[0001] 本申请是申请日为2011年11月29日，申请号为：201110387753.9，发明名称为“一种Bt蛋白Cyt3Aa1、其编码基因及应用”的专利申请之分案申请。

[0002] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。

[0003] 多年来，人类对蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点，并且避免了化学防治带来的一系列问题。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

[0004] 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididal crystal proteins，简称ICPs）是由cry基因和cyt基因编码的。人们已经分离克隆了470多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N.,et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。Cyt蛋白最早是在对双翅目昆虫具有毒性的Bt以色列亚种中发现的，它是Bt在芽孢阶段产生的δ-内毒素组成。截止2010年12月，已发现的Cyt蛋白共有31种，根据氨基酸序列同源性可分Cyt1和Cyt2两大类。Cyt蛋白对埃及伊蚊杀虫活性测定表明：Cyt1Aa、Cyt1Ab1、Cyt2Aa1和Cyt2Ba1都对伊蚊有活性，但是Cyt1蛋白的活性高于Cyt2类（Qi Donglai,Li Yidan,Gao Jiguo.2005.Journal of Northeast Agricultural University.12(1):5-10.）。自然界水体中广泛生长着可作为蚊幼虫食物的蓝藻。1996年,闫歌等将携带有Bt杀虫晶体蛋白基因的pDC26穿梭质粒,通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。所得到的基因工程藻Anabaena sp.7120、A nabaena cylidrica 和4
Anabaena subtropic对淡色库蚊幼虫,24h半数致死浓度(LC50)分别为:3.51×10细胞/
4 4
mL、3.32×10细胞/mL和4.34×10 细胞/mL。工程藻在连续传代50余次的情况下,仍能对淡色库蚊幼虫有较高的毒杀作用;在不加抗菌素条件下,穿梭质粒稳定,杀蚊幼虫毒效水平与加抗菌素培养的工程藻相差不大,为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。

[0005] 由于Cyt蛋白与Cry蛋白具有不同的作用原理，Cyt蛋白对某些Cry蛋白具有增效作用，使其越来越受到关注。研究发现，Cyt蛋白对双翅目害虫的作用并不主要在于其毒力本身,而在于它能增强其它杀虫晶体蛋白的杀虫活性，例如：Cyt1Aa蛋白与Bt以色列亚种其它Cry蛋白之间存在着明显的协同作用，将Cyt1Aa与Bt以色列亚种其它杀虫蛋白按照不同比例进行混合，发现比单个蛋白的毒力提高了4～10倍（Crickmore N,et al.1995.FEMS Microbiol Lett,131:249-254）。

[0006] 苏云金芽胞杆菌在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是频繁地使单一Bt杀虫蛋白的必然结果是因害虫的适应而产生对Cry类蛋白的抗性；目前，许多昆虫种群己相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实（Mc Gaughey W.H.,1985.Science.229:193-195），原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。上世纪90年代以来，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性（Tabashnik B.E.,et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124）；在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成（冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报,39(3):238-244）。目前，发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性（Schnepf E.,et al.1998.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806）。研究表明，Cyt蛋白能降低双翅目害虫对Cry蛋白的抗性：Cyt1A和Cry11A混合能使五带淡色库蚊(Culexquinquefasciatus)抗性系对Cry11A的抗性降低1000倍,而Cyt1A与Cry4、Cry11A混合使用则能完全抑制五带淡色库蚊抗性系对Cry4和Cry11A的抗性。五带淡色库蚊经以色列亚种晶体蛋白(含有Cyt1Aa蛋白)选择28代后,抗性仅提高3倍；但若所用为不含Cyt1Aa的晶体蛋白,则其抗性将提高90～900倍。以色列亚种从应用于杀蚊虫以来，至今尚未发现有明显的抗性发生，其中Cyt1Aa蛋白起着关键作用。

[0007] 正是由于Cyt蛋白独特的抗蚊幼虫作用，以及其增强Cry蛋白毒力、降低或延缓Cry蛋白抗性的特性，使得它将在Cry蛋白抗性的长期治理中充当重要角色，寻找新的cyt基因资源对我国的生物防治有着十分重要的意义。

[0008] 本发明的第一个目的在于提供一种新的Bt毒力蛋白Cyt3Aa1。

[0009] 本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。

[0010] 本发明的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。

[0011] 本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）新菌株TD516。该菌株已于2009年01月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），保藏号为CGMCC No.2859。

[0012] 通过对TD516的毒力测试表明，TD516对双翅目害虫具有极高的毒力。根据cyt3类基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在cyt3类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cyt3Aa1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长为777bp，析表明，GC含量为32.56%，编码258个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt3Aa1。Cyt3Aa1蛋白的氨基酸组成如表1。该蛋白的活性中心位于（2）区段。

[0013] 表1Cyt3Aa1蛋白的氨基酸组成

[0014]氨基酸 百分比/% 氨基酸 百分比/%
Ala(A): 3.88 Met(M): 0.78
Cys(C): 1.94 Asn(N): 7.36
Asp(D): 3.88 Pro(P): 5.81
Glu(E): 2.71 Gln(Q): 4.26
Phe(F): 6.89 Arg(R): 4.26
Gly(G): 5.04 Ser(S): 6.98
His(H): 2.71 Thr(T): 6.59
Ile(I): 6.20 Val(V): 6.20
Lys(K): 8.53 Trp(W): 0.39
Leu(L): 10.47 Tyr(Y): 5.04

[0015] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cyt3Aa1的氨基酸序列（SEQ ID No.2），在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第16位的Asn替换为Ala，将第25位的Pro替换为Ser，将第49位的Val缺失，将第60位增加一个Gln或增加Ala，不影响其活性。因此，本发明的Bt蛋白Cyt3Aa1还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与Bt蛋白Cyt3Aa1同等活性的由Cyt3Aa1衍生得到的蛋白质。

[0016] 本发明基因包括编码所述蛋白Cyt3Aa1的核苷酸序列。

[0017] 本发明提供了编码上述Bt蛋白Cyt3Aa1的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

[0018] 此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

[0019] 本发明的基因和蛋白质可以从菌株TD516中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

[0020] 可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如点击法、基因枪法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cyt3Aa1基因的转化体，例如鱼腥藻等水生生物，使其具备抗虫活性。

[0021] 在本发明的一个实施例中，Bt蛋白Cyt3Aa1重组表达载体的获得是通过将cyt3Aa1基因插入到表达载体pET-32a(+)上构建得到重组表达载体pET-3Aa。

[0022] 此外，还可以通过发酵本发明菌株TD516，得到含有Cyt3Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。因此本发明提供了Bt蛋白Cyt3Aa1或其编码基因cyt3Aa1或含有该基因的重组表达载体在制备杀虫剂中的应用。

[0023] 本发明提供了Bt蛋白Cyt3Aa1或其编码基因cyt3Aa1或含有该基因的重组表达载体在制备转基因水生生物（如鱼腥藻属）中的应用。

[0024] 本领域技术人员还可以根据本发明公开的cyt3Aa1基因，将其转化水生生物（如鱼腥藻属），使其具备相应的抗虫活性。

[0025] 本发明提供Cyt3Aa1蛋白是一种新的Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因水生植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道，因此，本发明的Bt蛋白Cyt3Aa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于防治蚊幼虫。

[0026] 图1是cyt3Aa1基因的PCR扩增结果电泳图，其中M.DNA marker，1.cyt3Aa1基因；

[0027] 图2是重组质粒PET-3Aa的酶切鉴定图，1.重组质粒pET-3Aa，2.Kpn I+Sal I双酶切pET-32a，3.Kpn I+Sal I双酶切pET-3Aa，4.插入的DNA，M.DNA marker；

[0028] 图3是cyt3Aa1基因在E.coli BL21(DE3)中的SDS-PAGE检测，其中M.蛋白marker；1.空载体(pET-32a)在E.coii BL21(DE3)中的表达，2.裂解液上清，3.包涵体中的Cyt3Aa1蛋白。

[0029] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0030] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0031] 实施例1cyt3Aa1基因的克隆

[0032] 本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌新菌株TD516，该菌株已于2009年01月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），保藏号为CGMCC No.2859。

[0033] 通过如下方法克隆得到cyt3Aa1基因的全长序列。

[0034] 采用基因组DNA纯化试剂盒（购自赛百盛公司）提取菌株TD516的总DNA。并设计引物序列如下：

[0035] P1：5’ATGTATACTAAAAATTTTAGTAAG3’

[0036] P2：5’TTACGAAAACTTTAAATTATGAAT3’

[0037] 25μl PCR反应体系：

[0038] 10×buffer 2.5μl

[0039] MgCl2(25mM) 1.5μl

[0040] Taq酶 0.2μl

[0041] dNTPs(2.5mM) 2μl

[0042] 上游引物P1 1μl

[0043] 下游引物P2 1μl

[0044] 模板 5μl

[0045] 双蒸水 11.8μl

[0046] 热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，45℃退火50s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。扩增反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为800bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列大小一致。

[0047] 实施例2Cyt3Aa1蛋白的获得

[0048] 根据Cyt3Aa1基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物：cry3F:5'-CGGGGTACCATGTATACTAAAAATTTTAGTAAG-3cry3R:5'-CGCGTCGACTTACGAAAACTTTAAATTATGAAT-3',5’端引物下划线部分碱基分别为Kpn I和Sal I酶切位点。以TD516质粒DNA为模板进行扩增，扩增的产物采用Kpn I和Sal I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-32a(+)连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，将重组质粒命名为pET-3Aa。重组质粒的酶切电泳验证插入片断大小符合目的片段后（图2）再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(3Aa)。然后转接阳性转化子于LB培养基中，在210r/min、37℃培养条件下，当OD600值为0.6时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达20h。
SDS-PAGE分析表明cyt3Aa1基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中（图3），分子量约为30kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。

[0049] 实施例3Cyt3Aa1蛋白的抗虫作用

[0050] 用实施例2获得的Cyt3Aa1蛋白分别对棉铃虫、暗黑鳃金龟、华北大黑鳃金龟、伊蚊进行杀虫活性测定。

[0051] 对鳞翅目害虫：将实施例2中获得的Cyt3Aa1蛋白配制成从1μg/ml到100ng/ml2
的6个不同浓度，选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm大小，分放在不同浓度Cyt3Aa1蛋白液中浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡的叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫30头；每处理重复3次，置室内，于3d后观察幼虫死亡情况，用SPSS10.0软件计算LC50。

[0052] 对鞘翅目害虫：将实施例2中获得的Cyt3Aa1蛋白配制成0.1，4，8，16，32，64μg/mL等6个不同的浓度梯度。然后将稀释液加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以5-7日龄暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟作为供试虫主，每个处理组放置虫30头，重复3次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7d、14d后检查死虫数，用SPSS10.0软件计算LC50。

[0053] 对双翅目害虫：将实施例2中获得的Cyt3Aa1蛋白配制成0.1，4，8，16，32，64μg/mL等6个不同的浓度梯度，然后每个处理投入20头伊蚊幼虫，每处理3次重复，清水为空白对照；12h后统计伊蚊幼虫死亡情况，LC50用SPSS10.0软件分析。

[0054] 结果表明：Cyt3Aa1蛋白对棉铃虫、暗黑鳃金龟华北大黑鳃金龟基本无杀虫活性，而对伊蚊幼虫的杀灭活性最好，LC50为3.25μg/mL。