[0001] 对序列表的引用

[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

[0003] 发明背景发明领域

[0004] 本发明涉及用于改进农作物的特性的组合物和方法。

[0005] 相关技术描述

[0006] 木葡聚糖内糖基转移酶(XET)是一种催化木葡聚糖(植物细胞壁的结构多糖)的内切-转糖基作用的酶。该酶存在于大多数植物中，并且具体地是陆生植物。已经从双子叶植物和单子叶植物中提取出XET。

[0007] 木葡聚糖存在于棉布、纸、或木纤维中(哈亚西(Hayashi)等人，1988，碳水化合物研究(Carbohydrate Research)181:273-277)使得牢固氢键合到纤维素(卡皮塔(Carpita)和吉比特(Gibeaut)，1993，植物杂志(The Plant Journal)3:1-30)。向包含木葡聚糖的各种纤维素材料添加木葡聚糖内糖基转移酶改变了在纤维素纤维之间的木葡聚糖介导的相互连接，改进它们的强度，并且维持纤维素结构，同时允许纤维素纤维在力的作用下相对于彼此运动。

[0008] 在本领域中已知的是大多数生长在温室中并且特别是户外的农作物由于暴露于环境或暴露于农业有害生物而腐败。在本领域中令人希望的是在不使用化学或生物杀有害生物剂的情况下在农作物周围形成物理保护或屏障。美国专利号6,027,740、美国专利号6,069,112、美国专利号6,110,867、和美国专利号6,156,327披露了通过在农产品周围产生物理屏障来保护作物的方法。还已知的是大多数从田地、园林和温室中收获的农产品在消费或销售之前已腐败。估计损失量在第一世界国家是从0至25％，并且在第三世界国家是0至
50％，这取决于所收获的作物，将其推测实质性的经济、营养和社会损失。在第一世界国家，大部分的收获后损失被称作定性损失(qualitative loss)；由于不好的外观，未腐败的农产品依然未被消费或未被销售。

[0009] 在本领域中需要保护农作物，就在外观上和免于腐败、腐烂、或污染两者而言。在本领域中还需要延长在收获与上市之间使所收获的作物在外观上保持新鲜的时间长度。在本领域中另外需要保护或减缓割下的或准备好的农产品的腐败发作或腐败出现。

[0010] 本发明提供了用于改进农作物的特性的方法。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明涉及用于改性农作物的方法，这些方法包括用选自下组的组合物处理该农作物，该组由以下各项组成：(a)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(h)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0013] 本发明还涉及通过此类方法获得的改性的农作物。

[0014] 本发明还涉及改性的农作物，这些农作物包括(a)聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0015] 本发明进一步涉及选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(h)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物。

[0016] 附图简述

[0017] 图1示出了pDLHD0012的限制性图谱。

[0018] 图2示出了pMMar27的限制性图谱。

[0019] 图3示出了pEvFz1的限制性图谱。

[0020] 图4示出了pDLHD0006的限制性图谱。

[0021] 图5示出了pDLHD0039的限制性图谱。

[0022] 图6示出了在室温下培育1天之后，上列中的浸渍在罗望子木葡聚糖中的、或下列中的未浸渍的康乃馨茎。

[0023] 图7A示出了培育2天之后，上列中的浸渍在罗望子木葡聚糖中的、或下列中的未浸渍的苹果片；图7B示出了培育5天之后的相同的切片。

[0024] 图8示出了在环境条件下培育3、4、和7天之后，澳洲青苹(Granny Smith apple)的浸渍盘在包含具有或不具有1.1μM红豆(Vigna angularis)木葡聚糖内糖基转移酶16(VaXET16)的1mg/ml罗望子木葡聚糖的40mM柠檬酸钠(pH 5.5)或5ml的去离子水中的效果。图8A示出了培育3天之后的苹果片。图8B示出了培育4天之后的苹果片。图8C示出了培育7天之后的苹果片。

[0025] 图9示出了苹果片图像的定量分析，以确定木葡聚糖和VaXET16阻止苹果氧化的程度。图9A示出了培育4天之后未被浸渍的苹果片的像素强度直方图。图9B示出了培育4天之后浸渍在40mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的苹果片的像素强度直方图。图9C示出了培育4天之后浸渍在木葡聚糖中的苹果片的像素强度直方图。图9D示出了培育4天之后浸渍在木葡聚糖和VaXET16中的苹果片的像素强度直方图。图9E示出了经不同处理的苹果片的平均强度与时间的图。

[0026] 图10A示出了包含浸渍在指定溶液中的马铃薯片的培养板的照片。在培育0小时、2.5小时、5小时、和22小时时拍照。图10B示出了包含浸渍在指定溶液中的鳄梨片的培养板的照片。在培育0小时和70小时时拍照。

[0027] 图11A-11H示出了一系列激光扫描共聚焦显微镜图像，这些图像将在环境温度下在150mM氯化钠-20mM磷酸盐(pH 7.2)中用拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14(AtXET14)培育过夜的与在150mM氯化钠-20mM磷酸盐(pH 7.2)中用AtXET14和异硫氰酸荧光素标记的木葡聚糖(FITC-XG)培育过夜的水果、花卉、或蔬菜进行了比较。图11A示出了用AtXET14培育的苹果片的截面的共聚焦图像。图11B示出了用AtXET14和FITC-XG培育的苹果片的截面的共聚焦图像。图11C示出了用AtXET14培育的康乃馨茎的截面的共聚焦图像。图11D示出了用AtXET14和FITC-XG培育的康乃馨茎的截面的共聚焦图像。图11E示出了用AtXET14培育的香蕉茎的截面的共聚焦图像。图11F示出了用AtXET14和FITC-XG培育的香蕉茎的截面的共聚焦图像。图11G示出了用AtXET14培育的南瓜茎的截面的共聚焦图像。图11H示出了用AtXET14和FITC-XG培育的南瓜茎的截面的共聚焦图像。

[0028] 定义

[0029] 如在此使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。

[0030] 农作物：术语“农作物”意指用于为人类或动物使用或消费的在其成长阶段的某个点收获的任何植物或其产品，如水果、蔬菜、易腐植物、花卉、谷物和其他主要作物、草药和植物、坚果或种子、用于纺布或纤维而种植的作物、以及直接从其中衍生的易腐食品。

[0031] 功能化的木葡聚糖低聚物：术语“功能化的木葡聚糖低聚物”意指短链木葡聚糖寡糖，包括单个或多个的重复单元的木葡聚糖，其已经通过掺入化学基团来修饰。该木葡聚糖低聚物分子量优选地是1至3kDa，对应于1至3个重复木葡聚糖单元。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。掺入的反应性基团可以用感兴趣的化合物衍生化，以提供直接的农业效益或配合金属阳离子和/或结合与这些反应性基团相互作用(例如，共价地、疏水地、静电地等)的其他化学实体。该衍生化可以直接在包括反应性基团的功能化的木葡聚糖低聚物上进行，或者在将包括反应性基团的功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。可替代地，该木葡聚糖低聚物可以通过使用包含于该化合物中的反应性基团直接合并化合物来功能化，该反应性基团是，例如，醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。在此可互换使用术语“功能化的木葡聚糖低聚物”和“包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物”。

[0032] 聚合木葡聚糖：术语“聚合木葡聚糖”意指包含不止一个重复单元的木葡聚糖(例如，多个重复单元的木葡聚糖)的短、中或长链木葡聚糖寡糖或多糖。最优化地，聚合木葡聚糖包含50-200kDa数均分子量的木葡聚糖，对应于50-200个重复单元。木葡聚糖的重复基序由以下构成：四个β-(1-4)-D-吡喃葡萄糖残基的骨架，其中三个在O-6处具有单个α-D-吡喃木糖残基。这些木糖残基中的一些在O-2处是β-D-吡喃半乳糖基化的，并且这些半乳糖残基中的一些在O-2处是α-L-吡喃海藻糖基化的。术语“木葡聚糖”在此被理解为意指聚合木葡聚糖。

[0033] 用化学基团功能化的聚合木葡聚糖：术语“用化学基团功能化的聚合木葡聚糖”意指通过合并化学基团修饰的聚合木葡聚糖。聚合木葡聚糖是包含不止一个重复单元的木葡聚糖(例如，多个重复单元的木葡聚糖)的短、中或长链木葡聚糖寡糖或多糖。聚合木葡聚糖包含50-200kDa数均分子量的木葡聚糖，对应于50-200个重复单元。木葡聚糖的重复基序由以下构成：四个β-(1-4)-D-吡喃葡萄糖残基的骨架，其中三个在O-6处具有单个α-D-吡喃木糖残基。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。可以通过在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下，将聚合木葡聚糖与功能化的木葡聚糖低聚物反应，来将化学基团掺入聚合木葡聚糖。然后可以将掺入的化学性基团与感兴趣的化合物衍生化。该衍生化可以直接在包括反应性基团的功能化的聚合木葡聚糖上进行，或者在将包括反应性基团的功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。可替代地，该聚合木葡聚糖可以通过使用包含于该化合物中的反应性基团直接合并化合物来功能化，该反应性基团，例如，醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。

[0034] 木葡聚糖内糖基转移酶：术语“木葡聚糖内糖基转移酶”意指木葡聚糖：木葡聚糖内糖基转移酶(EC 2.4.1.207)，该酶催化木葡聚糖骨架中β-(1→4)键的裂解，并且转移该木葡聚糖基区段到受体非还原末端葡萄糖残基的O-4上，该受体可以是木葡聚糖或木葡聚糖的寡糖。木葡聚糖内糖基转移酶又称木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶或内切木葡聚糖转移酶。一些木聚糖内糖基转移酶可以具有不同活性，这些活性包括木葡聚糖和甘露聚糖内糖基转移酶活性。例如，来自成熟的木瓜水果的木聚糖内糖基转移酶可以使用杂木聚糖，如小麦阿拉伯糖基木聚糖、桦木葡糖醛酸木聚糖、及其他作为供体分子。这些木聚糖可能与木葡聚糖发挥类似的作用，同时成本便宜很多，因为它们可以，例如，从纸浆厂废液和/或未来生物质生物炼制中提取。

[0035] 通过本领域中的那些技术人员，使用任何以下方法，可以评估木葡聚糖内糖基转移酶活性。当在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下用摩尔过量的木葡聚糖低聚物孵育时，木葡聚糖聚合物的平均分子量的减少可以通过液相层析(苏鲁瓦(Sulova)等人，2003，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)41:431-437)或通过乙醇沉淀(山中(Yaanaka)等人，2000，食品胶体(Food Hydrocolloids)14:125-128)，随后通过重量或纤维素结合分析(弗里(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828)来确定，或可以在碱性条件下通过与碘结合在比色上来进行评估(苏鲁瓦(Sulova)等人，1995，分析生物化学(Analytical Biochemistry)229:80-85)。在木葡聚糖内糖基转移酶的存在下，通过用木葡聚糖孵育功能化的低聚物，将功能化的木葡聚糖低聚物掺入到木葡聚糖聚合物中可以，例如，通过用木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶孵育放射性标记的木葡聚糖低聚物，随后进行滤纸结合和滤纸放射性的测量来评估，或者荧光或光功能化的木聚糖低聚物的掺入可以类似地，通过监测荧光或比色分析滤纸进行评估。

[0036] 木葡聚糖低聚物：术语“木葡聚糖低聚物”意指短链木葡聚糖寡糖，包括单个或多个重复单元的木葡聚糖。最优化地，该木葡聚糖低聚物分子量将是1至3kDa，对应于1至3个重复木葡聚糖单元。

[0037] 本发明详细说明

[0038] 本发明涉及用于改性农作物的方法，这些方法包括用选自下组的组合物处理该农作物，该组由以下各项组成：(a)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(h)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0039] 本发明还涉及通过此类方法获得的改性的农作物。

[0040] 本发明还涉及改性的农作物，这些农作物包括(a)聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0041] 本发明进一步涉及选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(h)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物。

[0042] 在一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶，聚合木葡聚糖，和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶，用化学基团功能化的聚合木葡聚糖，和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物。

[0043] 在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖和木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括用化学基团功能化的聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括聚合木葡聚糖。在另一个实施例中，该组合物包括含有化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物。在另一个实施例中，该组合物包括木葡聚糖低聚物。

[0044] 可以在任何有用的介质中用本发明的组合物对农作物进行改性。在一个实施例中，该介质是水性介质。在另一个实施例中，该介质是部分水性介质。在另一个方面，该介质是浆料。在另一个方面，该介质是水性浆料。在另一个方面，该介质是非水性浆料。在另一个方面，该介质是部分水性浆料。在另一个方面，该介质是蜡质悬液液。在另一个方面，该介质是乳液。

[0045] 在一个方面，收获该农作物。在另一个方面，未收获该农作物。

[0046] 本发明的方法预防农作物及其经加工的作物的定性和定量损失。一旦被收获，农产品便迅速地经历老化，外观、营养价值、构造、硬度、和/或合意性降低。以相关方式，一旦被收获，农产品便可以由于微生物降解而腐败。一旦刺破农产品的保护性外皮、果皮、或外壳，该农产品便经受氧化性损伤、脱水、合意外观的失去、以及潜在的微生物降解。收获之后，农产品被运给批发商、经销商、和/或整合商，并且然后走向消费市场。必然地必须加快销售以将损失最小化，由此则增加了相关成本。用聚合木葡聚糖(一种天然存在的植物多糖)的溶液、或更优选地用聚合木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的溶液处理割下的花卉、水果、蔬菜或其他农作物保护经处理的农产品免于例如降解、腐败、和出现不好的外观。可以用化合物(例如，用防腐剂或疏水性化学部分)对该聚合木葡聚糖进行功能化，并且木葡聚糖内糖基转移酶的存在允许用引入的具有例如防止水分流失并且阻止农产品干燥效果的功能化对该农产品的表面涂层。可以按这种方式类似地引入食品安全级的抗微生物化合物，如抑菌化合物或杀菌化合物。

[0047] 在一个方面，该功能化可以提供任何功能上有用的化学部分。

[0048] 在组合物中，该木葡聚糖内糖基转移酶优选地以约0.1nM至约1mM，例如，约10nM至约100μM或约0.5μM至约5μM存在。

[0049] 该聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖优选地以约1mg/g至约1g/g组合物，例如，约10mg至约950mg或约100mg至约900mg/g组合物存在。

[0050] 当在没有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物优选地以约1mg至约1g/g组合物，例如，约10mg至约950mg或约100mg至约900mg/g组合物存在。

[0051] 当有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物在有聚合木葡聚糖的情况下优选地以木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约50:1至约0.5:1摩尔比，例如，木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约10:1至约1:1或约5:1至约1:1摩尔比存在。

[0052] 该聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖优选地以约1ng至约1g/g农作物，例如，约10μg至约100mg或约1mg至约50mg/g农作物存在。

[0053] 当在没有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物优选地以约1ng/g至约1g/g农作物，例如，约10μg至约100mg或约1mg至约50mg/g农作物存在。

[0054] 当有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下存在时，该木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物在有聚合木葡聚糖的情况下优选地以约50:1至约0.5:1，例如，木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖约10:1至约1:1或约5:1至约1:1摩尔比存在。

[0055] 该木葡聚糖内糖基转移酶优选地以约0.1nM至约1mM，例如，约10nM至约100μM或约0.5μM至约5μM存在。

[0056] 掺入到农作物上或掺入到农作物中的聚合木葡聚糖、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、木葡聚糖低聚物、或包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物的浓度是约1pg至约500mg/g农作物，例如约0.1μg至约50mg或约1至约5mg/g农作物。

[0057] 农作物

[0058] 在本发明的方法中，这些农作物可以是用于人类或动物使用或消费而种植的任何植物、或其部分。

[0059] 在一个方面，种植这些农作物用作人类食物。在另一个方面，种植这些农作物用作青贮饲料。在另一个方面，种植这些农作物用作动物或家畜饲料。在另一个方面，种植这些农作物用作幼苗、幼树、或移植物。在另一个方面，这些农作物是观赏性的。在另一个方面，这些农作物是树木。在另一个方面，这些农作物是用于木材而种植的树木。在另一个方面，这些农作物是作为圣诞树而种植的树木。在另一个方面，这些农作物是用于水果、蔬菜、或坚果生产而种植的树木。在另一个方面，这些农作物是灌木丛或灌木。在另一个方面，这些农作物是草。在另一个方面，这些农作物是用于切花市场而种植的花卉。在另一个方面，这些农作物是作为室内植物而种植的花卉。在另一个方面，种植这些农作物用作药用或顺势化合物。在另一个方面，种植这些农作物用于纤维。在另一个方面，用于纤维而种植的农作物是棉花。在另一个方面，用于纤维而种植的农作物是大麻。在另一个方面，用于纤维而种植的农作物是亚麻。在另一个方面，用于纤维而种植的农作物是苎麻。在另一个方面，用于纤维而种植的农作物是竹子。在另一个方面，种植这些农作物用于酒精发酵或饮料生产。在另一个方面，种植这些农作物用于干酒糟。

[0060] 在另一个方面，该农作物是水果。该水果可以是任何类型的水果。这些水果可以是苹果、鳄梨、香蕉、浆果、黄瓜、葡萄、罗望子、西瓜、香瓜、南瓜、桃子、李子、橄榄，橙子、柠檬、酸橙、梨、黑莓、菠萝、无花果、桑椹、谷物、向日葵、坚果、以及非植物水果。在一个方面，这些水果是浆果(例如，覆盆子、蓝莓、葡萄、越橘、番茄、茄子、蔓越橘、番石榴、石榴、辣椒、以及黄瓜)。在另一个方面，这些水果是瓠果(例如，西瓜、香瓜、和南瓜)。在另一个方面，这些水果是核果(例如，桃子、李子、和橄榄)。在另一个方面，这些水果是蓇葖。在另一个方面，这些水果是蒴果(例如，七叶树、棉花、和桉树)。在另一个方面，这些水果是柑果(例如，橙子、橘子、葡萄柚、柠檬、和酸橙)。在另一个方面，这些水果是附果(例如，苹果和梨)。在另一个方面，这些水果是聚合果(例如，黑莓、菠萝、和无花果)。在另一个方面，这些水果是复果(例如，桑葚)。在另一个方面，这些水果是瘦果(例如，向日葵)。在另一个方面，这些水果是坚果(例如，胡桃、橡木、花生、和杏仁)。在另一个方面，这些水果是非植物水果(例如，杜松子和大黄)。

[0061] 在另一个方面，该农作物是蔬菜。该蔬菜可以是任何可食用植物或其部分。这些蔬菜可以是朝鲜蓟、芦笋、大麦、豆芽菜、豆类、黑芥、花椰菜、抱子甘蓝、胡萝卜、菜花、芹菜、三叶草、亚麻、大蒜、姜、大麻、印芥、羽衣甘蓝、大头菜、韭菜、小扁豆、莴苣、玉蜀黍(玉米)、粟、燕麦、洋葱、豌豆、花生、罂粟、马铃薯、萝卜、大黄、水稻、黑麦、青葱、高粱、大豆、菠菜、甘薯、罗望子、小黑麦、西洋菜、或小麦。

[0062] 在另一个方面，该蔬菜来源于植物的花芽(例如，花椰菜、菜花、和朝鲜蓟)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物叶子(例如，菠菜、莴苣、羽衣甘蓝、和西洋菜)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物芽(例如，抱子甘蓝)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物嫩枝(例如，芦笋和豆芽菜)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物茎(例如，姜和大头菜)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物块茎(例如，马铃薯和甘薯)。在另一个方面，该蔬菜来源于叶茎(例如，芹菜和大黄)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物根(例如，胡萝卜和萝卜)。在另一个方面，该蔬菜来源于植物鳞茎(例如，洋葱和青葱)。

[0063] 这些蔬菜可以是豆科蔬菜，包括豆类、大豆、豌豆、小扁豆、三叶草、花生、罗望子、和紫藤的植物或种子。

[0064] 在另一个方面，该农作物是谷物。在另一个方面，这些谷物是小麦、水稻、燕麦、黑麦、小黑麦或大麦。在另一个方面，这些谷物是粟、高粱、或玉蜀黍(玉米)。在另一个方面，这些谷物是芥(例如，黑芥和印芥)。在另一个方面，这些谷物是粮豆(例如，豌豆、扁豆、和豆类)。在另一个方面，这些谷物是亚麻、大麻、或罂粟。

[0065] 在另一个方面，该农作物是花卉。该花卉可以是任何花卉。在一个方面，这些花卉是田间种植的切花。在另一个方面，这些花卉是温室种植的切花。该花卉可以是紫花霍香蓟(Ageratum houstonianum)、大阿米芹、金鱼草、翠菊、鸡冠花、矢车菊、大矢车菊(Centaurea Americana)、愉悦山字草(Clarkia amoena)、分叉飞燕草(Consolida regalis)、须苞石竹、洋桔梗、缕丝花(Gypsophila elegans)、瓜葉向日葵(Helianthus debilis cucumerifolius)、屈曲花(Iberis amara)、星辰花(Limonium sinuatum)、黑种草(Nigella damascena)、松虫草(Scabiosa atropurpurea)、百日草、凤尾蓍、银蒿(Artemisia ludoviciana)、沼泽乳草(Asclepias incarnate)、蝴蝶乳草(Asclepias tuberosa)、荷兰菊(Aster novi-belgii)、石南菊(Aster ericoides)、落新妇属、Chrysanthemum x superbum、巴纳特蓝刺头(Echinops bannaticus)、高蓝刺头(Echinops exaltatus)、硬叶蓝刺头(Echinops ritro)、蓝刺头(Echinops sphaerocephalus)、紫晶刺芹(Eryngium amethystinum)、扁叶刺芹(Eryngium planum)、高山刺芹(Eryngium alpinum)、满天星、蛇鞭菊属、芍药属、桔梗、鼠尾草(Salvia farinacea)、高加索蓝盆花(Scabiosa caucasica)、一枝黄花属、葱属、唐菖蒲属、百合属、蔷薇属、金鱼草属、非洲菊属(Gerbera)、郁金香属、或唐菖蒲属。

[0066] 在一个方面，这些切花是一年生植物。这些一年生花卉可以是紫花霍香蓟、大阿米芹、金鱼草、翠菊、鸡冠花、矢车菊、大矢车菊、愉悦山字草、分叉飞燕草、须苞石竹、洋桔梗、缕丝花、瓜葉向日葵、屈曲花、星辰花、黑种草、松虫草、以及百日草。

[0067] 在另一个方面，这些切花是多年生植物。这些多年生花卉可以是凤尾蓍、银蒿、沼泽乳草、蝴蝶乳草、荷兰菊、石南菊、落新妇属、夏斯塔菊(Chrysanthemum x superbum)、巴纳特蓝刺头、高蓝刺头、硬叶蓝刺头、蓝刺头、紫晶刺芹、扁叶刺芹、高山刺芹、满天星、蛇鞭菊属、芍药属、桔梗、鼠尾草、高加索蓝盆花、以及一枝黄花属。

[0068] 在另一个方面，这些切花是鳞茎植物。这些花卉鳞茎可以是葱属、唐菖蒲属、和百合属。在另一个方面，这些切花是传统的切花，如菊花、康乃馨、和玫瑰。在另一个方面，这些切花是非传统切花，如百合(百合属)、金鱼草(金鱼草属)、非洲菊(非洲菊属)、郁金香(郁金香属)、以及唐菖蒲(唐菖蒲属)。在另一个方面，这些切花从南美、荷兰或加勒比海地区运来。在另一个方面，这些切花从当地农场运来。

[0069] 在另一个方面，该农作物是香料。该香料可以是印度藏茴香(Ajwain/Trachyspermum ammi)、灌木蕃茄(Akudjura/Solanum centrale)、亚历山大草
(Alexanders/Smyrnium olusatrum)、紫草根(Alkanet/Alkanna tinctoria)、鳄椒、Mbongo香料(mbongochobi)、赫珀椒(Hepper pepper)(丹尼利非洲豆蔻(Aframomum danielli)、柠檬非洲豆蔻(A.citratum)、A.exscapum)、多香果(Allspice/Pimenta dioica)、当归(Angelica/Angelica archangelica)、茴芹(Anise/Pimpinella anisum)、茴藿香(Anise Hyssop/Agastache foeniculum)、茴香蒲桃(Aniseed myrtle/Syzygium anisatum)、红木(Annatto/Bixa orellana)、苹果薄荷(Apple mint/Mentha suaveolens、圆叶薄荷(Mentha x rotundifolia)和长柔毛薄荷(Mentha x villosa))、蒿属(蒿属物种)、阿魏
(Asafoetida/Ferula assafoetida)、欧细辛(Asarabacca/Asarum europaeum)、水杨梅(Avens/Geum urbanum)、鳄梨叶(美洲鳄梨(Peresea americana))、小蘖(Barberry/Berberis vulgaris和其他小檗属物种)、罗勒(Sweet basil/Ocimum basilicum)、柠檬罗勒(Lemon basil/Ocimum x citriodorum)、泰国罗勒(Thai basil/O.basilicum 
var.thyrsiflora)、圣罗勒(Holy Basil/Ocimum tenuiflorum)、月桂叶(月桂)、香蜂草(Bee balm/Monarda didyma)、波尔多(Boldo/Peumus boldus)、琉璃苣(Borage/Borago officinalis)、香豆蔻(Black cardamom/Amomum subulatum、草豆蔻(Amomum costatum))、黑芥(Black mustard/Brassica nigra)、蓝葫芦巴、蓝色草木犀(Blue melilot)(卢豆(Trigonella caerulea))、棕芥(雪里蕻)、葛缕子(Caraway/Carum carvi)、白芥(White mustard/Sinapis alba)、白豆蔻(White cardamom/Elettaria cardamomum)、角豆(Carob/Ceratonia siliqua)、猫薄荷(Catnip/Nepeta cataria)、肉桂(Cassia/Cinnamomum aromaticum)、辣椒(Cayenne pepper/Capsicum annuum)、芹菜叶(芹菜)、芹菜籽(Celery seed/Apium graveolens)、雪维菜(Chervil/Anthriscus cerefolium)、菊苣(Chicory/Cichorium intybus)、红辣椒(辣椒属物种)、香葱(Chives/Allium schoenoprasum)、欧洲没药(Sweet Cicely/Myrrhis odorata)、芫荽(Cilantro或coriander/Coriandrum sativum)、肉桂(阴香(Cinnamomum burmannii)、罗雷弱肉桂(Cinnamomum loureiroi)、锡兰肉桂(Cinnamomum verum/Cinnamomum zeylanicum))、白肉桂(White Cinnamon/Canella winterana)、默特尔肉桂(Myrtle Cinnamon/Backhousia myrtifolia)、快乐鼠尾草(Clary sage/Salvia sclarea)、丁香(Clove/Syzygium aromaticum)、艾菊(Costmary/Tanacetum balsamita)、到手香(Cuban oregano/Plectranthus amboinicus)、荜澄茄(Cubeb pepper/Piper cubeba)、鼠曲草(鼠曲草属物种)、刺芹、刺芫荽(culangot或long coriander/Eryngium foetidum)、孜然(Cumin/Cuminum cyminum)、咖哩叶(Curry leaf/Murraya koenigii)、咖哩草(Curry plant)(永久花(Helichrysum italicum))、莳萝(Dill/Anethum graveolens)、接骨木(接骨木属物种)、土荆芥(Epazote/Dysphania ambrosioides)、小茴香(Fennel/Foeniculum vulgare)、葫芦巴(Fenugreek/Trigonella foenum-graecum)、Filé粉(黄樟(Sassafras albidum))、手指根(Fingerroot)、凹唇姜(Krachai或Temu kuntji/Boesenbergia rotunda)、大高良姜(Greater Galangal/Alpinia galanga)、高良姜(Lesser Galangal/Alpinia officinarum)、莎草(莎草属物种)、韭(Garlic chives/Allium tuberosum)、大蒜(Garlic/Allium sativum)、象大蒜(Elephant Garlic/Allium ampeloprasum var.ampeloprasum)、姜(Ginger/Zingiber officinale)、火炬姜(Torch Ginger/Etlingera elatior)、伊朗独活(Golpar/Heracleum persicum)、天堂椒
(paradise/Aframomum melegueta)的颗粒、塞利姆(Selim)的颗粒、卡尼椒(Kani pepper)(埃塞俄比亚木瓣树(Xylopia aethiopica))、辣根(Horseradish/Armoracia rusticana)、鱼腥草、Huacatay、墨西哥万寿菊(Mexican marigold)、万寿菊(Mint marigold/Tagetes minuta)、牛膝草(Hyssop/Hyssopus officinalis)、印尼月桂叶、多花蒲桃(Daun salam/Syzygium polyanthum)、茉莉花(茉莉属物种)、Jimbu(Allium hypsistum)、杜松子(Juniper berry/Juniperus communis)、泰国青柠叶(泰国青柠(Citrus hystrix))、Kala zeera(或kala jira)、黑种草(Black cumin)(伊朗布留芹(Bunium persicum))、卡瓦胡椒(Kawakawa)籽(高大胡椒(Macropiper excelsum))、山柰(Kencur/Kaempferia galanga)、印尼黑果(Keluak/Pangium edule)、越南香峰草(Vietnamese balm)(香薷(Elsholtzia ciliata))、柯卡姆(Kokam)籽(印度藤黄(Garcinia indica))、Korarima、埃塞俄比亚小豆蔻(Ethiopian cardamom/Aframomum corrorima)、Koseret叶(Lippia adoensis)、熏衣草(熏衣草属物种)、柠檬香蜂草(Lemon balm/Melissa officinalis)、柠檬草(香茅属)、柠檬铁皮桉(Lemon ironbark)(史泰格尤加利(Eucalyptus staigeriana))、柠檬香桃木(Lemon myrtle/Backhousia citriodora)、柠檬马鞭草(Lemon verbena/Lippia citriodora)、叉子股(Leptotes bicolor)、小风轮菜(Lesser calamint/Calamintha nepeta)、nipitella、欧亚甘草(Licorice(光果甘草(Glycyrrhiza glabra)))、椴树花(Lime flower(椴树属(Tilia spp.)))、洋甘草(Lovage/Levisticum officinale)、肉豆蔻(Mace/Myristica fragrans)、马哈利酸樱桃(St.Lucie cherry/Prunus mahaleb)、马郁兰(Marjoram/Origanum majorana)、药蜀葵(Marsh mallow/Althaea officinalis)、乳香(Mastic/Pistacia lentiscus)、薄荷(薄荷属物种)、山霍罗皮托(Mountain horopito/
Pseudowintera colorata)、黄葵、黄秋葵(abelmosk/Abelmoschus moschatus)、旱金莲(Nasturtium/Tropaeolum majus)、黑种草属(黑种草)、Njangsa(Ricinodendron heudelotii)、肉豆蔻(Nutmeg/Myristica fragrans)、苦楝、奥利达桉树(Olida/Eucalyptus olida)、牛至(牛至属)、鸢尾根(鸢尾属(Iris))、班兰(Pandan)花、kewra(Pandanus odoratissimus)、班兰叶(挺花露兜树(Pandanus amaryllifolius))、辣椒(Paprika/Capsicum annuum)、金钮扣(Paracress/Spilanthes acmella、Soleracea)、荷兰芹(Parsley/Petroselinum crispum)、黑胡椒、白胡椒或绿胡椒(胡椒(Piper nigrum))、多里戈胡椒(Dorrigo pepper/Tasmannia stipitata)、荜菝(Long pepper/Piper longum)、山胡椒(Mountain pepper/Tasmannia lanceolata)、胡椒薄荷(Peppermint/Mentha piperata)、胡椒薄荷胶叶(薄荷尤加利(Eucalyptus dives))、紫苏(紫苏属物种)、秘鲁胡椒(Peruvian pepper/Schinus molle)、挺花露兜树(Pandanus amaryllifolius)、巴西胡椒(Brazilian pepper/Schinus terebinthifolius)、苦木属(苦木(Quassia amara))、熊葱(Ramsons/Allium ursinum)、稻田草(紫苏草(Limnophila aromatica))、迷迭香(Rosemary/Rosmarinus officinalis)、芸香(Rue/Ruta graveolens)、红花(Safflower/Carthamus tinctorius)、藏红花(Saffron/Crocus sativus)、鼠尾草(Sage/Salvia officinalis)、西贡肉桂(Saigon cinnamon/Cinnamomum loureiroi)、小地榆(Salad burnet/Sanguisorba minor)、红门兰(Salep/Orchis mascula)、黄樟(Sassafras/Sassafras albidum)、夏香薄荷(Summer savory/Satureja hortensis)、冬香薄荷(Winter savory/Satureja montana)、紫苏(Shiso/Perilla frutescens)、酸模(Sorrel/Rumex acetosa)、小酸模(Sheep sorrel/Rumex acetosella)、留兰香(Spearmint/Mentha spicata)、甘松(匙叶甘松(Nardostachys grandiflora)或穗甘松(N.jatamansi))、八角(Star anise/Illicium verum)、漆树(Sumac/Rhus coriaria)、香猪殃殃(Sweet woodruff/Galium odoratum)、四川胡椒(Szechuan pepper/Zanthoxylum piperitum)、龙蒿(Tarragon/Artemisia dracunculus)、百里香(Thyme/Thymus vulgaris)、柠檬百里香(Lemon thyme/Thymus x citriodorus)、姜黄(Turmeric/Curcuma longa)、香草(Vanilla/Vanilla planifolia)、越南肉桂(Vietnamese cinnamon/Cinnamomum loureiroi)、越南芫荽(Vietnamese coriander/Persicaria odorata)、波本胡椒(Voatsiperifery/Piper borbonense)、山葵(Wasabi/Wasabia japonica)、水蓼(Water-pepper/Polygonum hydropiper)、豆瓣菜(Watercress/Rorippa nasturtium-aquatica)、金合欢籽
(Wattleseed/Acacia)、野萎(Wild betel)(假蒟(Piper sarmentosum))、红花百里香(Wild thyme/Thymus serpyllum)、柳草(Willow herb/Epilobium parviflorum)、冬青
(Wintergreen/Gaultheria procumbens)、水杨梅(Wood avens/Geum urbanum)、车叶草(Woodruff/Galium odoratum)、苦艾(absinthe/Artemisia absinthium)、或加州小薄荷(Yerba buena)。

[0070] 可以根据本发明的方法处理农作物的叶、茎、秆、嫩枝、种子、根、和/或果实。随后可以将该农作物准备好用于展示或消费，通过切割、切片、去皮、去籽、去壳、或本领域已知的其他方法。

[0071] 改进的特性

[0072] 根据本发明的方法处理农作物向该农作物赋予改进的特性，例如，在收获之前或收获后。

[0073] 该改进的特性可以是一种或多种改进，包括但不限于降低或预防氧化性褐变，降低或预防脱水，降低或预防干燥，降低或预防细菌、真菌、微生物、动物、或昆虫有害生物侵染，降低或预防老化，降低或预防早熟，和降低或预防软化。这一种或多种改进的特性还可以是物理改进，包括预防碰压伤、抗压碎性、预防或增强聚集、以及聚合或结合。该改进的特性还可以是一种或多种改进，包括但不限于外观，例如，增强的颜色或人工着色。这一种或多种改进的特性还可以是对不利环境因素(例如，阳光或紫外线损伤)的抗性。该改进的特性还可以是改进的味道，例如，通过碳水化合物、盐或食品添加剂功能化。

[0074] 在一个方面，该改进的特性是降低或预防氧化性褐变。在另一个方面，该改进的特性是减少或预防脱水。在另一个方面，该改进的特性是减少或预防干燥。在另一个方面，该改进的特性是细菌有害生物侵染。在另一个方面，该改进的特性是真菌有害生物侵染。在另一个方面，该改进的特性是微生物有害生物侵染。在另一个方面，该改进的特性是动物有害生物侵染。在另一个方面，该改进的特性是昆虫有害生物侵染。在另一个方面，该改进的特性是减少或预防老化。在另一个方面，该改进的特性是减少或预防早熟。在另一个方面，该改进的特性是减少或预防软化。在另一个方面，该改进的特性是预防碰压伤、抗压碎性、预防或增强聚集、以及聚合或结合。在另一个方面，该改进的特性是抗压碎性。在另一个方面，该改进的特性是预防或增强聚集。在另一个方面，该改进的特性是聚合或结合。在另一个方面，该改进的特性是改进的外观。在另一个方面，该改进的特性是对不利环境因素的抗性。在另一个方面，该改进的特性是改进的味道。

[0075] 在一个方面，该改进的特性在收获之前保护农作物。在另一个方面，该改进的特性延长走向市场的运输时间。在另一个方面，该改进的特性延长农作物的保质期。在另一个方面，该改进的特性增加农作物的营养价值持续更长时间段。

[0076] 聚合木葡聚糖

[0077] 在本发明的方法中，该聚合木葡聚糖可以是任何木葡聚糖。在一个方面，该聚合木葡聚糖获得自自然来源。在另一个方面，该聚合木葡聚糖是通过由本领域技术人员所使用的任何手段从组分碳水化物、UDP-或GDP-碳水化合物、或卤化的碳水化合物来合成的。在另一个方面，聚合木葡聚糖的自然来源是罗望子或罗望子内核粉末、旱金莲属、或旱金莲属植物具体地旱金莲。该聚合木葡聚糖的自然来源可以是各种双子叶植物的种子，这些双子叶植物如孪叶豆(Hymenaea courbaril)，豆科-云实亚科，其包括Cynometreae、Amherstieae、和Sclerolobieae属。该聚合木葡聚糖的自然来源还可以是报春花目、番荔枝科、沼花科、蜜花科、胡麻科、和旱金莲科或山牵牛亚科的植物的种子。该聚合木葡聚糖的自然来源还可以是风仙花科、爵床科、亚麻科、毛茛科、无患子科、和山榄科或豆科蝶形花亚科的非胚乳成员的植物的种子。在另一个方面，该聚合木葡聚糖的自然来源是双子叶植物的初生细胞壁。在另一个方面，该聚合木葡聚糖的自然来源可以是非禾本科的单子叶植物的初生细胞壁。

[0078] 该自然来源聚合木葡聚糖可以通过大量的沸水或热水提取，或通过本领域技术人员已知的其他方法来提取。在一个方面，可以随后将该聚合木葡聚糖进行纯化，例如，通过在80％乙醇中沉淀。在另一个方面，该聚合木葡聚糖是一种粗的或富集制品，例如，罗望子内核粉末。在另一个方面，该合成的木葡聚糖可以通过自动化碳水化物合成来产生(西贝格(Seeberger)，化学通讯(Chem.Commun)，2003，1115-1121)，或通过酶促聚合，例如，使用糖苷合成酶(斯派杜特(Spaduit)等人，2011，美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)133:10892-10900)。

[0079] 在一个方面，聚合木葡聚糖的平均分子量范围从约2kDa至约500kDa，例如，约2kDa至约400kDa、约3kDa至约300kDa、约3kDa至约200kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约75kDa、约7.5kDa至约50kDa、或约10kDa至约30kDa。在另一个方面，重复单元的数量是约2至约500，例如，约2至约400、约3至约300、约3至约200、约5至约100、约7.5至约50、或约10至约
30。在另一个方面，重复单位是根据弗里(Fry)等人(植物生理学(Physiologia Plantarum)
89:1-3，1993)的命名原则的G、X、L、F、S、T和J亚单元的任何组合。在另一个方面，重复单元是为双子叶植物和非禾本的单子叶植物所共有的海藻糖化的或非海藻糖化的XXXG型聚合木葡聚糖。在另一个方面，该聚合木葡聚糖是O-乙酰化的。在另一个方面，该聚合木葡聚糖不是O-乙酰化的。在另一个方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端海藻糖基残基。在另一个方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端阿拉伯糖基残基。在另一个方面，该聚合木葡聚糖的侧链可以包含末端木糖残基。

[0080] 出于本发明的目的，在此引用的术语木葡聚糖是指聚合木葡聚糖。

[0081] 木葡聚糖低聚物

[0082] 在本发明的方法中，该木葡聚糖低聚物可以是任何木葡聚糖低聚物。该木葡聚糖低聚物可以通过将来自任何来源的聚合木葡聚糖降解或水解来获得。该木葡聚糖低聚物可以通过聚合木葡聚糖的酶促降解来获得，例如，通过用木葡聚糖酶或葡聚糖内切酶(内切-β-1-4-葡聚糖酶)定量或部分消化。该木葡聚糖低聚物可以从组分碳水化物、UDP-或GDP-碳水化合物、或卤化的碳水化合物通过本领域技术人员通常使用的任何手段来合成。

[0083] 在一个方面，木葡聚糖低聚物的平均分子量范围从0.5kDa至约500kDa，例如，约1kDa至约20kDa、约1kDa至约10kDa、或约1kDa至约3kDa。在另一个方面，重复单元的数量是约1至约500，例如，约1至约20、约1至约10、或约1至约3。在本发明的方法中，该木葡聚糖低聚物最优地是尽可能短的(即，1个重复单位，或分子量约1kDa)来使每克的溶解的木葡聚糖低聚物的解度和溶液摩尔浓度最大化，同时针对木葡聚糖内糖基转移酶活性保持底物特异性。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物包括根据弗里(Fry)等人(植物生理学(Physiologia Plantarum)89:1-3，1993)的命名原则的G(β-D吡喃葡萄糖基-)、X(α-D-吡喃木糖基-(1→
6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、L(β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、F(α-L-海藻糖-吡喃糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、S(α-L-海藻阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、T(α-L-阿拉伯-海藻糖基-(1→3)-α-L-海藻阿拉伯糖基-(1→
2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-)、以及J(α-L-吡喃半乳糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-α-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-葡萄-吡喃糖基-)亚单元的任何组合。在另一个方面，该木葡聚糖低聚糖是为双子叶植物和非禾本的单子叶植物所共有的XXXG七糖。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物是O-乙酰化的。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物非是O-乙酰化的。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端海藻糖基残基。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端阿拉伯糖基残基。在另一个方面，该木葡聚糖低聚物的侧链可以包含末端木糖残基。

[0084] 木葡聚糖低聚物和聚合木葡聚糖的功能化

[0085] 该木葡聚糖低聚物可以通过掺入本领域中技术人员已知的任何化学基团来进行功能化。该化学基团可以是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。

[0086] 在一个方面，该化学基团可以是醛基基团。

[0087] 在另一个方面，该化学基团是氨基基团。可以通过还原氨化，将该氨基基团掺入到聚合木葡聚糖中。可替代地，氨基基团可以是脂肪胺或芳香胺(例如，苯胺)。该脂肪胺可以是伯、仲、或叔胺。伯、仲、或叔胺分别是结合到一个、两个和三个碳的氮。在一个方面，该伯胺是C1-C8，例如，乙胺。在另一个方面，仲胺中的每个碳是C1-C8，例如，二乙胺。在另一个方面，叔胺中的每个碳是C1-C8，例如，三乙胺。

[0088] 在另一个方面，该化学基团是芳香族基团。该芳香族基团可以是芳烃基团、芳基卤基团、酚基基团、苯胺基团、重氮基基团、或杂环基团。

[0089] 在另一个方面，该化学基团是羧基基团。该羧基基团可以是酰基卤、酰胺、羧酸、酯、或硫酯。

[0090] 在另一个方面，该化学基团是卤素基团。该卤素基团可以是氟、氯、溴、或碘。

[0091] 在另一个方面，该化学基团是羟基基团。

[0092] 在另一个方面，该化学基团是酮基基团。

[0093] 在另一个方面，该化学基团是腈基基团。

[0094] 在另一个方面，该化学基团是硝基基团。

[0095] 在另一个方面，该化学基团是巯基基团。

[0096] 在另一个方面，该化学基团是磺酸盐基团。

[0097] 该化学反应性基团本身可以是向农作物赋予所希望的物理或化学特性的化学基团。

[0098] 通过以此方式掺入化学反应性基团，本领域的技术人员可以进一步用将向农作物赋予所希望的物理或化学特性的化合物(例如，高分子)使掺入的反应性基团衍生化。例如，掺入的化学基团可以与给予所希望特性的化合物反应来通过共价键将该基团掺入到木葡聚糖低聚物中。可替代地，该化学基团可以按可逆或不可逆方法结合到给予所希望特性的化合物上，并且通过非共价结合掺入该化合物。该衍生化可以直接在功能化的木葡聚糖低聚物上进行，或者在将功能化木葡聚糖低聚物掺入聚合木葡聚糖后进行。

[0099] 可替代地，该木葡聚糖低聚物可以通过直接掺入向材料赋予所希望的物理或化学特性的化合物来进行功能化，该掺入是通过使用包含于化合物中的反应性基团或被掺入到该化合物中的反应性基团，如以上描述的任何基团来进行。

[0100] 另一方面，该聚合木葡聚糖可以通过掺入如以上描述的反应性化学基团来直接功能化。通过将反应性化学基团直接掺入聚合木葡聚糖，本领域的技术人员可以进一步用将向材料赋予所希望的物理或化学特性的化合物使掺入的反应性基团衍生化。通过直接将化合物掺入聚合木葡聚糖中，还可以将所希望的物理或化学特性直接赋予给材料。

[0101] 在一个方面，该功能化是通过使木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖的还原末端羟基反应来进行。在另一个方面，除末端葡萄糖的位置4处的非还原羟基以外，可以使非还原羟基基团进行反应。在另一个方面，除末端葡萄糖的位置4处的非还原羟基以外，可以使还原末端羟基和非还原羟基进行反应。

[0102] 该化学官能团可以通过酶促修饰该木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖，或通过非酶促化学反应来添加。在一个方面，使用酶促修饰来添加化学官能团。在酶促修饰的一个实施例中，该酶促功能化是对酮或羧化物的氧化，例如，通过半乳糖氧化酶。在酶促修饰的另一个实施例中，酶促功能化是通过AA9家族氧化酶对酮或羧化物的氧化(前身为糖原水解酶家族61酶)。

[0103] 在另一个方面，该化学官能团是通过非酶促化学反应来添加的。在非酶促化学反应的一个实施例中，该反应是通过如通过罗伊(Roy)等人，1984，加拿大化学杂志(Can.J.Chem.)62:270–275，或达尔帕萨多(Dalpathado)等人，2005，分析和生物分析化学(Anal.Bioanal.Chem.)，381:1130-1137描述的碳水化合物的还原末端的还原氨化来掺入反应性氨基基团。在非酶促化学反应的另一个实施例中，该反应是通过将还原端羟基氧化成酮来掺入反应性酮基基团，例如，通过铜(II)。在非酶促化学反应的另一个实施例中，该反应是通过(2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-基)氧基(TEMPO)、或其氧代铵盐，将非还原端羟基基团(例如，葡萄糖或半乳糖的非糖苷键位置6羟基)氧化，以产生如在(布拉吉(Bragd)等人，2002，碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)49:397-406，或布里顿(Breton)等人，
2007，欧洲有机化学杂志(Eur.J.Org.Chem.)10:1567-1570)中所描述的醛或羧酸。

[0104] 木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖可以通过与包含不止一个(即，双功能的或多功能的)化学官能团的化合物化学反应来进行功能化，该化合物包括直接与木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖反应的至少一个化学官能团。在一个方面，该双功能化学基团是包含伯胺和第二化学官能团的烃。该第二官能团可以是任何以上描述的其他基团。在一些方面中，这两种官能团通过本领域中熟知的各种长度的烃链(接头)来分离。

[0105] 木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖可以用感兴趣的化合物通过逐步或协同反应来进行功能化，其中该木葡聚糖低聚物或聚合木葡聚糖是如以上所述进行功能化的，并且该化合物对其引入的功能具有反应性。在由功能化的木葡聚糖低聚物偶联的一个方面，通过还原氨化，将氨基基团首先掺入木葡聚糖低聚物中，并且随后将反应性羰基连接到所引入的氨基基团上。在由氨基修饰的木葡聚糖低聚物偶联的另一个方面，该第二偶联步骤通过将N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯或亚氨酸酯偶联到引入的氨基基团，来掺入化学基团、化合物或高分子。在一个优选的实施例中，随后该偶联到氨基基团的NHS酯是单或双功能交联试剂的组分。在偶联到功能化的木葡聚糖或木葡聚糖低聚物上的另一个方面，该第一反应步骤包括用巯基基团的功能化，通过在升高的温度下在还原剂的存在下用烷基硫代氨(NH2-(CH2)n-SH)的还原氨化(马吉德(Magid)等人，1996，有机化学杂志(J.Org.Chem.)61:3849-3862)，或通过自由基偶合(王(Wang)等人，2009，Arkivoc xiv:171-180)，随后通过将马来酰亚胺基团反应成巯基。在一些方面中，如本领域中充分描述的，将该给予所希望特性的化合物中的反应性基团通过适当长度的烃链从其余化合物中分离出来。

[0106] 可以通过直接反应或通过与木葡聚糖反应的化合物反应用来功能化聚合木葡聚糖或木葡聚糖低聚物的感兴趣的化合物的非限制性实例包括肽、多肽、蛋白、疏水基团、亲水基团、阻燃剂、染料、修色剂、特异性亲和标记物、非特异性亲和标记物、金属、金属氧化物、金属硫化物、矿物质、杀真菌剂、除草剂、杀微生物剂或抑菌剂、以及非共价键分子。

[0107] 在一个方面，该化合物是肽。该肽可以是抗微生物肽，设计来降低过敏和免疫原性的“自体肽”、环肽、谷胱甘肽、或信号肽(如，速激肽、血管活性肠肽、胰多肽相关的肽、降钙素肽、脂肽、环脂肽、或其他肽)。

[0108] 在另一个方面，该化合物是多肽。该多肽可以是非催化活性的蛋白(即，结构或结合蛋白)、或催化活性的蛋白(即，酶)。该多肽可以是酶、抗体、或抗体酶。

[0109] 在另一个方面，该化合物是包括疏水基团的化合物。该疏水基团可以是聚氨酯、聚四氟乙烯、或聚偏氟乙烯。

[0110] 在另一个方面，该化合物是包括亲水基团的化合物。该亲水基团可以是甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、或聚丙烯酸酯。

[0111] 在另一个方面，该化合物是阻燃剂。该阻燃剂可以是氢氧化铝或氢氧化镁。该阻燃剂还可以是包括有机卤素基团或有机磷基团的化合物。

[0112] 在另一个方面，该化合物是染料或颜料。

[0113] 在另一个方面，该化合物是特异性亲和标记物。该特异性亲和标记物可以是生物素、阿维丁、螯合基团、冠醚、血红素基团、非反应性底物类似物、抗体、靶抗原、或凝集素。

[0114] 在另一个方面，该化合物是非特异性亲和标记物。该非特异性亲和标记物可以是聚阳离子基团、聚阴离子基团、磁性颗粒(例如，磁铁矿)、疏水基团、脂肪族基团、金属、金属氧化物、金属硫化物、或分子筛。

[0115] 在另一个方面，该化合物是杀真菌剂。该杀真菌剂可以是包括如下的化合物：二羧酰亚胺基团(如烯菌酮)、苯基吡咯基团(如咯菌腈)、氯苯基基团(如五氯硝苯)、氯硝基苯(如二氯硝基苯胺)、三二唑(triadiazole)基团(如土菌灵)、二硫代氨基甲酸酯基团(如代森锰锌或二甲基二硫代氨基甲酸酯)、或无机分子(如铜或硫)。在另一个方面，该杀真菌剂是细菌或细菌孢子如芽胞杆菌属或芽胞杆菌属孢子。

[0116] 在另一个方面，该化合物是除草剂。该除草剂可以是草甘磷、合成的植物激素(如包括如下的化合物：2,4-二氯苯氧乙酸基团、2,4,5-三氯苯氧乙酸基团、2-甲基-4-氯苯氧乙酸基团、2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸基团、2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸基团、或(2,4-二氯苯氧基)丁酸基团)、或包括三嗪基团的化合物(如莠去津(2-氯-4-(乙氨基)-6-异丙氨基)-s-三嗪))。

[0117] 在另一个方面，该化合物是杀菌或抑菌化合物。该杀菌或抑菌化合物可以是铜或铜合金(如黄铜、青铜、白铜、或铜镍锌合金)、磺酰胺基团(如磺胺甲噁唑、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰或磺胺哒嗪)、银或有机银基团、TiO2、ZnO2、抗微生物肽、或壳聚糖。

[0118] 在另一个方面，该化合物是抗紫外线化合物。该抗紫外线化合物可以是锌或ZnO2、高岭土、铝、氧化铝、或其他抗紫外线化合物。

[0119] 在另一个方面，该化合物是抗氧化化合物。该抗氧化化合物可以是抗坏血酸盐、锰、碘化物、视黄醇、萜类化合物、生育酚、类黄酮或其他抗氧化酚或多酚化合物、或其他抗氧化化合物。

[0120] 在另一个方面，该化合物是非共价接头分子。

[0121] 在另一个方面，该化合物是修色剂。该修色剂可以是染料、荧光增白剂、修色剂、或媒染剂(例如，矾、铬矾)。

[0122] 改性的农作物的制备

[0123] 在本发明的方法中，可以通过用以下项在产生改性的农作物的条件下在介质中处理农作物来制备改性的农作物：(a)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(b)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(c)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包括化学基团的、功能化的木葡聚糖低聚物；(h)一种组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；或(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0124] 这些方法通过但不限于苹果和马铃薯片的改进的抗褐变性来示例，通过在收获后用包括木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的溶液处理这些农作物。该木葡聚糖可以是任何木葡聚糖，例如，罗望子内核木葡聚糖。该木葡聚糖内糖基转移酶可以是例如红豆XET16或拟南芥XET14。在本发明的方法中，可以将水果或蔬菜(例如，苹果或马铃薯)的切片浸渍在包含木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的pH受控的溶液(例如，缓冲溶液，如柠檬酸钠)中。该缓冲溶液的pH可以在约3与约9之间，例如，约4至约8或约5至约7。柠檬酸钠的浓度可以是约1mM至约1M，例如，约5mM至约500mM、约10mM至约100mM、或约20mM至约50mM。木葡聚糖的浓度可以是约10mg/L至约100g/L，例如，约100mg/L至约10g/L、约500mg/L至约5g/L、或约1g/L至约2g/L。木葡聚糖内糖基转移酶的浓度可以是约1nM至约1mM，例如约10nM至约100μM、约
100nM至约10μM、或约500nM至约1.5μM。浸渍的时间长度可以是瞬时的至约12小时，例如，约
1秒至约3小时、约10秒至约30分钟、或约30秒至约2分钟。可以优化浸渍的时间长度，以便使改进的特性最大化，或者可以由本领域的技术人员根据该方法来优化。可以例如通过在水中洗涤，通过浸渍在不包含木葡聚糖、木葡聚糖内糖基转移酶、或两者的pH受控的溶液中，或通过使苹果或马铃薯的切片接触容器的侧面或接触纸巾或揩布来除去过量的溶液。可替代地，可以在洗涤之前将过量的溶液留在农作物上或留在作物上，持续适当的时间长度。在当前实例中，通过使水果或蔬菜接触容器的侧面来除去过量的溶液。在一个方面，可以将木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶分到2种溶液中，并且将农作物独立且顺序地浸渍在每种溶液中。在另一个方面，将木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物添加到木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的溶液中，或者如果这两种组分被分到2种溶液中的话，则添加到一种或另一种或两种溶液中。例如，可以将木葡聚糖低聚物以与木葡聚糖的约10-4至约100，例如约10-3至约10或约10-2至约1的摩尔比添加到木葡聚糖和木葡聚糖内糖基转移酶的溶液中。以此方式，本领域的技术人员可以使用木葡聚糖内糖基转移酶的糖基转移酶活性来优化木葡聚糖聚合物的大小和/或木葡聚糖的功能化程度，以实现最佳的改进特性。

[0125] 木葡聚糖内糖基转移酶的来源

[0126] 可以使用在适合于本发明方法的pH和温度下具有适合酶活性的任何木葡聚糖内糖基转移酶。优选的是，在广泛的pH和温度范围内，该木葡聚糖内糖基转移酶是有活性的。在实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有在约3至约10范围内的pH最佳值。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有在约4.5至约8.5范围内的pH最佳值。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有小于或等于约5℃的冷变性温度或约100℃或更高的熔解温度。在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶具有小于或等于20℃的冷变性温度或大于等于约75℃的熔解温度。

[0127] 所使用的木葡聚糖内糖基转移酶的来源在本发明中并不是关键。因此，该木葡聚糖内糖基转移酶可以从任何来源，如植物、微生物、或动物来获得。

[0128] 在一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶从植物来源中获得。木葡聚糖内糖基转移酶可以从豆科(同义词：豆科(Leguminosae和Papilionaceae))的子叶中获得，优选地菜豆属，具体地，绿豆。优选的单子叶植物是非禾本科的单子叶植物和百合的单子叶植物。木葡聚糖内糖基转移酶还可以从苔藓和苔类中来提取，如在弗里(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828中所描述的。例如，该木葡聚糖内糖基转移酶可以从子叶中获得，即，双子叶植物或单子叶植物，具体地而言选自下组的双子叶植物，该组由以下各项组成：赤小豆、卡诺拉、花椰菜、棉、白杨或杂种白杨、马铃薯、油菜、大豆、向日葵、阿拉伯芥、烟草、和番茄，或选自下组的单子叶植物，该组由以下各项组成：小麦、水稻、玉米和甘蔗。参见，例如，WO 2003/033813和WO 97/23683。

[0129] 在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶获得自拟南芥(GENESEQP:AOE11231、GENESEQP:AOE93420、GENESEQP:BAL03414、GENESEQP:BAL03622、或GENESEQP:
AWK95154)；番木瓜(GENESEQP:AZR75725)；黄瓜(GENESEQP:AZV66490)；野胡萝卜(GENESEQP:
AZV66139)；草地羊茅(GENESEQP:AZR80321)；大豆(GENESEQP:AWK95154或GENESEQP:
AYF92062)；大麦(GENESEQP:AZR85056、GENESEQP:AQY12558、GENESEQP:AQY12559、或GENESEQP:AWK95180)；番茄(GENESEQP:ATZ45232)；蒺藜状苜蓿(GENESEQP:ATZ48025)；稻(GENESEQP:ATZ42485、GENESEQP:ATZ57524、或GENESEQP:AZR76430)；欧洲山杨(GENESEQP:
AWK95036)；矮慈菇(GENESEQP:AZV66468)；双色高粱(GENESEQP:BAO79623或GENESEQP:
BAO79007)；红豆(GENESEQP:ATZ61320)；或玉蜀黍(GENESEQP:AWK94916)。

[0130] 在另一个实施例中，该木葡聚糖内糖基转移酶是具有水解和转糖基活性的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(XTH)。在一个优选的实施例中，该转糖基作用与水解速率的比例是至少10-2至107，例如，10-1至106或10至1000。

[0131] 木葡聚糖内糖基转移酶的产生

[0132] 木葡聚糖内糖基转移酶可以从植物中提取。用于从植物中提取木葡聚糖内糖基转移酶的适合的方法描述于弗雷(Fry)等人，1992，生物化学杂志(Biochem.J.)282:821-828；苏鲁瓦(Sulova)等人，1998，生物化学杂志(Biochem.J.)330:1475-1480；苏鲁瓦(Sulova)等人，1995，分析生物化学(Anal.Biochem.)229:80-85；WO 95/13384；WO 97/23683；或EP 
562 836中。

[0133] 木葡聚糖内糖基转移酶还可以是通过培养包含来自植物、微生物、或动物的适当的遗传信息的经转化宿主生物体来生产。通过本领域中已知的方法制备并培养转化体。

[0134] 用于分离或克隆基因的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。来自基因组DNA的基因的克隆可以例如通过使用聚合酶链反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。

[0135] 核酸构建体可以构成包括一种编码木葡聚糖内糖基转移酶、可操作地连接至一个或多个控制序列的基因，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导该编码序列在适合的宿主细胞中的表达。可以用许多方式操作所述基因以便于木葡聚糖内糖基转移酶的表达。取决于表达载体，在基因插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

[0136] 该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子包含介导木葡聚糖内糖基转移酶的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

[0137] 用于在细菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

[0138] 在丝状真菌宿主细胞中，用于指导核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；
及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

[0139] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

[0140] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸的3’-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

[0141] 用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

[0142] 用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。

[0143] 用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

[0144] 该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

[0145] 适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of 
Bacteriology)177:3465-3471)。

[0146] 该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接至编码木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导子。

[0147] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

[0148] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

[0149] 控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

[0150] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

[0151] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

[0152] 控制序列也可以是编码与木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

[0153] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

[0154] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

[0155] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。

[0156] 控制序列还可以是编码位于木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端的前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

[0157] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻木葡聚糖内糖基转移酶的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

[0158] 不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入供表达的适当载体中来进行表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

[0159] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

[0160] 该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

[0161] 该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

[0162] 细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。

[0163] 选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

[0164] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

[0165] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该木葡聚糖内糖基转移酶的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

[0166] 对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

[0167] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

[0168] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

[0169] 在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:
9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法完成。

[0170] 可以向宿主细胞中插入多于一个拷贝的多核苷酸，以增加木葡聚糖内糖基转移酶的产量。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

[0171] 用于连接以上所描述的元件以构建重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

[0172] 宿主细胞可以是在重组产生木葡聚糖内糖基转移酶中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

[0173] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

[0174] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

[0175] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

[0176] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，
2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满
(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)
65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

[0177] 宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

[0178] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

[0179] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。

[0180] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

[0181] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

[0182] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

[0183] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

[0184] 可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及以本身已知的方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:
1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-
1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：
贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:
163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:
1920。

[0185] 所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述木葡聚糖内糖基转移酶的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该木葡聚糖内糖基转移酶表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果木葡聚糖内糖基转移酶分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果该木葡聚糖内糖基转移酶不被分泌，则可以从细胞裂解物中回收该物质。

[0186] 可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该木葡聚糖内糖基转移酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

[0187] 可以使用本领域中已知的方法回收该木葡聚糖内糖基转移酶。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面，回收包含多肽的整个发酵液。在一个优选方面，木葡聚糖内糖基转移酶产率可以通过随后在缓冲液或在缓冲洗涤剂溶液中洗涤细胞碎片以提取生物质相关的多肽来改进。

[0188] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该木葡聚糖内糖基转移酶以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、复合型色谱、反相色谱、层析聚焦色谱、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、PAGE、膜过滤或提取(参见例如，蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。在一个优选方面，木葡聚糖内糖基转移酶可以通过用木葡聚糖形成共价酰基酶中间体，随后与微晶纤维素沉淀或吸附到纤维素膜上进行纯化。然后通过添加木葡聚糖低聚物来解析共价中间体来影响多肽的释放(苏鲁瓦(Sulova)和法卡斯(Farkas)，1999，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)16(2):231-
235，和斯蒂尔(Steele)和弗里(Fry)，1999，生物化学杂志(Biochemical Journal)340:
207-211)。

[0189] 通过以下实例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

[0190] 实例

[0191] 培养基和溶液

[0192] COVE琼脂板由以下各项构成：342.3g的蔗糖、252.54g的CsCl、59.1g的乙酰胺、520mg的KCl、520mg的MgSO4·7H2O、1.52g的KH2PO4、0.04mg的Na2B4O7·10H2O、0.4mg的CuSO4·5H2O、1.2mg的FeSO4·7H2O、0.7mg的MnSO4·2H2O、0.8mg的Na2MoO4·2H2O、10mg的ZnSO4·7H2O、25g的纯净琼脂、以及加至1升的去离子水。

[0193] LB培养基由以下各项构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、以及加至1升的去离子水。

[0194] LB板由以下各项构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌琼脂(bacteriological agar)、以及加至1升的去离子水。

[0195] 基本培养基琼脂板由以下各项构成：342.3g的蔗糖、10g的葡萄糖、4g的MgSO4·7H2O、6g的NaNO3、0.52g的KCl、1.52g的KH2PO4、0.04mg的Na2B4O7·10H2O、0.4mg的CuSO4·
5H2O、1.2mg的FeSO4·7H2O、0.7mg的MnSO4·2H2O、0.8mg的Na2MoO4·2H2O、10mg的ZnSO4·
7H2O、500mg的柠檬酸、4mg的d-生物素、20g的纯净琼脂、以及加至1升的去离子水。

[0196] 合成的、缺少尿苷的确定成分培养基由以下各项构成：18mg的腺嘌呤半硫酸盐、76mg的丙氨酸、76mg的精氨酸盐酸盐、76mg的天冬酰胺一水合物、76mg的天门冬氨酸、76mg的半胱氨酸盐酸盐一水合物、76mg的谷氨酸单钠盐、76mg的谷氨酰胺、76mg的甘氨酸、76mg的组氨酸、myo-76mg的肌醇、76mg的异亮氨酸、380mg的亮氨酸、76mg的赖氨酸单盐酸盐、
76mg的蛋氨酸、8mg的对-氨基苯甲酸钾盐、76mg的苯丙氨酸、76mg的脯氨酸、76mg的丝氨酸、
76mg的苏氨酸、76mg的色氨酸、76mg的酪氨酸二钠盐、76mg的缬氨酸、以及加至1升的去离子水。

[0197] TAE缓冲液由以下各项构成：4.84g的Tris碱、1.14ml的冰醋酸、2ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及加至1升的去离子水。

[0198] TBE缓冲液由以下各项构成：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、4ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及加至1升的去离子水。

[0199] 2XYT加氨比西林板由以下各项构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的氯化钠、15g的细菌琼脂(Bacto agar)、以及加至1升的去离子水。在高压蒸汽处理的培养基回火到55℃后，添加1ml的100mg/ml的氨比西林。

[0200] YP+2％葡萄糖培养基由以下各项构成：10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、以及加至1升的去离子水。

[0201] YP+2％麦芽糊精培养基由以下各项构成：10g的酵母提取物、20g的蛋白胨、20g的麦芽糊精、以及加至1升的去离子水。

[0202] 实例1：红豆木葡聚糖内糖基转移酶16的制备

[0203] 根据以下描述的方案，红豆木葡聚糖内糖基转移酶16(VaXET16；SEQ ID NO:1[天然DNA序列]、SEQ ID NO:2[合成DNA序列]、和SEQ ID NO:3[推导的氨基酸序列]；还称为XTH1)重组产生于米曲霉MT3568中。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉amdS基因恢复pyrG营养缺陷型。

[0204] 构建载体pDLHD0012以在米曲霉中多拷贝表达VaXET16基因。使用大引物克隆，通过合并如下两种DNA片段来产生质粒pDLHD0012：包含VaXET16ORF和与载体pBM120具有同源性的侧翼序列(US 20090253171)的片段1，和由载体pBM120的反向PCR扩增子组成的片段2。

[0205] 使用以下所示的引物613788(正义)和引物613983(反义)扩增片段1。这些引物被设计成包含与载体pBM120同源的序列的侧翼区(小写)，用于PCR片段之间的无连接克隆。

[0206] 引物613788(正义)：

[0207] ttcctcaatcctctatatacacaactggccATGGGCTCGTCCCTCTGGAC(SEQ ID NO:7)

[0208] 引物613983(反义)：

[0209] tgtcagtcacctctagttaattaGATGTCCCTATCGCGTGTACACTCG(SEQ ID NO:8)

[0210] 片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的包括在Sac I和Kpn I位点之间所克隆的VaXET16合成基因(SEQ ID NO:3[合成DNA序列])的 载体pMA、0.5μl的DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、
20pmol的引物613788、20pmol的引物613983、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、和35.5μl的水构成。在(Eppendorf AG公司，汉堡，德国)中孵育该反应，
程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续
10秒，以及72℃持续30秒。将得到的0.9kb PCR产物(片段1)用1μl的Dpn I(普洛麦格公司(Promega)，菲奇堡，威斯康辛州、美国)进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后根据制造商的说明，使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)
进行柱纯化。

[0211] 使用以下所示的引物613786(正义)和613787(反义)扩增片段2。

[0212] 613786(正义)：

[0213] taattaactagaggtgactgacacctggc(SEQ ID NO:9)

[0214] 613787(反义)：

[0215] catggccagttgtgtatatagaggattgagg(SEQ ID NO:10)

[0216] 片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pBM120、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613786、20pmol的引物613787、1μl的
1 0mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和35.5μl的水构成。在
中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续
30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。将得到的6.9kb PCR产物(片段2)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后根据制造商的说明，使用PCR纯化试剂盒进行柱纯化。

[0217] 使用大引物克隆，使用以下程序来合并两个PCR片段。将片段1和2通过PCR在反应中合并，该反应由5μl的各自纯化的PCR产物、0.5μl的 DNA聚合酶、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和28.5μl的水构成。在中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及40个循
环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。然后，根据制造商的说明，将2μl得到的PCR产物DNA转化到大肠杆菌ONE TOP10电转化感受态细胞(生命技术公司，格兰德岛，纽约，美国)中。将50μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将单个转化体挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。使用 旋转迷你制备
型试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)，将质粒DNA从菌落中进行纯化。将使用3130XL遗传分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州，美国)的DNA测序用来确认最终质粒pDLHD0012中两种片段中的每种的存在(图1)。

[0218] 根据以下方案，将米曲霉菌株MT3568用包括VaXET16基因的质粒pDLHD0012进行转化。将约2-5x107孢子的米曲霉菌株MT3568接种于500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中，并且在28℃和110rpm下孵育过夜。将10ml的过夜培养物在125ml无菌真空滤器中过滤，并且将菌丝用50ml的0.7M KCl-20mM CaCl2洗涤两次。将剩余液体通过真空过滤去除，留下垫在滤器上。将菌丝体再悬浮于10ml的0.7M KCl-20mM CaCl2中，并且转移至无菌125ml摇瓶中，该摇瓶包含20mg的 200G(诺维信瑞士股份公司(Novozymes 
Switzerland AG)，Neumatt，瑞士)/ml和0.2mg的几丁质酶(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)/ml(在10ml的0.7M KCl-20mM CaCl2中)。将该混合物在37℃和100rpm下孵育
30-90分钟，直到从菌丝体中产生原生质体。将该原生质体混合物通过衬有
(Calbiochem公司，圣迭哥，加利福尼亚州，美国)的无菌漏斗进行过滤，
到无菌50毫升塑料离心管中，以除去菌丝体碎片。将在 中的碎片彻底地
用0.7M KCl-20mM CaCl2进行洗涤并且在2500rpm(537x g)下，在20℃-23℃下，离心10分钟。去除该上清液，并且将原生质体球粒再悬浮于20ml的1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH 
6.5)-10mM CaCl2中。将该步骤重复两次，并且将最终的原生质体球粒再悬浮于1M山梨醇-
7
10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2中，以获得2x 10/ml的最终原生质体浓度。

[0219] 将2微克的pDLHD0012添加至无菌的2ml塑料离心管的底部。然后将100μl的原生质体添加至管中，随后添加在10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2中的300μl的60％PEG-4000。将该管手动地缓和地混合，并且在37℃下孵育30分钟。将添加2ml的1M山梨糖醇-10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2添加到每个转化中，并且将该混合物转染到150mm COVE琼脂板上。将转化板在34℃下孵育直到菌落出现。

[0220] 挑选21个转化体菌落到新鲜的COVE琼脂平板，并且在34℃下培养4天，直到转化体形成孢子。新鲜孢子转染到48孔深孔板，这些板包含2ml的YP+2％麦芽糊精，覆盖有可透气密封件，并且在没有振荡下在34℃下生长4天。在4天生长后，将培养基的样品针对木葡聚糖内糖基转移酶活性使用碘染色测定并且针对木葡聚糖内糖基转移酶表达通过SDS-PAGE来测定。

[0221] 根据以下方案，针对木葡聚糖内糖基转移酶活性进行碘染色测定。在96孔板中，将5μl培养液添加到5μl的木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)(5mg/ml在水中)、20μl的木葡聚糖低聚物(麦格酶公司，布雷，英国)(5mg/ml在水中)、和10μl的400mM柠檬酸钠pH 5.5的混合物中。将反应混合物在37℃下孵育30分钟，用包含14％(w/v)Na2SO4、0.2％KI、100mM HCl、和1％碘(I2)的200μl溶液进行淬灭，在黑暗中孵育30分钟，并且然后在620nm的酶标仪中测量吸光度。该测定证实了来自若干转化体的木葡聚糖内糖基转移酶的存在。

[0222] 使用8％-16％ 无染色SDS-PAGE凝胶(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)进行SDS-PAGE，并且使用以下设置，将该凝胶用无染色成像仪(伯乐实验室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国)成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。
SDS-PAGE分析指示出若干转化体表达与VaXET16对应的约32kDa蛋白。

[0223] 实例2：构建作为酵母表达质粒载体的质粒pMMar27

[0224] 构建质粒pMMar27，用于表达酵母中的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II。该质粒产生自酵母表达载体的谱系：质粒pMMar27构建自质粒pBM175b；质粒pBM175b构建自质粒pBM143b(WO 2008/008950)和质粒pJLin201；并且质粒pJLin201构建自pBM143b。

[0225] 除紧邻pBM143b中疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体基因的下游的Xba I位点突变为独特的Nhe I位点以外，质粒pJLin201与pBM143b相同。使用 II XL定点诱变试剂盒(Stratagenee公司，拉荷亚，加州，美国)将pBM143b中的Xba I序列(TCTAGA)变为Nhe I序列(gCTAGc)。以下示出了用来突变该位点的引物。

[0226] 引物999551(正义)：

[0227] 5’-ACATGTCTTTGATAAgCTAGcGGGCCGCATCATGTA-3’(SEQ ID NO:11)

[0228] 引物999552(反义)：

[0229] 5’-TACATGATGCGGCCCgCTAGcTTATCAAAGACATGT-3’(SEQ ID NO:12)

[0230] 小写代表突变的核苷酸。

[0231] 最终体积为50μl的扩增反应由以下各项构成：125ng的以上每种引物、20ng的pBM143b、1X 反应缓冲液(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)、3μl的 (Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)、1μl的
dNTP混合物、以及1μl的2.5单元/ml Pfu Ultra HF DNA聚合酶。使用
热循环程序进行该反应，程序为1个循环，在95
℃下，持续1分钟；18个循环，每个循环在95℃下持续50秒，60℃持续50秒，和68℃持续6分钟
6秒；以及1个循环，在68℃下，持续7分钟。在PCR后，将该管置于冰上2分钟。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。根据制造商的说明，使用2μl体积的DpnI消化的反应来转化大肠杆菌 高效感受态细胞(Stratagene公司，拉荷亚，
加利福尼亚州，美国)。在2XYT加氨比西林板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用
9600，将质粒DNA从转化体中的若干分离。通过限制性酶切和测序分析来确
认具有所希望的Nhe I变化的一个质粒，并且指定为质粒pJLin201。为了消除由定点突变引入的可能的PCR错误，通过将含Nhe I位点的片段克隆回质粒pBM143b中来构建质粒pBM175b。简言之，将质粒pJLin201用Nde I和Mlu I进行消化，并且将得到的片段克隆到之前用相同的酶使用快速连接试剂盒(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Corporation)，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)消化的pBM143b中。然后，将7μl的Nde I/Mlu I消化的pJLin201片段和1μl的消化的pBM143b与2μl的5X DNA稀释液(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、10μl的2X T4 DNA连接缓冲液(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、和1μl的T4 DNA连接酶(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)进行混合，并且在室温下孵育15分钟。将2微升的连接转化到XL1-蓝亚克隆-级感受态细胞(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)细胞并且散布于2XYT加氨比西林板上。
使用 9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA
测序进行分析，以鉴定含有所希望的构巢曲菌pyrG插入物的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pBM175b。

[0232] 质粒pMMar27构建自pBM175b和具有设计用于插入所消化pBM175b的突出端的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II的扩增的基因。在CUP I启动子的控制下包含疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶变体基因的质粒pBM175b包含独特的Hind III和Nhe I位点，来去除脂肪酶基因。将质粒pBM175用这些限制性内切酶进行消化，以去除脂肪酶基因。在消化后，将空载体通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约5,215bp的片段从凝胶切离，并且使用 凝胶提取试剂盒进行提取。连接反应(20μl)由1X缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加
州，美国)，1X BSA(BD生物科学公司，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加州，美国)，1μl酶(1:10稀释)(BD生物科学公司，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加州，美国)，用
Hind III和Nhe I消化的99ng pBM175b，和36ng的纯化的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II PCR产物。将反应液于室温保温30分钟。将2μl体积的 反应转化到大肠
杆菌 高效感受态细胞中。在补充有每ml 100μg的氨比西林的LB平板上选
择转化体。挑选一种菌落，其包含插入pBM175b载体替代脂肪酶基因产生pMMar27的土生梭孢壳霉Cel6A(图2)。所选择的质粒在从起始密码子的位置228处包含PCR错误，TCT代替TCC，但是导致中的土生梭孢壳霉Cel6A纤维二糖水解酶II的沉默变化。

[0233] 实例3：pEvFz1表达载体的构建

[0234] 表达载体pEvFz1是通过修饰pBM120a(美国专利8,263,824)来进行构建，以包括NA2/NA2-tpi启动子、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)、和作为选择性标志物的构巢曲霉乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶基因(pyrG)。

[0235] 通过该将构巢曲霉pyrG基因从pAlLo2(WO 2004/099228)克隆到pBM120a中来产生质粒pEvFz1。将质粒pBM120a和pAlLo2用Nsi I在37℃下消化过夜。将所得4176bp线性pBM120a载体片段和来自pAlLo2的1479bp pyrG基因插入片段各自使用TAE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用 凝胶提取试剂盒进行提
取。

[0236] 使用QUICK LIGATIONTM试剂盒(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)将1479bp pyrG基因插入片段连接至Nsi I消化的pBM120a片段。连接反应由以下构成：1X QUICK LIGATIONTM反应缓冲液(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)、50ng的Nsi I消化的pBM120a载体、54ng的1479bp Nsi I消化的pyrG基因插入物、以及1μl的T4 DNA连接酶，总体积为20μl。将连接混合物在37℃下孵育15分钟，随后在50℃下孵育15分钟，并且放置在冰上。

[0237] 将1μl的连接混合物转化到ONE TOP10化学感受大肠杆菌细胞中。在2XYT加氨比西林板上对转化体进行选择。使用 9600从若干转化体中纯化质粒
DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的构巢曲菌pyrG插入物的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz1(图3)。

[0238] 实例4：构建作为酵母/大肠杆菌/米曲霉穿梭载体的质粒pDLHD0006

[0239] 使用酵母重组克隆，将质粒pDLHD0006构建为基本载体，以使得米曲霉表达盒文库建立。通过使用酵母重组克隆合并三种DNA片段来产生质粒pDLHD0006：包含大肠杆菌pUC复制起点、大肠杆菌β-内酰胺酶(ampR)选择性标志物、URA3酵母选择性标志物、和来自pMMar27(实例2)的酵母2微米复制起点的片段1；包含10amyR/NA2-tpi启动子(来自基因的启动子，这些基因编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶并且包括针对米曲霉amyR转录因子的10个重复结合位点)、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶开放阅读框(ORF)、和来自pJaL1262(WO 2013/178674)的黑曲霉葡糖糖化酶终止子的片段2；和来自pEvFz1(实例3)的包含构巢曲霉pyrG选择标志物的片段3。

[0240]Pdlhd00006 PCR含量 PCR模板
片段1 大肠杆菌ori/AmpR/URA/2微米(4.1kb) pMMar27
片段2 10amyR/NA2-tpi PR/脂肪酶/Tamg(4.5kb) pJaL1262
片段3 来自pEvFz1的pyrG基因(1.7kb) pEvFz1

[0241] 使用以下所示的引物613017(正义)和613018(反义)扩增片段1。设计引物613017包含与片段3(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613018包含与片段2(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

[0242] 引物613017(正义)：

[0243] ttaatcgccttgcagcacaCCGCTTCCTCGCTCACTGACTC(SEQ ID NO:13)613018(反义)：

[0244] acaataaccctgataaatgcGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTC(SEQ ID NO:14)

[0245] 片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pMMar27、0.5μl的DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、
20pmol的引物613017、20pmol的引物613018、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程
序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续1.5分钟。将得到的4.1kb PCR产物(片段1)直接使用用于与以下片段2和3的酵母重组。

[0246] 使用以下所示的引物613019(正义)和613020(反义)扩增片段2。设计引物613019包含与片段1(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613020包含与片段3(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

[0247] 613019(正义)：

[0248] agatagggttgagtgttgttccGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG(SEQ ID NO:15)[0249] 613020(反义)：

[0250] ttctacacgaaggaaagagGAGGAGAGAGTTGAACCTGGACG(SEQ ID NO:16)

[0251] 片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pJaL1262、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613019、20pmol的引物613020、1μl的10mM d N T P 、1 0μl 的 5X HF 缓 冲液 、和3 5 .5μl的 水 构成 。在
中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续
30秒；30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续2分钟；以及20℃保持。将得到的4.5kb PCR产物(片段2)直接使用用于与以上片段1和以下片段3的酵母重组。

[0252] 使用以下所示的引物613022(正义)和613021(反义)扩增片段3。设计引物613021包含与片段2(小写)具有序列同源性的侧翼区，并且设计引物613022包含与片段1(小写)具有序列同源性的侧翼区以使得酵母在这三个PCR片段之间重组克隆。

[0253] 613022(正义)：

[0254] aggttcaactctctcctcCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG(SEQ ID NO:17)

[0255] 613021(反义)：

[0256] tcagtgagcgaggaagcggTGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG(SEQ ID NO:18)

[0257] 片段3在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pEvFz1(实例3)、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物613021、20pmol的引物613022、1μl的10 mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和35 .5μl的水构成。在
中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续
30秒；30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续2分钟；以及20℃保持。将得到的1.7kb PCR产物(片段3)直接使用用于与以上片段1和2的酵母重组。

[0258] 使用基于酵母同源性的重组克隆，使用以下程序来合并三个PCR片段。将三种PCR片段的每种的20μl等分试样与来自鲑鱼睾丸的100μg的单链脱氧核糖核酸(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)、100μl的菌株YNG318的感受态酵母细胞(酿酒酵母ATCC 208973)、和600μl的PLATE缓冲液(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)合并，并且混合。将反应在30℃下以200rpm振荡孵育30分钟。然后将该反应在42℃下在没有振荡的情况下继续15分钟。将这些细胞通过在5,000x g下离心1分钟进行沉淀，并且弃去上清液。将细胞球粒悬浮于200μl的高压蒸汽处理的水中，并且分在两个包含合成的所定义的培养基缺少尿苷的琼脂平板，并且在30℃下孵育3天。将这些酵母菌落使用1ml的高压蒸汽处理的水从板中分离。将这些细胞通过在13,000x g下离心30秒进行沉淀，并且将100μl等分试样的玻璃珠添加到该管中。将细胞和珠混合物悬浮在250μl的P1缓冲液(凯杰公司，巴伦西亚，加利福尼亚州，美国)中，并且然后涡旋1分钟来裂解这些细胞。使用 旋转迷你
制备型试剂盒纯化质粒DNA。根据制造商的说明，然后将3μl等分试样的质粒DNA转化到大肠杆菌ONE TOP10电转化感受态细胞中。将50μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将转化体各自挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。使用 旋转
迷你制备型试剂盒从菌落中纯化质粒DNA。将使用3130XL遗传分析仪的DNA测序用来确认指定为pDLHD0006的最终质粒中三种片段中的每种的存在(图4)。

[0259] 实例5：拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的制备

[0260] 根据以下描述的方案，拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶(AtXET14；SEQ ID NO:4[天然DNA序列]、SEQ ID NO:5[合成DNA序列]、和SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])重组产生于米曲霉JaL355(WO 2008/138835)。

[0261] 构建载体pDLHD0039以在米曲霉中多拷贝表达AtXET14基因。使用无限制性克隆，通过合并两种DNA片段来产生质粒pDLHD0039：包含AtXET14ORF和与载体pDLHD0006具有同源性的侧翼序列(实例4)的片段1，和由载体pDLHD0006的反向PCR扩增子组成的片段2。

[0262] 使用以下所示引物AtXET14F(正义)和AtXET14R(反义)来扩增片段1，这些引物被设计包含与载体pDLHD0006(小写)具有序列同源性的侧翼区，用于在PCR片段之间的物连接克隆。

[0263] 引物AtXET14F(正义)：

[0264] ttcctcaatcctctatatacacaactggccATGGCCTGTTTCGCAACCAAACAG(SEQ ID NO:19)[0265] AtXET14R(反义)：

[0266] agctcgctagagtcgacctaGAGTTTACATTCCTTGGGGAGACCCTG(SEQ ID NO:20)

[0267] 片段1在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的包括在Sac I和Kpn I位点之间所克隆的AtXET14合成DNA序列的 载体pMA、0.5μl的 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、20pmol的引物AtXET14F、
20pmol的引物AtXET14R、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和35.5μl的水构成。在 中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃
下，持续30秒；以及30个循环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续30秒。将得到的0.9kb PCR产物(片段1)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后使用
PCR纯化试剂盒进行柱纯化。

[0268] 使用以下所示的引物614604(正义)和613247(反义)扩增片段2。

[0269] 614604(正义)：taggtcgactctagcgagctcgagatc(SEQ ID NO:21)

[0270] 613247(反义)：

[0271] catggccagttgtgtatatagaggattgaggaaggaagag(SEQ ID NO:22)

[0272] 片段2在反应中通过PCR来扩增，该反应由10ng的质粒pDLHD0006、0.5μl的DNA聚合酶、20pmol的引物614604、20pmol的引物613247、1μl的10mM dNTP、10μl的5X HF缓冲液、和35 .5μl的水构成。在
中孵育该反应，程序为1个循环，在98℃下，持续30秒；以及30个循
环，每个循环在98℃持续10秒，60℃持续10秒，以及72℃持续4分钟。将得到的7.3kb PCR产物(片段2)用1μl的Dpn I进行处理，以去除质粒模板DNA。将该Dpn I直接添加到PCR管中，良好混合，并且在37℃下孵育60分钟，并且然后使用 PCR纯化试剂盒进行柱纯
化。

[0273] 根据制造商的说明书，使用 无缝克隆和装配套件(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)来合并两种PCR片段。然后将3μl得到的反应产物DNA转化到大肠杆菌ONE TOP10电转化感受态细胞中。将50μl的转化细胞散布于每ml补充有100μg氨比西林的LB板上，并且在37℃下孵育过夜。将单个转化体菌落挑入每ml补充有100μg的氨比西林的3ml的LB培养基中，并且在37℃下在250rpm的振荡下生长过夜。根据制造商的说明，使用 旋转迷你制备型试剂盒从菌落中纯化质粒DNA。
将使用3130XL遗传分析仪的DNA测序用来确认最终质粒pDLHD0039中两种片段中的每种的存在(图5)。

[0274] 根据以下方案，将米曲霉菌株JaL355用包括AtXET14基因的质粒pDLHD0039进行转化。将约2-5x 107孢子的米曲霉JaL355接种于500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖+10mM尿苷中，并且在28℃和110rpm下孵育过夜。将10ml的过夜培养物在125ml无菌真空滤器中过滤，并且将菌丝用50ml的0.7M KCl-20mM CaCl2洗涤两次。将剩余液体通过真空过滤去除，留下垫在滤器上。将菌丝体再悬浮于10ml的0.7M KCl-20mM CaCl2中，并且转移至无菌125ml摇瓶中，该摇瓶包含20mg的 200G/ml和0.2mg的几丁质酶在10ml的
0.7M KCl-20mM CaCl2中。将该混合物在37℃和100rpm下孵育30-90分钟，直到从菌丝体中产生原生质体。将该原生质体混合物通过衬有 的无菌漏斗进行过滤，到
无菌50毫升塑料离心管中，以除去菌丝体碎片。将在 中的碎片彻底地用
0.7M KCl-20mM CaCl2进行洗涤并且在2500rpm(537x g)下，在20-23℃下，离心10分钟。去除该上清液，并且将原生质体球粒再悬浮于20ml的1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH 6.5)-
10mM CaCl2中。将该步骤重复两次，并且将最终的原生质体球粒再悬浮于1M山梨醇-10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2中，以获得2x 107/ml的最终原生质体浓度。

[0275] 将2微克的pDLHD0039添加至无菌的2ml塑料离心管的底部。然后将100μl的原生质体添加至管中，随后添加在10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2中的300μl的60％PEG-4000。将该管手动地缓和地混合，并且在37℃下孵育30分钟。将添加2ml的1M山梨糖醇-10mM Tris-HCl(pH 6.5)-10mM CaCl2添加到每个转化中，并且将该混合物转染到150mm基本培养基琼脂板上。将转化板在34℃下孵育直到菌落出现。

[0276] 挑选35个转化体菌落到新鲜的基本培养基琼脂平板，并且在34℃下培养4天，直到菌株形成孢子。新鲜孢子转染到48孔深孔板，这些板包含2ml的YP+2％麦芽糊精，覆盖有可透气密封件，并且在没有振荡下在28℃下生长4天。在4天生长后，将培养基针对木葡聚糖内糖基转移酶活性并且针对木葡聚糖内糖基转移酶表达通过SDS-PAGE来测定。

[0277] 使用实例1中描述的碘染色测定，来测量木葡聚糖内糖基转移酶活性。该测定证实了若干转化体中木葡聚糖内糖基转移酶活性的存在。

[0278] 按在实施例1中的描述进行SDS-PAGE。SDS-PAGE分析指示出若干转化体表达与AtXET14对应的约32kDa蛋白。

[0279] 实例6：荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖的产生

[0280] 根据由周(Zhou)等人，2006，生物催化与生物转化(Biocatalysis and Biotransformation)24:107-120所描述的程序，通过木葡聚糖低聚物(XGO)的还原端的还原氨化，随后在100mM碳酸氢钠(pH 9.0)在室温下将XGO的氨基基团结合到荧光素异硫氰酸酯异构体I(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)24小时，来产生荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖低聚物(FITC-XGO)。将结合反应产物在真空中浓缩干燥，溶解于0.5ml的去离子水，并且通过硅胶层析进行纯化，该硅胶层析用从100:0:0.04至70:30:1梯度的乙腈:
水:乙酸作为流动相进行洗脱。通过蒸发该缓冲液、溶解于D2O(西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)，并且使用Varian 400MHz MercuryVx(安捷伦(Agilent)，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)通过1H NMR分析来确认纯度和产物同一性。在-20℃下在黑暗中，储存干燥的FITC-XGO，并且在解冻过程中干燥。

[0281] 彻底混合24ml的10mg的罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)/ml的去离子水、217μl的7.9mg的FITC-XGO/ml的去离子水、1.2ml的400mM柠檬酸钠(pH 5.5)、和600μl的1.4mg的VaXET16/ml的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)，并且在室温下孵育过夜。在过夜孵育后，通过添加冰冷的乙醇至终体积110ml来沉淀FITC-XG，彻底混合，并且在4℃下整夜孵育。用水洗涤沉淀的FITC-XG，并且然后转移到圆底烧瓶(Erlenmeyer bulb)中。通过使用EZ-2Elite蒸发器(SP Scientific/Genevac公司，斯通里奇，纽约，美国)蒸发4小时来去除残余的水和乙醇。将干燥的样品溶解于水中，并且用去离子水将体积调整到48ml，以产生，在所希望的
100kDa的平均分子量下，5mg/ml的最终FITC-XG浓度。

[0282] 实例7：针对木葡聚糖内糖基转移活性的荧光偏振测定

[0283] 使用以下测定来评估木葡聚糖内糖基转移活性。如在实例6中所描述的制备200μl的反应，该反应包含1mg的罗望子木葡聚糖/ml、0.01mg/ml FITC-XGO，并且将10μl的适当稀释的XET在25℃下在不透明96孔微量滴定板中的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中孵育10分钟。在这个时间段，以顶级阅读方向，用490nm的激发波长、520nm的发射波长、激发路径中495截止滤波器、高精度(100次读取)、和中光电倍增管的灵敏度，使用 M5酶标仪(分子器件公司(Molecular Devices)，森尼维耳市，加利福尼亚州，美国)连续监测荧光偏振。将荧光XGO以XET依赖性掺入非荧光木葡聚糖(XG)中导致随着时间增加荧光偏振。使用偏振时间进程曲线的线性区域的斜率来确定该活性。

[0284] 实例8：红豆木葡聚糖内糖基转移酶16的纯化

[0285] 使用0.22μm 滤器(密理博(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)过滤红豆的粗发酵液的1升溶液，并且在4℃下储存滤液。将细胞碎片在悬浮于1升的
0.25％ X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇；西格玛奥德里奇，圣
路易斯，密苏里州，美国)-20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中，在室温下孵育至少30分钟，并且然后使用0.22μm 滤器进行过滤。汇集包含红豆木葡聚糖内糖基转移酶16
(VaXET16)的滤液，并且使用配备有10kDa的分子量截留膜的 200切向流浓
缩器(密理博，贝德福德，马萨诸塞州，美国)来浓缩至在500和1500ml之间的体积。

[0286] 将浓缩的滤液装载到150ml Q 大珠柱(GE医疗生命科学集团(GE Healthcare Lifesciences)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上，用20mM柠檬酸钠(pH 5.5)进行预平衡，并且用相同缓冲液等度洗脱。将洗脱液装载到75ml Phenyl HP
柱(GE医疗生命科学集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上，该柱在20％乙二醇-20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中进行预平衡。使用从20％至50％的70％乙二醇在20mM柠檬酸钠(pH 5.5)的线性梯度经4柱体积洗脱VaXET16。

[0287] 使用BCA测定(皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊，美国)以96孔板格式，以牛血清白蛋白(皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊，美国)作为蛋白标准品，在0和2mg/ml之间的浓度下，量化纯化的VaXET16，并且确定为1.40mg/ml。通过约32kDa的单个条带的存在，使用8％-16％梯度无染色SDS-PAGE凝胶来确认VaXET16同质性，并且用无染色成像仪使用以下设置来将凝胶成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。

[0288] 通过荧光偏振测量荧光素异硫氰酸酯标记的木葡聚糖低聚物掺入到罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)中的比例来确定纯化的VaXET16的活性(如实例7中所描述的)。该表观活性为18.5±1.2P s-1mg-1。

[0289] 针对背景酶活性，使用以下所示的标准测定测试纯化的VaXET16制品，这些背景酶活性包括木聚糖酶，淀粉酶，纤维素酶，β-葡糖苷酶，蛋白酶，淀粉葡糖苷酶，和脂肪酶。

[0290] 使用小麦阿拉伯糖基木聚糖作为底物在pH 6.0和50℃下测定木聚糖酶活性。在405nm下通过添加包含PHBAH的碱性溶液来进行比色评估木聚糖水解。一个FXU(S)定义为使用 (诺维信公司)作为标准品的木聚糖内切酶活性。

[0291] 使用淀粉作为底物在pH 2.5和37℃下测定淀粉酶活性。通过添加碘溶液在600nm下比色测量剩余淀粉来评估淀粉水解。一个FAU(A)定义为使用酸性真菌α-淀粉酶(可从诺维信公司获得)作为标准品的酸性α-淀粉酶活性。

[0292] 使用(4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷(4,6-亚乙基-G7-pNP)作为底物，在pH 7和37℃下，测定淀粉酶活性。该底物水解产生对硝基酚，并且在405nm下进行比色评估。一个FAU(F)定义为使用 (诺维信公司)作为标准品的真菌α-淀粉酶单位。

[0293] 使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物在pH 5.0和50℃下测定纤维素酶活性。在405nm下通过添加包含对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)的碱性溶液来进行比色评估CMC水解。一个CNU(B)定义为使用NS22084酶(诺维信公司)作为标准品的纤维素酶活性。

[0294] 使用纤维二糖作为底物在pH 5.0和50℃下测定β-葡糖苷酶活性。使用偶联的酶测定，用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖酸酯，随后在340nm下将NAD还原为NADH，评估从纤维二糖生产葡萄糖。一个CBU(B)定义为使用纤维二糖酶作为标准品每分钟释放2微摩尔葡萄糖的酶的量。

[0295] 使用 蛋白酶检测试剂盒(绿色荧光)(生命技术公司，格兰德岛，纽约，美国)，以酪蛋白为底物，在pH 6或9和环境温度下，进行蛋白酶测定。一个KMTU定义为关于每分钟产生1微摩尔的对硝基苯胺的酶的量的千微生物胰蛋白酶单位。

[0296] 使用麦芽糖作为底物在pH 4.3和37℃下测定淀粉转葡糖苷酶活性。。使用偶联的酶测定，用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖酸酯，随后在340nm下将NAD还原为NADH，评估麦芽糖至葡萄糖的转化。一个AGU定义为使用 (诺维信公司)作为标准品的淀粉转葡糖苷酶单位。

[0297] 在pH 7和环境温度下进行4-甲基伞形酮β-D-乳糖苷(MUL)测定，并且在360nm激发和465nm发射下进行荧光测量。

[0298] 使用4-硝基苯基丁酸酯(pNP-butyrate)作为底物，在pH 7.5和环境温度下，测定脂肪酶活性。在对硝基酚释放后，在405nm下测定pNP-丁酸酯水解。一个LU定义为使用(诺维信公司)作为标准品释放1微摩尔的可滴定的丁酸的酶的量。

[0299]

[0300] 实例9：拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的纯化

[0301] 除以下内容以外，如针对实例8中VaXET16所描述的进行拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14(AtXET14)的纯化和定量：使用从40％至90％的70％乙二醇在20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的线性梯度经4个柱体积进行从苯基 HP柱的洗脱。

[0302] 通过约32kDa的单个条带的存在，使用8％-16％ 无染色SDS-PAGE凝胶来确认AtXET14同质性，并且用无染色成像仪使用以下设置来将凝胶成像：5分钟活化，自动成像曝光(强条带)，高亮饱和像素＝ON，颜色＝考马斯酸性染料，和带检测、分子量分析和报告禁用。

[0303] 使用BCA测定以96孔板格式，以牛血清白蛋白作为蛋白标准品，在0和2mg/ml之间的浓度下，量化纯化的AtXET14，并且确定为1.49mg/ml。

[0304] 如实例7中所述确定纯化的AtXET14的活性。该表观活性为34.7±0.9P s-1mg-1。

[0305] 针对背景活性，使用以下所示的标准测定测试纯化的AtXET14制品，这些背景酶活性包括木聚糖酶，淀粉酶，纤维素酶，β-葡糖苷酶，蛋白酶，淀粉葡糖苷酶，和脂肪酶。标准测定描述于实例8中。

[0306]

[0307] 实例10：通过木葡聚糖和具有拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的木葡聚糖预防水果脱水

[0308] 使用刮胡刀片将康乃馨茎和香蕉茎(奇基塔(Chiquita)有机的)切成薄段，并且将澳洲青苹(亚基马新鲜(Yakima Fresh))切成小片。将每个茎的末端的0.5cm长度丢弃，并且将剩余的段浸渍在5mg的罗望子木葡聚糖(麦格酶公司，布雷，英国)/ml的20mM柠檬酸钠(pH 5.5)的溶液中并且通过使茎接触容器的侧面来去除多余的木葡聚糖，或者不浸渍剩余的段。使用若干花茎，并且将来自每个茎的段分成浸渍和非浸渍两组，以控制茎与茎之间的变化。然后将每段在其一侧(切端不接触孔的底部)在科斯塔(CoStar)3513 12孔或科斯塔
3524 24孔、平底的、有盖的细胞培养板(科宁公司(Corning)，图克斯伯里，马萨诸塞州，美国)中进行培育。将样品在室温下培育5天。在第1天、第2天、和第5天拍照，以展示干燥/氧化的程度。

[0309] 图6示出了在室温下培育1天之后，上列中的浸渍在木葡聚糖中的、或下列中的未浸渍的康乃馨茎。经木葡聚糖浸渍的康乃馨茎看上去光滑且含水，而未被浸渍的康乃馨茎看上去干燥，具有白色的、积垢的、干斑。培育1天之后，已经被浸渍在木葡聚糖中的康乃馨茎与未被浸渍的那些相比看上去含水多得多。到培育2天时，浸渍和未被浸渍的茎片看上去都同样地干，因此木葡聚糖降低康乃馨茎的脱水速度。没有在浸渍和未被浸渍的香蕉茎之间观察到定性差异，尽管这些香蕉茎切地比康乃馨更厚。

[0310] 图7A示出了培育2天之后，上列中的浸渍在木葡聚糖中的、或下列中的未浸渍的苹果片；图7B示出了培育5天之后的相同的切片。在培育2天之后，在浸渍在木葡聚糖中的切片中观察到新鲜苹果褐变或被氧化程度的明显降低。到培育5天时，未被浸渍的苹果片显示出霉变和实质性氧化的征兆，而经木葡聚糖浸渍的切片仅显示出适度氧化。通过比较，在培育5天时浸渍的苹果片与在培育2天时未被浸渍的切片之间的氧化程度是类似的。这些图像指示木葡聚糖实质性地减缓或预防割下的水果的氧化性损伤，并且阻止导致产生腐败的微生物的生长。

[0311] 实例11：通过木葡聚糖和具有红豆木葡聚糖内糖基转移酶16的木葡聚糖保持苹果新鲜度

[0312] 为了产生大小均匀的不带皮苹果片，用7号橡皮塞钻具刺破澳洲青苹。从钻具中取出内部的苹果并且然后用刮胡刀片将其分段成1-2mm厚的盘。然后将六至八个盘浸渍在5ml的包含4.5mg的具有35μg的VaXET16/ml的木葡聚糖/ml、4.5mg的没有VaXET16的木葡聚糖/ml的40mM柠檬酸钠(pH 5.5)，或5ml的去离子水中。通过使切片接触容器的侧面从每个苹果片中除去多余的溶液，并且使用镊子将苹果盘转移到科斯塔#3513 12孔、平底的、有盖的细胞培养板中。将样品板盖上并且在环境条件下培育。在3天、4天、和7天之后通过倒置这些板并且通过板的底部为切片照相来为这些切片拍照。

[0313] 图8A示出了培育3天之后的苹果片。

[0314] 图8B示出了培育4天之后的苹果片。

[0315] 图8C示出了培育7天之后的苹果片。

[0316] 到制备好苹果片之后在环境条件下培育3-4天时，实质性差异是显而易见的。在所有情况下开始是白色的苹果片都具有褐变且被氧化的表面，并且在所有切片上都不同程度地可见深褐色斑点。浸渍在木葡聚糖和VaXET16的溶液中的苹果片的新鲜苹果显示出最小程度的氧化或褐变，而经柠檬酸钠缓冲液浸渍的和未被浸渍的苹果片大部分被氧化。未被浸渍的苹果的直径看上去比其他样品要小，指示它们比浸渍的样品脱水严重。

[0317] 到培育7天时，所有切片的直径看上去都更小，指示它们已经干透。深褐色斑点覆盖了经木葡聚糖浸渍的苹果片的大部分表面积，经缓冲液浸渍的切片看上去是发霉的，并且未被浸渍的切片看上去比在先前的时间点被较少地氧化，但是高度干燥。通过比较，经木葡聚糖和VaXET16浸渍的苹果片被氧化，但是被氧化地比经木葡聚糖或缓冲液浸渍的样品要少。

[0318] 这些图像指示经过3至4天，木葡聚糖或具体地木葡聚糖和VaXET16降低苹果氧化速度。经过更长的时间段，木葡聚糖或木葡聚糖和VaXET16延迟割下的农产品的腐败。

[0319] 实例12：苹果片图像的定量分析，以确定木葡聚糖和红豆木葡聚糖内糖基转移酶16阻止苹果氧化的程度

[0320] 使用 (迈斯沃克公司(The Mathworks)，纳蒂克，马萨诸塞州，美国)对示于图9A、图9B、和图9C中的苹果片照片进行定量分析，以区分浸渍在木葡聚糖、具有VaXET16的木葡聚糖、40mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的苹果片、或未被浸渍的苹果片的氧化程度。苹果样品的褐变或氧化是显而易见的，不仅因为全部的白色苹果片出现时间依赖性褐变，还因为许多更深的褐色斑点的数目或大小出现增加。另外地，在若干图像中，特别是经柠檬酸钠浸渍的苹果的第7天图像，观察到另外的黑变。根据以下方案量化褐变程度以及木葡聚糖和VaXET16对褐变的阻止。对图像文件的单独颜色通道进行检查，并且确定蓝色通道在来自这些板的切片和样品的深褐色斑点和较亮的区域两者之间在强度上具有最大差异。
仅使用蓝色通道进行后续分析。将照片简化成蓝色通道强度值，并且通过与图像上的最大像素强度做减法来将其倒置。选择包含每个苹果样品的感兴趣区域，并且应用阈值过滤器，以从感兴趣区域中去除非样品像素。阈值过滤器跨单板图像中的所有样品保持不变，但是在图像之间是变化的。对于每个经过滤的感兴趣区域，生成阈值相减的、非零像素强度的直方图，并且确定单正态分布和双正态分布的最佳拟合参数的最大似然估计。将以相同方式处理的8个苹果片的所有非零像素强度组合，以生成每个处理的全局强度直方图。将这些直方图通过最大似然估计类似地拟合到单正态分布和双正态分布中。然后按2种方式确定褐变程度。第一种，随着这些样品总体上显示出黑化或黄化趋势，使用单正态分布的平均值来确定高于阈值的所有样品像素的颜色的平均暗化。第二种，为了量化深色斑点覆盖苹果片表面的程度，确定深色斑点与总表面积的相对面积。在概率分布上对所有高于分布平均值的>1xσ的强度积分，以确定最深的斑点的相对表面积。

[0321] 图9A示出了培育4天之后未被浸渍的苹果片的像素强度直方图。将该直方图拟合到双正态分布中。

[0322] 图9B示出了培育4天之后浸渍在40mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的苹果片的像素强度直方图。将该直方图拟合到双正态分布中。

[0323] 图9C示出了培育4天之后浸渍在木葡聚糖中的苹果片的像素强度直方图。将该直方图拟合到双正态分布中。

[0324] 图9D示出了培育4天之后浸渍在木葡聚糖和VaXET16中的苹果片的像素强度直方图。将该直方图拟合到双正态分布中。

[0325] 比较图9中的直方图，用木葡聚糖和VaXET16处理的样品具有在最低强度处达到峰值的强度分布，因此被最少地黄化。还明显的是在除了浸渍在木葡聚糖和VaXET16的那些之外的所有样品中，相当大部分的像素具有大于100单位的强度；对于经木葡聚糖浸渍的和未被浸渍的苹果，这些作为另外的重叠分布出现。到7天时，这种另外的分布更明显，并且归因于非常深的斑点的出现，这些斑点在经缓冲液和木葡聚糖浸渍的样品中是最显而易见的(图9C)。这种分布不存在于经木葡聚糖和VaXET16浸渍的苹果中，与这些苹果片上没有深褐色斑点相一致。

[0326] 图9E示出了经不同处理的苹果片的随时间变化的单高斯分布的平均值图。未被浸渍的苹果片被示为圆形，浸渍在40mM柠檬酸钠(pH5.5)中的苹果片被示为正方形，浸渍在木葡聚糖中的苹果片被示为菱形，并且浸渍在木葡聚糖和VaXET16中的苹果片被示为三角形。除了未被浸渍的切片之外，平均值随时间增加，指示切片的颜色随时间变得更深。在3天时间点时，经柠檬酸钠浸渍的和未被浸渍的切片的平均值比经木葡聚糖和具有VaXET16的木葡聚糖浸渍的切片的高得多。未被浸渍的切片的平均强度是68.91±0.0666，经缓冲液浸渍的切片是69.48±0.0526，经木葡聚糖浸渍的切片是47.57±0.0436，并且经木葡聚糖和VaXET16浸渍的切片是50.10±0.0451。因此，浸渍在木葡聚糖或木葡聚糖和VaXET16中将褐变程度分别降低了45％和38％。

[0327] 从双正态分布的拟合来看，以所有方式处理的苹果片都具有50-65单位之间的强度分布平均值和20-25的标准差。因此，将>90的像素强度认为是异常值或属于高强度分布；它们归因于深褐色斑点。相对于超过阈值过滤器的像素的总数的超过这个强度的像素的总数给出了被深褐色氧化斑点覆盖的表面积的相对比例。通过相对于对所有强度的积分，在强度分布上对那些强度值积分对其进行确定，并且这些值被提供于表1中。

[0328] 从深褐色斑点的定量来看，清楚的是木葡聚糖并且具体地具有VaXET16的木葡聚糖防止深褐色氧化斑点的形成。在经木葡聚糖+VaXET16浸渍的苹果片与经缓冲液浸渍的和未被浸渍的苹果片的均值之间，被这些斑点覆盖的相对表面积大约在第3天时低14倍，在第4天时低17倍，并且在第7天时低7倍。

[0329] 表1：深褐色氧化斑点的相对表面积

[0330]

[0331] 实例13：通过木葡聚糖和具有拟南芥木葡聚糖内糖基转移酶14的木葡聚糖保存马铃薯和鳄梨片

[0332] 如在实例11中描述的评估不同水果和蔬菜的保存，以下除外。如在实例9中描述的纯化拟南芥内糖基转移酶14(AtXET14)。将八个重复样品浸渍在20mM柠檬酸钠(pH 5.5)、20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的1mg罗望子木葡聚糖/ml、或20mM柠檬酸钠(pH 5.5)中的具有1μM AtXET14的1mg罗望子木葡聚糖/ml中。使用7号橡皮塞钻具产生经检查水果或蔬菜的大小均匀的圆柱；将马铃薯通过马铃薯的整个厚度刺破，除去鳄梨的核并且从核孔刺破到果皮。
将圆柱从钻具中取出，并且将马铃薯分段成1mm厚的盘，将每个圆柱的外面1cm排除在外。按以下方式产生来自水果内的相同深度的鳄梨片。在离核一定距离排成一直线处一起定位三个具有相同长度的三个圆柱，并且将其同时分段成2mm厚的盘。差别地浸渍来自每个深度的所得3个切片，并且彼此进行比较，以将可能由水果差异造成的氧化、褐变、或干燥的潜在差异考虑在内。在环境条件下培育0小时、2.5小时、5小时、21小时和70小时时，为培养板照相，以记录鳄梨和马铃薯片已经氧化的程度。

[0333] 图10A示出了培育0小时、2.5小时、5小时和21小时之后经不同处理的马铃薯片。从照片来看，明显的是在培育开始时(时间＝0小时)，所有切片都是白色的。在前几个小时内，马铃薯片开始变成褐色或氧化，并且随时间颜色越来越深。浸渍在木葡聚糖和AtXET14中的切片显示出最晚的褐变出现，并且在较长的培育时间时显示出最小程度的褐变。

[0334] 图10B示出了培育0小时和70小时之后经不同处理的鳄梨片。鳄梨果实随着从果皮到核的深度增加颜色从绿色向黄色过渡。因此，将相同深度并且因而具有相同初始颜色的切片进行比较，如在培育开始时(时间＝0)所拍照中明显的。培育70小时之后，鳄梨片已经完全褐变和黑化；浸渍在木葡聚糖并且具体地具有AtXET14的木葡聚糖中的那些褐变地较少。

[0335] 实例14：经异硫氰酸荧光素标记的木葡聚糖证实木葡聚糖与割下的水果和蔬菜结合

[0336] 为了证实木葡聚糖与割下的水果结合，将20μl的FITC-XG或40mM柠檬酸钠(pH 5.5)应用于如在实例6中描述的制备的康乃馨茎、香蕉茎、南瓜茎、或苹果片。将样品在室温下培育30分钟，并且使用手持紫外灯成像。通过肉眼检查，仅有已经应用了FITC-XG的南瓜茎可以显现出荧光。其他样品太具反射性，太自发荧光，或具有不够集中的荧光木葡聚糖，以致不能从背景中区分出FITC-XG荧光。

[0337] 将样品各自用500μl的40mM柠檬酸钠(pH 5.5)覆盖，并且向每个样品中添加含1.5mg的AtXET14/ml的10μl的40mM柠檬酸钠(pH 5.5)，从而产生每ml 30μg的最终AtXET14浓度。将样品在室温下伴随振荡培育过夜。过夜培育之后，经8小时的时间段，将样品在20mM磷酸盐(pH 7.2)中的2ml的150mM氯化钠中洗涤3次。然后将样品在20mM磷酸盐(pH 7.0)中的最小体积的150mM氯化钠中培育过夜。

[0338] 用刮胡刀片切割每个样品的薄段，并且将其铺在FisherFinest Premium 3”x1”x 1mm显微镜载玻片(飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Inc.)，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)上。将大约20μl的去离子水应用于载玻片的样品周围，并且在用指甲油将盖玻片密封到载玻片之前，用飞世尔品牌22x22-1.5显微镜盖玻片(飞世尔科技公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)覆盖样品。

[0339] 使用奥林匹斯(Olympus)FV1000激光扫描共聚焦显微镜(奥林匹斯公司(Olympus)，中心谷(Center Valley)，宾夕法尼亚州，美国)进行激光扫描共聚焦显微术。用
10X气隙或40X油浸物镜，应用488nm谱线的氩离子激光激发源获取数据。使用相同的激发强度和PMT电压获得所有图像；因而图像之间的相对荧光强度是可比较的。

[0340] 图11示出了一系列激光扫描共聚焦显微镜图像，这些图像将在20mM磷酸盐(pH 7.2)中的150mM氯化钠中用AtXET14培育的与在20mM磷酸盐(pH 7.2)中的150mM氯化钠中用AtXET14和FITC-XG培育的水果、花卉、或蔬菜进行了比较。在每种情况下，经FITC-XG和AtXET14培育的样品都显示出比仅用AtXET14培育的样品高得多的荧光强度，指示实质的FITC-XG结合。

[0341] 图11A示出了用AtXET14培育的苹果片的截面的共聚焦图像。

[0342] 图11B示出了用AtXET14与FITC-XG培育的苹果片的截面的共聚焦图像。

[0343] 图11C示出了用AtXET14培育的康乃馨茎的截面的共聚焦图像。

[0344] 图11D示出了用AtXET14与FITC-XG培育的康乃馨茎的截面的共聚焦图像。

[0345] 图11E示出了用AtXET14培育的香蕉茎的截面的共聚焦图像。

[0346] 图11F示出了用AtXET14与FITC-XG培育的香蕉茎的截面的共聚焦图像。

[0347] 图11G示出了用AtXET14培育的南瓜茎的截面的共聚焦图像。

[0348] 图11H示出了用AtXET14和FITC-XG培育的南瓜茎的截面的共聚焦图像。

[0349] 在每种情况下，共聚焦显微镜图像指示在AtXET14的存在下，异硫氰酸荧光素标记的木葡聚糖与割下的水果、花卉或蔬菜结合。

[0350] 本发明进一步由下述编号的段落描述：

[0351] [1]一种用于改性农作物的方法，该方法包括在产生与未改性的农作物相比具有改进的特性的改性的农作物的条件下在介质中用选自下组的组合物处理该农作物，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物。

[0352] [2]如段落1所述的方法，其中收获该农作物。

[0353] [3]如段落1所述的方法，其中未收获该农作物。

[0354] [4]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该农作物是水果。

[0355] [5]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该农作物是蔬菜。

[0356] [6]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该农作物是花卉。

[0357] [7]如段落1-3中任一项所述的方法，其中该农作物是香料。

[0358] [8]如段落1-7中任一项所述的方法，其中该改进的特性是选自下组的一种或多种改进，该组由以下各项组成：降低或预防氧化性褐变，降低或预防脱水，降低或预防干燥，降低或预防细菌、真菌、微生物、动物、或昆虫有害生物侵染，降低或预防老化，降低或预防早熟，和降低或预防软化；预防碰压伤、抗压碎性、预防或增强聚集、聚合、或结合；对不利环境因素的抗性；外观、和味道，以及对阳光或紫外线损伤的抗性。

[0359] [9]如段落1-8中任一项所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的平均分子量范围从2kDa至约500kDa。

[0360] [10]如段落1-9中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖低聚物或该包括化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物的平均分子量范围从0.5kDa至约500kDa。

[0361] [11]如段落1-10中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶以约0.1nM至约1mM的浓度存在。

[0362] [12]如段落1-11中任一项所述的方法，其中该聚合木葡聚糖或该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖以约1ng/g农作物至约1g/g农作物存在。

[0363] [13]如段落1-12中任一项所述的方法，其中在有该聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物以木葡聚糖低聚物或功能化的木葡聚糖低聚物与聚合木葡聚糖的约50:1摩尔比至约0.5:1摩尔比存在。

[0364] [14]如段落1-13中任一项所述的方法，其中掺入到该材料中的聚合木葡聚糖、该用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、该木葡聚糖低聚物、或该包括化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物的浓度是约0.01g至约500mg/g农作物。

[0365] [15]如段落1-14中任一项所述的方法，其中在没有聚合木葡聚糖或用化学基团功能化的聚合木葡聚糖的情况下，该木葡聚糖低聚物或该功能化的木葡聚糖低聚物以约1ng/g材料至约1g/g农作物存在。

[0366] [16]如段落1-15中任一项所述的方法，其中该化学基团是感兴趣的化合物或反应性基团，如醛基团、氨基基团、芳香族基团、羧基基团、卤素基团、羟基基团、酮基团、腈基团、硝基基团、巯基基团、或磺酸盐基团。

[0367] [17]如段落1-16中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶可获得自植物。

[0368] [18]如段落17所述的方法，其中该植物选自下组，该组由以下各项组成：双子叶植物和单子叶植物。

[0369] [19]如段落18所述的方法，其中该双子叶植物选自下组，该组由以下各项组成：赤小豆、花椰菜、棉、白杨或杂种白杨、马铃薯、油菜、大豆、向日葵、阿拉伯芥、烟草、和番茄。

[0370] [20]如段落18所述的方法，其中该单子叶植物选自下组，该组由以下各项组成：小麦、水稻、玉米和甘蔗。

[0371] [21]如段落1-20中任一项所述的方法，其中该木葡聚糖内糖基转移酶是通过有氧培养包含来自植物的适当的遗传信息的经转化宿主生物体来生产的。

[0372] [22]一种通过如段落1-21中任一项所述的方法获得的改性的农作物。

[0373] [23]一种改性的农作物，包括(a)聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)聚合木葡聚糖；(g)包括化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；或(h)木葡聚糖低聚物，其中与未改性的农作物相比，该改性的农作物具有改进的特性。

[0374] [24]一种选自下组的组合物，该组由以下各项组成：(a)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(b)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(c)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、用化学基团功能化的聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(d)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶、聚合木葡聚糖、和木葡聚糖低聚物；(e)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和用化学基团功能化的聚合木葡聚糖；(f)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和聚合木葡聚糖；(g)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和包含化学基团的功能化的木葡聚糖低聚物；(h)组合物，包括木葡聚糖内糖基转移酶和木葡聚糖低聚物；以及(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、或(h)的没有木葡聚糖内糖基转移酶的组合物。

[0375] 在此描述并且要求的这些发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为这些发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于这些发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言这些发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。