食线虫真菌

食线虫真菌

由松木线虫Bursaphelenchus xylophilus导致的松树萎蔫病在亚洲东部盛行。据日本在1981年所作的预测，如日本赤松，Pinus densifloraSleb.& Zucc.，日本黑松，P.thunbergii Parl.和硫球松，P.luchuensisMayr的天然松树群落每年损失约达200万平方米，将近1000万棵松树会死亡。在日本，据记载最早的松树萎蔫病于1905年发生于九州、长崎。那时，还不了解这种松树破坏性疾病的致病原因。接种实验表明松木线虫B.xylophilus是松树萎蔫病流行的原因所在。进一步的研究已确定松树萎蔫病的疾病周期。

本发明涉及一种对茎、叶、芽或花线虫具有高感染性的新的真菌，其特征在于当在体内或固体培养基上生长时可产生第一种类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子，以及第二种类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子。

更具体地说，第一种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝，直立和广口壶状；第一种类型的产孢细胞为整合的，瓶梗产孢和很少及顶的；第一种类型的分生孢子为单生的，单细胞的，不对称的椭圆形，新月形和凹形；第二种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝或分枝，圆柱形，钻形和长形；第二种类型的产孢细胞为整合的，瓶梗产孢，肠芽殖产孢，末端或间生的，侧面增生的和不定型的；第二种类型的分生孢子是单生的，单细胞的，杆形和圆柱形。本发明真菌的其它特征在于当在液体肉汤中生长时可产生芽生孢子。

两种类型细胞的更详细的特征在于：第一种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝，直立，广口壶状，往上渐尖至细颈部，近透明至灰绿色，和光滑，变得粗糙至非常粗糙；第一种类型的产孢细胞为整合的，瓶梗产孢和很少及顶的；第一种类型的分生孢子为单生的，单细胞的，不对称的椭圆形，新月形，凹形，透明，壁光滑和粘附的，末梢具中度细尖并含有内生孢子样结构；第二种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝或分枝，直立的，圆柱形，钻形，有隔，透明，近透明至灰绿色，光滑，变得粗糙至非常粗糙，基底部有点肿胀；第二种类型的产孢细胞为整合的，瓶梗产孢，肠芽殖产孢，末端或间生的，侧面增生的和不定型的；第二种类型的分生孢子是单生的，粘液质的，单细胞的，杆形，圆柱形，透明，光滑和非粘附的，并经常聚生在顶端形成假头。

本发明的真菌可感染的线虫如松木线虫B.xylophilus；水稻白尖线虫Aphelenchoides besseyi；假松木线虫Bursaphelenchusmucronatus；水稻茎线虫Ditylenchus angustus；草莓、小麦、玉米、烟草、番茄和甜菜的茎线虫Ditylenchus dipsacis；椰子树的赤环线虫Phadinaphelenchus cocophilus；草莓线虫Aphelenchoidesfragariae或Aphelenchoides ritzemabos；和其他在形态或习性上密切相关的茎、叶、芽和花线虫。

于1999年1月29日将本发明的真菌，Esteya vermicola菌株保藏在美国典型培养物保藏中心(美国)，保藏号为74485。还于1999年2月4日将该菌株保藏于台湾培养物保藏中心和研究中心(保藏号为CCRC 930028)。本发明范围内还包括衍生自保藏菌株的突变体(通过常规的或重组的方法得到)，以及经证明与保藏菌株具有相同特征的任何真菌。

本发明的所有真菌，包括保藏菌株及其突变体都是食线虫的，可用作抗线虫的生物防治剂。从下列的图，详细描述和所附权利要求书中显而易见本发明的其他特征。

图1表示Esteya vermicola两种类型的分生孢子梗和分生孢子。

图2表示Esteya vermicola的与线虫角质层附着的分生孢子。

图3表示Esteya vermicola的由被感染的线虫产生的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子。

图4表示在瓶状瓶梗产孢的产孢细胞尖端上产生的不对称的，椭圆形，具细尖的分生孢子(箭头)，bar＝5μm。

图5表示Esteya vermicola第二种类型的瓶状，瓶梗产孢的分生孢子梗，所述分生孢子梗具有开口分离的产孢细胞(箭头)，并附着有不对称的椭圆形分生孢子(箭)，bar＝5μm。

图6表示Esteya vermicola第一种类型的分生孢子梗，所述分生孢子梗具有杆形分生孢子(箭头)，bar＝5μm。

图7表示Esteya vermicola的与线虫角质层附着的分生孢子(单个)。

图8表示由穿透线虫角质层和肌肉层的Esteya vermicola的分生孢子引发的入侵刺(箭头)，bar＝5μm。

图9和图10分别表示Esteya vermicola的由被感染的线虫产生的分生孢子梗和分生孢子(箭头)，bar＝50和20μm。

1985年首次在台湾北部地区发现了此病，目前，此病已分布很广，造成台湾50-60％，甚至更高的死亡率。为了使用柯赫氏定律证明致病性，第一步需从萎蔫的松树中提取松木线虫，这也是我们实验室的常规操作。一种情况下，在生长于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(Difco)斜面的菌丝体不育的真菌培养物上建立从萎蔫黑松中提取的松木线虫B.xylophilus的群体。无法解释的是：于室温下保温2至4周后，群体显著减少。对此群体中松木线虫尸体的检查显示出体内寄生虫丝孢菌类的大批出没。通过单个或大量孢子的分离技术可得到体内寄生虫的纯性培养物。有色的体内寄生虫在体内和体外产生了两种类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子，但其比例不同。第一种类型的产孢细胞由膨大的，近球形的至球形的基底和突然变得细小的，无囊领的颈部组成。分生孢子为新月形，凹形，含有与众不同的内生孢子样结构。第二种类型的分生孢子梗为单菌丝，单枝或分枝。产孢细胞为分离的或整合的，长形，钻形，3-7个分隔，基底膨大或不膨大，尖部光滑或具疣。分生孢子为圆柱形至杆形。表面上看，体内寄生虫与Phialophora Medlar有些类似，但通过形成孢子之结构，分生孢子的形态学特征及其生物学和习性易于将它们区分开。由于体内寄生虫不能被任何所述的显微动物寄生虫所接纳，因此需建立新属以接纳此生物体。

无需进一步详述，可以相信上文的描述足以实施本发明，因此，给出下列具体的实施例仅是为了阐明，而不是以任何方式限制公开内容的其余部分。本文提及的所有出版物都全文列入本文作为参考。松木线虫B.xylophilus的单种培养物1995年9月，在台湾省台北市阳明山(Yangmingshan)中，用生长锥从被松木线虫感染并萎蔫的日本黑松树体中心取长度约为5-8cm，直径为0.3mm的木块。将所述木块劈成长度约为0.5-1cm的小段，并浸入培养皿中的自来水中。将培养皿置于室温(约24-27℃)下保温24小时，用非常精细的螺旋蚀刻的金属针头抽取由木组织释放至自来水中的大量松木线虫，并将所述线虫转移至1％的次氯酸钠中，进行表面去感染2-3分钟，用无菌的蒸馏水冲洗3次，每次约5分钟。最后，将可能为纯性的松木线虫转移至PDA斜面上的菌丝体无菌的真菌培养物上，不经光照于25℃保温以建立群体。以每3-4周为间隔传代培养所建立的线虫群体，维持该群体以进行接种实验。分离、培养、判定和阐明丝孢菌类体内寄生虫将被真菌体内寄生虫侵染的松木线虫尸体平铺在2％水琼脂平板上，在立体显微镜下单个或大批分离附着的分生孢子，并将所述分生孢子转移至PDA斜面上。于25℃将纯的真菌培养物保温2-3周，在借助于活动镜筒(Olympus)的复合光学显微镜(Olympus BH-2)下，以400X或1000X的放大倍数判定和阐明所述培养物的形态学特征。通过上述方法还判定和阐明了由经接种和感染的松木线虫产生的体内寄生虫的形成孢子的结构和分生孢子。颜色的命名参见文献Kornerup，A.& Wanscher，J.H.(1978)，Methuen Handbook of Colour.Eyre Methuen有限公司：伦敦，英国。B.xylophilus被新的真菌体内寄生虫寄生于4℃或室温下，在PDA斜面上维持真菌体内寄生虫。为了检测感染性，首先于25℃，在1/10强度的玉米粉琼脂(CMA)(Difco)平板或斜面上传代培养体内寄生虫约2-3周。切下带有增生菌丝体的琼脂块并接种于2％水琼脂平板的中心。将平板于25℃保温约7-10天后，菌落产生了足够量的新月形，粘附的分生孢子，用10μl悬浮液中的250-300个松木线虫感染所述菌落。在光学显微镜下，以2、4、6、8、16、24小时和2、4、7天为间隔检查经接种的平板，记录感染率。挑选在不同发育阶段被体内寄生虫感染的线虫，放在水中，用光学显微术和照相检查寄生情况。为了通过扫描电子显微镜(SEM)检查寄生虫或宿主-寄生虫的相互作用，可使用以前描述的方法，即Tzean，S.S.& Estey，R.H.(1978)，破坏性的真菌上寄生物Schizophyllum commne Fr.，加拿大微生物学杂志，24，780-784。分类学Esteya(属的范围)

半知菌，丝孢菌类，具有子囊菌成员，两种类型的分生孢子梗，产孢细胞和分生孢子。第一种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝，直立和广口壶状；产孢细胞为整合的，瓶梗产孢和很少及顶的；分生孢子为单生的，单细胞的，不对称的椭圆形，新月形和凹形。第二种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝或分枝，圆柱形，钻形和长形；产孢细胞为整合的，瓶梗产孢，肠芽殖产孢，末端或间生的，侧面增生的和不定型的；分生孢子是单生的，单细胞的，杆形和圆柱形的。

Esteya vermicola(种的范围)于25℃，7天后，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上的菌落中度生长，直径为3.5-4.5mm，灰色，灰绿色至暗绿色(27F6-7；27EF1-3)，背面为灰色至暗绿色(28F4-5；30F1-4)。菌丝分枝，有隔，透明，近透明至灰绿色，光滑，变得粗糙至很粗糙，宽2-4μm。两种类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子。第一种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝，直立，广口壶状，(10-)16-29(-62)×(1.5-)3-4.4μm，往上渐尖至细颈部，宽1.5-1.9μm，近透明至灰绿色，光滑，变得粗糙至非常粗糙；产孢细胞为整合的，瓶梗产孢，很少及顶的；分生孢子为单生的，单细胞的，不对称的椭圆形，新月形，凹形，末梢具中度细尖，透明，壁光滑，8.2-11.1×3.5-3.7μm，含有内生孢子样结构，粘附的；第二种类型的分生孢子梗的菌丝体粗大，为单菌丝，单枝或分枝，直立的，圆柱形，钻形，有隔，透明，近透明至灰绿色，光滑，变得粗糙至非常粗糙，基底部长(22.2-)34.1-43μm，宽3-4.4μm，顶部宽1.48μm；产孢细胞为整合的，瓶梗产孢，肠芽殖产孢，末端或间生的，侧面增生的，不定型的；分生孢子是单生的，粘液质的，单细胞的，杆形，圆柱形，透明，光滑，(3-)4.4-7.4×1.5-1.9μm，非粘附的，经常聚生在顶端形成假头。在液体肉汤中，除了新月形的和杆形的分生孢子，细胞还能产生极大量的芽生孢子。当在营养贫瘠的固体培养基上传代培养时，芽生孢子萌发并产生了新月形的、粘附分生孢子。线虫被粘附的，新月形的分生孢子寄生。在被感染的线虫宿主体内，第一种类型的分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子占优势；形态学特征与培养基上出现的差不多。

习性：寄生于松木线虫。

词源学：为了纪念加拿大，McGill大学Macdonald学院的荣誉教授R.H.Estey，奖励他对食线虫真菌和线虫学研究的贡献，命名了该属；种的命名参照的是真菌寄生线虫的能力。

检查的标本：1995年9月10日在台北市阳明山(Yanmingshan)，从萎蔫的日本黑松Pinus thunbergii中提取的被感染的松木线虫B.xylophilus；全模标本PPH30(干燥的培养物)和extype(活培养物)被保藏于台湾台北国立台湾大学，植物病理学和昆虫学系，和台湾培养物保藏中心和研究中心(保藏号CCRC930028)。寄生Esteya vermicola在营养贫瘠的水琼脂平板上产生具有稀疏菌丝体，和显著不连续的，瓶状产孢细胞和新月形，凹形粘附分生孢子的菌落(图1，4和5)。在这种平板上，当线虫迁移和接触到产孢细胞和分生孢子时，大量新月形分生孢子易于通过凹侧的附着粘液粘附在松木线虫上。在24小时内，90％的被寄生线虫被粘附的分生孢子附着和感染(图2)。尽管头和尾区似乎是优选的位点，但分生孢子对线虫宿主的附着在体长范围内是随机的(图2)。附着18-24小时后，分生孢子萌发，并通过细小的入侵刺穿透线虫的角质层，在皮下产生感染球，从中长出2或3根营养菌丝(图7和8)。感染菌丝广泛分枝并破坏器官和组织后，线虫被杀死。通常在寄生后8-10天内(图3、9和10)，将近100％的线虫群体被消灭。当出现死亡的线虫时，菌丝几乎全部只产生不连续的，瓶状产孢细胞和新月形，粘附的分生孢子(图3和10)。在营养丰富的培养基中，E.vermicola主要产生长形、钻形、多隔的产孢细胞和圆柱形至杆形、非粘附的分生孢子(图1和6)。未发现任何被寄生的线虫被这种类型的分生孢子侵染。

表面上看，具有橄榄绿至黑色的菌落和有色的瓶状至圆柱形，钻形产孢细胞的E.vermicola类似于某些Phialophora的种。Schol-Schwarz，M.B.(1970)，Persoonia 6，59-94；G.T.& Kendrick，B.(1973)，Mycologia 65，661-688；Iwatsu，T.，Udagawa，S.I.& Toyazaki，N.(1988)，Mycotaxon 32，439-445；Millar，K.R.(1990)，Mycologia 85，647-650。然而，在Phialophora中，产孢细胞在颈部压缩，以独特的杯形或小桶形囊领为开口，这与Esteya的产孢细胞形成鲜明对照。Phialophora中最象E.vermicola的一个种是P.bubakii(Laxa)Schol-Schwarz，Schol-Schwarz，M.B.(1970)，它产生两种类型的产孢细胞和几种类型的分生孢子，初生的瓶梗为瓶形，光滑或具疣的，产生圆柱形至香肠形的分生孢子。次生的瓶梗为圆柱形，渐尖，末端刚好为不明显的成熟囊领，产生卵球形至球形的分生孢子。P.bubakii的特征还在于念珠状菌丝，束丝的分生孢子梗和小菌核。尽管具有相似性，但通过形成孢子的结构以及分生孢子在显微镜下的特征可明显地区分E.vermicola和P.bubakii。偶尔，Phialophora某些种的瓶梗为增生的和及顶的，分生孢子为二形的或根据年龄、培养基或培养条件的不同、形状和大小可以变化[Schol-Schwarz(1970)；Cole &Kendrick(1973)]。在E.vermicola中也会发生相同的事件，因此引起我们对预防措施和检定鉴定结果所必需的标准化的重视。大多数Phialophora种为腐生，已从空气、水、土壤和储存的松木或桦木、松树、云杉、冷杉、杨树、山毛榉等的木材中分离出它们，但有些是人类的病原体，Schol-Schwarz(1970)；Cole & Kendrick(1973)。已从蛭形轮虫中描述了两个体内寄生虫Phialophora种，P.endoparasitica Barron &Szijarto和P.tribrachispora Barron & Szijarto，它们的特征都在于以突出的膜状囊领开口的瓶状瓶梗，和附器分生孢子，Barron，G.L.& Szijarto，E.(1982)，加拿大植物学杂志60，1212-1215；Barron，G.L.& Szijarto，E.(1984)，Mycologia 76，1107-1100。最近，这两个种已被转移至新属Haptospora Barron中，该属以H.appendiculataBarron为代表，它也是轮虫类体内寄生虫，Barron，G.L.(1991)，加拿大植物学杂志69，503-506。从生物学和生态学上看，这些种与E.vermicola更密切相关，它们之间的系统发育关系值得用rDNA分子技术进一步研究，Yan，Z.H.，Rogers，S.O.& Wang.C.J.K.(1995)，Mycologia 87，72-83。

E.vermicola的形态学特征在某种程度上也类似于Phaeoacremo-nium W.Gams，Crous et M.J.Wingf.和Phialemonium W.Gams &McGinnis，它们是Phialophora和Acremonium Link：Fr.这两个属的中间体，具有有色的产孢细胞和不明显的囊领。这些属是腐生的或病原性的，可导致人类感染或进攻木本植物导致矮化或顶梢枯死。从生物学上看，它们似乎与任何线虫体内寄生虫真菌都不相关，Crous，P.W.，Gams，W.，Wingfield，M.J.& Wyk，P.S.van.(1996)，Mycologia 88，786-796；Gams，W.& McGinnis，M.R.(1983)，Mycologia 75，977-987。

除了Hirsutella rhossiliensis Minter & Brady据报道能寄生环形线虫Criconemella xenoplax(Roski)Luc & Rasiisan和囊线虫Heterodea schachtii Schmidt以外(Jaffee，B.A.& Zehr，E.I.(1982)，植物病理学72，1378-1381；Jaffee，B.A.& Zehr，E.I.(1985)，Journal of Namatodology 17，341-345；Jaffee，B.A.& Muldoon，A.E.(1989)，线虫学杂志21，505-510)，Hirsutella属大多数为昆虫病原体[Minter，D.W.& Brady，B.L.(1980)，Transactions of theBritish Mycological Society 74，271-282；Evans，H.C.& Samson，R.A.(1986)，加拿大植物学杂志64，2098-2103]。Hirsutella可以是单菌丝的或束丝的，单-或多瓶梗的，Minter & Brady(1980)。H.rhossiliensis的产孢细胞是无柄的，由营养菌丝较垂直或较不垂直地独自产生，该产孢细胞为透明的，光滑的或朝长、细顶部方向上略微具疣的，且基底膨大的。分生孢子为单细胞的，透明，椭球状，经常为橘子瓣的形状，单生或群生于颈部，被包裹在有色的粘液鞘中，Minter & Brady(1980)。这些特征使人联想到E.vermicola瓶状的产孢细胞和新月形的粘附的分生孢子，然而，新月形的分生孢子缺乏粘液鞘的包被，附着的粘液仅存在于凹侧。在线虫-体内寄生虫Drechmeria coniospora(Drech.)W.Gams & Jansson中也报道了粘合剂在特定位点处的定位，它利用了分生孢子远端的粘附结来附着线虫角质层[Gams，W.& Jansson，H.B.(1985)，Mycotaxon 22，33-38；Dijksterhuis，J.，Veenhuis，M.& Harder，W.(1990)，真菌学研究94，1-8]。

E.vermicola是最早记载的松木线虫体内寄生虫，它对松木线虫表现出高感染性。在体外，松木线虫群体可被E.vermicola在8-10天内全部杀死，因此，E.vermicola是抗松木线虫的生物防治剂。

其他实施方案可以任何组合方式组合本说明书中公开的所有特征，本说明书中公开的每个特征也可以被用于相同、等价，或相似目的的其它特征所取代，因此，除非特别说明，所公开的每个特征仅是一般系列的等价或相似特征的例子。

另外，鉴于上文的描述，本领域技术人员易于确定本发明的必要技术特征，在不背离本发明精神和范围的情况下，可对本发明进行多种改变和修饰以使本发明适应多种用途和条件。