[0001] 本发明涉及一种内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的5个化合物抗凝血活性的应用，属于生物制药技术领域。

[0002] 血栓栓塞性疾病的防治问题一直是近年来的研究热点。血栓形成，即局部血液凝块形成，是导致心肌梗死和中风等动脉疾病以及静脉血栓栓塞性疾病发生和患者死亡的主
要原因。而药物治疗在防治过程中起着重要的作用[王秀,夏泉.抗凝血药物临床应用的现
状及研究进展. 安徽医药,2011,15(10):1189‑1192.]。抗凝治疗是治疗血栓性疾病的基
础，其原理是通过影响凝血因子，从而阻止血液凝固过程的药物，临床主要用于血栓栓塞性
疾病的预防与治疗。抗凝血类药物主要分为四大类，分别为肝素类、维生素K拮抗剂类、Xa因
子抑制剂类和直接凝血酶抑制剂类[王山立.高粱根抗凝血活性物质基础研究.贵州大学,
2020.]。但市面上有些药物会带来严重甚至致死性的出血风险。此外，因药动学的个体差异
性大且易受到饮食的影响，药物相互作用又很复杂，故在临床实践中难以最优剂量用药
[Rashid MA，Parker MJ.Anticoagulation management in hip fracture patients on 
warfarin.Int J Care Injured，2005，36:1311－5.]。据文献报道川芎哚及类似物具有一
定的黄嘌呤氧化酶抑制活性[周继慧,闫鑫磊,田梦,等.内生真菌Paraconiothyrium 
brasiliense代谢产物β‑咔啉生物碱及其黄嘌呤氧化酶抑制活性研究.天然产物研究与开
发,2021,33(01):41‑47.]，而黄嘌呤氧化酶能够引起心力衰竭、心肌梗死、高血压等一系列
心血管疾病。鉴于市场机会较大和现有药物各有缺陷，制药公司对抗凝血药物研究与开发
的关注和投入已明显加大。这也将成为抗凝药物发展的必然趋势。

[0003] 本发明公开了一种蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的5个化合物抗凝血方面的应用。经鉴定这5个化合物分别为川芎哚(化合物1)、1‑(1',2'‑dideoxy‑α‑
D‑ribopyra nosyl)‑β‑carboline(化合物2)、1‑acetyl‑β‑carboline(化合物3)、4‑(9H‑β‑
carbolin‑1‑yl)‑4‑ox obutyric acid(化合物4)、1‑(Furan‑2‑yl)‑9H‑pyrido[3,4‑b]
indole(化合物5)，其中化合物2、化合物3和化合物4均为川芎哚类似物。实验结果显示前4
个化合物对抗凝血活性有显著的抑制作用，它们的半数抑制浓度分别为7.11ug/ml、
13.11ug/ml、13.59ug/ml和2.23ug/ml，明显优于阳性药水蛭素，可用于开发为治疗凝血药
物。因此本发明提供的4个化合物具有抗凝血活性的临床应用潜力。

[0004] 本发明所用菌株为从神农架地区的中华剑角蝗肠道中分离得到的巴西类壳小圆孢Paraconiothyrium brasiliense MZ‑1菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大
学)，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏名称为：巴西类壳小圆孢MZ‑1，分类命名为
Paraconiothyrium brasiliense MZ‑1，保藏编号：CCTCC NO：M 2016279，保藏日期：2016年
5月25日。

[0005] 所述的蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的4个化合物，所述5个化合物的结构如下所示：

[0006]

[0007] 上述5个化合物的制备方法见文献内生真菌Paraconiothyrium brasiliense代谢产物β‑咔啉生物碱及其黄嘌呤氧化酶抑制活性研究，天然产物研究与开发Nat Prod Res 
Dev 2021，3 3:41‑47，周继慧，闫鑫磊，田梦，李慧，刘朝霞，刘呈雄，邹坤。本发明的化合物
1、2、3、 4对应于该文献的1、2、5、6。

[0008] 本发明相对现有技术，具有如下优点及效果：

[0009] 本发明提供一类内生真菌来源的4个化合物具备一定的抗凝血活性，均优于阳性药水蛭素，具备开发为治疗心血管疾病药物的应用潜力。

[0010] 图1为水蛭素血浆标准曲线。

[0011] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0012] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购分析纯产品。

[0013] 实施例1

[0014] 将采用PDA培养基活化好的菌种接种于PDB培养基，在28℃，180rpm条件下分批次加入终浓度为1.0mM的前体L‑色氨酸，继续培养20天后收集发酵液和菌丝体，采用乙酸乙酯
萃取发酵液 3次，菌丝体在45℃条件下烘干，加入丙酮浸泡过夜，超声(45℃、60W)提取
30min，反复提取 3次，合并所有浸提物总重量为15g。总提取物进行正相硅胶(200～300目)
柱层析分离，采用氯仿‑甲醇＝20∶1(体积比)横梯度洗脱，共得到50个流份。进行TLC检测，
展开体系为:氯仿‑甲醇＝15∶1(体积比)，在365nm紫外灯下观察荧光，再用改良碘化必钾喷
雾显色，观察有无橙色斑点，经TLC检测发现第25个到第30个流份，共6个流份中具有紫外
365nm荧光显色和改良碘化必钾喷雾显橙色的斑点，合并这6个流份。合并后经制备型和半
制备型高效液相(HPLC)反复精制纯化。最终分离得到化合物1(200mg)、2(3.0mg)、3
(2.5mg)、4(3.1mg)、5(3.4mg)、6(3.6 mg)、7(3.3mg)、8(3.4mg)、9(2.0mg)、10(2.3mg)。化合
物结构均采用质谱(MS)、核磁共振(NMR)波谱方法鉴定，并与文献对照确定化合物1～10的
结构，本发明取自化合物1、2、5、6、 7。

[0015]

[0016] 实施例2

[0017] 根据实施例1得到的5个化合物的抗凝血活性测定

[0018] 为了评价川芎哚及其类似物抗凝血活性，采用直接凝血酶抑制剂显色测定法筛选并比较。直接凝血酶抑制剂显色测定法：以水蛭素为阳性药，按照试剂盒操作采用牛血清白
蛋白缓冲液，配置相同浓度梯度的水蛭素及化合物溶液，实验设置实验组和空白组，实验组
在37℃的微孔板中加入50μl配置后样品溶液以及50μl凝血酶底物(空白组不加50μl样品溶
液)，混匀后在37℃下孵育2分钟，再加入凝血酶50μl混匀后在37℃下孵育2分钟，最后加入
2％柠檬酸100μl作为反应终止液，混匀，在405nm处测定吸光度(OD值)，平行操作三次，以平
均值作为最后结果。抑制率的计算公式为： 采用SPSS19.0计算半
数抑制浓度IC50。

[0019] 对部分川芎哚及其类似物进行抗凝血性筛选，通过生色底物法是采用含有酞胺键的生色底物来检测化合物的活性，凝血酶能使酞胺键断裂释放对硝基苯胺，能在405nm处产
生生色效应，显色深浅与凝血酶含量呈正相关。阳性药水蛭素在血浆中标准曲线的线性回
2
归方程为 y＝‑0.1198x+1.8279(R ＝0.9992)，表示水蛭素在0‑2ug/mL浓度时线性关系良
好，与文献报道较一致[肖骏,佘强.黄嘌呤氧化酶抑制剂与心血管疾病.心血管病学进展,
2008,4:622‑624.]。不同浓度的水蛭素作为阳性药对抗凝血活性的测试半数抑制浓度为
13.89μg/ml，具有一定重复性和参考价值。本发明的5个化合物对抗凝血活性作用的测定结
果如表1所示，结果表明其中4个化合物具有不同程度的抑制作用，其对抗凝血活性的半数
抑制浓度分别为7.11ug/ml、 13.11ug/ml、13.59ug/ml和2.23ug/ml，且明显好于水蛭素。与
川芎哚(化合物1)(IC50＝7.11 ug/ml)的活性相比，化合物4的抑制作用更佳。

[0020] 表1不同浓度5个化合物的OD平均值(n＝3)

[0021]

[0022] 表2不同浓度川芎哚及其类似物的抗凝血活性(抑制率％)(n＝3)

[0023]