一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法

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一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法
申请号	CN201910493158.X	申请日	2019-06-06	公开(公告)号	CN110079552A	公开(公告)日	2019-08-02
申请人	玉林师范学院;			发明人	任振新; 史列琴;
摘要	本发明公开了一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，旨在解决现有的筛选方法成本高、品种不全以及破坏生物化学性质的问题。所述筛选方法通过构建ZEB1启动子pZEB1驱动表达载体phZEB1-PURO-GFP并转染肿瘤细胞，通过筛选可获得具有肿瘤干细胞特性且ZEB1高表达的细胞株系。该发明的高迁移性肿瘤细胞株筛选方法可用于各种类型肿瘤干细胞的筛选。
权利要求	1.一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，通过构建ZEB1启动子pZEB1驱动表达载体phZEB1-PURO-GFP并转染肿瘤细胞，通过筛选可获得具有肿瘤干细胞特性且ZEB1高表达的细胞株系。 2.根据权利要求1所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，所述表达载体phZEB1-PURO-GFP的构建方法，包括以下步骤：(1)分别以PLKO-PURO载体和人基因组为模板，PCR扩增PURO基因和ZEB1启动子序列； (2)将puro构建到pIRES2-EGFP载体得到PI-PURO-EGFP，然后将pZEB1启动子插入到PI-PURO-EGFP中得到PI-pZEB-PURO-EGFP，最后将pZEB-PURO-EGFP片段切下构建到PCDNA3.0中，命名为phZEB1-PURO-GFP。 3.根据权利要求2所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增PURO和ZEB1启动子序列使用的引物组为：phZEB1-F:GCAGATCTGTGGTTATCTGTATGGTCTTTTCAG Bgl IIphZEB1-R:GCCTGCAGCTGCTTTCTGCGCTTACACCTGG Pst IPURO-F:CGCTGCAGCTCGAGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGC PstIPURO-R：GCGGATCCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATG BamHI。 4.根据权利要求2所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，将pZEB-PURO-EGFP片段切下的限制性内切酶为BglII和NotI。 5.根据权利要求1或2或3所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，所述转染肿瘤细胞为786-O肿瘤细胞。 6.根据权利要求5所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，所述转染肿瘤细胞前用胰酶消化786-O细胞，使其转染日密度为90％。 7.根据权利要求1所述的一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法为绿色荧光蛋白检测和嘌呤霉素双重筛选。
说明书全文	一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法技术领域 [0001] 本发明涉及细胞的筛选方法，具体涉及了一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法。背景技术 [0002] 上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞的极性、粘附性及细胞间的紧密连接逐渐丧失，获得侵袭和迁移的能力，并且产生大量细胞外基质，抑制细胞的凋亡，变成了具有间质细胞形态和特性的细胞。EMT是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程(Huang et al.2013；Hu et al.2018)。此外，越来越多的证据表明，EMT能诱导细胞肿瘤干细胞特性(Cancer stem cell，CSC)，产生具有侵袭和转移的CSC(Mani et al.2008；Zhang et al.2018)(Ze-Yu et al.2014)，表明EMT和肿瘤干细胞特性形成是紧密关联的过程(Abell and Johnson 2014)。然而，肿瘤干细胞数量稀少，分离及纯化较难，成为肿瘤干细胞相关研究的关键性技术瓶颈问题。 [0003] 虽然越来越多的证据支持肿瘤是一种干细胞疾病，但是CSC的研究仍然存在许多难题：(1)CSC在肿瘤组织中含量少，分离和鉴定技术不完善。(2)并不是在所有肿瘤中都分离到CSC。(3)CSC发生、发展机制尚不明确。因此需要大量的CSC作为研究材料。目前，干细胞分选主要为细胞表面标志物分选法，但该方法存在许多不足。首先，通过该方法获得的肿瘤干细胞，破坏了细胞的生物化学性质，不利于后续的检验研究。其次，该方法需要复杂的操作和昂贵的设备支持，且分离的通量受到设备和操作参数的影响，如FACS需要使用合适的电压进行，在需要提高操作通量增加电压时又会影响到目标细胞的活性。第三，该方法分离肿瘤干细胞，耗时长，成本高，且品种不全。由于CSC资源匮乏，严重阻碍了CSC相关研究的步伐。建立一种简便、快捷、通用的CSC制备方法迫在眉睫。 [0004] 筛选干细胞特性的EMT细胞并进行研究，将有助于加快阐明肿瘤转移及干性形成的分子机制，从而对药物研发、提高患者生存率和改善患者生活质量具有重要意义。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，该方法具有简单、快捷、阳性率高等特点，获得的肿瘤细胞可为阐明EMT和CSC形成机制奠定坚实的基础。 [0006] 本发明的目的通过如下技术方案实现： [0007] 一种高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，通过构建ZEB1启动子pZEB1驱动表达载体phZEB1-PURO-GFP并转染肿瘤细胞，通过筛选可获得具有肿瘤干细胞特性且ZEB1高表达的细胞株系。 [0008] 进一步地，所述表达载体phZEB1-PURO-GFP的构建方法，包括以下步骤： [0009] (1)分别以PLKO-PURO载体和人基因组为模板，PCR扩增PURO基因和ZEB1启动子序列； [0010] (2)将puro构建到pIRES2-EGFP载体得到PI-PURO-EGFP，然后将pZEB1启动子插入到PI-PURO-EGFP中得到PI-pZEB-PURO-EGFP，最后将pZEB-PURO-EGFP片段切下构建到PCDNA3.0中，命名为phZEB1-PURO-GFP。 [0011] 进一步地，所述PCR扩增PURO和ZEB1启动子序列使用的引物组为： [0012] phZEB1-F:GCAGATCTGTGGTTATCTGTATGGTCTTTTCAG Bgl II [0013] phZEB1-R:GCCTGCAGCTGCTTTCTGCGCTTACACCTGG Pst I [0014] PURO-F:CGCTGCAGCTCGAGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGC PstI [0015] PURO-R：GCGGATCCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATG BamH I [0016] 引物phZEB1-F、phZEB1-R、PURO-F、PURO-R的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 [0017] 进一步地，将pZEB-PURO-EGFP片段切下的限制性内切酶为BglII和NotI。 [0018] 进一步地，所述转染肿瘤细胞为786-O肿瘤细胞。 [0019] 进一步地，所述转染肿瘤细胞前用胰酶消化786-O细胞，使其转染日密度为90％。 [0020] 进一步地，所述的筛选方法为绿色荧光蛋白检测和嘌呤霉素双重筛选。 [0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： [0022] 1.本发明的高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，具有简单、快捷、阳性率高等特点，获得的肿瘤细胞可为阐明EMT和CSC形成机制奠定坚实的基础。其中，ZEB1是EMT的关键转录因子之一，在EMT发生中起到重要作用。在多种癌症中发现肿瘤起始干细胞上皮－间质转化的转录因子ZEB1的表达增加，且ZEB1能够诱导肿瘤细胞的EMT和CSC的产生。构建ZEB1启动子驱动嘌呤霉素抗性基因+GFP绿色荧光蛋白基因的真核表达载体并转染肿瘤细胞，利用嘌呤霉素和GFP双标记筛选，可方便、快捷的筛选出ZEB1高表达的肿瘤细胞，从而可为EMT及CSC相关研究提供材料。 [0023] 2.本发明的高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，载体中含有两种筛选标记，筛选过程快捷，操作简单，且一旦获得稳定表达系，可通过细胞传代多次使用。 [0024] 3.本发明的高迁移性肿瘤细胞株筛选方法，可用于各种类型肿瘤干细胞的筛选。附图说明 [0025] 下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。 [0026] 图1为phZEB1-PURO-GFP载体结构示意图； [0027] 图2为Transwell细胞侵袭迁移实验结果； [0028] 图3为Western blot结果示意图。具体实施方式 [0029] 实施例1 [0030] 下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0031] 下述实施例中所选用的材料、试剂等，如无特别说明，均可以从商业途径中获得。 [0032] 1.构建phZEB1-PURO-GFP [0033] 1.1PCR扩增PURO和ZEB1启动子序列 [0034] 设计引物，分别以PLKO-PURO载体和人基因组为模板，PCR扩增PURO基因和ZEB1启动子序列，所述ZEB1启动子序列为人ZEB1启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0035] 引物序列如下： [0036] phZEB1-F:GCAGATCTGTGGTTATCTGTATGGTCTTTTCAG(Bgl II) [0037] phZEB1-R:GCCTGCAGCTGCTTTCTGCGCTTACACCTGG(Pst I) [0038] PURO-F:CGCTGCAGCTCGAGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGC(Pst I) [0039] PURO-R：GCGGATCCTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATG(BamH I)， [0040] 分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 [0041] 反应体系如下： [0042] [0043] PCR扩增程序如下： [0044] [0045] PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒(Omega生物公司)回收PCR片段。 [0046] 1.2将PCR片段连接到全式金生物公司Peasy-blunt载体中(按试剂盒操作说明)[0047] 1.3酶切、连接 [0048] 先用限制性内切酶pstI和bamHI将puro构建到pIRES2-EGFP载体得到PI-PURO-EGFP，然后利用限制性内切酶Bgl II和pstI将pZEB1启动子插入到PI-PURO-EGFP中得到PI-pZEB-PURO-EGFP，然后用限制性内切酶BglII和NotI将pZEB-PURO-EGFP片段切下构建到PCDNA3.0中，命名为phZEB1-PURO-GFP。其结构示意图如图1所示。 [0049] 2.细胞转染 [0050] 2.1铺板 [0051] 转染前一天，胰酶消化786-O细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。细胞铺板在0.5mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 [0052] 2.2转染(24孔板) [0053] A.使用50μl无血清培养基(OPTI-MEM I培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 [0054] B.每孔细胞，使用50μL OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μL-3μL LIPOFECTAMINE 2000试剂，LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。 [0055] C.将A、B两管混合，放置20min。转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400uL。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时后换成有血清培养基。 [0056] 3.高迁移性肿瘤细胞筛选 [0057] 胰酶消化步骤2中转染的786-O细胞并重新种入6孔板，待细胞贴壁后，加入嘌呤霉素筛选。正常的786-O细胞在puro 600ng/mL即可致死。用2ug/mL浓度筛选，筛选出4株phZEB1-PURO-GFP质粒转化后具有嘌呤霉素抗性细胞且观察到绿色荧光的稳定细胞克隆，随后进行传代培养。 [0058] 4.Transwell肿瘤细胞迁移试验 [0059] 选择其中两株绿色荧光phZEB1-4、phZEB1-7进行细胞迁移实验，以pCDNA3.0空白载体转染细胞为对照。 [0060] 4.1基质胶铺板： [0061] 用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 [0062] 4.2制备细胞悬液 [0063] 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/mL。 [0064] 4.3接种细胞 [0065] ①取细胞悬液100μL加入Transwell小室。 [0066] ②24孔板下室加入600μL含15％FBS的培养基。 [0067] ③培养细胞：常规培养48h。 [0068] 4.4固定染色 [0069] 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，拍照、记数。 [0070] 嘌呤霉素和绿色荧光蛋白双重标记筛选出的phZEB1-PURO-GFP质粒稳定转化细胞株phZEB1-4和phZEB1-7进行transwell迁移实验，结果如图2所示，pCDNA3.0空白载体转染细胞(ph)、phZEB1-4和phZEB1-7的迁移数目依次增加。图中细胞迁移数目计数统计结果显示，phZEB1-7的迁移数目为ph细胞株迁移数目增加10倍以上。 [0071] 5.western blot [0072] (1)蛋白提取及定量。 [0073] 采用超声波破碎法进行细胞破碎并提取细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量。 [0074] (2)SDS-PAGE [0075] a.根据目的蛋白的分子量，配制12％分离胶，浓缩胶浓度为5％。 [0076] b.待检测蛋白样品上样量：上样15ug。 [0077] c.电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压160V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。 [0078] (3)转膜(湿转法) [0079] 转膜条件：300mA恒流；0.22um孔径PVDF膜，转膜时间75min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标记，准备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。 [0080] (4)封闭：将膜完全浸没封闭液(德元国际Cat#LY7141)中室温轻摇60min。 [0081] (5)一抗孵育：用TBST稀释一抗，室温孵育10min，放4℃过夜。 [0082] (6)洗膜：第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次10min。 [0083] (7)二抗孵育：用5％脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP兔抗山羊IgG(H+L)HRP，1:5000，室温轻摇40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。 [0084] (8)ECL加到膜上后反应2min，凝胶成像仪曝光：10s-5min。 [0085] 其中NC细胞为pCDNA3.0载体转染后G418筛选的细胞株，N-Cad及ZEB1蛋白抗体为Abcam公司生产，实验结果如图3所示，phZEB1-4、phZEB1-7均为phZEB1-PURO-GFP质粒稳定转化细胞株。 [0086] 以上实施例为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。