一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法

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一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法
申请号	CN201810296904.1	申请日	2018-03-29	公开(公告)号	CN110320169A	公开(公告)日	2019-10-11
申请人	南京农业大学;			发明人	许媛媛; 苗晋锋; 张源淑;
摘要	一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。该方法具有高灵敏度，低成本，快速、易操作等特点，可实现样品中氧四环素的灵敏测定。
权利要求	1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面；当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。 2.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，将20μL 10μM APTOTC和20μL 10μM CPOTC加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为 7.0的10mM PBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰好的SDB重悬于50μL pH值为7.0的10mM PBS溶液中。 3.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面，将100μL的AuNPs与4μL 10μM的HPOTC、40μL 10μM的SPOTC以及356μL pH值为7.0的10mM PBS混合，37℃孵育1h后，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs。 4.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求2中CPOTC/APTOTC修饰的SDB 4μL、4μL不同浓度的OTC和2μL含0.1M NaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育 1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HPOTC/SPOTC修饰的AuNPs于 37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。 5.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是利用 370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品在370nm处的紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测，将上述权利要求4中形成的SDB-AuNPs体系中加入0.5μL SAv-HRP于37℃下孵育1h，用200μL pH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL TMB-H2O2溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度。检测一系列标准浓度的氧四环素的紫外吸光度，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得氧四环素的牛奶样品替代上述一系列标准浓度的氧四环素，得到牛奶样品的紫外吸光度，通过标准曲线可计算出实际牛奶中氧四环素的浓度。
说明书全文	一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法技术领域 [0001] 本发明是一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，特别是牛奶中氧四环素残留的检测方法，属于分析化学领域。背景技术 [0002] 氧四环素是一种四环素类广谱抗生素和生长促进剂，常常被用作饲料添加剂，由于氧四环素的不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，极易残留在牛奶和动物组织中，长期食用必然会危及人类的健康。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对牛奶中氧四环素的残留都做出了严格的规定，控制氧四环素的使用。 [0003] 磁珠分离技术与其他分离技术(如色谱分离，离心分离和膜分离)相比具有高通量，低成本，快速和简化操作的显着优点。金纳米颗粒(AuNPs)因其独特的物理和化学性质，被广泛用于信号放大的纳米材料之一。可在其表面偶联其他许多功能分子，成功保持其原有生物特性的同时，拥有更好的稳定性。通过DNA探针修饰磁珠识别抗生素和AuNPs信号放大可建立一种超灵敏建立高效，实用的、简便、快速、灵敏检测氧四环素的方法。 [0004] 目前抗生素分析的方法包括ELISA，色谱，质谱，毛细管电泳，SERS，表面等离子体共振(SPR)和电化学生物传感器学。这些方法中的大多数都有一定的缺陷，繁琐的样本预处理程序、免疫化学方法的试剂昂贵、检测时间长、复杂的仪器。因此，利用磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势建立一种专一性强、操作简便、快速、灵敏的氧四环素检测方法显得尤为重要。发明内容 [0005] 本发明的目的是将磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，极高灵敏度的应用于实际样品中氧四环素浓度的检测方法。 [0006] 本发明的技术方案：一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，首先将氧四环素适体(APTOTC)与生物素标记的探针CPOTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SPOTC和HPOTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APTOTC的特异性结合并使APTOTC脱离SDB，紧接着CPOTC则与AuNPs修饰的HPOTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SPOTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H2O2溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度的关系，测定一系列标准浓度的氧四环素所得的紫外吸光度的大小，绘制标准曲线，即可实现实际样品中氧四环素含量的灵敏检测。 [0007] 方法包括以下步骤：磁珠的预处理、探针修饰SDB的制备、金纳米颗粒的制备、探针修饰AuNPs的制备、样品孵育，紫外分光光度计检测。 [0008] (1)磁珠的预处理 [0009] 取10mg/mL的链霉亲和素偶联的磁珠(SDB)原液于EP管中，加入含有1mM EDTA，2M NaCl的10mM Tris-HCl(pH 7.5)洗涤磁珠3次，最后用10mM PBS(pH 7.0)重悬SDB，得到2mg/mL干净磁珠备用。 [0010] (2)探针修饰SDB的制备 [0011] 将20μL 10μM APTOTC和20μL 10μM CPOTC加入到210μL含0.3M NaCl，10mM PBS(pH 7.0)溶液中，得到总体积250μL的混合液，将该混合液于90℃加热2min后缓慢降至室温。在 250μL的混合液加入上述(1)中预处理的50μL磁珠溶液混匀，在37℃孵育90min，用10mM PBS(pH 7.0)洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CPOTC/APTOTC修饰好的SDB重悬于 50μL 10mM PBS(pH 7.0)中得到50μL 2mg/mL CPOTC/APTOTC修饰的SDB。 [0012] 上述APTOTC的序列为：5′-CGT ACG GAA TTC GCT AGC GGG CGG GGG TGC TGG GGG AAT GGA GTG CTG CGT GCT GCG GGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3′上述CPOTC的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TCA CGT GGA GCT CGG ATC CCC GCA GCA CGC AGC ACT CCA TTC CCC CAG CAC CCC CGC CCG CTA GCGAAT TCC GTA CG-3′[0013] (3)金纳米颗粒的制备 [0014] 制备所需的所有玻璃器皿必须在新配置王水(HNO3∶HCl＝3∶1)中浸泡30min后，用大量的双蒸水洗涤并在烘烤箱中烘干备用。金纳米颗粒的制备过程如下：配制100mL0.01％的氯金酸加入三颈瓶中，搅拌并加热至沸腾。待其煮沸后，在剧烈搅拌下迅速加入3.5mL 1％的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后待溶液变成酒红色关闭加热器，继续搅拌30min，关闭搅拌器，待溶液冷却至室温后，将制备好的金纳米颗粒(AuNPs)存放于棕色试剂瓶中并放置在4℃冰箱保存。 [0015] (4)探针修饰AuNPs的制备 [0016] 将100μL上述(3)中制备的AuNPs与4μL 10μM的HPOTC、40μL 10μM的SPOTC以及356μL pH值为7.0的10mM PBS制成500μL混合液。将该混合液于37℃孵育1h后，12000rpm，4℃离心20min，弃上清485μL后，加485μL 10mM PBS(pH 7.0)重悬(重复离心洗涤3次)，得到总体积为500μL修饰SPOTC/HPOTC的金纳米颗粒。 [0017] 上述HPOTC的序列为：5′-SH-AAA AAA CGT ACG GAA TTC-3′上述SPOTC的序列为：5′-Biotin-ATA TAT ATA TCA CGT GGA GCT CGG AAA AAA A-SH- 3′ [0018] (5)样品孵育 [0019] 将上述(2)中制备的2mg/mL CPOTC/APTOTC修饰的SDB 4μL与4μL不同浓度的OTC和2μL含0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.4)制成混合液，将该混合液于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗3次，加入12.5μL上述(4)中制备的SPOTC/HPOTC修饰的金纳米颗粒于37℃孵育1h后，用100μL 10mM PBS(pH 7.0)清洗3次，用10mM PBS(pH 7.0)重悬。 [0020] (6)紫外分光光度计检测 [0021] 向上述(5)中溶液加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)于37℃孵育1h，用200μL 10mM PBS(pH 6.0)清洗5次，加600μL TMB-H2O2溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度。 [0022] 氧四环素的浓度在10-6至105pg/mL时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，在370nm处的吸光度随着氧四环素浓度的升高而增加，370nm处紫外吸光度与氧四环素的浓度存在良好线形关系，符合定量要求。 [0023] 本发明的有益效果：①本方法利用磁珠的快速分离、AuNPs介导的信号放大和选择性生物比色传感器的优势，实现了牛奶中氧四环素的检测，灵敏度极高，对牛奶中氧四环素宽范围线性内定量、灵敏检测具有重要意义；②在方法学上具有普遍借鉴意义，通过替换探针DNA序列，就可设计出多种抗生素检测的高灵敏度成本低，操作方便，无需繁琐的程序分析方法。附图说明 [0024] 图1为一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法的原理图 [0025] 图2为一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法的专一性图 [0026] 图3为不同浓度的氧四环素存在下，紫外吸光度与氧四环素的浓度关系图具体实施方式 [0027] 实施例1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法专一性的测定 [0028] 在最佳实验条件下，进行了体系专一性验证。将上述方法步骤(2)中制备的CPOTC/APTOTC修饰的SDB 4μL与4μL不同种类的抗生素和2μL含0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.4)制成混合液于37℃孵育1h，10mM PBS(pH 7.0)清洗3次后加入12.5μL上述步骤(4)中SPOTC/HPOTC修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗并重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)于37℃孵育1h，用200μL 10mM PBS(pH 6.0)清洗5次，加600μL TMB-H2O2溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度，测得的结果如图2A，2B所示，该检测方法对氧四环素有很好的选择性。 [0029] 实施例2.不同浓度氧四环素存在下，紫外吸光度与氧四环素的浓度标准曲线的测定 [0030] 将上述方法步骤(2)中制备的CPOTC/APTOTC修饰的SDB 4μL与4μL不同浓度的抗生素和2μL含0.1M NaCl的10mM PBS(pH 7.4)制成混合液于37℃孵育1h，10mM PBS(pH 7.0)清洗3次后加入12.5μL上述步骤(4)中SPOTC/HPOTC修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用10mM PBS(pH 7.0)清洗并重悬，加入0.5μL的SAv-HRP(0.01mg/mL)于37℃孵育1h，用200μL 10mM PBS(pH 6.0)清洗5次，加600μL TMB-H2O2溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度，检测的结果如图3A-C所示，当添加10-6至105pg/mL的氧四环素时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，在370nm处的紫外吸光度(Abs370nm)与氧四环素浓度显示出良好的线性关系，两者符合Abs370nm＝0.0845logcOTC+0.6718(R2＝0.997)，其中Abs代表吸光度值，c代表OTC(Pg/mL)的浓度。 [0031] 往牛奶中添加标准浓度氧四环素制备人工污染牛奶的方法获得氧四环素的牛奶样品替代上述不同浓度的氧四环素标准溶液，实验结果(表1)所示，证明了该体系具有实际的操作性，很好的可信度和重复性。 [0032] 表1.牛奶样品实测结果