Insecticide Resistance Diagnosis-kit which Using Residual Contact Method

잔류접촉법에 의한 살충제 저항성 진단키트{Insecticide Resistance Diagnosis-kit which Using Residual Contact Method}

본 발명은 포장에서 살충제에 대한 해충의 약제 저항성을 손쉽게 측정할 수 있는 진단키트 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 특히 잔류접촉법(residual contact method)을 이용하여 살충제에 대한 저항성을 간편하고 정확하게 측정할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.

시설재배지 내의 환경은 온도 및 습도와 같은 미세기상이 일정하며, 비 가림으로 인해 해충 발생에 적합한 조건을 제공해주므로 야외에서는 그다지 문제되지 않았던 해충들도 새로운 문제를 일으키기 쉬우며 한 번 발생하면 재배시설 내의 발생 호조건으로 인해 계속적으로 발생하므로 재배자들은 방제에 큰 어려움을 겪게 된다(농촌진흥청 농업과학기술원, 2000). 특히, 연중 재배되는 시설작물의 경우, 1980년대 전반부터 문제가 된 진딧물과 점박이응애( Tetranychus urticae ) 및 1980년대 후반부터 문제가 된 온실가루이( Trialeurodes vaporariorum )는 시설재배작물의 난방제 해충으로, 현재까지도 이들에 의한 피해가 가장 심각하다.

최근 친환경, 유기농산물에 대한 요구가 높아짐으로써 미생물 살충제의 사용이 권장되고 있으나, BT( Bacillus thuringiensis ) 독소를 위주로 한 미생물살충제들은 나비목, 파리목 및 일부 딱정벌레목 해충들에게만 효과를 보일 뿐 응애 및 매미목에 속하는 시설원예 흡즙성 해충에 대해서는 전혀 살충력을 보이지 않아 근본적으로 사용할 수 없는 문제가 있다. 또한, 천적의 방사를 통하여 시설원예 해충을 방제할 때도 해충의 피해허용밀도가 너무 높거나 낮으면 선택성 농약을 이용하여 해충-천적의 평형상태를 바로잡아야 유효한 방제 효과를 얻을 수 있다(Committee on the Future Role of Pesticides in US Agriculture, 2000). 상기와 같은 문제점으로 인해 현시점에서 네오니코티노이드계, 피레스로이드계, 유기인계, 카바메이트계 등과 같은 합성살충제의 사용 없이는 시설원예 작물의 재배가 거의 불가능한 실정이다.

그러나, 상기 합성살충제를 오랜 기간 사용함에 따라, 최근에 이르러 살충제 저항성 문제가 심각하게 대두되고 있다. Kim 등(한국응용곤충학회지 38:53-57, 1999)은 국내 배추좀나방 개체군 내에서 피레스로이드계 및 유기인계/카바메이트계 저항성 유전형질인 kdr T929I 돌연변이 및 ace1 G227A 돌연변이 빈도가 거의 포화상태에 다다른 것으로 추정하였으며, Lee 등(J. Asia-Pacific Entomol. 6:91-96, 2003)은 장미와 딸기 시설재배단지내의 점박이응애에 대한 약제 저항성을 조사한 결과, 신규 및 기존 약제에 대한 저항성이 발달된 것으로 보고하였으며, Jung과 Son(한국응용곤충학회지, 40:327-335, 2001)은 온실가루이의 살충제 감수성을 조사한 결과, 피레스로이드 계통에 대해 빠른 저항성 발달이 관찰되었다고 하였다.

또한, Hoy(Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 353:1787-1795, 1998)는 살충제에 대한 해충의 저항성은 살충제의 오용과 남용이 도태압으로 작용하여 생기는 진화현상이므로 농약의 불필요한 살포횟수를 줄여야 약제저항성의 효율적인 관리가 가능하다고 하였다. 때문에 살충제 저항성 해충군의 효율적인 관리를 위해서는 해충밀도 예찰 및 약제처리시기 선정에 앞서 대상해충이 어떤 계열의 살충제에 대하여 저항성인지 감수성인지를 우선 파악하여 효력이 저하된 약제사용을 억제하고, 충분한 방제효과를 갖는 약제를 교대로 교호 살포하도록 권장할 수 있는 체계적인 관리체계가 절실히 요구된다.

상기 해충의 체계적인 관리를 위하여 살충제 저항성에 관련된 많은 연구가 이루어졌으며, 국내연구현황(표 1) 및 국외연구현황(표 2)은 다음과 같다.

농약의 무분별한 살포횟수를 줄이기 위해서는 농약살포 전에 살포할 약제에 대하여 대상해충이 감수성인지 저항성인지를 농가별로 올바르게 파악해야할 필요가 있다. 이에 본 발명자들은 종래 살충제 저항성 진단방법을 개선하여 보다 간편하고 정확한 살충제 저항성 모니터링용 진단키트를 개발하고, 시설재배지 현장에서 누구나 손쉽게 살충제에 대한 감수성 및 저항성 수준을 정확하게 판별할 수 있도록 하고자 한다.

본 발명은 잔류접촉법(residual contact method)을 이용한 진단키트로써 휴대가 간편하여 포장에서 누구나 손쉽게 측정할 수 있다. 종래 Dennehy 등(표 2)에 의해 개발된 간이검정키트는 디코폴 1㎖을 페트리디시에 넣고 흔들어서 묻히고 나머지 여액을 제거한 후 건조하여 제조함으로써 진단키트별 약량이 다르다는 문제점이 발생하였다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여

a) 살충제를 휘발성 유기용매에 용해하여 희석액을 제조하는 단계;

b) 상기 살충제 희석액을 1~20㎖의 바이엘에 10~500㎕ 투입하는 단계;

c) 상기 바이엘을 회전 및 교반하여 살충제 희석액을 용기 내부 표면에 고르게 도포하는 단계 및

d) 상기 도포된 바이엘 내부의 휘발성 유기용매를 휘발시킨 후 밀폐하는 단 계로 제조된 살충제 저항성 진단키트의 제조방법(도 1) 및 상기 제조방법에 의해 제조된 살충제 저항성 진단키트를 제공하고자 한다.

상기 살충제 저항성 진단키트는 바이엘마다 처리 약량이 동일하기 때문에 약제 감수성 및 저항성을 정확하게 진단할 수 있게 된다.

또한, 본 발명에서는 상기 살충제 저항성 진단키트를 이용하여 실제 포장에서 미세해충인 진딧물류, 가루이류, 응애류의 살충제 저항성을 진단하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 본 발명에 의한 살충제 저항성 진단키트를 사용하면, 누구나 손쉽게 포장에서 특정 살충제에 대한 포장내 대상해충의 감수성 및 저항성 수준을 정확하게 측정할 수 있어 우수한 효과를 갖는 살충제를 선별, 살포하도록 하여 무분별한 농약의 오용을 막는 효과가 있다.

또한, 신규 약제 및 합제에 따른 살충효과를 손쉽고 정확하게 검정할 수 있어 새로운 살충제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

대상해충

상기 본 발명의 잔류접촉법을 이용한 살충제 저항성 진단키트는 몸집이 작은 미세해충의 약제저항성을 측정할 수 있으며, 상기 미세해충으로는 조팝나무진딧물, 사과혹진딧물, 찔레수염진딧물, 목화진딧물, 복숭아혹진딧물, 우엉수염진딧물, 복숭아가루진딧물, 무테두리진딧물, 붉은테두리진딧물, 국화꼬마수염진딧물, 복숭아 가루이진딧물 등의 진딧물류; 온실가루이, 담배가루이 등의 가루이류; 점박이응애, 차먼지응애, 간자와응애, 사과응애, 뿌리응애, 귤응애, 차응애, 혹응애 등의 응애류가 있다. 특히, 본 발명의 실시예 및 시험예에서는 점작이응애, 목화진딧물, 온실가루이의 약제저항성에 대하여 실험하였다.

살충제

상기 본 발명에 의한 살충제 저항성 진단키트에서는 식독, 접촉독, 훈증제, 침투이행제 활성을 갖는 살충제를 모두 사용할 수 있으나, 바람직하게는 진딧물류, 가루이류, 응애류에 접촉독 활성을 나타내는 약제를 사용한다.

상기 진딧물류, 가루이류, 응애류에 접촉독 활성을 나타내는 살충제로 아바멕틴(abamection), 아세퀴노실(acequinocyl), 아세페이트(acephate), 아세타미프리드(acetamiprid), 아크리나트린(acrinathrin), 알라니카브(alanycarb), 알파싸이퍼메트린(alpha-cypermethrin), 아미트라즈(amitraz), 아조싸이클로틴(azocyclotin), 벤푸라카브(benfuracarb), 벤족시메이트(benzoximate), 베타싸이플루트린(beta-cyfluthrin), 비페나제이트(bifenazate), 비펜트린(bifenthrin), 부프로페진(buprofezin), 카바릴(carbaryl), 클로르페나피르(chlorfenapyr), 클로르피리포스(chlorpyrifos), 클로르피리포스메칠(chlorpyrifos-methyl), 클로펜테진(clofentezine), 클로치아니딘(clothianidin), 싸이헥사틴(cyhexatin), 싸이플루메토펜(cyflumetofen), 싸이플루트린(cyfluthrin), 싸이퍼메트린(cypermethrin), 델타메트린(delta-methrin), 디코폴(dicofol), 디노테푸란(dinotefuran), 디클로르 보스(dichlorvos), 디메토에이트(dimethoate), 에스펜발러에이트(esfenvalerate), 이피엔(EPN), 에토펜프록스(etofenprox), 에톡사졸(etoxazole), 페나자퀸(fenazaquin), 펜부타틴옥사이드(fenbutatin oxide), 페니트로티온(fenitrothion), 페노티오카브(fenothiocarb), 펜프로파트린(fenpropathrin), 펜피록시메이트(fenpyroximate), 펜발러에이트(fenvalerate), 플루아크리피림(fluacrypyrim), 플루아지남(fluazinam), 플루페녹수론(flufenoxuron), 푸라치오카브(furathiocarb), 할펜프록스(halfenprox), 람다싸이할로트린(lambda-cyhalothrin), 메치다치온(methidathion), 메토밀(methomyl), 밀베멕틴(milbemectin), 모노크로토포스(monocrotophos), 오메토에이트(omethoate), 피리미카브(pirimicarb), 피리미포스메칠(pirimiphos-methyl),포사론(phosalone), 프로파자이트(propargite), 프로치오포스(prothiofos), 피메트로진(pymetrozine), 피라클로포스(pyraclofos), 피리다벤(pyridaben), 피리다펜치온(pyridaphenthion), 피리미디펜(pyrimidifen), 테부펜피라드(tebufenpyrad), 테트라디폰(tetradifon), 트랄로메트린(tralomethrin), 트리아자메이트(triazamate), 트리아조포스(triazophos), 스피노사드(spinosad), 스피로디클로펜(spirodiclofen), 스피로메시펜(spiromesifen), 제타싸이퍼메트린(zeta-cypermethrin) 등이 1종 이상 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 실시예 및 시험예에서는 아바멕틴(abamectin)과 테부펜피라드(tebufenpyrad), 람다싸이할로트린(lambda-cyhalothrin), 스피노사드(spinosad) 및 푸라치오카브(furathiocarb)를 사용하였다.

또한, 상기 살충제 희석액은 제조사 및 한국농약공업협회에서 발간된 농약사 용지침서의 권장사용량에 의해 결정되며 측정내용(저항성 또는 감수성), 대상해충, 2종 이상의 합제에 의한 상승효과 등을 고려하여 0.2~200ppm 농도로 제조되며, 본 발명에 의한 실시예 및 시험예에서는 2~240ppm 농도로 실험하였다. 상기 살충제를 용해시키는 휘발성 유기용매는 상기 살충제의 화학적 안정성을 고려하여 알코올, 글리콜, 아세테이트, 에테르, 케톤, 지방족탄화수소, 방향족탄화수소 및 할로겐화 탄화수소로부터 1종 이상 선택되어진다. 특히 본 발명의 실시예 및 시험예에서는 아세톤을 사용하였다.

이하 구체적인 실시예 및 시험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

시험해충별 무처리 생존시간 조사

대상해충이 5㎖ 크기의 바이엘에 접종된 후 수분 또는 먹이 급여 없이 생존할 수 있는 시간을 관찰한 결과, 100% 생존시간은 점박이응애, 목화진딧물, 온실가루이의 경우 각각 48시간, 24시간, 및 10시간으로 판정되었으며 점박이응애의 무처리 생존기간을 도 2에 나타내었다. 온실가루이는 활발한 행동 습성 때문에 생존시간이 비교적 짧은 것으로 보였다. 이를 바탕으로 잔류접촉법 및 파라필름 흡즙법 을 일률적으로 시험해충에 적용할 경우 접종 후 관찰시간을 10시간 이내, 보다 안전하게 설정한다면 6~8시간 정도로 설정해야 될 것으로 사료되었다.

대상해충 접종 개체수

점박이응애는 먹이가 부족하거나 밀도가 높을 경우에 거미줄을 치는 것으로 알려져 있다. 따라서 바이엘 내부에서 거미줄을 칠 경우 약제에 대한 균일한 접촉에 영향을 미칠 것으로 생각되어 바이엘 내에서 거미줄을 치는 과정 및 속도를 조사하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이 20마리를 5ml 바이엘에 접종하였을 경우 10시간 이내에는 대략 5% 정도의 개체가 거미줄을 치는 것으로 나타나 약제에 대한 효력평가에는 큰 영향을 주지 않았다.

실시예 1

아바멕틴 ( abamectin ) 저항성 진단키트

아바멕틴을 아세톤에 농도별(3.7, 7.5, 11.3, 15, 30, 45, 60ppm) 로 희석하여 5㎖ 용량의 뚜껑이 있는 유리바이엘에 100㎕씩 투입한 후, rolling wave rotator (Eberbach corporation, USA)를 이용하여 30분 동안 회전시키며 골고루 도포하였다. 도포된 바이엘을 후드에서 풍건시킨 후 뚜껑을 닫아 밀폐시켜 살충제 저항성 진단키트를 제조하였다. 상기 제조된 살충제 저항성 진단키트에 대상해충인 점박이응애 10마리를 접종하고 6시간 후, 농도별 사망률을 5반복으로 측정하였으며 그 결과를 도 4, 5, 6에 나타내었다. 상기 결과를 토대로 하여 살충제 유효 농도를 결정하였으며 표 3에 나타내었다.

실시예 2

테부펜피라드 ( tebufenpyrad ) 저항성 진단키트

테부펜피라드를 아세톤에 농도별(15, 30, 60, 90, 120, 240ppm)로 희석하여 5㎖ 용량의 뚜껑이 있는 유리바이엘에 100㎕씩 투입한 후, rolling wave rotator (Eberbach corporation, USA)를 이용하여 30분 동안 회전시키며 골고루 도포하였다. 도포된 바이엘을 후드에서 풍건시킨 후 뚜껑을 닫아 밀폐시켜 살충제 저항성 진단키트를 제조하였다. 상기 제조된 살충제 저항성 진단키트에 대상해충인 점박이응애 10마리를 접종하고 6시간 후, 농도별 사망률을 5반복으로 측정하였으며 그 결과를 도 7, 8, 9에 나타내었다. 상기 결과를 토대로 하여 살충제 유효농도를 결정하였으며 표 3에 나타내었다.

실시예 3~5

목화진딧물에 대한 람다싸이할로트린(lambda-cyhalothrin) 저항성 진단키트(실시예 3)와 온실가루이에 대한 스피노사드(spinosad) 및 푸라치오카브(furathiocarb) 저항성 진단키트(실시예 4, 5)를 실시예 1, 2와 동일한 방법으로 제조하였으며, 제조된 진단키트에 목화진딧물과 온실가루이를 각각 10마리씩을 접종하고 6시간 후 나타난 사충률이 약 80%에 이르는 농도를 유효농도를 결정하였으며 하기 표 3에 나타내었다.

시험예 1: 뚜껑 개폐에 따른 살충력

폐쇄 상태의 바이엘에서 훈증에 의한 살충성 강화가 일어나는 것인지를 확인하기 위해 상기 실시예 1에 의해 제조된 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트에 점박이응애를 접종하고 뚜껑의 개폐여부에 의한 차이를 비교하였다. 실험 결과 살충력의 유의한 차이는 없었으나(도 10), 접종된 해충의 이동을 방지하기 위하여 뚜껑을 밀폐한 상태로 잔류접촉법 생물검정을 수행하는 것으로 결정하였다.

시험예 2: 온도에 따른 살충력(아바멕틴)

상기 실시예 1에 의해 제조된 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트에 점박이응애(유기인계 저항성/아바멕틴 감수성 계통)를 접종한 결과 온도가 높을수록 독성이 빠르게 발현되었으나 8시간 이후에는 모든 시험온도에서 100%에 근접하는 최종사망률을 보였다(도 11). 따라서 접종 8시간 후에 사망률을 조사한다면 온도에 따른 살충력 편차에 따른 검정오차를 최소화 할 수 있을 것이다.

시험예 3: 온도에 따른 살충력(테부펜피라드)

상기 실시예 2에 의해 제조된 30ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트에 점박이응애를 접종한 결과 온도가 높을수록 독성이 빠르게 발현되었으나 6~8시간 이후에는 모든 시험온도에서 포화반응점에 도달하는 것으로 나타났다(도 12). 그러나 일반적인 조사온도로 생각되는 25~30℃에서의 최종사망률은 차이가 없는 것으로 나타나 접종 8시간 후에 사망률을 조사한다면 온도에 따른 살충력 편차에 따른 검정오차를 최소화 할 수 있을 것이다.

시험예 4: 생육단계별 살충력(아바멕틴)

상기 실시예 1에 의해 제조된 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트에 점박이응애의 약충과 성충을 각각 접종한 결과 생육시기에 따라 최종 사망률에 도달하는 시간의 차이가 나타났다(도 13). 접종 초기에 약충이 성충에 비해 다소 독성이 빨리 발현되는 것으로 보였으나 접종 후 6~8시간대에는 발육단계별 유의한 차이는 없었다.

시험예 5: 생육단계별 살충력(테부펜피라드)

상기 실시예 2에 의해 제조된 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트에 점박이응애의 약충과 성충을 각각 접종한 결과 생육시기에 따라 최종 사망률에 도달하는 시간의 차이가 나타났다(도 14). 접종 초기에 약충이 성충에 비해 다소 독성이 빨리 발현되는 것으로 보이나 접종후 6~8시간대에는 발육단계별 유의한 차이는 없었다.

시험예 6: 분해도

상기 실시예에 의해 제조된 살충제 저항성 진단키트의 바이엘 내부에 도포된 약제의 시간에 따른 분해 정도를 조사하였다. 2, 6, 12개월 후, 아바멕틴, 테부펜피라드가 도포된 바이엘에서 각각 내부 약제를 재추출하여 잔량을 고속액체크로마토그래피(HPLC, High performance liquid chromatography)를 이용하여 측정하였다(도 15, 도 16). 그 결과 시간 경과에 따른 일정한 감소, 혹은 증가 양상은 나타나지 않아 바이엘 도포 약제의 시간에 따른 분해 정도는 미미하다고 판단되었다.

시험예 7: 지역 계통별 저항성

종래 분무법에 의해 저항성비가 판별된 충남, 경북 소재의 실제 농가 포장을 대상으로 상기 실시예 2에 의해 제조된 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트를 이용하여 지역 계통별 저항성을 측정하였다. 그 결과 본 발명에 의한 살충제 저항성 진단키트의 사충률이 분무법에 의해 측정된 저항성비와 높은 상관관계(r ² =0.79)를 보여 실제 포장에서의 살충제 저항성 진단에 효율적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다(표 4, 도 17).

시험예 7: 온실내 저항성(아바멕틴)

상기 실시예 1에 의해 제조된 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트를 이용하여 동일한 비닐하우스 전체 포장을 12구획으로 구분하여 3반복으로 점박이응애 사충률을 조사하였다. 그 결과 모든 구획에서 90% 이상의 사충률을 보였으며 낮은 편차를 보였다(도 18).

시험예 8: 온실내 저항성(테부펜피라드)

상기 실시예 2에 의해 제조된 , 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트를 이용하여 동일한 비닐하우스 전체 포장을 12구획으로 구분하여 3반복으로 점박이응애 사충률을 조사하였다. 그 결과 구획 간의 편차가 비교적 크게 관찰되어 같은 온실 내에서도 테부펜피라드에 대한 점박이응애의 감수성 및 저항성 변이가 클 수 있음을 알 수 있었다(도 19).

도 1은 본 발명의 잔류접촉법을 이용한 살충제 저항성 진단키트의 제조공정도이며,

도 2는 바이엘에 접종된 점박이응애의 무처리 생존기간을 나타낸 그래프이며,

도 3은 바이엘에 접종된 점박이응애의 거미줄을 치는 시간을 나타낸 그래프이며,

도 4~6은 본 발명에 의한 아바멕틴 농도별 점박이응애 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 7~9은 본 발명에 의한 테부펜피라드 농도별 점박이응애 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 10은 본 발명에 의한 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트의 뚜껑 개폐에 따른 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 11은 본 발명에 의한 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트의 온도별 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 12는 본 발명에 의한 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트의 온도별 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 13은 본 발명에 의한 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트의 점박이응애 생육단계별 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 14는 본 발명에 의한 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트의 점박이응애 생육단계별 살충력을 나타낸 그래프이며,

도 15는 본 발명에 의한 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트의 시간별 분해 정도를 나타낸 그래프이며,

도 16은 본 발명에 의한 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트의 시간별 분해 정도를 나타낸 그래프이며,

도 17은 본 발명에 의한 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트의 지역별 저항성 측정결과를 나타낸 그래프이며,

도 18은 본 발명에 의한 30ppm 아바멕틴 저항성 진단키트의 온실내 저항성 측정결과를 나타낸 그래프이며,

도 19는 본 발명에 의한 60ppm 테부펜피라드 저항성 진단키트의 온실내 저항성 측정결과를 나타낸 그래프이다.