[0001] 本发明大体上涉及包含高效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis  subsp.kurstaki)菌株和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subsp.aizawai)菌株的农业制剂，其中苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种的重量比率为约20:80到约80:20。本发明还涉及使用本发明的制剂防治作物害虫的方法和制备本制剂的方法。

[0002] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是天然土壤细菌。许多苏云金芽孢杆菌菌株在芽孢形成期间产生称为δ-内毒素的晶体蛋白质，所述蛋白质可被用作生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和鲇泽亚种产生在摄入后数分钟内使一些鳞翅目幼虫的消化系统麻痹的晶体。幼虫最终死于饥饿。

[0003] 使用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和鲇泽亚种的一个优点在于它们对人和环境安全。由于苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和鲇泽亚种是靶特异性杀虫剂，因此它们不危害人或非靶标昆虫。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和鲇泽亚种还可用于即将收获前的作物。这向对于害虫防治有很少选择的有机种植者提供了安全且有效的方式来管理可能最终毁坏整个作物的虫害。

[0004] 最近，发现了苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的高效力菌株。该菌株2546提供比其他菌株至少两倍量的δ-内毒素。

[0005] 鳞翅目(Lepidoptera)是包含蛾或蝴蝶的昆虫目。估计存在超过174,000个鳞翅目种，包含在估计的126个科中。鳞翅目种在它们的生命周期期间经历完全变态。成体交配并产卵。从卵中出现的幼虫具有圆柱形身体和咀嚼式口器。幼虫经历称为龄期的若干生长阶段直到它们达到它们的末龄期并随后化蛹。鳞翅目然后作为成体蝴蝶或蛾出现。

[0006] 尽管一些鳞翅目种由于它们的美学吸引力而通常被认为是有益生物体，但许多种会引起对作物的毁灭性破坏。可能由于无法循环(rotate)化学防治程序，因此已有鳞翅目种产生对常用杀虫剂的抗性的报道。因此，需要用于鳞翅目害虫防治的安全且有效的制剂。这些制剂应当容易施加，具有增加的功效、降低的增加抗性率的风险并且有成本效益。

[0007] 在一个方面，本发明涉及包含约10％w/w到约40％w/w苏云金芽孢杆菌发酵固体、芽孢和杀虫毒素以及约60％w/w到约90％w/w稀释剂的农业制剂，其中所述发酵固体、芽孢和杀虫毒素来源于高效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株，并且苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素的重量比率为约20:80到约80:20。

[0008] 在另一方面，本发明涉及使用本发明的制剂防治作物害虫的方法。

[0009] 在再一方面，本发明涉及制备本发明的制剂的方法。

[0010] 申请人意外地设计了用于有效作物植物害虫防治的新制剂。使用高效力菌株对于制剂的成功来说至关重要，因为如果使用低效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株，则在与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种组合后，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种毒素被过度稀释而不能实现目标作物植物害虫的期望的高杀灭率。

[0011] 此外，申请人的制剂包含稀释剂和提供优异功效率的特定范围的总苏云金芽孢杆菌。申请人没有预料到本发明的制剂将提供许多作物植物种的优良杀灭率。本发明的制剂还对已产生对常用杀虫剂如氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)的抗性的害虫有效。

[0012] 申请人的制剂提供了比单独使用两种苏云金芽孢杆菌菌株中任一种可获得的范围更宽范围的作物害虫的防护。苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种各自含有不同的毒素谱。通过将两种菌株的毒素和芽孢组合成单一产物的新颖方法，申请人能够实现对更宽范围的鳞翅目幼虫的高功效。

[0013] 本发明的另一优点在于苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种和苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的组合遵照综合害虫管理(IPM)原理。通过组合不同的毒素和宽范围的毒素，昆虫不大可能能够显性表达克服所有毒素的突变。

[0014] 本发明的再一优点在于它需要向植物施加更少的总苏云金芽孢杆菌。种植者不需要转用替代的生物合成杀虫剂，从而为种植者节省了显著的成本。

[0015] 本发明的制剂的又一优点在于苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种是靶特异性的。这意指着本发明的方法将不会损害人和其他非靶标生物体，如靶标害虫的天然捕食者。

[0016] 在一个实施方案中，本发明涉及包含约10％w/w到约40％w/w苏云金芽孢杆菌发酵固体、芽孢和杀虫毒素以及约60％w/w到约90％w/w稀释剂的农业制剂，其中所述发酵固体、芽孢和杀虫毒素来源于高效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株，并且苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素的重量比率为约20:80到约80:20。

[0017] 在一个优选的实施方案中，高效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株选自由ABTS-351、VBTS-2528和VBTS-2546组成的组。在一个更优选的实施方案中，高效力苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株为VBTS-2546。

[0018] 如本文所用的“高效力”苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌株是指具有至少7500IU/mg的收获醪(beer)效力或至少28,000IU/mg的浓缩浆效力的菌株。含有δ-内毒素(也被称为Cry毒素)芽孢、协同可溶性代谢物和可溶性蛋白质的发酵液体中的固体百分比可在约7％wt/wt到20％wt/wt范围，这取决于如何回收或浓缩发酵收获物。

[0019] 在另一优选的实施方案中，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素的重量比率为约30:70到约70:30。在一个更优选的实施方案中，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种的比率为约55:45到约65:35。在一个最优选实施方案中，比率为约60:40。

[0020] 在另一实施方案中，所述制剂含有多种δ-内毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry 1D和Cry 2Aa。

[0021] 在再一实施方案中，所述制剂中苏云金芽孢杆菌发酵固体、芽孢和杀虫毒素的总量为约15％w/w到约35％w/w。在一个优选的实施方案中，所述制剂中苏云金芽孢杆菌发酵固体、芽孢和杀虫毒素的总量为约23％w/w到约29％w/w。

[0022] 在另一实施方案中，所述制剂含有约65％w/w到约80％w/w稀释剂。在一个优选的实施方案中，所述制剂含有约63％w/w到约70％w/w稀释剂。

[0023] 适合的稀释剂尤其包括玉米油、大豆油、棉子油、介花油、棕榈油、甲基化种子油、石蜡油、异链烷烃、油混合物和二醇。一种优选的稀释剂为石蜡油。

[0024] 在又一实施方案中，所述制剂含有流变添加剂。在一个优选的实施方案中，所述制剂含有约0.5％w/w到约2.5％w/w流变添加剂。在一个更优选的实施方案中，所述制剂含有约1％w/w到约2％w/w流变添加剂。在一个甚至更优选的实施方案中，所述制剂含有约1.2％w/w到约1.8％w/w流变添加剂。

[0025] 适合的流变添加剂尤其包括亲有机性锂蒙脱石粘土、改性蒙脱石粘土、改性膨润土粘土和蓖麻油衍生物(氢化和/或有机改性的)。一种优选的流变添加剂为改性蒙脱石粘土。

[0026] 在再一实施方案中，所述制剂含有至少一种乳化剂。在一个优选的实施方案中，所述制剂含有约2％w/w到约9％w/w至少一种乳化剂。在一个更优选的实施方案中，所述制剂含有约4％w/w到约7％w/w至少一种乳化剂。在一个甚至更优选的实施方案中，所述制剂含有约5％w/w到约6％w/w至少一种乳化剂。

[0027] 适合的乳化剂包括非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂和其他聚合表面活性剂或它们的混合物。优选地，乳化剂是非离子型的，因为它易溶于优选的稀释剂中，有助于稳定悬浮液，容易形成稳定的乳液，并且对作物无植物毒性。优选的乳化剂包括多元醇脂肪酸酯和其聚乙氧基化衍生物以及聚山梨醇酯20。

[0028] 在另一实施方案中，35％w/w到约50％w/w的总发酵固体、芽孢和杀虫毒素为苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。在一个优选的实施方案中，38％w/w到约42％w/w的总发酵固体、芽孢和杀虫毒素为苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。

[0029] 在又一实施方案中，55％w/w到约65％w/w的总发酵固体、芽孢和杀虫毒素为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。在一个优选的实施方案中，58％w/w到约62％w/w的总发酵固体、芽孢和杀虫毒素为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。

[0030] 在另一实施方案中,本发明涉及用于防治鳞翅目幼虫的方法，其包括向作物植物施加本发明的制剂。所述制剂优选适于用水或油稀释施加。本发明的制剂还可单独施加或与常用的杀虫剂如氯虫苯甲酰胺、氰虫酰胺和赐诺杀(多杀菌素A和多杀菌素D的混合物)组合施加。

[0031] 在一个优选的实施方案中，每公顷施加约5到约600克组合的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。在一个更优选的实施方案中，每公顷施加约10到约350克组合的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。在一个最优选的实施方案中，每公顷施加约25到约300克组合的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素。

[0032] 尽管在一些实施方案中，苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种和苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的比率以克/公顷、IU/mg和DBMU/mg或斜纹夜蛾属(Spodoptera)U/mg表示，但本发明并不限于这些测量效力的方法。如果其他产品以其他效力测量值开发或销售，则基于申请人在本文的教导将所述比率转化为与本文的本发明的一致的有效量，以实现对靶标作物植物害虫的协同防治在本领域技术人员的知识范围内。

[0033] 此外，本发明并不限于特定类型的制剂。例如，在本文的实施例中，可乳化悬浮液被用作苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克/苏云金芽孢杆菌鲇泽的来源。然而，可使用其他类型的制剂，包括但不限于可润湿粉末制剂、水可分散颗粒、干式可流动颗粒和其他递送系统。

[0034] 适合的苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌株包括但不限于VBTS-1857、GB413、GC-91以及重组、接合转移(transconjugate)和改良的菌株。

[0035] 本发明的制剂可用于防治许多不同的作物害虫。下表列出了适于用本发明的制剂加以防治的若干靶标作物害虫。

[0036]

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[0040]

[0041]

[0042] 在又一实施方案中，本发明涉及用于防治作物植物害虫的方法，其包括向作物植物施加本发明的制剂，其中所述作物植物选自由以下组成的组：根菜和块茎菜(root and tuber vegetable)、球茎类蔬菜(bulb vegetable)、非芸苔属叶类蔬菜(leafy non-brassica vegetable)、芸苔属叶类蔬菜(leafy brassica vegetable)、多汁豆类或干豆类、果菜类、葫芦科蔬菜、柑橘类水果、仁果类水果、核果、浆果和小果、树生坚果、谷物(cereal grain)、牧草和饲料草和干草、非草类动物饲料(non-grass animal feed)、药草(herb)、香料、花卉、花坛植物、观赏用花、朝鲜蓟、天门冬属植物、咖啡、棉花、热带/亚热带水果作物、蛇麻草、暗绿叶黄体芋、花生、石榴、油料种子作物、树和灌木、甘蔗、烟草、草地和水田芥。

[0043] 在另一实施方案中，作物植物经遗传修饰。“遗传修饰的”作物植物是特定基因已被去除、修饰或具有天然或外源DNA的额外基因拷贝者。作物植物DNA的变化可能导致作物植物产生的RNA、蛋白质和/或其他分子的类型或量的变化，这可能影响其对非生物(例如除草剂)或生物(例如昆虫)胁迫的应答的和/或影响其生长、发育或产率。

[0044] 在一个优选的实施方案中，根菜和块茎菜选自由以下组成的组：秘鲁胡萝卜(arracacha)、竹芋、甘露子(Chinese artichoke)、洋姜(Jerusalem artichoke)、菜用甜菜(garden beet)、糖用甜菜(sugar beet)、牛蒡(edible burdock)、姜芋(edible canna)、胡萝卜、苦木薯、甜木薯、块根芹(celeriac)、根佛手瓜(root chayote)、香菜芹(turnip-rooted chervil)、菊苣、油莎草(chufa)、芋头(dasheen,taro)、生姜、人参、辣根、食用蓝花蕉(leren)、根用香芹菜(turnip-rooted parsley)、欧洲防风草(parsnip)、马铃薯(potato)、萝卜(radish)、白萝卜(oriental radish)、芜菁甘蓝(rutabaga)、婆罗门参(salsify)、黑婆罗门参(black salsify)、西班牙婆罗门参、泽芹(skirret)、甘薯、芋类(tanier)、姜黄、芜菁、豆薯、真正山药(true yam)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0045] 在另一优选的实施方案中，球茎类蔬菜选自由以下组成的组：新鲜细香葱叶、新鲜韭菜叶、球茎黄花菜(bulb daylily)、优雅玉簪(elegans Hosta)、球茎贝母(bulb fritillaria)、贝母叶、球茎大蒜、大头球茎大蒜、蛇形球茎大蒜(serpent bulb garlic)、近似韭葱的作物(kurrat)、垂花葱(lady's leek)、韭葱、野韭菜(wild leek)、球茎百合(bulb lily)、贝兹维尔大葱(Beltsville bunching onion)、球茎洋葱(bulb onion)、中华球茎洋葱(Chinese bulb onion)、新鲜洋葱、绿洋葱、薤白(macrostem onion)、珍珠洋葱(pearl onion)、马铃薯球茎洋葱、马铃薯球茎、珠芽圆葱顶部(tree onion top)、大葱顶部(Welsh onion top)、球茎胡葱(bulb shallot)、新鲜胡葱叶以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0046] 在又一实施方案中，非芸苔属叶类蔬菜选自由以下组成的组：苋菜(Chinese spinach Amaranth)、叶类苋菜(leafy Amaranth)、芝麻菜(arugula)(roquette)、刺菜蓟(cardoon)、芹菜、唐芹(Chinese celery)、芹莴(celtuce)、香叶芹、食用叶菊(edible-leaved chrysanthemum)、茼蒿(garland chrysanthemum)、野苣(corn salad)、独行菜(garden cress)、山芥(upland cress)、蒲公英、蒲公英叶、酸模(sorrel,dock)、菊苣(endive,escarole)、甘茴香(Florence fennel)、结球莴苣(head lettuce)、散叶莴苣(leaf lettuce)、滨藜属植物(orach)、欧芹、花园马齿苋(garden purslane)、冬马齿苋(winter purslane)、红菊苣(radicchio,red chicory)、大黄、菠菜、番杏(New Zealand spinach)、落葵(vine spinach)、牛皮菜(Swiss chard)、三色苋以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0047] 在另一实施方案中，芸苔属叶类蔬菜选自由以下组成的组：西兰花(broccoli)、芥兰(Chinese broccoli,gai lon)、球花甘蓝(broccoli raab,rapini)、抱子甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、结球白菜(Chinese cabbage,bok choy)、大白菜(Chinese napa cabbage)、芥菜(Chinese mustard cabbage,gai choy)、花椰菜(broccoli)、卡瓦卢花椰菜(cavalo broccoli)、羽衣甘蓝(collard)、无头甘蓝(kale)、苤蓝(kohlrabi)、日本芜菁(mizuna)、芥菜叶(mustard greens)、芥末菠菜(mustard spinach)、油菜(rape greens)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0048] 在再一实施方案中，多汁菜豆类或干菜豆类选自由以下组成的组：羽扇豆属豆(Lupinus bean)、菜豆属豆(Phaseolus bean)、豇豆属豆(Vigna bean)、蚕豆(broad bean,fava)、鹰嘴豆(chickpea,garbanzo)、瓜尔豆(guar)、刀豆(jackbean)、扁豆属豆(lablab bean)、小扁豆(lentil)、豌豆属豌豆(Pisum pea)、木豆(pigeon pea)、大豆、未成熟种子大豆(immature seed soybean)、刀豆(sword bean)、花生以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，羽扇豆属豆包括谷物羽扇豆(grain lupin)、甜羽扇豆、白羽扇豆、白甜羽扇豆和其杂交种。在另一优选的实施方案中，菜豆属豆包括菜豆(field bean)、芸豆(kidney bean)、利马豆(lima bean)、海军豆(navy bean)、斑豆(pinto bean)、红花菜豆(runner bean)、食荚菜豆(snap bean)、宽叶菜豆(tepary bean)、蜡豆和其杂交种。在再一优选的实施方案中，豇豆属豆包括赤豆(adzuki bean)、长豇豆(asparagus bean)、黑眼豆(blackeyed bean)、短豇豆(catjang)、中华长豇豆(Chinese longbean)、豇豆荚(cowpea)、克罗德豌豆(Crowder pea)、乌头叶菜豆(moth bean)、绿豆、赤小豆、八月豆(southern pea)、印度黑小豆(urid bean)、裙带豆(yardlong bean)和其杂交种。在另一实施方案中，豌豆属豌豆包括低矮型豌豆(dwarf pea)、可食荚豌豆(edible-podded pea)、菜豌豆(English pea)、紫花豌豆(field pea)、菜用豌豆(garden pea)、青豌豆(green pea)、糖荚豌豆(snow pea)、蜜豆(sugar snap pea)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0049] 在又一实施方案中，果菜类选自由以下组成的组：灌木番茄、可可娜(cocona)、醋栗番茄、花园越橘(garden huckleberry)、枸杞果(goji berry)、地樱桃(groundcherry)、角胡麻属(martynia)、奎东茄(naranjilla)、秋葵、小茄(pea eggplant)、茄瓜、胡椒、非灯笼椒(non-bell pepper)、玫瑰茄(roselle)、司考特番茄田玫瑰茄(Scout tomato fields roselle)、茄子、全绿叶茄(scarlet eggplant)、非洲茄(African eggplant)、阳光浆果(sunberry)、粘果酸浆(tomatillo)、蕃茄、树番茄以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，胡椒包括灯笼椒、红辣椒、烹饪用胡椒、西班牙甘椒(pimento)、甜椒以及其栽培变种、品种和杂交种。

[0050] 在一个实施方案中，葫芦科蔬菜选自由以下组成的组：佛手瓜、佛手瓜果(Chayote fruit)、冬瓜(waxgourd,Chinese preserving melon)、枸橼西瓜(citron melon)、黄瓜、小黄瓜、可食用葫芦(edible gourd)、苦瓜属种(Momordica species)、香瓜(muskmelon)、南瓜、夏南瓜、冬南瓜、西瓜以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，可食用葫芦包括瓢箪(hyotan)、cucuzza、丝瓜(hechima,Chinese okra)和其杂交种。在另一优选的实施方案中，苦瓜属蔬菜包括胶苦瓜(balsam apple)、凉瓜(balsam pear)、苦瓜、中华黄瓜(Chinese cucumber)和其杂交种。在另一优选的实施方案中，甜瓜包括真哈蜜瓜(true cantaloupe)、哈蜜瓜、卡萨巴甜瓜(casaba)、克兰省甜瓜(crenshaw melon)、黄金培肖瓜(golden pershaw melon)、白兰瓜(honeydew melon)、蜜球(honey ball)、柑瓜、波斯甜瓜(Persian melon)、菠萝甜瓜(pineapple melon)、圣诞老人甜瓜(Santa Claus melon)、蛇甜瓜和其杂交种。在再一优选的实施方案中，夏南瓜包括弯颈南瓜、扁圆南瓜、直颈南瓜、菜瓜(vegetable marrow)、绿皮西葫芦(zucchini)和其杂交种。在又一优选的实施方案中，冬南瓜包括胡桃南瓜(butternut squash)、瓶葫瓜(calabaza)、笋瓜(hubbard squash)、橡实形南瓜(acorn squash)、鱼翅瓜(spaghetti squash)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0051] 在另一实施方案中，柑橘类水果选自由以下组成的组：酸橙(lime)、四季橘(calamondin)、枸橼、葡萄柚、日本夏葡萄柚(Japanese summer grapefruit)、金橘(kumquat)、柠檬、地中海柑橘(Mediterranean mandarin)、酸橙、甜橙、绿果矮椰(pummel)、温州蜜柑(Satsuma mandarin)、立花橘(tachibana orange)、橘柚、蜜柑(mandarin tangerine)、桔柑(tangor)、枸橘(trifoliate orange)、丑橘(uniq fruit)以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，酸橙选自由以下组成的组：澳洲沙漠酸橙(Australian desert lime)、澳洲指橘(Australian finger lime)、澳洲圆酸橙(Australian round lime)、布朗河指橘(Brown River finger lime)、怀特山酸橙(mount white lime)、新几内亚野生酸橙(New Guinea wild lime)、甜酸橙(sweet lime)、罗素河酸橙(Russell River lime)、塔希提酸橙(Tahiti lime)和其杂交种。

[0052] 在一个实施方案中，仁果类水果选自由以下组成的组：苹果、南欧山楂果(azarole)、沙果、枇杷、夏花山楂(mayhaw)、枸杞(medlar)、梨、沙梨、温柏、木瓜(Chinese quince)、日本海棠(Japanese quince)、墨西哥山楂(tejocote)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0053] 在另一实施方案中，核果选自由以下组成的组：杏、甜樱桃、酸樱桃(tart cherry)、油桃、桃、李子(plum)、奇克索李(Chicksaw plum)、乌制子李(Damson plum)、日本李(Japanese plum)、李杏、鲜西梅(fresh prune)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0054] 在又一实施方案中，浆果和小果选自由以下组成的组：阿穆尔河葡萄(Amur river grape)、阿萝尼亚果(aronia berry)、月桂果(bayberry)、熊果、越橘(bilberry)、黑莓、蓝莓、低灌木蓝莓(lowbush blueberry)、高灌木蓝莓(highbush blueberry)、香醋栗(buffalo currant)、水牛莓(buffaloberry)、Che、智利番石榴(Chilean guava)、稠梨(chokecherry)、云莓(cloudberry)、酸果蔓(cranberry)、高灌木酸果蔓(highbush cranberry)、黑醋栗(black currant)、红醋栗(red currant)、接骨木果(elderberry)、欧洲小檗果(European barberry)、鹅莓(gooseberry)、葡萄、可食用金银花、越橘果、杂交醋栗(jostaberry)、唐棣属植物的果实(Juneberry)(萨斯卡通莓(Saskatoon berry))、红豆越橘(lingonberry)、粉色西蕃莲(maypop)、山胡椒浆果(mountain pepper berries)、桑椹(mulberry)、鸸鹋苹果(muntries)、土生醋栗(native  currant)、蔓虎刺浆果(partridgeberry)、捕鱼木果(phalsa)、针樱桃、黑覆盆子(black raspberry)、红覆盆子(red raspberry)、小阔叶番樱桃(riberry)、沙龙白珠树果(salal)、五味子果(schisandra berry)、沙棘果(sea buckthorn)、花楸树果(serviceberry)、草莓、野生覆盆子(wild raspberry)以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，黑莓包括安第斯黑莓(Andean blackberry)、北极黑莓(arctic blackberry)、蔓藤类浆果(bingleberry)、black satin berry、波森莓(boysenberry)、欧洲黑莓(brombeere)、加州黑莓(California blackberry)、圣洁莓(Chesterberry)、切罗基黑莓(Cherokee blackberry)、夏安黑莓(Cheyenne blackberry)、普通黑莓(common blackberry)、科瑞莓(coryberry)、达罗莓(darrowberry)、露莓(dewberry)、德克森无刺莓(Dirksen thornless berry)、常青黑莓(evergreen blackberry)、喜马拉雅莓(Himalayaberry)、赫尔莓(hullberry)、拉瓦卡莓(lavacaberry)、罗甘莓(loganberry)、低灌莓(lowberry)、卢克丽拉莓(Lucreliaberry)、巨大黑莓(mammoth blackberry)、紫蓝莓(marionberry)、莫拉莓(mora)、牟礼德龙斯莓(mures deronce)、耐克特莓(nectarberry)、北方露莓(Northern dewberry)、奥拉里莓(olallieberry)、俄勒冈常绿莓(Oregon evergreen berry)、变色莓(phenomenalberry)、阮杰莓(rangeberry)、乌黑莓(ravenberry)、罗斯莓(rossberry)、肖尼黑莓(Shawnee blackberry)、南方露莓(Southern dewberry)、泰莓(tayberry)、杨氏草莓(youngberry)、萨尔萨莫拉莓(zarzamora)和其杂交种。

[0055] 在另一实施方案中，树生坚果选自由以下组成的组：杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果(Brazil nut)、灰胡桃、腰果(cashew)、栗子(chestnut)、矮栗(chinquapin)、榛子(hazelnut,filbert)、山胡桃果(hickory nut)、夏威夷坚果(macadamia nut)、美洲山核桃(pecan)、阿月浑子(pistachio)、黑胡桃(black walnut)、英国核桃(English walnut)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0056] 在又一实施方案中，谷物选自由以下组成的组：大麦、荞麦、珍珠粟(pearl millet)、黍(proso millet)、燕麦、玉米、非甜质玉米(field corn)、甜玉米、种用玉米(seed corn)、爆玉米(popcorn)、大米、裸麦、蜀黍属(sorghum,milo)、蜀黍属种、粒用高粱(grain sorghum)、苏丹草(Sudangrass)(种子)、墨西哥类蜀黍(teosinte)、黑小麦、小麦、菰(wild rice)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0057] 在再一实施方案中，牧草、饲料草和干草选自由以下草组成的组：除甘蔗以及包含在谷物组中的那些种以外的禾本科成员、牧场和牧区草以及生长用于干草或青贮料的草。在其他实施方案中，禾本科草可以是青草或调制草。

[0058] 在一个实施方案中，非草类动物饲料选自由以下组成的组：苜蓿(alfalfa)、绒毛豆、车轴草(trifolium clover)、草木犀属三叶草(melilotus clover)、野葛、胡枝子属植物(lespedeza)、羽扇豆、红豆草(sainfoin)、车轴草、巢菜(vetch)、小冠花(crown vetch)、紫云英(milk vetch)以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0059] 在另一实施方案中，药草和香料选自由以下组成的组：多香果、当归(angelica)、大茴香、茴香籽、八角茴芹、胭脂树子(annatto seed)、脂草、罗勒(basil)、琉璃苣、地榆(burnet)、甘菊、续随子蕾(caper bud)、香旱芹(caraway)、黑页蒿(black caraway)、小豆蔻、肉桂、桂蕾(cassia bud)、猫薄荷、芹菜籽(celery seed)、香叶芹、细香葱、韭菜、肉桂、南欧丹参(clary)、丁香花蕾(clove bud)、胡荽叶(coriander leaf)、胡荽籽(coriander seed)、艾菊、刺芹叶(culantro leaves)、刺芹籽(culantro seed)、芫荽叶(cilantro leaves)、芫荽籽(cilantro seed)、小茴香子、莳萝叶、莳萝子、茴香(fennel)、小茴香(common fennel)、结球茴香籽(Florence fennel seed)、胡芦巴、乐园子(grains of paradise)、苦薄荷、海索草(hyssop)、杜松子(juniper berry)、熏衣草、芸香草、拉维纪草叶(leaf lovage)、拉维纪草籽(seed lovage)、豆蔻香料(mace)、金盏花、马郁兰、薄荷、芥菜子、旱金莲、肉豆蔻、欧芹、薄荷油(pennyroyal)、黑胡椒、白胡椒、罂粟籽、迷迭香、芸香(rue)、藏红花、鼠尾草、夏香薄荷(summer savory)、冬香薄荷(winter savory)、月桂(sweet bay)、艾菊、龙艾(tarragon)、百里香、香草、冬青(wintergreen)、车叶草、苦艾以及其栽培品种、变种和杂交种。在一个优选的实施方案中，薄荷选自由留兰香、胡椒薄荷和其杂交种组成的组。

[0060] 在再一实施方案中，洋蓟选自由甘露子、洋姜以及其栽培品种、变种和杂交种组成的组。

[0061] 在一个实施方案中，亚热带/热带水果选自由以下组成的组：番荔枝(anonna)、鳄梨(avocado)、毛茸茸奇异果(fuzzy kiwifruit)、硬头奇异果(hardy kiwifruit)、香蕉、车前草、黄金果(caimito)、杨桃(carambola,star fruit)、番石榴、龙眼、人心果(sapodilla)、番木瓜(papaya)、西潘莲果(passion fruit)、芒果、荔枝、木菠萝(jackfruit)、火龙果(dragon fruit)、曼蜜果(mamey sapote)、椰子、毛叶番荔枝(cherimoya)、蛋黄果(canistrel)、孟思特果(monster)、蜡莲雾(wax jambu)、石榴、红毛丹果(rambutan)、山荔枝(pulasan)、巴基斯坦桑椹(Pakistani mulberry)、兰萨果(langsat)、尖不辣果(chempedak)、榴莲、无花果菠萝(fig pineapple)、拟爱神木果(jaboticaba)、山苹果(mountain apple)、香蕉、番石榴、菠萝以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0062] 在又一实施方案中，油料种子植物选自由以下组成的组：琉璃苣、金盏花、蓖麻油植物、乌桕、棉籽、海甘蓝、萼距花属(cuphea)、蓝蓟属(echium)、大戟属(euphorbia)、月见草、亚麻籽(flax seed)、亚麻荠(gold of pleasure)、兔穗(hare’s ear)、芥菜或油料油菜子(oil rapeseed)、西蒙德木(jojoba)、雷克斯勒属(lesquerella)、缎花属(lunaria)、白芒花(meadowfoam)、马利筋(milkweed)、黑芝麻(niger seed)、油萝卜(oil radish)、罂粟籽(poppy seed)、玫瑰果(rosehip)、芝麻、玻璃菊(stokes aster)、萝卜花(sweet rocket)、西门木(tallowwood)、茶油植物、斑鸠菊(vermonia)、芸苔或油料油菜籽、红花、向日葵以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0063] 在另一实施方案中，树和灌木选自由以下组成的组：森林树木、绿荫树和糖槭以及其栽培品种、变种和杂交种。

[0064] 可向种子、叶子或植物欲生长的区域施加本发明的制剂。

[0065] 在一个替代实施方案中，向储存的农产品施加本发明的制剂。储存的产品包括但不限于谷物、大豆、向日葵籽、作物种子、调味种子、香料、药草、鸟食和爆玉米(popcorn)。

[0066] 本发明的制剂可在未稀释(不搀水)的情况下或在施加前用水或油稀释到期望的浓度的情况下被施加。

[0067] 本发明的制剂还可包含其他佐剂。适合的佐剂可尤其包括防腐剂、表面活性剂、分散剂、粘合剂、聚合物、pH调节剂、防飘移剂(drift control agent)、UV保护剂、着色剂、微囊化剂(microencapsulating agent)、糖、淀粉、自由流动剂、粘土、营养素、润湿剂、植物生长调节剂或刺激剂、取食刺激剂、具有杀虫或杀真菌或杀螨性质或系统获得性抗性(SAR)的其他天然、天然来源或合成的化合物。组分的选择和其待选择的浓度可取决于制剂类型、最终使用的稀释、施加方法(空中或地面)、作物和作物害虫复杂性、待使用的罐混物(tank-mix)、稳定性要求、处理成本以及许多其他要求而变化。

[0068] 所述制剂可进一步含有添加剂，例如，用于改善的耐雨性、UV保护、改善的热稳定性、防飘移性质和取食刺激剂的添加剂。

[0069] 在再一实施方案中，向作物植物施加本发明的制剂与另一农业活性成分。其他活性剂可以是例如杀真菌剂、杀虫剂、杀螨剂、植物生长调节剂或植物生长刺激剂。

[0070] 在一个优选的实施方案中，向作物植物施加本发明的制剂与至少一种邻氨基苯甲二酰胺(anthranilic diamide)杀虫剂。优选的邻氨基苯甲二酰胺为氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺(flubendiamide)。

[0071] 氯虫苯甲酰胺为邻氨基苯甲二酰胺。氯虫苯甲酰胺对人和哺乳动物具有低毒性。此外，它在低使用率下有效。与苏云金芽孢杆菌一样，为了有效，氯虫苯甲酰胺必须被幼虫食用。氯虫苯甲酰胺迫使幼虫内的肌肉释放它们储存的所有钙，使幼虫停止食用并最终死亡。

[0072] 在另一实施方案中，向作物植物施加本发明的制剂与杀卵剂。在一个优选的实施方案中，杀卵剂为thiacarb。

[0073] 另外的活性成分可与苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和杀虫毒素一起配制。另外的活性成分还可与本发明的制剂罐式混合。或者，另外的活性成分可单独但同时与所述制剂施用或其施用与本发明的施用轮流。

[0074] 在一个优选的实施方案中，当幼虫幼小(早期龄)并且活跃进食时并且更重要的是在已超过损坏的经济阈值之前，施加本发明的制剂。

[0075] 在再一实施方案中，每季向作物植物施加本发明的制剂至少一次。在优选的实施方案中，取决于害虫压力、作物生长和环境条件如紧随施加后的降雨，制剂每季被施加1到7次。在一个更优选的实施方案中，所述制剂每季施加约3次。本发明的制剂可通过地面、空中设备或用大量水或足以提供受侵染植物部分的充分覆盖的其他载体进行喷灌来施加。

[0076] 不管每季的施加次数如何，总比率都应当不超过由环境保护局(environmental protection agencies)所确定的每年最大比率或相关标签率(label rate)。

[0077] 在又一实施方案中，本发明涉及用于生产本发明的制剂的方法。所述方法包括在优化的生长培养基和生长条件下单独地发酵苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的高效力菌株和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种的菌株，以特定比率的效力或含有苏云金芽孢杆菌晶体毒素、芽孢、协同代谢物和营养期杀虫蛋白质的固体保存并组合发酵浆，喷雾干燥所组合的发酵浆以获得工业级活性成分，对其进行加工，表征其物理和生物性质并将其配制成各种产物形式，其中优选可乳化悬浮液浓缩物和水可分散颗粒。所组合的浆还可直接用分散剂、稳定剂、表面活性剂和稀释剂配制并且在半连续或流体床造粒机中喷雾干燥造粒以获得干式可流动或可润湿的颗粒制剂。在一个替代实施方案中，发酵醪可通过本领域技术人员已知的方法浓缩，如例如通过离心、蒸发、微滤或超滤或通过两种或更多种回收方法的组合浓缩。

[0078] 如本文所用的“植物”是指至少一株植物，而不是植物群体。

[0079] 如本文所用的，当指代苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽的比率时，所述比率包括苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种的发酵固体、芽孢和杀虫毒素的wt％相比于苏云金芽孢杆菌鲇泽的发酵固体、芽孢和杀虫毒素的wt％。

[0080] 如本文所用的“防治(control)”或“防治(controlling)”意指幼虫对植物的损害量下降、害虫群体减少、干扰生命周期发育或产生植物保护的其他生理学或行为效果。

[0081] 如本文所用的，与量、重量百分比等有关的所有数值均被定义为“约”或“大约”每个特定值，加或减10％。例如，短语“至少5.0重量％”应被理解为“至少4.5重量％到5.5重量％”。因此，权利要求书的范围涵盖所要求保护的值的10％内的量。

[0082] 所公开的实施方案仅仅是本文所公开的的发明构思的示例性实施方案并且不应被认为是限制性的，除非这样说明。

[0083] 以下实施例意在说明本发明和教导本领域普通技术人员如何制备和使用本发明。它们并不意在以任何方式进行限制。

[0084] 实施例

[0085] 在以下实施例中，使用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克菌株VBTS-2546作为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种来源。

[0086] 在以下实施例中，使用苏云金芽孢杆菌鲇泽菌株ABTS-1857(可得自Valent BioSciences公司)作为苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种来源。

[0087] 在以下实施例中，使用Sunspray 6N(可得自R.E.Carroll公司和其他)石蜡农业喷雾油(轻质石蜡石油馏出物)作为稀释剂来源。

[0088] 在以下实施例中，使用 38(可得自Elementis  Specialties公司，Bentone是Elementis Specialties公司的注册商标)蒙脱石粘土(改性流变添加剂)作为流变添加剂来源。

[0089] 在以下实施例中，使用AtplusTM 300FA(可得自Croda Crop Care)乳化剂(由多元醇脂肪酸酯和其聚乙氧基化衍生物构成)作为乳化剂来源。

[0090] 在以下实施例中，使用聚山梨醇酯20或Tween 20(可得自Croda Crop Care)表面活性剂作为乳化剂来源。

[0091] 实施例1

[0092] 本发明的制剂制备如下。将苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种单独发酵。然后将发酵浆以苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽的期望发酵固体比率60:40在混合罐中组合。接下来，将浆喷雾干燥并筛分以获得工业级活性成分。

[0093] 在带有混合器的罐中，使用一部分稀释剂、流变添加剂和乳化剂制备凝胶浓缩物。在带有混合器的单独的罐中，首先装入稀释剂石蜡农业喷雾油，之后装入凝胶浓缩物、活性成分，然后装入剩余的乳化剂。混合制剂直到均匀。然后筛分制剂以去除直径高于约100微米的粒子。该制剂的示例在下表1中。稀释剂、流变添加剂和乳化剂的量将取决于苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽的浓度而变化，所述浓度将取决于发酵浆的效力而变化。

[0094] 表1：可乳化悬浮液浓缩物制剂

[0095]

[0096]

[0097] 实施例2

[0098] 制剂的效力

[0099] 利用在约25％wt/wt到约28％wt/wt变化的量的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种制备另外6批本发明的制剂。然后测试这些制剂对粉纹夜蛾、小菜蛾和甜菜夜蛾的效力和LC50值。这些研究的结果汇总于下表2、3和4中。

[0100] 表2：制剂对粉纹夜蛾(Cabbage Looper)的效力和LC50值

[0101]

[0102] 表3：制剂对小菜蛾的效力和LC50值

[0103]

[0104] 注意：Bta参考标准：LC50＝1.25ug/mL(CL＝0.922–1.56)；效力＝60,805DBM U/mg。

[0105] 表3：制剂对甜菜夜蛾的LC50值

[0106]

[0107] 注意：Bta参考标准：LC50＝27.8ug/mL(CL＝24.6–31.4)

[0108] 如表3中所见，本发明的制剂具有如针对标准粉纹夜蛾所确定的超过17,590IU/mg的效力。对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和小菜蛾的LC50比率全部显示如申请人所配制的0.6:0.4苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克:苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种的协同重量比率产生对所有三种害虫的高杀灭率。这些结果是出乎意料的，因为其他比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克:苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种无法提供优越的结果。

[0109] 实施例3

[0110] 制剂的毒素含量

[0111] 使用离子交换HPLC使用本领域技术人员已知的标准技术(参考文献参见美国专利号5,523,211)来分析本发明的制剂。总之，将苏云金芽孢杆菌的伴胞晶体溶解、分离并定量以确定存在于本发明制剂中的毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C和Cry 1D的水平。如下表4中所见，所述研究显示Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C和Cry 1D的明确毒素峰。

[0112] 表4.制剂的离子交换HPLC分析

[0113]

[0114] 如通过该研究所确认的，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种表达毒素Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac。苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种表达毒素Cry1C、Cry1D、Cry1Aa和Cry1Ab。如表4中所见，本发明的制剂含有由苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽表达的毒素。

[0115] 实施例4罐混物

[0116] 如上文所示，本发明的制剂可与其他活性成分在罐混物中混合或与其他活性物一起配制。表5示出了这些提议的罐混物中的一些。本发明并不限于这些实施例。

[0117] 表5.示例性Btk/Bta(60:40)罐混物

[0118]

[0119]

[0120] 0.11到0.29升 SC(含有39％氟虫双酰胺的悬浮液浓缩物)(可得自Bayer)[0121] 实施例5

[0122] 进行研究以确定协同重量比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种将对具有对常用杀虫剂氯虫苯甲酰胺的已知抗性的昆虫种具有的作用。PrevathonTM(可得自DuPontTM)是氯虫苯甲酰胺的5％悬浮液浓缩物并且在以下两项研究中被用作氯虫苯甲酰胺来源。SympaticoTM可乳化悬浮液浓缩物(可得自Valent BioSciencesTM
公司)被用作苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种和苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克的来源。Sympatico含有约60:40重量比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种发酵固体、芽孢和毒素与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种发酵固体、芽孢和毒素。在地块上种植卷心菜并且被已知抗氯虫苯甲酰胺的小菜蛾(Plutella xylostella)和甘蓝薄翅螟蛾(Crocidolomia pavonana)群体自然感染。

[0123] 表6

[0124]

[0125] 如表6中所见，协同重量比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种提供显著的产率增益。未处理对照和氯虫苯甲酰胺处理的地块分别仅具有46.2和67.0kg/地块的产率，而苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克/苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种处理的地块具有至少89.9kg/地块的产率。该研究确认苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克/苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种协同混合物在防治已对氯虫苯甲酰胺产生抗性的幼虫方面有效。

[0126] 实施例7

[0127] 进行另一研究以确定协同重量比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种和苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种将对具有对常用杀虫剂氯虫苯甲酰胺的已知抗性的昆虫种具有的作用。

[0128] 表7

[0129]

[0130] 如表7中所见，协同重量比率的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种与苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种提供显著的产率增益。此外，本发明的制剂与氯虫苯甲酰胺的混合物在增加产率方面尤其有效。