已经开发和销售多种针对以松天牛为媒介昆虫的寄生在松树上的 松材线虫、寄生在黄瓜或卷心菜上的根结线虫、寄生在马铃薯上的包 囊线虫等的杀线虫剂。
例如：在特公平2-32251号公报中提出了用属于曲霉属 (Aspergillus sp.)等的菌或其代谢产物的线虫驱除方法的提案，其 中记载了属于曲霉菌属的蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)等，不过，在该专利文献中只是提示菌的代 谢产物中存在配糖体，没有针对从菌的培养液中提取、纯化具有杀线 虫活性成分的研究。
因此，本发明的目的是提供从属于曲霉菌属(Aspergillus sp.) 的菌的培养液中提取、纯化出的杀线虫剂。

鉴于上述问题点，本发明的杀线虫剂，其特征是，如权利要求1 所记载的：根据需要，在pH 7以下，用与水分离的第1有机溶剂分配 提取属于曲霉菌属(Aspergillus sp.)的菌的培养滤液，得到的第1 有机溶剂提取级分再用碱性水溶液分配提取，在pH7以下，得到的碱 性溶液提取级分用与水分离的第2有机溶剂分配提取，以由此得到的 有机酸性级分提取物为有效成分。
此外，权利要求2记载的杀线虫剂，其特征是，在权利要求1记 载的杀线虫剂中的线虫是松材线虫。
此外，权利要求3记载的杀线虫剂，其特征是，在权利要求1记 载的杀线虫剂中的属于曲霉菌属(Aspergillus sp.)的菌是蜂蜜曲霉 JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)
此外，权利要求4记载的杀虫剂，其特征是，在权利要求1记载 的杀线虫剂中，第1有机溶剂和第2有机溶剂中的任何一个是醋酸乙 酯。
此外，本发明的杀虫剂，其特征是，如权利要求5记载的以青霉 酸为有效成分。
根据本发明，可以提供从属于曲霉菌属(Aspergillus sp.)的菌 的培养液中提取、纯化出的杀线虫剂。

图1表示在实施例的试验例中提取具有杀松材线虫活性的成分的 工序图。

本发明的杀线虫剂的特征是，根据需要，在pH7以下，用与水分 离的第1有机溶剂分配提取属于曲霉菌属(Aspergillus sp.)的菌的 培养滤液，得到的第1有机溶剂提取级分再用碱性水溶液分配提取， 在pH7以下，得到的碱性水溶液提取级分用与水分离的第2有机溶剂 分配提取，以由此得到的有机酸性级分提取物为有效成分。而且，本 发明的杀线虫剂的特征是，以青霉酸作为有效成分。关于青霉酸 (Penicillic acid，3-methoxy-5-methyl-4-oxo-2，5-hexadienoic acid)的生物活性，已知有抗细菌活性、抗霉菌活性、抗病毒活性等， 至今为止，还没有关于杀线虫活性的报道。
在本发明中，作为属于曲霉属(Aspergillus sp.)的菌优选使用 蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP-726)， 此外，也可以使用寄生曲霉JAM4002(Aspergillus parasiticus JAM4002，FERM BP-724)、塔木里氏曲霉JAM4007(Aspergillus tamarii JAM4007，FERM BP-723)、烟曲霉JAM4008(Aspergillus fumigatus JAM4008，FERM BP-727)、黑曲霉JAM4054(Aspergillus niger JAM4054，FERM BP-8300)、黑曲霉JAM4055(Aspergillus niger JAM4055，FERM BP-8301)等。并且JAM指的是株式会社应微研的菌株 分类号( JAPAN  APPLIDE RESEARCH  MICROORGANISMS的简称)。
可以按照用于提取、纯化含有有机酸的酸性级分提取物的一般性 方法进行从属于曲霉属(Aspergillus sp.)的菌的培养滤液中得到有 机酸性级分提取物的具体操作。优选醋酸乙酯作为可以用作第1溶剂 和第2溶剂的能与水分离的有机溶剂。优选饱和碳酸氢钠水溶液作为 碱性水溶液。在将培养滤液或者碱性水溶液提取级分调节到pH 7以下 时，可以使用盐酸。
以杀线虫活性为指标，可以用在分离、纯化天然有机化合物所通 常采用的柱层析或者薄层层析的层析方法等将得到的有机酸性级分提 取物再次分离。本发明的杀线虫剂包含进行上述再次分离的多种成分 组成的有机酸性提取物或每个分离并纯化的以青霉酸等有机化合物为 有效成分的物质。另外，用青霉酸作为本发明的杀线虫剂的有效成分 时，不局限于用从有机酸性级分提取物中分离、纯化的青霉酸，也可 以是通过化学合成等得到的青霉酸。
本发明的杀线虫剂，可以含有任意量的有效成分，用公知的载体 或者添加剂，制备成粉剂、液体制剂等各种剂型以供应用。可以对应 于使用目的，使用液体载体和固体载体中的任何一种作为载体。液体 载体可列举：水、醇类、酮类、醚类等。固体载体可列举：矿物粉末、 氧化铝、硫磺粉末、活性炭等。添加剂可列举：乳化剂、悬浊剂、稳 定剂、展开剂、浸透剂、分散剂等。其使用的剂量，相应于采用的剂 型、受灾状况、适用方法、适用场所等来确定。
本发明的杀线虫剂，除了针对松材线虫发挥效果之外，对根结线 虫、包囊线虫、根腐线虫等的效果也是值得期待的。另外，本发明的 杀线虫剂还可以含有具有杀线虫活性之外的有效成分。
实施例
以下，通过实施例详细说明本发明，不过，本发明不局限于此。 并且，可以认为本实施例是将本发明的杀线虫剂作为杀松材线虫剂使 用的实施例。
试验例：
将蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，FERM BP -726)接种到以PDA培养基(日水制药公司制造的PDA培养基39重 量份，蒸馏水1000重量份)作为带盖玻璃器皿内的固体培养基中，在 25℃震荡培养2周，直到产生足够量的分生菌为止。然后，向该固体 培养基上注入灭菌蒸馏水，为了使在培养基上长成的培养物悬浊到液 体中去，加以搅拌，得到悬浊液。接着，将该悬浊液加到液体麦芽培 养基[麦芽提取物(オリエンタル酵母工业公司制造)30重量份、蛋 白胨3重量份(极东制药公司制造)、葡萄糖20重量份、蒸馏水1000 重量份]中，在24℃下于暗处培养28天。
按照下面的方式从得到的培养液中提取、纯化出具有杀松材线虫 活性的有效成分。并且，在下面的说明中，液体的混合比表示体积比。
用滤纸(No.5)过滤得到的培养液，分离培养滤液和残渣(菌体)。
向得到的培养滤液中加入2N的盐酸，调整到pH2～3，将该培养 滤液和醋酸乙酯按照1∶3的比例用分液漏斗振摇提取后，静置，得到 上层的醋酸乙酯提取级分和下层的盐酸水溶液级分。相对下层的盐酸 水溶液级分按照和上面相同的比例加入新的醋酸乙酯，同样的操作， 重复2次，分别得到醋酸乙酯提取级分。混合3次提取得到的醋酸乙 酯提取级分，得到第1醋酸乙酯提取级分。
针对该第1醋酸乙酯提取级分、盐酸水溶液级分的丁醇提取级分、 残渣(菌体)的丙酮提取级分，调查杀松材线虫活性时，因为测定发 现第1醋酸乙酯提取级分有很强活性，所以对第1醋酸乙酯提取级分 再进行提取、纯化。
为了进行第1醋酸乙酯提取级分的再次提取、纯化，准备大量的 培养液。即，将30L上述液体麦芽培养基分别以500mL注入到120个 的摇瓶中，向每个摇瓶中分别加入0.1mL按照上述同样方法得到的悬 浊液进行培养，将得到的培养液按照上述同样的方法进行处理，得到 第1醋酸乙酯提取级分。
将第1醋酸乙酯提取级分和饱和碳酸氢钠水溶液按照1∶1的比例 用分液漏斗振摇提取后，静置，得到上层的醋酸乙酯级分和下层的饱 和碳酸氢钠水溶液提取级分。
向得到的饱和碳酸氢钠水溶液提取级分中加入2N的盐酸，调整到 pH2～3，将该酸性水溶液级分和醋酸乙酯按照1∶3的比例用分液漏斗 振摇提取后，静置，得到上层的醋酸乙酯提取级分和下层的盐酸水溶 液级分。相对下层的盐酸水溶液级分按照和上面相同的比例加入新的 醋酸乙酯，同样的操作，重复2次，分别得到醋酸乙酯提取级分。混 合3次提取得到的醋酸乙酯提取级分，得到第2醋酸乙酯提取级分。 用硫酸钠使上述第2醋酸乙酯提取级分脱水后，浓缩至干，得5.51g 有机酸性级分提取物的红色固体物。该有机酸性级分提取物的杀松材 线虫的活性在500ppm浓度下，为7.0％，在浓度1000ppm下，为50.0 ％。并且，针对通过振摇提取分离的上述第1醋酸乙酯提取级分和饱 和碳酸氢钠水溶液的醋酸乙酯级分的杀松材线虫活性进行调查时，发 现虽然有所减弱，不过还是有活性的。
用WakogelC-200(和光纯药公司制造：内径3.5cm、长40cm)将有 机酸性级分提取物加样到硅胶层析柱上。用己烷-醋酸乙酯作为溶剂， 其混合比在100∶0～0∶100之间每隔10变化一次，各个混合比的溶 剂分别流过1L，分别收取各个1L的洗脱液，浓缩至干。在各个洗脱 级分的浓缩干燥物中，表现高的杀松材线虫活性以及量多的级分的活 性如表1所示。从表1可知，30％醋酸乙酯洗脱级分、40％醋酸乙酯洗 脱级分即使在浓度1000ppm时也显示出高的杀松材线虫活性。由此将 最高杀松材线虫活性并且浓缩至干的固体物量也多的30％醋酸乙酯 洗脱级分供给下面的第二次层析柱。
                                       表1   级分名  浓缩至干的固体物的量(g)   死亡率(％)   1000ppm   3000ppm   20％醋酸乙酯洗脱级分   0.0505   8.8   99.0   30％醋酸乙酯洗脱级分   1.2978   49.1   99.0   40％醋酸乙酯洗脱级分   1.1690   44.9   89.4   70％醋酸乙酯洗脱级分   0.2292   26.8   99.0   80％醋酸乙酯洗脱级分   0.1069   28.1   78.4
用Wakogel C-200(和光纯药公司制造：内径2.0cm、长35cm)将 上述30％醋酸乙酯洗脱级分供给到到硅胶层析柱上。用己烷-醋酸乙 酯作为溶剂，它们的混合比在100∶0～0∶100之间每隔5变化一次， 各个混合比的溶剂分别流过1L，分别收取每个500mL的洗脱液，浓缩 至干。在各个洗脱级分的浓缩干燥物中，表现高的杀松材线虫活性以 及量多的级分的活性如表2所示。通过表2可知，由级分8、级分11、 级分12即使在1000ppm浓度下也表现高的杀松材线虫活性。由此，将 这3个级分供给下述的薄层层析。
                                        表2   级分名(注)   浓缩至干的   固体物的量   (g)   性状   死亡率(％)   1000ppm   3000ppm   级分8(15％醋酸乙酯   洗脱级分·2)   0.0526   红色油状物   92.8   98.9   级分9(20％醋酸乙酯   洗脱级分·1)   0.1195   黄色固体物   72.0   82.0   级分10(20％醋酸乙   酯洗脱级分·2)   0.4016   橙色油状物   86.2   98.9   级分11(25％醋酸乙   酯洗脱级分·1)   0.5863   混合橙色针状结   晶的固体物   87.8   95.1   级分12(25％醋酸乙   酯洗脱级分·2)   0.0460   橙色粉状物   95.7   98.9
注)表示将使用溶剂前面的500mL洗脱级分定为1，其后的500mL 溶出级分定为2。
将上述的级分8、级分11、级分12供给到硅胶(Kiesel 60 GF254， メルク公司制造)的薄层层析上。对级分11用己烷-丙酮(7∶3)、 级分8和级分12己烷-丙酮(6∶4)作为展开溶剂。刮取各个分离的 点，提取分离。调查各自的杀松材线虫活性和含有物质的量。结果如 表3所示。从表3可以明确，在级分8中，从离开展开开始位置开始， 第1个级分(Rf值＝0.01)和第2个级分(Rf值＝0.15)具有高的杀松 材线虫活性。在级分11中，从离开展开开始位置开始，第2个级分(Rf 值＝0.14)具有高的杀松材线虫活性，同时含有物质的量多。用薄层层 析、红外吸收光谱分析、核磁共振光谱分析确定该第2个级分和标准 品青霉酸一致。在级分12中，从离开展开开始位置开始，第1个级分 (Rf值＝0.01)、第2个级分(Rf值＝0.08)、第3个级分(Rf值＝0.19)、 第4个级分(Rf值＝0.34)经确认具有杀松材线虫活性。
表3   级分名   Rf值   含有物质   的量(g)   死亡率(％)   500ppm   1000ppm   级分8-TLC/Fr1   0.01   0.0028   53.1   77.5   级分8-TLC/Fr2   0.15   0.0110   59.5   74.8   级分11-TLC/Fr2   0.14   0.1732   29.6   67.8   级分11-TLC/Fr1   0.01   0.0017   32.2   57.6   级分12-TLC/Fr2   0.08   0.0291   38.9   46.8   级分12-TLC/Fr3   0.19   0.0030   13.7   63.4   级分12-TLC/Fr4   0.34   0.0016   41.6   - (注)
注)由于微量，不能进行测定。
按照下述方法评价上述的杀松材线虫活性。即，向10mg样本(浓 缩至干的固体物)中加入适量的100μL～500μL的丙酮或者甲醇，溶 解或者悬浊，然后，用纯化水稀释到10000ppm作为试验溶液的原液。 将该原液调节到试验浓度的2倍浓度，向96孔板的每个孔中分别加入 100μL，然后再加入松材线虫的蒸馏水悬浊液100μL(400～1000个 /mL)，在25℃下，于暗处放置1周后，用显微镜计数各个孔内松材 线虫的生存数和死亡数，用[(死亡数)/(生存数+死亡数)×100] 表示死亡率(表1～表3的死亡率表示的是1个浓度下3个试验孔的 平均值)。并且，认为会有松材线虫的假死状态，在进行如上所述的 孔内的松材线虫的死亡率测定后，将各孔内的液体分别移到试管中， 离心分离，去除上清，再用蒸馏水洗涤2、3次，将其移到中央计数板 上，通过显微镜计数松材线虫的生存数和死亡数。和上述同样的方法 计算出死亡率。其结果发现用微孔板求得的死亡率和用中央计数板求 得的死亡率几乎一致。
在实验例中的提取工序图，如图1所示。
制备例：
制备青霉酸1体积％的水溶液，作为杀线虫剂(液体制剂)。
产业上的可利用性
本发明可以提供从属于曲霉菌属(Aspergillus sp.)的菌的培养 液中提取、纯化出的杀线虫剂。从上述出发点考虑，本发明具有在产 业上的可利用性。