一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用

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一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用
申请号	CN202111115813.1	申请日	2021-09-23	公开(公告)号	CN113832117A	公开(公告)日	2021-12-24
申请人	盐城师范学院;			发明人	朱德伟; 康贻军; 印志峰; 沈敏; 夏丹;
摘要	本发明提供了一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用，属于生物工程技术领域。来源于保藏编号CGMCCNo.14393的克雷伯氏菌，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2所示。本发明采用基因工程的方法将上述编码基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用Histrap1mL亲和柱进行纯化得到酶液；利用该酶液(200U)对氧四环素样品(初始浓度为20mmol/L)进行处理，其降解效率可达75.3％。该酶制剂具有成本低、周期短、操作简便等特点，有望应用到环境中四环素类抗生素的生物降解中。
权利要求	1.一种四环素类抗生素降解酶，其特征在于，来源于保藏编号CGMCC No.14393的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.TR5)，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2所示。 2.编码权利要求1所述的四环素类抗生素降解酶的基因，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1。 3.一种表达权利要求1所述的四环素类抗生素降解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：以从克雷伯氏菌菌液中提取其质粒DNA为模板，以SEQ ID No.3表示的引物1和SEQ ID No.4表示的引物2扩增目的基因；将目的基因连接入pET28(a+)表达载体后，转化至宿主细胞BL21(DE3)中，发酵重组宿主细胞，使目的基因获得表达，即得所述四环素类抗生素降解酶。 4.根据权利要求3所述的表达四环素类抗生素降解酶的方法，其特征在于，所述引物1和引物2分别带有EcoRI和XhoI两种酶的酶切位点。 5.根据权利要求3所述的表达四环素类抗生素降解酶的方法，其特征在于，在发酵重组宿主细胞过程中，利用0.025mmol/L的IPTG诱导表达12h；将其发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用Histrap1mL亲和柱进行纯化。 6.一种包含权利要求1所述的四环素类抗生素降解酶的酶制剂。 7.一种权利要求6所述的酶制剂在降解四环素类抗生素中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酶制剂用于降解氧四环素。
说明书全文	一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用技术领域 [0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用。背景技术 [0002] 四环素类抗生素可抑制肠道细菌繁殖，促进牲畜生长，是一类被广泛使用的饲料添加剂。然而，由于缺乏完善的监管，我国四环素类抗生素的滥用情况严重，2013年的使用量为12000吨。四环素类抗生素不能被动物完全吸收，部分会随粪便排出。如未经无害化处理直接施入农田，会导致残留的四环素在土壤中累积。随雨水进入河流系统，再通过食物链进入到人体，人类和动物体内持续的抗生素选择压力基因一旦被激活，耐药性的传播风险就会增加，从而对人类健康安全构成潜在危胁。因此，如何降解环境中的四环素类抗生素已经成为焦点问题。而微生物降解是成本最低且应用前景广阔的一种方法，其本质是酶制剂对四环素类抗生素的降解。本发明提供了一种微生物体内产生的可降解四环素类抗生素的酶制剂。发明内容 [0003] 本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种降解氧四环素的酶及其编码基因和应用，该酶降解基因明确，安全性更高，对环境中四环素类抗生素的降解具有优良的作用。 [0004] 本发明第一个目的是提供一种四环素类抗生素降解酶，来源于保藏编号CGMCC No.14393的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.TR5)，其氨基酸序列为：SEQ ID No.2所示。 [0005] 本发明第二个目的是提供编码所述的四环素类抗生素降解酶的基因，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1。 [0006] 本发明第三个目的是提供一种表达所述的四环素类抗生素降解酶的方法，包括以下步骤： [0007] 以从克雷伯氏菌菌液中提取其质粒DNA为模板，以SEQ ID No.3表示的引物1和SEQ ID No.4表示的引物2扩增目的基因； [0008] 将目的基因连接入pET28(a+)表达载体后，转化至宿主细胞BL21(DE3)中，发酵重组宿主细胞，使目的基因获得表达，即得所述四环素类抗生素降解酶。 [0009] 优选的，所述引物1和引物2分别带有EcoRI和XhoI两种酶的酶切位点。 [0010] 优选的，在发酵重组宿主细胞过程中，利用0.025mmol/L的IPTG诱导表达12h；将其发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用Histrap1mL亲和柱进行纯化。 [0011] 本发明第四个目的是提供一种包含所述的四环素类抗生素降解酶的酶制剂。 [0012] 本发明第五个目的是提供一种所述的酶制剂在降解四环素类抗生素中的应用。 [0013] 优选的，所述酶制剂用于降解氧四环素。 [0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0015] 本发明提供的四环素类抗生素降解酶，相对于克雷伯氏菌降解四环素来说，该酶降解基因明确，安全性更高，对环境中四环素类抗生素的降解具有优良的作用。 [0016] 本发明采用基因工程的方法将克雷伯氏菌中编码该酶制剂的基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达：具体是件设计引物扩增出该目的基因，利用EcoRI和XhoI进行双酶切，并与pET28(a+)进行连接，将上述载体导入BL21(DE3)感受态细胞中，利用 0.025mmol/L的IPTG诱导表达12h。将其发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用 Histrap1mL亲和柱进行纯化得到酶液，按照(200U)浓度添加至含(20mmol/L)浓度氧四环素的样品中进行降解，设对照组(含空载体的工程菌发酵液)，其降解效率为75.3％。该酶制剂具有成本低、周期短、操作简便等特点，有望应用到环境中四环素类抗生素的生物降解中。附图说明 [0017] 图1为本发明提供的酶制剂纯化的SDS‑PAGE图。具体实施方式 [0018] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。 [0019] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。 [0020] 本发明采用的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.TR5)已于2017年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14393，保藏地址为：中国北京；该克雷伯氏菌已在专利号为CN201711212339.8的中国专利已公开。 [0021] 所用的引物1和引物2来自无锡晟杰生物科技有限公司。 [0022] 实施例1 [0023] 一种四环素类抗生素降解酶的表达方法，包括以下步骤： [0024] 挑取克雷伯氏菌单菌落，接种至含LB培养基30mL的三角瓶中，37℃振荡培养过夜。采用质粒抽提试剂盒，按照质粒抽提试剂盒说明书从上述菌液中提取其质粒DNA为模板，以 SEQ ID No.3表示的引物1和SEQ ID No.4表示的引物2的引导下扩增目的基因； [0025] 其中， [0026] 引物1：5’‑CCGGAATTCATGAAATCACGCGCAGCAGT‑3’(下划线为EcoRI酶切位点，基因序列为SEQ ID No.3)， [0027] 引物2：5’‑CGGCTCGAGGTAATGAATGACTGTGCGGATG‑3’(下划线为XhoI酶切位点，基因序列为SEQ ID No.4)； [0028] 从上述质粒DNA中扩增出该目的基因，获得目的基因后，对该目的基因进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列，相应的氨基酸序列为SEQ IDNo.2。 [0029] 随后将目的基因利用EcoRI和XhoI进行双酶切，连接入pET28(a+)表达载体后，将上述载体转化至宿主细胞BL21(DE3)中，利用0.025mmol/L的IPTG诱导表达12h；将其发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用Histrap1mL亲和柱进行纯化得到酶液，即得四环素类抗生素降解酶。 [0030] 为了说明本发明提供的四环素类抗生素降解酶相关性能，则对实施例1提供的相关样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)测试分析；见图1所示，其中图 1中，泳道0为空白；1为对照；2为破碎液上清；3为亲和色谱分离后样品；从图1中可知，目标基因成功在大肠杆菌中进行了表达，其分子量约为3.9KDa。 [0031] 实施例2 [0032] 一种四环素类抗生素降解酶制剂，包括实施例1提供的四环素类抗生素降解酶；酶制剂是将实施例1提供的四环素类抗生素降解酶用pH7.5的Tris‑HCl溶液溶解而制得。 [0033] 为了说明本发明提供的四环素类抗生素降解酶制剂的降解性能，将实施例2提供的酶制剂按照200U浓度添加至含20mmol/L浓度氧四环素的样品中进行降解，并监测在不同降解时长下的降解率，见表1所示，其中设对照组为含空载体的工程菌发酵液。 [0034] 表1实施例2提供的酶制剂对氧四环素的降解率 [0035] 0h 6h 12h 18h 24h 对照 0 0.5％ 1.1％ 1.8％ 2.2％实验 0 25.2％ 48.5％ 64.1％ 75.3％ [0036] 从表1中可知，本发明提供的酶制剂对氧四环素降解效率最高可达为75.3％。 [0037] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 [0038] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。