[0001] 本发明涉及一种生物技术领域的冠菌素诱导大豆体内次级代谢产物的方法，具体是冠菌素处理大豆叶片可以诱导大豆体内的次级代谢产物发生变化的方法。

[0002] 冠菌素是由假单胞菌(Pseudomonas syringae)分泌的非寄主专一性的植物毒素，在自然界中仅仅有七个病原菌小种可以分泌冠菌素。COR由两部分组成，一部分为α-氨基酸的冠烷酸(Coronamic Acid,CMA)，另外一部分是聚酮结构的冠菌酸(Coronafacic Acid，CFA)，两部分通过酰胺健联接而成。COR因其CFA结构部分模拟植物激素茉莉酸(JAs)，和茉莉酸有类似的生理功能已被报道。冠菌素存在剂量效应，通常低浓度的冠菌素施用到农作物上，可以提高农作物在非生物逆境下的抗性。科学家试图把冠菌素作为一种潜在的提高农作物抗性的植物生长调节剂来使用。然而，其中涉及到冠菌素如何调控寄主体内的次级代谢产物机制仍然不清楚，主要原因是冠菌素在细菌体内合成和调控途径复杂，且在不同的寄主体内，冠菌素调控的次级代谢产物并不相同，这些均给研究冠菌素的功能带来一定的困难。大豆(Soybean Glycine max(L.)Merr.)是我国最重要的五谷作物之一，大豆可以用于食品、食用油、饲料等，同时还可用于生物燃油生产。大豆具有丰富的营养价值，民间诉有“七颗大豆的营养价值等于一颗鸡蛋”；“可一日无肉，不可一日无豆”等都充分说明了大豆的营养价值之高。我国大豆资源从南到北都非常丰富，中国是世界第四大豆生产国，但同时也是世界上最大的大豆进口国。然而，大豆在生长发育过程中，由于受到各种病虫害的影响，导致产量和品质严重下降。比如，大豆胞囊线虫病是大豆种植期常见的线虫病害气温、土壤条件等多种条件都可以导致这种病害的发生。这种病害可以导致大豆大面积减产，而且在世界各大豆类种植区都有发生。每年可造成全世界的大豆生产约30亿美元的损失。为了控制病害，施用各种化学农药已成为农民不得已的手段。大豆体内次级代谢产物丰富，我们通过利用冠菌素与大豆的互作，揭示冠菌素诱导的抗性与大豆体内哪些次级代谢产物有关，希望以此为基础，从大豆体内提取提高大豆抗性的次级代谢产物，通过体外施用后，增加大豆抗性，提高大豆的产量和品种。

[0003] 本发明被公布之前，未有任何与本专利申请中所提及的内容有相关专利或文献报道。

[0004] 本发明的目的是在于突破现有技术的局限，提供一种运用冠菌素处理诱导大豆体内次级代谢产物发生变化的方法，使其有效的改变了大豆体内部分代谢产物的含量，并且无需高昂的前期投入，操作简便，未来有很强的实用性。

[0005] 本发明通过以下技术方案实现，首先将大豆种子播种于土壤中发芽生长，待三周左右对大豆叶片注射浓度为0.3μM的冠菌素，并且注射去离子水作为对照，待24小时候取样。样品处理通过气相-质谱上样分析样品间的次级代谢产物变化，明确冠菌素诱导大豆体内次级代谢产物含量的变化。

[0006] 所述的栽培大豆用的土壤，就是普通种植植物所用土壤。

[0007] 所述的大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)。

[0008] 所述的冠菌素是从上海西格玛奥德里奇公司购买，溶于乙醇后配成3μM的母液。用去离子水稀释到工作液浓度。然后用1毫升除去针头的注射器(从淘宝网上购买)注射大豆叶片，注射到叶片饱和为止。

[0009] 本发明的原理在于冠菌素可以模拟植物激素茉莉酸的结构，且冠菌素和茉莉酸在植物体内具有相同的受体。茉莉酸可以调控植物体内次级代谢产物的变化，因此冠菌素也具有类似功能，可以调控植物体内次级代谢产物的变化。我们通过对大豆叶片注射一定浓度的冠菌素，发现通过外源施用冠菌素，改变了大豆体内次级代谢产物的变化，涉及到的生物代谢途径主要有:卟啉和叶绿素代谢途径、α-亚麻酸代谢途径，倍半萜类和三萜系化合物生物合成途径、双萜类生物合成、姜醇类生物合成，泛酸酯和乙酰辅酶A生物合成途径。其中，涉及到的代谢产物列表如下表1所示。

[0010] 本发明建立了通过体外注射一定浓度的冠菌素处理大豆叶片，可以有效的改变大豆体内次级代谢产物的含量(具体代谢产物参考表1)，利用本发明提供的信息，对未来通过利用这些代谢产物提高大豆抗性育种具有重要意义。

[0011] 图1为外源施用冠菌素后大豆次级代谢产物的质谱图

[0012] a去离子水 b.外源注射0.3μM冠菌素到大豆叶片,24h后取样检测侵染叶片大豆次级代谢产物的变化。其中X轴为上样时间，Y轴为大豆次级代谢产物的相对含量百分比。

[0013] 具体实施方法

[0014] 下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0015] 实施例1

[0016] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天24度，晚上16度，光照条件16小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.3μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。如图1显示，这是冠菌素处理大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物图谱发生的变化。

[0017] 经过质谱代谢分析，我们发现在施用冠菌素后，涉及到大豆体内的卟啉和叶绿素代谢途径、α-亚麻酸代谢途径，倍半萜类和三萜系化合物生物合成途径等多条生物途径发生变化。其中，涉及到的代谢产物列表如下表1所示。

[0018]

[0019] 表1中左边为代谢途径名称，右边为冠菌素处理影响大豆体内的次级代谢产物名称。可见，冠菌素处理大豆叶片后，大豆体内的次级代谢产物途径受到影响。

[0020] α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA，十八碳9,12,15-三烯酸)是有三个双键的多元不饱和脂肪酸(C18H30O2)，是一种ω-3必需脂肪酸。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质，α-亚麻酸及其衍生的长链多不饱和脂肪酸是所有细胞膜和线粒体膜的重要成分，膜磷脂中脂肪酸的组成成分直接影响膜的功能，如酶的催化反应、受体活性、跨膜运转、代谢率等。而酸酯和乙酰辅酶A生物合成途径是生物中最重要的能量代谢途径。本发明表明，冠菌素影响这些途径，说明冠菌素可能通过干扰大豆体内的能量代谢途径改变大豆体内次级代谢产物含量。我们的发明还表明，冠菌素可能与粪卟啉原代谢中的coproporphyrin III和coproporphyrin I相关(如表1)。在有氧条件下，粪卟啉原Ⅲ经脱羧、脱氢、氧化形成原卟啉Ⅸ，原卟啉Ⅸ是形成叶绿素和亚铁血红素的分水岭。如果与铁结合，就生成亚铁血红素；若与镁结合，则形成Mg-原卟啉Ⅸ。Mg-原卟啉Ⅸ的一个羧基被甲基酯化，在原卟啉Ⅸ上形成第五个环，接着B环上的-CH2＝CH2侧链还原为-CH2-CH3，即形成原叶绿酸酯。原叶绿酸酯经光还原变为叶绿酸酯a，然后与叶醇结合形成叶绿素a。叶绿素b是由叶绿素a转化而成的。冠菌素可能通过抑制coproporphyrin III和coproporphyrin I合成，从而影响叶绿素的合成，影响植物的光合作用。赤霉素，是影响植物生长和发育的一类重要激素，化学结构属于较大的萜类化合物家族，由四环骨架衍生而得。赤霉素最突出的作用是加速细胞的伸长(赤霉素可以提高植物体内生长素的含量，而生长素直接调节细胞的伸长)，对细胞的分裂也有促进作用，它可以促进细胞的扩大。赤霉素在农业生产上起着重要的作用。应用本发明发现，冠菌素可能通过影响大豆体内赤霉素信号来影响大豆体内的赤霉素含量。

[0021] 实施例2

[0022] 将大豆种子种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天25度，晚上14度，光照条件20小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.5μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0023] 实施例3

[0024] 将大豆种子种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天20度，晚上12度，光照条件10小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.4μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0025] 实施例4

[0026] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天25度，晚上15度，光照条件30小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.5μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0027] 实施例5

[0028] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天30度，晚上11度，光照条件16小时。每周浇水一次。植株长至5个星期左右，用0.5μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0029] 实施例6

[0030] 将大豆种子种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天20度，晚上10度，光照条件10小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.5μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0031] 实施例7

[0032] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天24度，晚上14度，光照条件10小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.3μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0033] 实施例8

[0034] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天22度，晚上16度，光照条件15小时。每周浇水一次。植株长至5个星期左右，用0.4μM的冠菌素注射到大豆第四片和第五片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0035] 实施例9

[0036] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天24度，晚上24度，光照条件16小时。每周浇水一次。植株长至3个星期左右，用0.5μM的冠菌素注射到大豆第四片和第五片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。

[0037] 实施例10

[0038] 将大豆种子Glycine max(L.)Merrill cv Williams 82(从南京农业大学大豆种质资源研究中心获得)种植于土壤中，每个直径为10cm的花盆种3棵大豆苗。把种有大豆的花盆放置于植物培养箱中培养，培养箱温度为白天24度，晚上16度，光照条件16小时。每周浇水一次。植株长至5个星期左右，用0.3μM的冠菌素注射到大豆第三片和第四片叶子，同时用注射去离子水作为对照，24小时后收集样品。样品处理后，跑LC-MS(液相-质谱)，监测冠菌素诱导大豆叶片后，大豆体内次级代谢产物的变化。