制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂

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制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂
申请号	CN202311256004.1	申请日	2023-09-25	公开(公告)号	CN117304240A	公开(公告)日	2023-12-29
申请人	新疆农业科学院海南三亚农作物育种试验中心;			发明人	张浩; 陈积豪; 梁其干; 张学军; 王建国; 王佩; 朱白婢; 刘斌; 符小发; 王敏; 周勃; 凌悦铭;
摘要	本发明公开了制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂，属于化合物应用技术领域。本发明将化合物I～IV中的至少一种用于制备杀线虫剂。化合物I～IV均提取自刺角瓜，提取包括以下步骤：将刺角瓜切片、浸泡、过滤并旋蒸后得粗提取液；将粗提取液上样至树脂层析柱，洗涤、洗脱、浓缩并干燥后得提取物；将提取物溶解、过滤后进样至高效液相色谱，分别收集、浓缩及冻干后得化合物I～IV。本发明提供的化合物是首次从植物中分离获得，具有杀线虫能力，可应用于杀线虫剂的制备中。
权利要求	1.如式I～IV所示化合物中的至少一种在制备杀线虫剂中的应用， 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述化合物I～IV均提取自刺角瓜。 3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，化合物I～IV的提取包括以下步骤：(1)将刺角瓜切分成0.5～1cm的薄片，再放入第一溶剂中常温浸泡6～8d，过滤后旋蒸，得粗提取液； (2)将粗提取液上样至树脂层析柱，用纯水洗涤，再用第二溶剂洗脱后浓缩干燥，得提取物；所述树脂层析柱的制备方法为：先用乙醇浸泡三菱化学的HP‑20大孔吸收树脂，然后装柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味；所述层析柱规格为50×500mm； (3)将提取物溶解于第三溶剂，过滤，进样至高效液相色谱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩冻干，得化合物I～IV；所述化合物I的洗脱时间为7.9～11.8min；所述化合物II的洗脱时间为21.1～22.5min；所述化合物III的洗脱时间为19.8～20.5min；所述化合物IV的洗脱时间为20.51～21min；所述高效液相色谱的色谱柱规格为：DAC 100×250mm，YMC AQ C18，10μm；所述高效液相色谱的色谱条件为：检测波长：214nm&254nm；流速：300mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％乙酸的水溶液；所述洗脱以乙腈‑0.1％乙酸的水溶液体积比为1:9→1:9→3:2进行，洗脱时间为65min。 4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述刺角瓜与第一溶剂的料液比为1g:8mL；所述第一溶剂为乙醇溶液、甲醇溶液或乙腈溶液；所述乙醇溶液、甲醇溶液和乙腈溶液的体积分数均为50％；所述浸泡时间为7d。 5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述第二溶剂为乙醇溶液或乙腈溶液；所述乙醇溶液和乙腈溶液的体积分数均为60％。 6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述第三溶剂为体积分数为0.1％的乙酸溶液。 7.一种杀线虫剂，其特征在于：以如式I～IV所示化合物中的至少一种作为活性成分。 8.如权利要求7所述的杀线虫剂，其特征在于：以如式I所示化合物作为活性成分，其有效浓度为2～4mg/mL。 9.如权利要求7所述的杀线虫剂，其特征在于：以如式III所示化合物作为活性成分，其有效浓度为0.25～0.5mg/mL。 10.如权利要求7所述的杀线虫剂，其特征在于：以如式IV所示化合物作为活性成分，其有效浓度为0.25～0.5mg/mL。
说明书全文	制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂技术领域 [0001] 本发明属于化合物应用技术领域，具体涉及制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂。背景技术 [0002] 杀线虫剂是用于防治有害线虫的一类农药。目前已知的对植物有害的线虫约3000种，大多生活在土壤中，也有的寄生在植物体内。线虫通过土壤或种子传播，能破坏植物的根系或侵入地上部分的器官，影响农作物的生长发育，还间接地传播由其他微生物引起的病害，造成很大的经济损失。 [0003] 我国对于线虫的防治主要仍以化学防治为主，杀线虫剂的种类较少，全世界的单剂类杀线虫剂仅30余种，常用的有10余种，目前使用到的杀线虫剂如溴甲烷、克百威、噻唑磷及阿维菌素等具有较高的毒性和极高的土壤残留，同时大多数杀线虫剂对人畜有较强的毒害作用，对生物安全和环境易造成极大的威胁。相比于化学源杀线虫剂，植物源杀线虫剂具有分解快、毒性小、残留低、污染少及害虫不易产生抗性等优点，符合当今绿色生产的理念。因此，提取植物杀线虫活性物质研制植物源杀线虫剂是具有极大现实意义的。发明内容 [0004] 本发明的目的在于提供制备杀线虫剂的化合物和其制备方法及杀线虫剂，化合物均为首次从植物中分离。 [0005] 为达到上述目的所采取的技术方案是： [0006] 如式I～IV所示化合物中的至少一种在制备杀线虫剂中的应用， [0007] [0008] 优选的，上述化合物I～IV均提取自刺角瓜。 [0009] 优选的，上述化合物I～IV的提取包括以下步骤： [0010] (1)将刺角瓜切分成0.5～1cm的薄片，再放入第一溶剂中常温浸泡6～8d，过滤后旋蒸，得粗提取液； [0011] (2)将粗提取液上样至树脂层析柱，用纯水洗涤，再用第二溶剂洗脱后浓缩干燥，得提取物；树脂层析柱的制备方法为：先用乙醇浸泡三菱化学的HP‑20大孔吸收树脂，然后装柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味；层析柱规格为50×500mm； [0012] (3)将提取物溶解于第三溶剂，过滤，进样至高效液相色谱进行洗脱，收集洗脱液，浓缩冻干，得化合物I～IV；化合物I的洗脱时间为7.9～11.8min；化合物II的洗脱时间为21.1～22.5min；化合物III的洗脱时间为19.8～20.5min；化合物IV的洗脱时间为20.51～ 21min；高效液相色谱的色谱柱规格为：DAC 100×250mm，YMC AQ C18，10μm；高效液相色谱的色谱条件为：检测波长：214nm&254nm；流速：300mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％乙酸的水溶液；洗脱以乙腈‑0.1％乙酸的水溶液体积比为1:9→1:9→3:2进行，洗脱时间为 65min。 [0013] 本发明采用优选技术方案的有益效果为：采用浸提、过滤、旋蒸、树脂层析、洗脱、溶解、进样高效液相色谱、收集并浓缩干燥的制备方法，可有效的从刺角瓜中提取出化合物I～IV。 [0014] 优选的，刺角瓜与第一溶剂的料液比为1g:8mL；第一溶剂为乙醇溶液、甲醇溶液或乙腈溶液；乙醇溶液、甲醇溶液和乙腈溶液的体积分数均为50％；浸泡时间为7d。 [0015] 本发明采用优选技术方案的有益效果为：通过选用体积分数为50％的有机溶剂，并按一定的料液比进行化合物I～IV的浸提，在合适的温度以及浸提时间内能很好的从刺角瓜中提取出化合物I～IV。 [0016] 优选的，第二溶剂为乙醇溶液或乙腈溶液；乙醇溶液和乙腈溶液体积分数均为60％。 [0017] 优选的，第三溶剂为体积分数为0.1％的乙酸溶液。 [0018] 本发明还公开了一种杀线虫剂，以如式I～IV所示化合物中的至少一种作为活性成分。 [0019] 优选的，以如式I所示化合物作为活性成分，其有效浓度为2～4mg/mL。 [0020] 优选的，以如式III所示化合物作为活性成分，其有效浓度为0.25～0.5mg/mL。 [0021] 优选的，以如式IV所示化合物作为活性成分，其有效浓度为0.25～0.5mg/mL。 [0022] 本发明具有以下有益效果： [0023] (1)本发明的化合物I～IV对线虫具有一定的触杀作用，可应用于杀线虫剂的制备中； [0024] (2)首次从植物中发现本发明中的四种化合物，并从刺角瓜中分离出来； [0025] (3)本发明提供的提取方法操作简单、快速，适合大量推广； [0026] (4)通过本发明的提取方法得到的化合物纯度高。附图说明 [0027] 图1是化合物I对DPPH自由基清除率图； [0028] 图2是化合物I中关键HMBC和1H‑1H COSY相关信号示意图； [0029] 图3是化合物II中关键HMBC和1H‑1H COSY相关信号示意图； [0030] 图4是化合物III中关键HMBC和1H‑1H COSY相关信号示意图； [0031] 图5是化合物IV中关键HMBC和1H‑1H COSY相关信号示意图； [0032] 图6是化合物I杀线效果图； [0033] 图7是化合物III杀线效果图； [0034] 图8是化合物IV杀线效果图； [0035] 图9是化合物I对线虫触杀作用图； [0036] 图10是化合物III对线虫触杀作用图； [0037] 图11是化合物IV对线虫触杀作用图。具体实施方式 [0038] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步详细的描述。 [0039] 实施例1 [0040] 化合物I～IV的提取方法，包括以下步骤： [0041] (1)将5kg刺角瓜切分成0.5cm的薄片，放入40L体积分数为50％的乙醇溶液中常温浸泡7d，取浸泡液用滤纸过滤后旋蒸去除乙醇，以滤液中残留的乙醇含量＜10％为宜，得粗提取液； [0042] (2)先用乙醇浸泡三菱化学的HP‑20大孔吸收树脂，然后装入规格为50×500mm的层析柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味，得树脂层析柱；将粗提取液上样至树脂层析柱，用纯水洗涤，再用体积分数为60％的乙醇溶液洗脱至变色，并将洗脱液浓缩干燥，得提取物； [0043] (3)设置高效液相色谱的色谱柱规格为：DAC 100×250mm；YMC AQ C18，10μm；色谱条件为：检测波长：214nm&254nm；流速：300mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％乙酸的水溶液；称取2g提取物，加入20mL0.1％乙酸的水溶液溶解，0.45μm滤膜过滤后进样至高效液相色谱，以乙腈‑0.1％乙酸的水溶液体积比为1:9→1:9→3:2进行洗脱，洗脱时间为65min；收集洗脱时间为7.9～11.8min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物I；收集洗脱时间为21.1～22.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物II；收集洗脱时间为19.8～20.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物III；收集洗脱时间为20.51～21min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物IV。 [0044] 实施例2 [0045] 化合物I～IV的提取方法，包括以下步骤： [0046] (1)将2.5kg刺角瓜切分成0.7cm的薄片，放入20L体积分数为50％的甲醇溶液中常温浸泡6d，取浸泡液用滤纸过滤后旋蒸去除甲醇，以滤液中残留的甲醇含量＜10％为宜，得粗提取液； [0047] (2)先用乙醇浸泡三菱化学的HP‑20大孔吸收树脂，然后装入规格为50×500mm的层析柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味，得树脂层析柱；将粗提取液上样至树脂层析柱，用纯水洗涤，再用体积分数为60％的乙腈溶液洗脱至变色，并将洗脱液浓缩干燥，得提取物； [0048] (3)设置高效液相色谱的色谱柱规格为：DAC 100×250mm；YMC AQ C18，10μm；色谱条件为：检测波长：214nm&254nm；流速：300mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％乙酸的水溶液；称取3g提取物，加入30mL0.1％乙酸的水溶液溶解，0.45μm滤膜过滤后进样至高效液相色谱，以乙腈‑0.1％乙酸的水溶液体积比为1:9→1:9→3:2进行洗脱，洗脱时间为65min；收集洗脱时间为7.9～11.8min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物I；收集洗脱时间为21.1～22.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物II；收集洗脱时间为19.8～20.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物III；收集洗脱时间为20.51～21min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物IV。 [0049] 实施例3 [0050] 化合物I～IV的提取方法，包括以下步骤： [0051] (1)将2kg刺角瓜切分成1cm的薄片，放入16L体积分数为50％的乙腈溶液中常温浸泡6d，取浸泡液用滤纸过滤后旋蒸去除乙腈，以滤液中残留的乙腈含量＜10％为宜，得粗提取液； [0052] (2)先用乙醇浸泡三菱化学的HP‑20大孔吸收树脂，然后装入规格为50×500mm的层析柱，依次用乙醇、水冲洗至无乙醇味，得树脂层析柱；将处提取液上样至树脂层析柱，用纯水洗涤，再用体积分数为60％的乙腈溶液洗脱至变色，并将洗脱液浓缩干燥，得提取物； [0053] (3)设置高效液相色谱的色谱柱规格为：DAC 100×250mm；YMC AQ C18，10μm；色谱条件为：检测波长：214nm&254nm；流速：300mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％乙酸的水溶液；称取5g提取物，加入50mL0.1％乙酸的水溶液溶解，0.45μm滤膜过滤后进样至高效液相色谱，以乙腈‑0.1％乙酸的水溶液体积比为1:9→1:9→3:2进行洗脱，洗脱时间为65min；收集洗脱时间为7.9～11.8min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物I；收集洗脱时间为21.1～22.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物II；收集洗脱时间为19.8～20.5min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物III；收集洗脱时间为20.51～21min的洗脱液，旋蒸浓缩，反复纯化至纯度95％以上，再冷冻干燥，得化合物IV。 [0054] 实验例 [0055] 1、化合物I对DPPH自由基清除率的影响 [0056] 将化合物I精准配置成质量浓度为0.4mg/mL、0.8mg/mL及1mg/mL的溶液，精确移取2.0mL不同质量浓度的样品溶液于具塞试管中，加入3.0mL质量浓度为0.004mg/mL的DPPH乙醇溶液，摇匀，避光放置30min，于波长514nm处测定吸光度Ai；按照同样步骤，以等量的无水乙醇代替质量浓度0.004mg/mL的DPPH乙醇溶液，在波长517nm处测定吸光度Aj；以等量的无水乙醇代替样品溶液，于波长517nm处测定吸光度A0。所有的试验重复测定3次后取其平均值，按下式计算DPPH清除率K，结果见图1。 [0057] K＝(1‑(Ai‑Aj)/Ac)×100％。 [0058] 由图1可知，化合物I对DPPH自由基具有明显的清除作用，随着化合物质量浓度的增加，其对DPPH自由基清除效果呈上升趋势，当化合物I浓度为1mg/mL时，清除率达到最高。 [0059] 2、结构鉴定 [0060] 对分离得到的单体成分应用MAT95XP高分辨质谱仪和瑞士Bruker AVANCE AV 600MHz超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪分别进行MS，MR谱的测定。 [0061] (1)采用600MHz核磁共振仪对化合物I进行氢谱、碳谱、DEPT谱、1H‑1HCOSY谱、HSQC谱、HMBC谱及NOESY谱测试，解析结果见表1及表2。 [0062] 表1 [0063] [0064] [0065] 对化合物I核磁共振谱数据及结构归属进行测试，结果见表2。 [0066] 表2 [0067] [0068] 化合物I的氢谱显示，其低场区存在4组芳香质子信号，包括1组AA'BB'偶合信号[δH7.93，d(8.8Hz)；δH6.93，d(8.8Hz)]，两个孤立的芳香质子信号[δH6.77，s；δH6.48，s]。13 由 C‑NMR和DEPT谱可知，共有27个有效信号峰，包括16个次甲基(δC129.0，129.0，116.5， 116.5，106.0，103.3，94.0，82.2，81.5，78.9，77.0，77.0，75.2，71.7，70.9，69.9)，2个亚甲基(δC62.0，60.9)，以及9个季碳信号(δC182.7，164.0，163.5，162.1，161.7，157.0，121.7， 108.4，103.9)。需要指出的是，由于对称性，部分碳信号完全重叠。根据结构特征，该化合物实为黄酮醇苷元与两个葡萄糖形成的黄酮苷类成分。将其分解成A、B、C、D、E环进行解析，详细结构解析过程如下： [0069] a.黄酮母核(A～C环) [0070] 通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定特征的B环中2'，3'，5'，6'位上质子AA'BB'的偶合体系。再结合HSQC谱，可以确定C‑2'，C‑3'，C‑5'，C‑6'的碳谱化学位移分别为δC129.0，116.5，116.5，129.0。同时，H‑3'和H‑5'均与C‑1'，C‑2'，C‑4'有HMBC相关点，进而确定B环中季碳C‑1'和C‑4'的碳谱化学位移分别为δC121.7，161.7。 [0071] 同时，H‑3与δC164.0(C‑2)，δC103.9(C‑10)的HMBC相关点，确定了C‑3和C‑10的归属。而NOESY谱中，H‑3与H‑2'，6'之间非常明显的NOE相关，也确证了上述归属。其次，通过黄酮结构的特征，将C环的C‑4，C‑9分别归属为δC182.7，157.0。 [0072] A环中，H‑8与δC108.4(C‑6)的HMBC相关点，确定了C‑6的归属。结合黄酮特征，将剩下的芳香季碳信号C‑5，C‑7分别归属δC162.1，163.5。 [0073] b.D环 [0074] 通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定特征的D环中H‑1”～H‑6”相互偶合。再结合HSQC谱，可以确定C‑1”～C‑6”的碳谱化学位移分别为δC71.7，81.5，78.9，70.9， 82.2，61.9。 [0075] HMBC谱中，H‑1”与C‑5，C‑6，C‑7，C‑2”，C‑3”的远程相关点，也进一步确定上述信号的归属。 [0076] c.E环 [0077] 通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定特征的E环中H‑1”'～H‑6”'相互偶合。再结合HSQC谱，可以确定C‑1”'～C‑6”'的碳谱化学位移分别为δC106.0，75.2，77.0，69.8，77.0，60.8。 [0078] HMBC谱中，H‑2”'与C‑1”'，C‑3”'的远程相关点，H‑3”'与C‑2”'，C‑4”'的远程相关点，H‑4”'与C‑3”'，C‑5”'的远程相关点，也进一步确定上述信号的归属。 [0079] 采用MAT95XP高分辨质谱仪对化合物I质谱数据进行测定，结果见表3。 [0080] 表3 [0081] 精确质量数测定理论值元素组成+ + 595.2[M+H] 595.2 C27H31O15 + + 617.5[M+Na] 617.2 C27H30O15Na + + 633.7[M+K] 633.1 C27H30O15K ‑ ‑ 593.4[M‑H] 593.2 C27H29O15 ‑ ‑ 629.3[M+Cl] 629.1 C27H30O15Cl [0082] 由表1‑3及图2可知，化合物I分子式为C27H30O15，相对分子量为594.2。 [0083] (2)采用600MHz核磁共振仪对化合物II进行氢谱、碳谱、DEPT谱、1H‑1HCOSY谱、HSQC谱、HMBC谱及NOESY谱测试，解析结果见表4及表5。 [0084] 表4 [0085] [0086] 对化合物II核磁共振谱数据及结构归属进行测试，结果见表5。 [0087] 表5 [0088] [0089] 化合物II的氢谱显示，其低场区存在5个双键质子信号，包括1个醛基质子信号[δH9.49，d(8.1Hz)]和4个相互偶合的共轭双键信号[δH7.31，dd(15.2，9.4Hz)；δH6.40，13 overlapped；δH6.39，overlapped；δH6.09，dd(15.2，8.1Hz)]。由 C‑NMR和DEPT谱可知，共有 13个有效信号峰，包括5个次甲基(δC194.8，153.9，147.7，130.4，129.3)，7个亚甲基(δC34.2，33.0，29.0，29.0，29.0，28.4，25.0)，以及1个季碳信号(δC175.0)。需要指出的是，由于中间链状脂肪碳链中亚甲基所处环境的相似性，部分碳信号完全重叠。详细结构解析过程如下： [0090] 从最特征的H‑13出发，通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定H‑2～H‑13依次相互偶合。再结合HSQC谱，可以确定C‑2～C‑13的碳谱化学位移分别为δC34.2，25.0，29.0，29.0，29.0，28.4，33.0，147.7，129.3，153.9，130.4，194.8。 [0091] 同时，HMBC谱中，H‑3与C‑1，C‑2，C‑4的远程相关点，H‑9与C‑8，C‑10，C‑11的远程相关点，H‑11与C‑9，C‑10，C‑12，C‑13的远程相关点，可确定该结构中羧基碳信号C‑1碳谱化学位移分别为δC175.0，也进一步确证了上述信号的归属。 [0092] 另外，NOESY谱中，H‑9/H‑11/H‑13之间非常明显的NOE相关点，证明它们是处在同一侧的，也即结构中的双键构型均为反式。 [0093] 采用MAT95XP高分辨质谱仪对化合物II质谱数据进行测定，结果见表6。 [0094] 表6 [0095]精确质量数测定理论值元素组成 + + 263.0[M+K] 263.1 C13H20O3K ‑ 447.2[2M‑H]‑ 447.3 C26H39O6 [0096] 由表4‑6及图3可知，化合物II分子式为C13H20O3，相对分子量为224.1。 [0097] (3)采用600MHz核磁共振仪对化合物III进行氢谱、碳谱、DEPT谱、1H‑1HCOSY谱、HSQC谱、HMBC谱及NOESY谱测试，解析结果见表7及表8。 [0098] 表7 [0099] [0100] 对化合物III核磁共振谱数据及结构归属进行测试，结果见表8。 [0101] 表8 [0102] [0103] [0104] 化合物III的氢谱显示，其低场区存在4个相互偶合的共轭双键信号[δH7.12，dd(15.3，10.4Hz)；6.23，dd(15.1，10.4Hz)；6.17，dd(15.1，6.7Hz)；δH5.77，d(15.3Hz)]。由13 C‑NMR和DEPT谱可知，共有13个有效信号峰，包括4个次甲基(δC144.7，144.4，128.9， 121.1)，7个亚甲基(δC34.3，32.8，29.0，29.0，29.0，28.6，25.0)，以及2个季碳信号(δC175.1，168.5)。需要指出的是，由于中间链状脂肪碳链中亚甲基所处环境的相似性，部分碳信号完全重叠。详细结构解析过程如下： [0105] 通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定H‑2～H‑12依次相互偶合。再结合HSQC谱，可以确定C‑2～C‑12的碳谱化学位移分别为δC34.3，25.0，29.0，29.0，29.0，28.6，32.8，144.4，128.9，144.7，121.1。 [0106] 同时，HMBC谱中，H‑3与C‑1，C‑2，C‑4的远程相关点，H‑7与C‑6，C‑8，C‑9的远程相关点，H‑8与C‑7，C‑9，C‑10的远程相关点，H‑11与C‑9，C‑10，C‑12，C‑13的远程相关点，H‑12与C‑9，C‑10，C‑13的远程相关点，可确定该结构中两个羧基季碳信号C‑1和C‑13的碳谱化学位移分别为δC175.1，168.5，也进一步确证了上述信号的归属。 [0107] 另外，NOESY谱中，H‑9/H‑11之间的NOE相关点，证明它们是处在同一侧的，即结构中的双键构型均为反式。 [0108] 采用MAT95XP高分辨质谱仪对化合物III质谱数据进行测定，结果见表9。 [0109] 表9 [0110] [0111] [0112] 由表7‑9及图4可知，化合物III分子式为C13H20O4，相对分子量为240.3。 [0113] (4)采用600MHz核磁共振仪对化合物IV进行氢谱、碳谱、DEPT谱、1H‑1H COSY谱、HSQC谱、HMBC谱及NOESY谱测试，解析结果见表10及表11。 [0114] 表10 [0115] [0116] 对化合物IV核磁共振谱数据及结构归属进行测试，结果见表11。 [0117] 表11 [0118] [0119] 化合物IV的氢谱显示，其低场区存在4个相互偶合的共轭双键信号[δH6.12，m；δ13 H6.02，dd(15.1，10.5Hz)；δH5.65，m；δH5.62，m]。由 C‑NMR和DEPT谱可知，共有13个有效信号峰，包括4个次甲基(δC134.0，132.4，130.4，129.9)，8个亚甲基(δC61.7，34.2，32.4，29.2， 29.1，29.0，28.9，25.0)，以及1个季碳信号(δC175.0)。详细结构解析过程如下： [0120] 通过1H‑NMR偶合信息和1H‑1H COSY谱，可确定H‑2～H‑13依次相互偶合。再结合HSQC谱，可以确定C‑2～C‑13的碳谱化学位移分别为δC34.2，25.0，28.9，29.0，29.1，29.2，32.4，134.0，130.4，129.9，132.4，61.7。 [0121] 同时，HMBC谱中，H‑3与C‑1，C‑2，C‑4的远程相关点，H‑7与C‑6，C‑8的远程相关点，H‑9与C‑7，C‑8，C‑10的远程相关点，H‑11与C‑9，C‑10，C‑13的远程相关点，H‑13与C‑11，C‑12的远程相关点，可确定该结构中羧基碳信号C‑1碳谱化学位移为δC175.0，也进一步确证了上述信号的归属。 [0122] 另外，NOESY谱中，H‑9/H‑11/H‑13之间非常明显的NOE相关点，证明它们是处在同一侧的，即结构中的双键构型均为反式。 [0123] 采用MAT95XP高分辨质谱仪对化合物IV质谱数据进行测定，结果见表12。 [0124] 表12 [0125] 精确质量数测定理论值元素组成+ + 249.2[M+Na] 249.1 C13H22O3Na + + 244.2[M+NH4] 244.2 C13H26O3N + + 265.1[M+K] 265.1 C13H22O3K ‑ ‑ 451.4[2M‑H] 451.3 C26H43O6 [0126] 由表10‑12及图5可知，化合物IV分子式为C13H22O3，相对分子量为226.3。 [0127] 3、化合物I、化合物III和化合物IV的杀线效果实验 [0128] 供试南方根结线虫为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所线虫实验室培养；具体分离培养方法：(1)将采集到的感染根结线虫的植物根系用清水清洗干净，用剪刀剪成约1cm长，放入豆浆机至500mL量杯的1/3～2/3处，加入无菌水和适量次氯酸钠，进行根组织破碎3～5s；(2)将破碎后的根组织依次通过35、200和500目的筛子，500目筛子中即得到分离出的根结线虫的卵块和寄生早期幼虫；(3)准备1个自制线虫孵化器，孵化器从下至上依次为培养皿、20目网筛，网筛上铺盖2层手帕纸；将收集的根结线虫卵块转入手帕纸上，加水至界面，于25～28℃孵化幼虫，4d后收集2龄幼虫；(4)收集到的线虫放置自然沉降，用胶头滴管将表面清水吸出。 [0129] 在96孔板中的每孔加入线虫悬液(200～300条线虫)、95μL无菌水及样品，使得样品终浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mg/mL，空白对照为用等量的无菌水替代样品，阳性对照为用等量的1mg/mL阿维菌素水溶液替代样品，3次重复，96孔板周围的孔加200μL无菌水保湿；混匀后于室温下培养24h，于荧光数码生物显微镜下计数线虫死亡数，统计的线虫数量不少于100条。分别计算线虫的死亡率和校正死亡率。 [0130] 参照杀线虫活性强弱分级标准进行分级。具体分级标准：“‑”表示无活性，校正死亡率≤10％；“+”表示弱活性，校正死亡率为10％～30％；“++”表示中等活性，校正死亡率为30％～50％；“+++”表示较强活性，校正死亡率为50％～80％；“++++”表示强活性，校正死亡率＞80％。 [0131] 线虫死亡率＝死亡线虫数/供试线虫数×100％ [0132] 线虫校正死亡率＝(处理组线虫死亡率‑对照组线虫死亡率)/(1‑对照组线虫死亡率)×100％。 [0133] 结果如图6‑11所示，化合物I在2.0mg/mL和4.0mg/mL时具要较强的灭杀线虫的能力，对线虫的致死率分别为90.5％和90.6％；化合物III和化合物IV在0.25～4mg/mL浓度范围时对线虫的致死率均为100％；化合物I、化合物III及化合物IV处理组的线虫死亡率明显高于无菌水培养的对照组，表明化合物I化合物III及化合物IV具有潜在的杀虫活性，而对于化合物II的具体作用仍需进一步研究。 [0134] 本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的包含范围之内。