-DNDMC1对照转录物未跨过嫁接接合处分配到野生型砧木叶(n＝6)或接穗花(n＝8)中。ACTIN2(ACT2)特异性RT-PCR用作阳性对照。

[0116] (E)来自嫁接植物的RNA样品的RT-PCR测定。在转基因和野生型接穗花中检测到DNDMC1::tRNAMet和DNDMC1::StBEL5。来自嫁接的野生型砧木叶和野生型花(红色星号)的样品中特定PCR产物的出现表明DNDMC1::tRNAMet融合转录物的迁移性。受试的嫁接植物的数量显示在右侧。

[0117] (F)在产生YFP-DNDMC1的接穗上形成的萼片的CLSM图像。上图：YFP-DNDMC1/YFP-DNDMC1对照嫁接，具有由YFP-DNDMC1发射的预期的高绿色荧光。中图：使用产生siRNA的砧木植物(hpDMC1)的对照嫁接物，具有预期的低YFP荧光和在YFP-DNDMC1花中的分布(Zhang等人，2014)。下图：嫁接到DNDMC1::tRNAMet转基因砧木上的YFP-DNDMC1接穗显示与YFP-DNDMC1/YFP-DNDMC1对照嫁接物相似的YFP荧光水平。注意，在所有表皮叶细胞中检测到YFP-DNDMC1融合蛋白，除了用产生hpDMC1的DMC1siRNA系嫁接时。绿色表示存在YFP-DNDMC1；蓝色：质体自发荧光。比例尺：300μm。

[0118] (G)嫁接植物上出现的畸形花粉的统计分析。在DNDMC1::tRNAMet和DNDMC1::StBEL5砧木植物支持的野生型接穗上畸形花粉的形成比在对照嫁接物中显著更高。星号表示使用列联表中变量的独立性的卡方检验获得的相对对照的高度显著差异。生物学重复：n>8。误差条表示S.D.。有关详细信息，请参见表1。

[0119] 图3.tRNAMet::DNDMC1进入花的迁移和花粉表型。

[0120] (A)上图：由DNDMC1::tRNAMet和tRNAMet::DNDMC1支持的非嫁接转基因植物的花在模拟处理时是可育的。下图：诱导DNDMC1::tRNAMet和tRNAMet::DNDMC1表达的雌二醇应用导致部分不育的花药，表明产生显性负效的DNDMC1蛋白。

[0121] (B)上图：嫁接的tRNAMet::DNDMC1/野生型或野生型/tRNAMet::DNDMC1植物在模拟处理时显示出部分不育花粉的产生。下图：将雌二醇施用于嫁接的tRNAMet::DNDMC1/野生型或野生型/tRNAMet::DNDMC1植物后，在野生型花中形成异常花粉/不育花药表明tRNAMet::DNDMC1mRNA转运和野生型雄性器官中截短的DMC1蛋白的表达。

[0122] (C)来自转基因DNDMC1::tRNAMet(n＝6)和tRNAMet::DNDMC1(n＝7)组织的多聚(A)-RNA样品的RT-PCR测定表明转基因和野生型接穗花中存在融合转录物(红色星号)，表明tRNAMet::DNDMC1融合转录物跨过嫁接连接处的迁移性。所测试的嫁接植物数量显示在右侧。ACTIN2(ACT2)特异性RT-PCR用作阳性对照。

[0123] (D)嫁接植物上出现的畸形花粉的统计分析(表1)。与模拟处理的对照嫁接相比，雌二醇处理的DNDMC1::tRNAMet和tRNAMet::DNDMC1转基因植物以及由tRNAMet::DNDMC1支持的野生型接穗中的畸形花粉的产生显著更高。星号表示使用列联表中变量的独立性的卡方检验获得的相对对照的统计学上显著的差异。生物学重复：n>8。误差条表示S.D.。有关详细信息，请参见表1。注意>3个独立的转基因DNDMC1::tRNAMet或tRNAMet::DNDMC1系用于嫁接实验。

[0124] 图4.在嫁接的拟南芥中的GUS::tRNA融合转录物和迁移性。

[0125] (A)使用的35Spro:GUS::tRNA融合构建体的示意图(对于tRNAMet tRNAGly、tRNAIle和tRNAMet缺失的序列，参见图5)。

[0126] (B)下胚轴嫁接的GUS::tRNAMet/野生型(Col-0)植物的实例。蓝色表示在嫁接连接处上方的下胚轴(箭头)和野生型根尖中存在GUS活性。

[0127] (C)在GUS::tRNA/野生型嫁接中检测到的叶和初生根尖中的GUS活性。数字表示在用指定的转基因系嫁接的植物的野生型根尖或野生型叶脉管系统(箭头)中检测到的GUS染色的分数。每种嫁接组合使用至少3个独立的转基因系(对于嫁接植物的其他图像，参见图6)。

[0128] (D)从嫁接植物收获的多聚(A)-RNA样品的RT-PCR。汇集来自3-5个嫁接植物的三个样品并测试野生型组织中GUS转录物的存在(星号)。数字表示在测试的野生型根或野生型叶RNA样品中GUS多聚(A)RNA的出现。ACTIN2(ACT2)特异性RT-PCR用作阳性对照，证实样品中mRNA的存在。

[0129] 图5.与GUS的3'UTR融合的tRNA序列。

[0130] 与GUS编码DNA序列融合的tRNA序列的比对。携带内含子的GUS序列与tRNAMet(CAU)、tRNAGly(GCC)、tRNAIle(TAT)和tRNAMet(CAU)的缺失变体(命名为tRNAMetΔD，ΔDA，ΔDT和ΔAT)融合。tRNA序列的长度(从GUS ATG起始密码子计数)显示在右侧。星号表示GUS TGA终止密码子。红框表示克隆的tRNA的反密码子序列。

[0131] 图6.下胚轴嫁接的野生型/GUS::tRNA转基因植物的图像。

[0132] (A)下胚轴嫁接的拟南芥Col-0植物的实例图像。所呈现的野生型(Col-0)/转基因植物嫁接组合如上所示。叶区域、根尖和嫁接连接处(箭头)的放大图像由橙色矩形表示。所示植物部分中的蓝色组织表明存在GUS活性。

[0133] (B)在石蜡包埋的嫁接植物上制成的薄切片的显微照片。野生型用GUS::tRNAMetΔDT转基因砧木嫁接。在野生型叶的脉管细胞和与脉管系统相关的细胞中的野生型下胚轴中(箭号)检测到GUS酶活性(蓝色)。箭头表示木质部导管。

[0134] 图7.可迁移的拟南芥mRNA和tRNA样基序的出现。

[0135] (A)所有鉴定的具有由默认RNAMotif tRNA描述符(descriptor)发现的预测的tRNA样结构的可迁移的转录物的数量(n＝3630)，其不捕获tRNAIle(TAT)(图8)。显示了与在迁移数据库中未找到的转录物相关的绝对计数和丰富度。根据Fisher精确检验，星号表示显著计数(p<0.05)。

[0136] (B)tRNA-mRNA串联基因对的基因间距离的归一化频率(估计密度)和累积相对频率(ecdf)，其中tRNA位于编码可迁移的转录物(蓝色)或非可迁移的预测转录物(灰色)的基因上游或下游1000个核苷酸内。垂直虚线表示所示分布的中位数。与不产生可迁移的转录物的基因座相比，可迁移的转录物编码基因座显示出与tRNA基因的显著更接近性(双样品单侧Kolmogorov-Smirnov检验，p<0.004；Cohen's D d＝0.349)。

[0137] (C)根据其反密码子的tRNA基因的数量，其在RNA-Seq数据中被检测为多聚(A)-RNA::tRNA双顺反子转录物。观察到双顺反子的94个tRNA基因的分布以橙色给出；与可迁移的转录物相关的24个tRNA基因的分布以蓝色显示。TAIR10注释的tRNA基因的总数以灰色显示。通过RT-PCR证实具有双顺反子转录物的tRNA基因用星号表示，实验测试的tRNA融合物用箭头标记。(D)拟南芥胆碱激酶1(CK1，AT1G71697)基因和分析的插入突变体的示意图。注意CK1 mRNA以双顺反子多聚(A)-tRNA转录物的形式存在，并且ck1.2突变体在CK1终止密码子和3'UTR中的注释的tRNAGly(AT1G71700)之间携带T-DNA插入，导致缺乏tRNAGly序列的截短的多聚(A)转录物。RT-PCR引物如下所示：与CK1CDS的外显子7结合的P1，与tRNAGly序列结合的P3用于野生型CK1::tRNAGly鉴定。将P1与跨越T-DNA左边界和CK1 3'UTR的P2一起用于特异性ck1.2检测。

[0138] (E)用指示的引物进行的RT-PCR显示CK1多聚(A)转录物存在于源自茎嫁接的野生型Col-0组织的ck1.2突变体样品(星号)中。在彼此的野生型样品中，未检测到在ck1.2中产生并缺少3'UTR tRNAGly序列的突变CK1多聚(A)转录物。

[0139] (F)ck1.1和ck1.2的表型和转录物的定量实时RT-PCR。野生型和ck1.2植物显示出相似的高水平CK1表达，而ck1.1突变体显示非常低的表达。成年植物的莲座区域大小测量显示ck1.1和ck1.2突变体均显著小于野生型(学生T-检验，突变体相对野生型；p值ck1.1＝0.006；p值ck1.2＝0.002；n＝16株植物/系)。误差条：S.D.。

[0140] (G)根据其最小自由能(MFE)预测的GUS TLS 3'UTR基序的示意性折叠结构。

[0141] 图8.可迁移的mRNA中存在的tRNA样序列(TLS)的计算分析。

[0142] (A)tRNA结构描述符和tRNAMet、tRNAGly和tRNAIle的结构比对。数字表示结构元素(茎和环)的可接受的描述符范围。注意，tRNA描述符不识别tRNAIle的结构，其在与GUS融合时不赋予迁移性。

[0143] (B)评估tRNA描述符约束的参数空间。鉴于tRNA描述符模型，我们测试了可迁移的预测基因转录物相对于不可迁移的预测基因转录物中TLS的富集。默认的tRNA描述符(由坐标原点的红色圆圈表示，p＝0.001)表示与不可迁移的转录物相比，可迁移的转录物中的命中的富集数量更多。从默认tRNA描述符参数的偏离通过最小元素长度(y轴)的约束值的差异上的总和以及最大元素长度差异(x轴)上的总和来表示。在20,000个生成的描述符中，绘制了对不可迁移的数据集(不包括tRNA基因)具有少于5,000个基因命中的13,598个。着色是根据从可迁移的转录物序列相对于不可迁移的转录物序列的基序命中的计数得到的p值(Fisher精确检验)，点大小表示可迁移的转录物的命中数。增加RNA结构模型中的最小茎和环长度导致可迁移的转录物数据集中的匹配数量较少。类似地，放松最大长度约束导致不可迁移的数据集中的假阳性匹配的数量更大，因此，可迁移的转录物相对于不可迁移的转录物的基序命中变得较不显著。

[0144] (C)与可迁移的(n＝3,606)相对于不可迁移的(n＝23,132)预测mRNA的150nt 3'-末端序列区域的预测结构相关的结构度。上图显示了在预测的配对碱基数方面的结构性。下图显示预测的最小自由能(MFE)的方面。垂直虚线表示两个分布的中位数。
实施例

[0145] 实施例1

[0146] tRNAMet融合转录物迁移进入花中

[0147] 引言

[0148] 为了建立用于含有预测的迁移性基序如TLS的mRNA的简单的表型评分系统，使用缺乏N末端92氨基酸残基(图1A)和干扰减数分裂进展的显性负效拟南芥DMC1变体(DNDMC1)。

[0149] 方法

[0150] 植物材料和生长条件

[0151] 烟草(N.tabacum cv.Petite Havana)植物在无菌条件下在含有30g L-1蔗糖的琼脂固化培养基上生长。将生根的烟草植物转移到土壤中并在标准温室条件(相对湿度：55％；白天温度：25℃；夜间温度：20℃；昼夜循环：16小时光照/8小时黑暗；光照强度：190-
600μE·m-2·s-1)下生长至成熟。

[0152] 嫁接和雌二醇处理

[0153] 用于嫁接实验的烟草植物在温室土壤上生长2至3个月。如前所述使用标准剪接嫁接程序(Zhang等人，2014)。简而言之，携带五个完全展开的叶的具有相同茎直径的植物被用作砧木和接穗材料；通过从植物顶部除去顶端叶并保留两到三个源叶来制备砧木。通过在茎尖下方3至4cm切割茎并移除源叶来制备接穗。在砧木茎上(与垂直方向成约30度)进行长的倾斜切割，在接穗基部具有匹配的切口。将两个切口的表面立即压在一起，并用封口膜紧密包裹连接处。嫁接接穗后第一周用塑料袋覆盖并保持在高湿度下。

[0154] 在建立嫁接连接后，移除在砧木上出现的腋生枝和叶，以强制接穗的顶端优势。在诱导花之前，将与羊毛脂(Sigma-Aldrich)混合的5μM 17-β-雌二醇(1000x储备溶液：在DMSO中的5mM 17-β-雌二醇，在-20℃储存)用浸湿的薄纸施加到砧木植物叶表面的近轴侧以诱导基因表达。将薄纸留在表面上以标记诱导位点。在接穗上出现花后，对部分诱导叶和首先出现的封闭花进行取样，用于通过RT-PCR检测融合转录物的存在。

[0155] RNA分离和逆转录反应

[0156] 如前所述(Zhang等人，2009)，在1mL Trizol试剂(Invitrogen)(0.5ml/100mg组织)中制备样品。离心(10,000g，4℃10分钟)后，将上清液(～1ml)转移到新的无RNA酶的管中，用200μl氯仿提取一次，并用50μl氯仿提取一次。为了沉淀RNA，向上清液中补充两倍体积的99％异丙醇、0.1体积的3M乙酸钠(pH 5.2)、1μg线性丙烯酰胺(Invitrogen)，并在-20℃温育>1小时。离心(16,000g，4℃30分钟)后，将得到的沉淀用80％乙醇洗涤两次，用99％乙醇洗涤一次，晾干，并重悬于20μl无RNA酶的水中。为了确定RNA质量和浓度，将1μl每种RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳(2％，琼脂糖，1x TBE)并使用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)定量。

[0157] 用1U/μl AMV逆转录酶(Promega)进行具有以下修改的逆转录反应：在寡(dT)引物存在下，总RNA(～4μg)在70℃变性10分钟，然后在RT反应之前在37℃进行5分钟的退火孵育，然后在42℃孵育1小时，并在72℃孵育10分钟以灭活。在标准PCR条件下进行RT-PCR，进行40-45个循环。用于RT-PCR的寡核苷酸列于表2中。

[0158] 表2.研究中使用的寡核苷酸。

[0159]

[0160]

[0161]

[0162]

[0163]

[0164] 表达构建体

[0165] 为了在具有3'UTR和5'UTR融合体的拟南芥DMC1(DNDMC1)转录物中产生具有N-末端92个氨基酸缺失的显性负效AtDMC1，基于pMDC7(Curtis and Grossniklaus，2003)主链创建称为pRD1和pRD4的表达二元构建体。将DNDMC1片段引入到pMDC7gateway克隆盒的5'或3'，这产生模板双元载体，其用于通过gateway反应克隆StBEL5的RNA序列，或DNDMC1ORF与启动子或终止子之间的tRNAMet(图1A)。

[0166] 合成的寡核苷酸用于产生gateway ENTRY克隆，其具有用于与二元载体gateway重组的相应序列(表2)。基于pMDC7的二元载体构建体允许雌二醇诱导的DNDMC1::RNA或RNA::DNDMC1表达。用于35Spro:YFP-DNDMC1表达的pEarlyGate104和DMC1siRNA烟草系(35Spro:BcDMC1hpRNAi)及其功能先前已描述(Zhang等人，2014)。

[0167] 显微镜和花粉形状分析

[0168] 如前所述(Zhang等人，2014)进行指示不育性的统计花粉形状分析。收集烟草花粉并用碘化丙锭(0.01mg/ml，Molecular Probes，USA)染色。为了使花粉的形状和大小成像，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM；TCS SP5；Leica Microsystems)。该系统具有以下设置：检测通道2(红色)：570-650nm。通道2增益(PMT)设定在500-600V之间，针孔：1.0Airy单位，5个具有5-6μm的Z-堆叠(Z-stack)被合并并用于所描述的形状识别算法(Zhang等人，2014)。

[0169] 如所述的(Zhang等人，2014)检测YFP荧光，使用以下设置：具有1.5Airy单位的最大空气针孔的顺序通道扫描模式。为了比较植物之间的YFP荧光强度，使用相同的设置，例如激光功率、增益电压、针孔、物镜、放大率和通道/滤波器波长。使用Image J软件包(NIH)组装和处理Z-堆叠图像。检测通道1(绿色)：535至617nm；检测通道2(红色)：未使用；检测通道3(蓝色；叶绿体/质体自发荧光)：695至765nm。通道1增益(PMT)设置在500-600V之间。

[0170] 结果

[0171] DMC1是特异性减数分裂细胞周期因子，并且是在孢子形成细胞的减数分裂过程中活跃的DNA依赖性ATP酶的高度保守的RecA型重组酶家族的成员。功能性DMC1/RAD51复合物的缺乏诱导无交叉减数分裂，导致形成含有异常数量的染色体的异常形状的花粉，并因此对于适当的花粉发育是必需的。因此，花药中畸形花粉的产生和可育性降低用作读出，表明可迁移的DMC1siRNA的存在(图1B，C)和/或可迁移的显性负效DNDMC1mRNA的翻译产物的存在。

[0172] 为了实现mRNA迁移性报告系统，产生表达与已知的可迁移的全长StBEL5转录物(Cho等人，2015)(DNDMC1::StBEL5)和全长tRNAMet(AT5G57885；DNDMC1::tRNAMet；tRNAMet::DNDMC1)(其在南瓜的韧皮部液中检测到)(图1A)融合的DNDMC1mRNA的转基因烟草植物。证实表达这些构建体的植物显示花粉不育表型(图1D，E)，并将它们用于嫁接实验(图1F，G)以评估从转基因源组织到野生型花的转录物迁移性。

[0173] 首先通过RT-PCR证实DNDMC1本身不是可迁移的，因此适合作为产生花粉表型的转录物迁移性报道分子(图2A)。接下来，通过用野生型植物嫁接DNDMC1::StBEL5、DNDMC1::tRNAMet或tRNAMet::DNDMC1转基因植物来探寻融合转录物的迁移性，并检查花粉不育性和在野生型花中融合转录物的存在(图2B-G；图3)。

[0174] 正如预期的那样，在用雌二醇诱导后，嫁接到野生型砧木上的DNDMC1::StBEL5接穗在花中的异常花粉形成百分比(30.9±7.6％)显著高于嫁接的野生型植物(4.0±3.0％)(图2C；表1)。确认StBEL5融合转录物是可迁移的，嫁接到DNDMC1::StBEL5砧木上的野生型植物比野生型对照产生显著更高数量的畸形花粉(19.7±14.3％)，并通过RT-PCR证实融合转录物在封闭的野生型花中的存在(图2E)。因此，DNDMC1-RNA融合构建体可以通过产生可量化的花粉表型而用作RNA迁移性报告系统。

[0175] 接下来，为了了解韧皮部分配的tRNA是否含有介导长距离mRNA迁移的必要结构信息，嫁接表达3'UTR DNDMC1::tRNAMet(图2B)或5'UTR tRNAMet::DNDMC1(图3)融合构建体的转基因植物。通过在嫁接后约1.5周和在花诱导之前将雌二醇施用于转基因源叶(砧木)或转基因茎(接穗)来诱导表达。与对照嫁接物和野生型植物相比，雌二醇处理的嫁接植物形成了明显更高数量的畸形花粉(14.2±7.6％；表1)(图2A，B)，并且RT-PCR测定证实了DNDMC1::tRNAMet和tRNAMet::DNDMC1多聚(A)转录物在转基因砧木植物上形成的野生型花中的存在(图
2E，图3)。

[0176] 表1.野生型、转基因和嫁接的烟草植物的花粉形状分析。

[0177]

[0178]

[0179] 星号表示使用列联表中变量的独立性的卡方检验获得的相对野生型对照的畸形花粉的增加的数量的统计学显著性(ns-不显著，*p值≤0.05，**p值≤0.01，***p值≤0.001)

[0180] 为了排除嫁接的嵌合植物产生进入野生型花组织并触发花粉不育表型的可迁移的DMC1siRNA沉默信号的可能性，嫁接了DNDMC1：tRNAMet植物与产生黄色荧光YFP-DNDMC1融合蛋白的报告系。与DMC1siRNA对照系相反，在萼片中未检测到siRNA介导的YFP-DNDMC1报道构建体的全身沉默(图2F)。因此，DNDMC1::tRNAMet融合转录物不诱导全身沉默，并且观察到的嫁接植物中花粉形成的缺陷(图2G)可归因于DNDMC1融合转录物的全身递送。

[0181] 总之，5'或3'UTR中全长tRNAMet序列的存在触发DNDMC1多聚(A)转录物从砧木到源叶的转运和进入孢子形成组织中的转运，在孢子形成组织中它被翻译，因为其干扰雄性组织的减数分裂。

[0182] 实施例2

[0183] tRNA具有全身mRNA迁移的信号

[0184] 为了评估与病毒TLS相关的特定tRNA序列是否介导全身mRNA迁移，韧皮部输入的Met GlytRNA (72个碱基；TAIR#AT5G57885)和tRNA (74个碱基；TAIR#AT1G71700)和非韧皮部输入的tRNAIle(73个碱基；TAIR#AT3G05835)(Zhang等人，2009)的核心tRNA序列被融合到细胞自主性β-GUS mRNA序列的3'UTR(图4A，图5)。为了评估融合转录物的迁移性，产生表达
35Spro:GUS或35Spro:GUS::tRNA融合构建体的拟南芥Col-0系，并用Col-0野生型(芽或根)嫁接下胚轴。

[0185] 方法

[0186] 植物材料和生长条件

[0187] 使用野生型(Col-0)和生态型Col-0的转基因35Spro:β-GUS,ck1.1(SALK_070759)、ck1.2(SALK_023420)植物的拟南芥种子并在用于生长测定的受控环境室中或在温室土壤上(相对湿度：60％；白天温度：22℃；夜间温度：19℃；昼夜循环：16小时光照/8小时黑暗；光照强度：170-200μE·m-2·s-1)生长。SALK-系获自Salk Institute Genomic Analysis Laboratory,California(Alonso等人，2003)。

[0188] 嫁接

[0189] 如所述的(Thieme等人，2015)进行拟南芥下胚轴嫁接。简而言之，植物在22℃在固体0.5MS培养基(1％蔗糖)上垂直生长，光周期为8小时光照(注量率为100μmol m-2s-1)。发芽后4天将温度升至26℃以减少不定根形成。发芽后6至7天，如所述的(Thieme等人，2015)，在不育条件下将幼苗用于嫁接。

[0190] 简而言之，用刮胡刀片(Dumont；No.5)在下胚轴中间横向切割幼苗，并将硅箍(NeoTecha； )滑套在其中插入接穗的砧木上。将嫁接的小植株置于固体0.5MS培养基(补充有1％琼脂和1％蔗糖)上，并在22℃生长(8小时光照)。每两天切割出现的不定根，并在两周后，将成功嫁接的植物进行组织化学GUS染色测定，或分别收获根和芽材料用于GUS转录物的RT-PCR检测。

[0191] 表达构建体

[0192] 通过使用覆盖GUS起始密码子的NcoI GUS正向引物和覆盖GUS终止密码子和tRNA序列的BstEII GUS反向引物的PCR扩增产生在3'UTR中含有tRNAMet(AUG)、tRNAGly(GGC)或tRNAIle(AUA)和tRNAMet(AUG)变体的GUS融合构建体。用含有XbaI位点的非特异性XbaI反向引物再次扩增得到的PCR片段，以鉴定克隆的片段。将得到的NcoI-BstEII消化的片段克隆到相应经消化的允许表达由35S启动子驱动的GUS::tRNA构建体的pCambia1305.1(Chen等人，1998)中。PCR反应中使用的所有合成寡核苷酸列于表2中。

[0193] β-葡萄糖醛酸酶(GUS)检测

[0194] 使用在80％丙酮中于-20℃孵育20分钟的植物材料进行与底物X-Gluc的组织化学反应，用50mM pH 7.0的NaPO4缓冲液洗涤2次。将染色溶液(以25mg/ml在50mM pH 7.0的NaPO4缓冲液中稀释的1mM X-Gluc，补充有2mM铁氰化钾，2mM亚铁氰化钾，0.1％Triton X-100)真空渗透15分钟。染色反应在37℃进行过夜，并通过在70％乙醇中对组织进行三次1小时的漂洗来终止。

[0195] 通过立体显微镜(Leica，DFC300，FX)检查染色的植物材料。对于薄切片，GUS染色的样品在乙醇系列(包括固定步骤20％乙醇，35％乙醇，50％乙醇，新鲜制备的FAA(50％乙醇，3.7％甲醛，5％乙酸)，70％乙醇)中脱水，在室温下各进行30分钟。然后使用封闭的组织处理器Leica ASK300S和包埋中心Leica EG1160将样品包埋在石蜡中。将10μm和20μm的纵向和横向切片置于聚L-赖氨酸涂覆的载玻片上。

[0196] 将样品在42℃干燥过夜后，将载玻片在histoclear中脱蜡两次，每次10分钟，然后在室温下在恒定移动下在99.8％乙醇中孵育两次，每次10分钟。干燥过夜后，用Entellan new(Merck Millipore)固定盖玻片，并用落射荧光显微镜(BX61，Olympus)检查。

[0197] 生物信息学分析

[0198] tRNA基序扫描

[0199] 所有蛋白质编码基因的参考序列(与所有编码蛋白质的拟南芥基因相关的可用cDNA序列数据，TAIR10(Lamesch等人，2012)，不包括细胞器基因组)根据它们如在异种嫁接的拟南芥品种材料或菟丝子寄生拟南芥-宿主相互作用(Thieme等人，2015)中检测到的可迁移或不可迁移的注释分为不同的集合。对两个可迁移集合共有的(n＝486)、存在于其中至少一个的(n＝3606)基因以及根据观察到的运动方向(根到芽，芽到根，和双向)生成子集。将指定为不可迁移的所有基因和相关转录物用作对照。对所有集合就重复序列进行过滤，并移除注释的tRNA基因。从tRNAdb(Juhling等人，2009)获得tRNA序列数据。在结构基序扫描之前，每个序列用50“N”前导和尾随字符填充，以便于检测在tRNA受体臂上没有不对称末端的末端定位的tRNA结构，其是默认tRNA描述符所需的。使用提供的tRNA结构描述符和默认参数设置，通过RNAMotif 3.1.1版(Macke等人，2001)分析所有集合。与背景数据相比较的与编码可迁移的转录物的基因相关的基序富集通过Fisher精确检验进行评估。通过默认tRNA描述符的置换扫描评估搜索的tRNA样结构的特异性。

[0200] 通过随机改变模型中茎和单链环的可接受的最小和最大长度限制产生20,000个不同的tRNA描述符(正态分布，使用μ＝0，sigma＝5；最小茎长度设置为3nt)。通过使用默认设置的RNAMotif针对可迁移/不可迁移数据评估每个描述符。结构性；即，通过切除150nt 3'-末端序列部分并随后分析其预测的二级结构(RNAfold，默认设置)来获得3'UTR内碱基配对的核苷酸的百分比和相关的能量学。

[0201] tRNA-mRNA串联扫描

[0202] 根据TAIR10基因模型鉴定与tRNA基因座相邻的基因，包括蛋白质编码、非编码基因和假基因。通过非参数Kolmogorov-Smirnov检验(单侧检验)估计基因邻近分布差异(tRNA基因与可迁移相对不可迁移基因邻居之间的距离)的统计学显著性；基于观察到的平均差异和相关的标准偏差，通过效应大小(Cohen's D)评估相关性。

[0203] 双顺反子tRNA分析

[0204] 拟南芥参考基因组(TAIR10)序列信息获自拟南芥信息资源(http://www.arabidopsis.org)，相关的基因模型描述(gtf版本10.30)来自http://
plants.ensembl.org。从序列读取档案(SRA)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，登录号SRX853394(14.1G碱基，根样品)和SRX853395(15.3G碱基，芽样品)(Thieme等人，2015)以及DRX014481(19G碱基，根样品)和DRX014482(32.7G碱基，根样品)中获得配对末端RNA-Seq数据(来自两端的100nt读数)。通过使用Trimmomatic(Lohse等人，2012)标准设置(ILLUMINACLIP::2:40:15,LEADING:3,TRAILING:3,SLIDINGWINDOW:4:15,和MINLEN:36)对阅读数据进行了质量调整，并对Illumina衔接子序列进行了修剪。

[0205] 基于Ensembl基因模型描述，通过STAR v2.5.1(Dobin等人，STAR：ultrafast universal RNA-seq aligner，Bioinformatics 2012)完成序列配对针对拟南芥参考基因组(TAIR10)的映射。考虑到拟南芥基因组中的大量tRNA基因及其相似序列，排除了具有多重比对的读数，基因连接点的最小突出部分对于注释的连接点设置为10nt，对于未注释的连接点设置为20nt，每对允许的最大错配数量是10nt(outFilterMultimapNmax 1,alignSJDBoverhangMin 10,alignSJoverhangMin 20,outFilterMismatchNmax 10)。

[0206] 随后，检查具有最小比对质量Q≥10的映射到染色体1至5的所有读数对以与tRNA和mRNA基因注释两者相交。最后，鉴定出的132个双顺反子多聚(A)-RNA::tRNA转录物按其tRNA基因同一性(118个独特的tRNA基因，图7C)以及蛋白质编码基因(120个独特基因)和指定的转录物迁移性进行分组。将结果与注释的tRNA-mRNA串联列表进行比较，并且通过Fisher精确检验评估观察到的与双顺反子转录物的重叠的统计学显著性。

[0207] 结果

[0208] 嫁接后两周，原位观察到GUS酶活性(图4B，C；图6)。与缺乏3'UTR中的tRNA序列的转基因35Spro:GUS植物的对照嫁接物在远处野生型根(n＝0/55个嫁接物)或叶(n＝0/43个嫁接物)组织中未显示GUS活性和GUS mRNA存在，表明GUS mRNA和GUS蛋白均未迁移跨过嫁接连接处(图4C，D)。

[0209] 然而，在用表达GUS::tRNAMet(n＝9/44个嫁接物)或GUS::tRNAGly(n＝6/25个嫁接物)的转基因接穗植物嫁接下胚轴后，在野生型根中的韧皮部相关细胞中检测到GUS活性。在用表达GUS::tRNAIle(n＝0/57个嫁接物)的植物嫁接的野生型根中未观察到GUS活性。再次，RT-PCR测定证实嫁接后野生型根中GUS::tRNAMet和GUS::tRNAGly的存在，以及GUS::
tRNAIle转录物的不存在(图4D)。值得注意的是，具有转基因根和野生型接穗的反向嫁接物表明，芽-根迁移的GUS::tRNAMet融合转录物不从根迁移到芽(n＝0/36个嫁接物)并且GUS::
tRNAGly几乎不从根迁移到芽(n＝3/26个嫁接物)。

[0210] 为了了解是否需要整个tRNA序列或子序列是否足以介导mRNA迁移性，使用缺乏指定的二氢尿苷(D)-、反密码子(A)-或TψC(T)-臂/环结构和其组合的tRNAMet缺失构建体使(图4C)。再次，将表达这些GUS mRNA融合构建体的植物与野生型植物嫁接，然后测试GUS活性和融合转录物的存在。如GUS和RT-PCR测定所示，ΔD、ΔDT和ΔDA，而不是ΔAT tRNAMet缺失构建体，足以介导GUS转运到野生型根中，并且以非常低的频率转运至接穗叶(图4C，D)。在野生型根和叶的韧皮部相关细胞中GUS::ΔDtRNAMet转录物和翻译的存在显示仅需要部分tRNAMet序列来触发迁移性。这也证明A-和TψC发夹-环序列在触发mRNA转运中具有冗余的作用，因为只有A和TψC发夹环序列两者的缺失消除了GUS融合转录物的迁移性。

[0211] 为了阐明tRNA序列或相关的TLS基序是否赋予mRNA迁移性，评估了在拟南芥中发现的内源可迁移的mRNA群体是否富含与病毒TLS相关的tRNA序列。为此目的，筛选拟南芥嫁接可迁移的转录组数据库(n＝3606)(Thieme等人，2015)中mRNA UTR和编码序列(CDS)中TLS基序的存在(图7A)。使用提供的识别tRNA茎-环排列的共有tRNA描述符(Macke等人，2001)进行针对序列非依赖性结构基序的扫描(图8)。分析显示，在拟南芥(11.4％；n＝3606中的411个)或葡萄(Vitis vinifera)(7.5％；n＝3333中的249个)中发现的大量的可迁移的转录物携带被发现富集在CDS和3'UTR中的TLS基序(图7A)。此外，注释的tRNA基因在编码可迁移的转录物的基因附近过度呈现。独立于DNA链分配，侧翼为tRNA基因的1,125个基因中的158个产生可迁移的RNA，并且在这158个例子中，113个位于1,000bp距离间隔内(图
7B)。

[0212] 实施例3

[0213] tRNA样结构介导的mRNA迁移性对正常发育和功能是重要的

[0214] 引言

[0215] 为了证实实施例1和2的发现，并证实TLS在内源基因的转录物迁移中起作用的观点，分析了产生嫁接可迁移的转录物(Thieme等人，2015)的胆碱激酶1(CK1；TAIR#AT1G71697)基因的插入突变体，其在tRNAGly基因座附近并且根据配对的末端测序数据产生双顺反子转录物。

[0216] 方法

[0217] 嫁接

[0218] 用于CK1迁移性测定的拟南芥花序茎嫁接的详细程序如所述的(Nisar等人，2012)进行，并且在嫁接后一周收获样品用于RNA提取和RT-PCR检测。

[0219] 定量RT-PCR

[0220] 使用4μg总RNA、2.5μl SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)、0.2μM正向和反向引物，根据SYBR Green方法以5μl体积进行定量实时PCR。对于每个基因组确认的ck1突变体，分离并使用来自3-5个个体植物的RNA。至少执行了三次技术重复。以以下热循环方案使用ABI系统序列检测器(Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR)：阶段1：1个循环，在50℃2分钟；阶段2：1个循环，在95℃10分钟；阶段3：40个循环，在95℃15秒，在60℃1分钟。解离阶段：在95℃15秒，在60℃15秒，在95℃15秒。用于RT-PCR的寡核苷酸列于表2中。

[0221] 结果

[0222] CK1催化胆碱与磷脂酰胆碱的反应(并且CK1转录物是双顺反子，在3'UTR区域含有tRNAGly(TAIR#AT1G71700)序列(CK1::tRNAGly)。为了检测CK1mRNA的迁移性是否依赖于GlytRNA 在3'UTR中的存在，首先确认并随后使用用于嫁接实验的两个SALKT-DNA插入系：
ck1.1(SALK_070759)和ck1.2(SALK_023420)(图7D)。在ck1.1突变体中，T-DNA定位在第一个内含子中，而ck1.2突变体在CK1基因的终止密码子和注释的tRNAGly序列之间具有T-DNA插入，导致CK1的编码序列和tRNAGly序列彼此远离。

[0223] 用ck1.2和野生型(Col-0)进行拟南芥茎嫁接实验，并通过RT-PCR测定野生型CK1::tRNAGly和截短的ck1.2mRNA在砧木和接穗样品中的存在(图7E)。

[0224] 尽管ck1.2突变体产生含有所有蛋白质编码序列的全长CK1多聚(A)转录物，但是在野生型样品中不能检测到缺乏tRNAGly序列的截短的转录物。相反，野生型CK1::tRNAGly转录物存在于ck1.2接穗和ck1.2砧木组织样品中。这表明CK1::tRNAGly转录物从砧木到接穗是可双向迁移的(图7E)，而缺乏tRNAGly序列的突变体ck1.2转录物不转运跨过嫁接连接处。因此，内源产生的双顺反子CK1::tRNAGly转录物的嫁接迁移性取决于3'UTR tRNAGly序列的存在。

[0225] 由于可检测的ck1.2转录物迁移性的缺乏可能是低表达水平的结果，因此进行定量RT-PCR测定以评估两种ck1.1和ck.2突变体和野生型植物中的CK1表达水平。这里，在ck1.1突变体中仅检测到最小表达，而ck1.2突变体中的CK1转录物水平与野生型中发现的相似(图7F)。尽管野生型和ck1.2突变体植物产生相似水平的CK1多聚(A)-RNA转录物，但ck1.2系和ck1.1系显示与野生型相比莲座叶大小的显著减少(图7F)。这意味着拟南芥的正常生长行为不仅需要CK1mRNA在表达细胞中的存在，而且还需要整个植物中CK1mRNA的迁移性。

[0226] 引用的参考文献

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