一种抗真菌制剂、抑制细胞PD-L1表达的抑制剂及应用

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一种抗真菌制剂、抑制细胞PD-L1表达的抑制剂及应用
申请号	CN202210059044.6	申请日	2022-01-19	公开(公告)号	CN114470195A	公开(公告)日	2022-05-13
申请人	同济大学;			发明人	贾鑫明; 于垚; 王蓉蓉; 鲁向冉;
摘要	本发明公开一种抗真菌制剂、抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂及应用；抗真菌制剂包括anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐；抑制剂包括二甲胺基含笑内酯富马酸盐；二甲胺基含笑内酯富马酸盐，可显著抑制真菌感染宿主中性粒细胞PD‑L1表达，恢复宿主骨髓中性粒细胞趋化至感染脏器的功能，使骨髓中性粒细胞数量减少，感染脏器中性粒细胞数量增加，宿主感染脏器荷菌量显著减少、生存率显著增加；综上，本发明提供的抗真菌制剂、抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂及应用，对于更好地进行真菌感染疾病的预防和治疗具有重要的意义和临床应用价值。
权利要求	1.一种抗真菌制剂，其特征在于，包括anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 2.如权利要求1所述的抗真菌制剂，其特征在于，所述anti‑PD‑L1抗体包括阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。 3.如权利要求1所述的抗真菌制剂，其特征在于，所述真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、肺孢子菌、毛菌、马纳青霉菌。 4.权利要求1‑3任意一项所述的抗真菌制剂在制备抗真菌药物中的用途。 5.一种抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 6.如权利要求5所述的抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂，其特征在于，所述细胞包括中性粒细胞。 7.权利要求5‑6任意一项所述的抑制剂在制备抑制细胞PD‑L1表达的药物中的应用。 8.一种预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，其特征在于，包括权利要求5‑6任意一项所述的抑制剂。 9.如权利要求8所述的预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，其特征在于，所述疾病包括免疫调节相关疾病、真菌感染。 10.如权利要求8所述的预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，其特征在于，所述真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、肺孢子菌、毛菌、马纳青霉菌。 11.如权利要求8所述的预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。 12.如权利要求8所述的预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物的给药量为10～200mg/kg。
说明书全文	一种抗真菌制剂、抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂及应用技术领域 [0001] 本发明涉及医药技术领域，具体是一种抗真菌制剂、抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂及应用。背景技术 [0002] 广谱抗生素、化疗药物及免疫抑制剂的广泛使用以及器官移植手术的大量开展，真菌感染的发病率逐年上升，据世界卫生组织统计，每年新增的侵袭性真菌病人数达435 万，死亡率高达45‑75％，已成为临床第四大血流感染性疾病。目前临床上可用的抗真菌药物种类有限，抗菌谱窄且真菌耐药性严重，使得临床治疗抗真菌感染举步维艰。随着宿主抗真菌免疫应答机制的研究，调控宿主免疫的分子靶点不断被发现，研发靶向抗体药物成为新型的免疫治疗方法，有望成为治疗真菌感染的有效手段。 [0003] C型凝集素受体(CLRs)是机体发挥抗真菌感染免疫的关键模式识别受体，CLRs利用胞外碳水化合物结合域识别真菌表面多种病原体相关分子模式。中性粒细胞是固有免疫系统中重要的效应细胞，在抗真菌免疫应答中发挥重要作用。目前，中性粒细胞中CLRs信号通路的研究相对较少，以及CLRs调控中性粒细胞功能的分子机制尚不明确，基于中性粒细胞研发精准免疫治疗真菌感染的新策略尚未见报道。 [0004] 二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)是在对天然产物含笑内酯衍生物筛选的基础上，发现的一个能选择性消除癌症干细胞的高活性化合物，被FDA认定为治疗脑胶质母细胞瘤的孤儿药，现已在多国开展临床试验(I期：ACTRN12616000228482，澳大利亚、新西兰临床试验注册号；I期：ChiCTR‑OIC‑17013604，中国临床试验注册号)。 [0005] 中性粒细胞PD‑L1表达与多种疾病相关，但是中性粒细胞表达PD‑L1作用机制及意义上不明确。比如，有相关文章表明，系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中性粒细胞表达PD‑ L1异常，与病情活动性和严重程度以及抗体产生有关，但机制仍不明确。此外，还有研究表明，PD‑L1在脓毒症小鼠外周血中性粒细胞中高表达，但并未深入研究其机制。发明内容 [0006] 本发明提供了一种抗真菌制剂、抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂及应用。对于更好地进行疾病的预防和治疗、真菌的抑制，具有重要的意义和临床应用价值。 [0007] 为达此目的，本发明提供如下的技术方案： [0008] 本发明的第一个方面，提供了一种抗真菌制剂，包括anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 [0009] 优选的，所述anti‑PD‑L1抗体包括但不限于阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。 [0010] 优选的，所述真菌包括但不限于念珠菌、曲霉菌、隐球菌、肺孢子菌、毛菌、马纳青霉菌。 [0011] 本发明首先通过实验证实，真菌感染使宿主中性粒细胞PD‑L1分子表达上调，进而抑制中性粒细胞趋化功能，使中性粒细胞大量聚集在骨髓，不能向感染脏器中迁移。当采用抗体阻断PD‑L1功能、或宿主PD‑L1基因缺失，可恢复宿主骨髓中性粒细胞的趋化至感染脏器的功能，骨髓中性粒细胞数量减少，感染脏器中性粒细胞数量增加，宿主感染脏器荷菌量显著降低，生存率显著提高。这一研究结果，使得靶向抑制中性粒细胞PD‑L1表达成为实现精准免疫治疗真菌感染的新策略。 [0012] 本发明进一步通过实验证实，一种天然产物含笑内酯衍生物，二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)具有显著抑制中性粒细胞PD‑L1表达的作用，采用ACT001治疗同样可以恢复宿主中性粒细胞从骨髓趋化至感染脏器的功能，真菌感染小鼠骨髓中性粒细胞数量显著减少，感染脏器中性粒细胞数量显著增加，进而使宿主感染脏器荷菌量显著减少、生存率显著增加。 [0013] 通过以上实验证实，anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐具有有效的抗真菌作用，可以降低宿主感染脏器荷菌量、增加宿主生存率。 [0014] 本发明的第二个方面，提供了本发明所述的抗真菌制剂在制备抗真菌药物中的用途。 [0015] 优选的，所述抗真菌制剂，包括anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 [0016] 优选的，所述anti‑PD‑L1抗体包括但不限于阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。 [0017] 优选的，所述真菌包括但不限于念珠菌、曲霉菌、隐球菌、肺孢子菌、毛菌、马纳青霉菌。 [0018] 本发明的第三个方面，提供了一种抑制细胞PD‑L1表达的抑制剂，所述抑制剂包括二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 [0019] 优选的，所述细胞包括中性粒细胞。 [0020] 本发明再进一步通过实验证实，二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)通过抑制中性粒细胞JAK‑STAT信号通路，进而抑制中性粒细胞PD‑L1表达，恢复了中性粒细胞从骨髓趋化至感染脏器的功能。可见，二甲胺基含笑内酯富马酸盐可以作为抑制PD‑L1表达的抑制剂，其抑制PD‑L1表达的信号通路为：JAK‑STAT。 [0021] 本发明的第四个方面，提供了本发明所述的抑制剂在制备抑制细胞PD‑L1表达的药物中的应用。 [0022] 优选的，所述抑制剂包括二甲胺基含笑内酯富马酸盐。 [0023] 优选的，所述细胞包括中性粒细胞。 [0024] 本发明的第五个方面，提供了一种预防、治疗或者辅助治疗疾病的药物组合物，包括本发明所述的抑制剂。 [0025] 优选的，所述疾病包括免疫调节相关疾病、真菌感染。 [0026] 优选的，所述药物组合物还可以用于调节JAK2蛋白的表达水平，和/或，调节JAK2蛋白的磷酸化水平，和/或，调节STAT3蛋白的表达水平，和/或，调节STAT3蛋白的磷酸化水平。 [0027] 优选的，所述免疫调节相关疾病包括：PD‑L1上调导致的中性粒细胞免疫调节相关的疾病。 [0028] 优选的，所述免疫调节相关疾病包括但不限于：肿瘤、炎症、系统性红斑狼疮、脓毒症。进一步优选的，所述肿瘤选自PD‑L1阳性的肿瘤，且所述肿瘤不依赖T细胞的调节下的肿瘤。 [0029] 优选的，所述真菌包括但不限于念珠菌、曲霉菌、隐球菌、肺孢子菌、毛菌、马纳青霉菌。 [0030] 优选的，还包括药学上可接受的载体。 [0031] 优选的，所述药物的给药量为10～200mg/kg。 [0032] 本发明首次发现了二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)通过抑制中性粒细胞JAK‑STAT信号通路从而抑制PD‑L1表达。PD‑L1表达下调与免疫调节相关的众多疾病有关，因此，本发明可以证实二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)可以作为治疗免疫调节相关疾病。此外，本发明还证实了真菌表面β‑葡聚糖通过激活中性粒细胞Dectin‑1受体，进而介导中性粒细胞JAK‑STAT通路激活，而二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)可抑制中性粒细胞 JAK‑STAT信号通路。因此，二甲胺基含笑内酯富马酸盐(ACT001)是通过抑制中性粒细胞 JAK‑STAT信号通路，抑制中性粒细胞PD‑L1表达，恢复中性粒细胞趋化至感染脏器的功能，进而使宿主感染脏器荷菌量显著减少、生存率显著增加。 [0033] 与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于： [0034] 1、本发明首次提出anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐可以用于抗真菌免疫治疗。其抑制原理可能是：anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐可以下调中性粒细胞PD‑L1表达，本发明通过实验证实，真菌表面β‑葡聚糖通过激活中性粒细胞Dectin‑1 受体，进而介导中性粒细胞JAK‑STAT通路激活，上调PD‑L1分子表达。anti‑PD‑L1抗体、二甲胺基含笑内酯富马酸盐可以通过下调中性粒细胞PD‑L1表达，从而抑制真菌对宿主脏器的损伤。 [0035] 2、本发明首次提出二甲胺基含笑内酯富马酸盐可以抑制中性粒细胞PD‑L1表达。其抑制的信号通路为：JAK‑STAT信号通路。 [0036] 3、本发明为PD‑L1上调导致的免疫调节相关疾病、真菌感染提供了一种新的治疗药物，即二甲胺基含笑内酯富马酸盐。附图说明 [0037] 为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。 [0038] 显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。 [0039] 图1A为本发明实施例1的骨髓中性粒细胞(CD11b+Ly‑6G+)中PD‑L1+的含量； [0040] 图1B为本发明实施例1的不同处理时间下的小鼠骨髓和肾脏中性粒细胞(CD11b++ Ly‑6G)； [0041] 图2A为本发明实施2的感染处理的小鼠的骨髓和肾脏的中性粒细胞(CD11b+Ly‑6G+ )含量； [0042] 图2B为本发明实施2的感染处理的小鼠的生存率和肾脏荷菌量； [0043] 图2C为本发明实施2的感染、抗体处理的小鼠的骨髓和肾脏的中性粒细胞(CD11b++ Ly‑6G)含量； [0044] 图2D为本发明实施2的感染、抗体处理的小鼠的存活率和肾脏荷菌量； [0045] 图3A为本发明实施3的curdlan处理WT和Clec7a‑/‑小鼠骨髓来源中性粒细胞的含量； [0046] 图3B为本发明实施3的curdlan处理WT和Clec7a‑/‑小鼠骨髓来源中性粒细胞和人血中性粒细胞的JAK2和STAT3磷酸化水平； [0047] 图3C为本发明实施3的curdlan处理WT和Clec7a‑/‑小鼠骨髓来源中性粒细胞的JAK2和STAT3磷酸化水平； [0048] 图4A为本发明实施4的curdlan和ACT001处理的骨髓来源的中性粒的JAK2和STAT3磷酸化水平； [0049] 图4B为本发明实施4的curdlan和ACT001处理的骨髓来源的中性粒和人血中性粒细胞的JAK2和STAT3磷酸化水平； [0050] 图4C为本发明实施4的感染、灌胃处理的小鼠的骨髓和肾脏的中性粒细胞(CD11b++ + Ly‑6G)中PD‑L1的含量； [0051] 图4D为本发明实施4的感染、灌胃处理的小鼠的骨髓和肾脏的中性粒细胞(CD11b++ Ly‑6G)含量； [0052] 图4E为本发明实施4的感染、灌胃处理的小鼠的生存率和肾脏荷菌量。具体实施方式 [0053] 为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。 [0054] 显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0055] 对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。 [0056] 还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。 [0057] 下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。 [0058] 本发明的实验方案均得到同济大学实验动物伦理委员会许可。 [0059] 实施例1 [0060] 1.1、获取实验样本，C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，4天后处死小鼠，取小鼠组织； [0061] 1.2、获取小鼠骨髓中性粒细胞：取小鼠后腿股骨和胫骨，收集骨髓冲洗液；加入2mL IB液重悬；Percoll提取67％与76％浓度梯度液之间的细胞层，加入5mLPBS缓冲液冲洗细胞两遍(500g，10min，4℃)；弃上清，裂解红细胞，加入2mL医用灭菌注射用水用无菌巴氏管轻柔吹打20s，加入等体积的2×无钙镁HBSS和IB冲洗液，离心(500g，7min，4℃)，弃上清，得到提纯后的骨髓中性粒细胞； [0062] 1.3、流式细胞术检测：取适量单细胞(骨髓中性粒细胞)悬液置于1.5mL EP管中，离心(500g，10min，4℃)，弃上清；用1mLPBS洗涤细胞2次，PBS稀释活细胞染料(比例：1/ 100)，每个样品加入100μL稀释后的染料，染色30min(4℃)，离心(500g，10min，4℃)，弃上清；配置抗体稀释液(PBS缓冲液+2％FBS)，按照比例稀释抗体，用100μL抗体稀释液重悬细胞，染色30min(4℃)，离心(500g，10min，4℃)，弃上清，用1ml抗体稀释液洗涤细胞2次；用 500μL抗体稀释液重悬细胞，经200目铁丝网过滤到流式管中，流式细胞术检测骨髓中性粒细胞的PD‑L1表达； [0063] 1.4、获取实验样本，C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，分别于处理后的0天、1天、2天、3天、4天、5天和6天后处死小鼠，取小鼠组织； [0064] 1.5、获取小鼠骨髓中性粒细胞：按照前述的方法进行实验。 [0065] 1.6、获取小鼠肾脏中性粒细胞：取出上述处死后的小鼠的肾脏，用手术剪剪碎，加入5mL 1mg/ml的胶原酶D溶液，37℃摇床，200rpm振荡消化1h；将消化液以及碎块组织研磨液用70μm滤膜过滤，得到肾脏单细胞悬液，离心(500g，10min，4℃)，弃上清；Percoll抽提 40％和80％浓度梯度液之间的细胞层，加入5mLPBS缓冲液冲洗细胞两遍(500g，10min，4 ℃)；加入2mLRBC缓冲液，破红5min后，加入10mL1640培养基后离心(500g，10min，4℃)，用 1mL 1640培养基重悬细胞后，得到小鼠肾脏免疫细胞的单细胞悬液。 [0066] 1.7、流式细胞术检测：根据前述的方法进行实验，检测骨髓和肾脏中性粒细胞数目和PD‑L1表达。 [0067] 实验结果如图1A所示，真菌感染使小鼠骨髓中性粒细胞PD‑L1表达显著上升。如图1B所示，真菌感染使小鼠骨髓中性粒细胞数量增加，感染脏器肾脏的中性粒细胞数量降低。该结果证明，真菌感染使宿主中性粒细胞大量聚集在骨髓，向感染脏器肾脏的趋化能力显著降低。 [0068] 实施例2 [0069] 2.1、C57BL/6小鼠和PD‑L1‑/‑小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第4天处死，按+ + 1.2和1.6方法，将骨髓和肾脏处理为单细胞悬液，FASC分析中性粒细胞(CD11bLy‑6G)的比例；实验结果如图2A所示，PD‑L1基因缺失小鼠，骨髓中性粒细胞数量降低，感染脏器肾脏中性粒细胞数量增加。 [0070] 2.2、以C57BL/6小鼠和PD‑L1‑/‑小鼠为实验对象考察系统性白念珠菌感染小鼠的生存率差异：实验分组为对照组和实验组，每组10只小鼠，小鼠尾静脉注射SC5314(2 5 10CFU)构建感染模型，每日记录各组小鼠存活情况，观察周期为15天，统计分析各组之间的差异。 [0071] 2.3、以C57BL/6小鼠和PD‑L1‑/‑小鼠为实验对象考察系统性白念珠菌感染小鼠的肾脏荷菌量差异：实验分组为对照组和实验组，每组6只小鼠，小鼠尾静脉注射SC5314(2* 5 10CFU)构建感染模型，于感染后的第4天取小鼠的感染脏器肾脏，称重并研磨脏器，研磨液梯度稀释涂板，计数涂板后的菌落个数从而计算出小鼠肾脏荷菌量，统计分析各组之间的 ‑/‑ 差异。实验结果如图2B所示，PD‑L1 小鼠肾脏荷菌量显著降低，生存率显著提高。 [0072] 2.4、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第2天腹腔注射anti‑PD‑L1抗体和IgG抗体(200μg/只)，第4天处死，将骨髓和肾脏处理为单细胞悬液，FASC分析中性粒细胞 + + (CD11bLy‑6G)的比例；实验结果如图2C所示，采用PD‑L1抗体治疗，小鼠骨髓中性粒细胞数量降低，感染脏器肾脏中性粒细胞数量增加。 [0073] 2.5、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第2天腹腔注射anti‑PD‑L1抗体和IgG抗体(200μg/只)，按2.2中实验方法，记录小鼠生存率。实验结果如图2D所示。 [0074] 2.6、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第2天腹腔注射anti‑PD‑L1抗体和IgG抗体(200μg/只)，按2.3中实验方法，计算感染第4天小鼠肾脏荷菌量。实验结果如图 2D所示。 [0075] 以上实验结果证明，真菌感染的小鼠经anti‑PD‑L1抗体治疗，或宿主PD‑L1基因缺失，可恢复中性粒细胞从骨髓趋化至感染脏器肾脏的功能，骨髓中性粒细胞数量减少，肾脏中性粒细胞数量增加，感染脏器肾脏荷菌量显著降低，小鼠生存率显著提高。该实验结果证明，靶向抑制中性粒细胞PD‑L1表达可作为免疫治疗真菌感染的全新策略。 [0076] 实施例3 [0077] 3.1、25μg curdlan处理C57BL/6小鼠和Clec7a‑/‑小鼠骨髓来源中性粒细胞12小+ + + 时，FASC检测中性粒细胞(CD11bLy‑6G)中PD‑L1的比例；实验结果如图3A所示，Clec7a基因缺失小鼠的中性粒细胞受到真菌来源的β‑葡聚糖(curdlan)刺激，可显著降低中性粒细胞表面PD‑L1表达；证明中性粒细胞是通过细胞表面dectin‑1受体识别真菌表面β‑葡聚糖，进而上调PD‑L1表达。 [0078] 3.2、中性粒细胞蛋白质提取和蛋白质印迹：配置蛋白裂解液(1mL Mammalian Cell Lysis Buffer+1U Nuclease+10μL Protease Inhibitor(100x))，取500 6 μL蛋白裂解液重悬5×10个中性粒细胞，4℃震荡5min。4℃，14000g离心10min，取上清，BCA 法测定蛋白质浓度，上清液中按1:4比例加入5×loadingbuffer，混合均匀，95℃煮10min变性。样本置于‑20℃保存。配置10％SDS‑PAGE电泳凝胶，恒压进行电泳。电泳结束后，将目的蛋白从凝胶上转移至PVDF膜上。转膜结束后，5％脱脂牛奶室温封闭抗原表位至少1h，孵育一抗，4℃过夜。1×TBS/T洗膜3次，10min/次，孵育二抗，37℃60min，1×TBS/T洗膜5次， 10min/次，曝光分析，保存图片。 [0079] 3.3、25μg curdlan处理C57BL/6小鼠骨髓来源的中性粒细胞1小时，50μg curdlan处理人血中性粒细胞1小时，按3.2中方法Westernblot检测JAK2和STAT3磷酸化水平。实验结果如图3B所示，小鼠和人中性粒细胞受curdlan刺激可激活JAK2和STAT3磷酸化。 [0080] 3.4、流式胞内染色：Curdlan刺激小鼠骨髓来源中性粒细胞30min后，离心收细胞，用FACS Buffer 2mL洗涤一次后染色表面蛋白4℃避光孵育30min。1mL Buffer洗涤后弃上清，加入1mL Fix/permeabilizatioin Buffe并脉冲式涡旋细胞，4℃避光孵育60min。每管加入2mL 1X PermWash Buffer，室温600g离心5min，弃上清，重复两次。后进行胞内蛋白染色4℃避光孵育60min。每管加入2mL 1X Perm Wash Buffer，室温600g离心5min，弃上清，加入适量的FACS Buffer重悬染色的细胞，使用流式细胞仪分析样本。 [0081] 3.5、按3.4中所述方法，25μg curdlan处理C57BL/6和Clec7a‑/‑小鼠骨髓来源中性粒细胞30分钟，FASC检测JAK2和STAT3磷酸化水平。实验结果如图3C所示，小鼠中性粒细胞受curdlan刺激可上调JAK2和STAT3磷酸化。 [0082] 以上实验结果证明真菌表面β‑葡聚糖是通过Dectin‑1/JAK2/STAT3轴上调中性粒细胞PD‑L1表达。 [0083] 实施例4 [0084] 4.1、将C57BL/6小鼠骨髓中性粒细胞分为四组：(1)空白对照组，(2)ACT001(40μM)处理组，(3)25μg curdlan处理组，(4)25μg curdlan+ACT001(40μM)处理组，按3.4中所述方法，FASC检测JAK2和STAT3磷酸化水平；实验结果如图4A所示，ACT001可显著抑制JAK2和 STAT3磷酸化。 [0085] 4.2、25μg curdlan和ACT001(10，20，40，60μM)共同处理C57BL/6小鼠骨髓来源中性粒细胞12小时，50μg curdlan和ACT001(20，40，60，80μM)共同处理人血中性粒细胞12小 + + + 时，FASC检测中性粒细胞(CD11bLy‑6G)中PD‑L1的比例；实验结果如图4B所示，ACT001对小鼠和人中性粒细胞PD‑L1表达的抑制作用均呈剂量依赖，ACT001的剂量越高，对中性粒细胞PD‑L1表达的抑制能力越强。 [0086] 4.3、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，感染1‑3天灌胃给予PBS和ACT001(200mg/kg)，第4天处死，将骨髓和肾脏处理为单细胞悬液，FASC检测中性粒细胞 + + + + + (CD11bLy‑6G)中PD‑L1的比例，及中性粒细胞(CD11bLy‑6G)的比例；实验结果如图4C和 4D所示，采用ACT001治疗，可显著降低小鼠骨髓和肾脏中性粒细胞PD‑L1表达，恢复了小鼠骨髓中性粒细胞趋化至感染脏器肾脏的能力，小鼠骨髓中性粒细胞数量减少，肾脏中性粒细胞数量增加。 [0087] 4.4、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第2天分别口服灌胃PBS(200μL/只)和ACT001(200mg/kg，200μL/只)，按2.2中实验方法，记录小鼠生存率。 [0088] 4.5、C57BL/6小鼠尾静脉注射SC5314(2105CFU)，第2天分别口服灌胃PBS(200μL/只)和ACT001(200mg/kg，200μL/只)，按2.3中实验方法，计算感染第4天小鼠肾脏荷菌量。实验结果如图4E所示，采用ACT001治疗，显著降低小鼠感染脏器肾脏荷菌量，显著提高小鼠生存率。 [0089] 以上实验结果证明，ACT001具有显著抑制中性粒细胞PD‑L1表达作用，采用ACT001治疗可恢复宿主中性粒细胞从骨髓趋化至感染脏器的功能，骨髓中性粒细胞数量减少，感染脏器中性粒细胞数量增加，具有显著的真菌感染治疗作用。 [0090] 在上述说明书的描述过程中： [0091] 术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如……所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。 [0092] 最后应说明的是： [0093] 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制； [0094] 尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。