一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用

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一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用
申请号	CN202210270277.0	申请日	2022-03-18	公开(公告)号	CN114507607B	公开(公告)日	2023-07-07
申请人	昆明理工大学;			发明人	张迪; 朱蓉; 李春雪; 李永建; 于显东;
摘要	本发明涉及微生物技术领域。本发明提供了一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。本发明的淡水真菌及其次级代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果，次级代谢产物的提取方法简单、易实现、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。
权利要求	1.一株淡水真菌，其特征在于，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。 2.权利要求1所述的淡水真菌在抑制食源性病原细菌中的应用，其特征在于，所述食源性病原细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌；所述应用非疾病的治疗方法。 3.一种权利要求1所述淡水真菌的次级代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养基的制备：固体培养基：将马铃薯葡萄糖琼脂培养基在121℃下灭菌20 min，将灭菌后的培养基均匀的倒在培养皿中，凝固后得到固体培养基；液态培养基：将马铃薯葡萄糖肉汤培养基放在250 mL锥形瓶中，在121℃下灭菌20 min，制得液体培养基；（2）淡水真菌扩大培养：将淡水真菌Chaetosphaeria thailandense菌丝接种到固体培养基上，用封口膜封口，倒置放在恒温培养箱中，在27℃下培养14天；（3）淡水真菌的液态发酵：将步骤（2）培养好的淡水真菌Chaetosphaeria thailandense用打孔器在固体培养基上打成直径6 mm的菌饼，并接入液体培养基中，在恒温摇床上以27℃、160 r/min的条件进行培养12天，得到发酵液；（4）次级代谢产物的提取：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，功率180w，频率40KHZ条件下超声提取30 min，提取后静置1天，用滤网过滤菌体，用分液漏斗分液，取上层乙酸乙酯层，得到萃取液；（5）萃取液的浓缩：将萃取液用滤纸过滤后，在旋转蒸发仪上以38℃、80 r/min 条件进行蒸发，得到淡水真菌的代谢产物。 4.权利要求3所述制备方法制备的次级代谢产物。 5.权利要求4所述的次级代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用，其特征在于，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌；所述应用非疾病的治疗方法。
说明书全文	一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用技术领域 [0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用。背景技术 [0002] 近年来，真菌的次级代谢产物因结构出新率高、生物活性显著，是新药物开发的重要来源，已成为药物化学领域的研究热点。淡水真菌是真菌的一个重要类群，其生存环境与海洋真菌和土壤真菌的巨大差异，导致淡水真菌次级代谢产物的化学多样性明显不同于这两类真菌。 [0003] 有报道显示，淡水真菌代谢产物的次级代谢产物结构类型复杂多样，多数具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗虫等生物活性，在医药与农药研发等领域有着广阔的应用前景。并且与从植物中提取或者合成具有抑制食源性病原细菌的化合物相比较，从淡水真菌的次级代谢产物中提取具有周期短、成本低的特点。然而，目前对于淡水真菌及其次级代谢产物的研究相对较少。发明内容 [0004] 本发明的目的在于提供一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，该淡水真菌及其次级代谢产物能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌等食源性病原细菌。 [0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0006] 本发明提供了一株淡水真菌，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。 [0007] 本发明还提供了所述淡水真菌在抑制食源性病原细菌中的应用。 [0008] 作为优选，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。 [0009] 本发明还提供了所述淡水真菌的次级代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将淡水真菌接种到培养基中发酵9～15天，将发酵液用乙酸乙酯萃取后收集萃取液，过滤浓缩得到淡水真菌的次级代谢产物。 [0010] 作为优选，所述培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基。 [0011] 作为优选，所述萃取的方法为：在发酵液中加入0.8～1.2倍体积的乙酸乙酯，超声提取25～35min，提取后静置12～36h。 [0012] 本发明还提供了所述制备方法制备的次级代谢产物。 [0013] 本发明还提供了所述次级代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。 [0014] 作为优选，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。 [0015] 本发明提供了一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。本发明的淡水真菌及其次级代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果，次级代谢产物的提取方法简单、易实现、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。附图说明 [0016] 图1为自然基质上的淡水真菌菌落； [0017] 图2为淡水真菌的分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子的显微结构，右侧空白为标尺，标尺长度为30μm； [0018] 图3为淡水真菌的分生孢子，右侧空白为标尺，标尺长度为10μm； [0019] 图4为为基于LSU、ITS和TEF1‑α数据集的Chaetosphaeriaceae的最大似然分析系统发育图，最大似然值(ML)高于50％在分枝附近标出，本发明的淡水真菌用加下划线表示，系统发育树以Gelasinospora tetrasperma(AFTOL‑ID 1287)和Sordariafimicola(CBS 508.50)为外源基因； [0020] 图5为本发明淡水真菌代谢产物对六种食源性病原细菌的抑菌实验结果，其中a为大肠杆菌，b为金黄色葡萄球菌，c为枯草芽孢杆菌，d为李斯特菌，e为沙门氏菌，f为志贺菌，每个图中标出的D表示为DMSO空白对照。 [0021] 保藏说明 [0022] 淡水真菌V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年5月10日，保藏编号为：CGMCC No.22419。具体实施方式 [0023] 本发明提供了一株淡水真菌，其特征在于，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。 [0024] 本发明还提供了所述的淡水真菌在抑制食源性病原细菌中的应用。 [0025] 在本发明中，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。 [0026] 本发明还提供了所述淡水真菌的次级代谢产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将淡水真菌接种到培养基中发酵9～15天，将发酵液用乙酸乙酯萃取后收集萃取液，过滤浓缩得到淡水真菌的次级代谢产物。 [0027] 在本发明中，所述发酵时优选在摇床上进行。 [0028] 在本发明中，所述发酵时摇床的转速优选为140～180r/min，进一步优选为160r/min。 [0029] 在本发明中，所述发酵的温度优选为25～30℃，进一步优选为27～28℃。 [0030] 在本发明中，所述发酵的时间优选为10～14天，进一步优选为11～13天，再进一步优选为12天。 [0031] 在本发明中，所述培养基优选为马铃薯葡萄糖肉汤培养基。 [0032] 在本发明中，所述萃取的方法为：在发酵液中加入0.8～1.2倍体积的乙酸乙酯，超声提取25～35min，提取后静置12～36h。 [0033] 在本发明中，所述乙酸乙酯的体积优选为发酵液的0.9～1.1倍，进一步优选为1倍。 [0034] 在本发明中，所述超声提取的时间优选为28～32min，进一步优选为30min。 [0035] 在本发明中，所述静置的时间优选为18～30h，进一步优选为24h。 [0036] 在本发明中，所述过滤时优选采用滤纸过滤。 [0037] 在本发明中，所述浓缩时优选采用旋转蒸发仪。 [0038] 在本发明中，所述旋转蒸发仪的使用条件优选为35～41℃、60～100r/min，进一步优选为38℃、80r/min。 [0039] 本发明还提供了所述制备方法制备的次级代谢产物。 [0040] 本发明还提供了所述的次级代谢产物在抑制食源性病原细菌中的应用。 [0041] 在本发明中，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌。 [0042] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0043] 实施例1菌种筛选和鉴定 [0044] 1、菌种来源：从泰国攀牙府塔布区的小河边的淡水腐木上分离。 [0045] 2、淡水腐木上的形态特征(如图1所示)：无性型：丝孢菌。菌落在自然基质上疏展，表生，直立，单个或者聚集，毛发状，棕色到黑棕色，大量的黏糊状，反光的孢子聚集在分生孢子梗顶部。菌丝体部分埋生，部分表生，由具有隔膜的，分枝的，透明到近透明的菌丝组成，光滑。不具有刚毛。分生孢子梗(如图2所示)粗大，单生，长70～135μm底部宽3.5～5.0μm，中部宽2.3～4μm，直的或弯曲，圆柱状，底部棕色到深棕色，向顶端逐渐变浅至近透明到淡棕色，多隔膜，光滑，无分枝，有时顶部增殖1到2次。产孢细胞(如图2所示)单瓶梗或偶尔多瓶梗产孢，末端的，圆柱状的，透明到浅棕色的，在顶部具有一个明显的领状结构。分生孢子(如图3所示)2.5～4.5×1.9～3μm 顶生，无隔，近透明到浅棕色，椭圆形到卵圆形，顶部圆形，无隔膜，有一个液滴，光滑。 [0046] 3、菌落的形态学特征：菌落整齐，圆形的，菌丝体在中部稠密，边缘稀疏，中部微微隆起，颜色从正面和背面看，中部为金黄色到中棕色，边缘未白色到浅黄色，表面粗糙，干燥，边缘完整。 [0047] 4、分子鉴定：采用植物基因组DNA提取试剂盒(通用型)提取该菌株的总DNA，后进行PCR扩增，扩增出LSU、ITS和TEF1‑α基因序列。PCR产物送到云南省擎科生物技术有限公司进行测序。所获得的基因序列经过拼接，进行多基因系统发育分析(如图4所示)。 [0048] 跑树结果发现该菌株与Chaetosphaeria dilabens跑在一簇(98％ML)。但是与C.dilabens比较，C.thailandense有更短的分生孢子梗(70～135μm vs.180(‑200)μm)。另外，比较了我们的菌株和C.dilabens(CBS 735.83，模式菌株)的LSU和ITS序列，发现LSU相差0.1％(8/847)，ITS相差5.8％(31/537)。因此认为我们的菌株不是C.dilabens。 [0049] 结合形态学特征和多基因系统发育结果，菌株CGMCC No.22419被鉴定为Chaetosphaeria属的新种，根据其正模标本采样地泰国，将其命名为Chaetosphaeria thailandense。 [0050] 实施例2次级代谢产物的制备 [0051] (1)培养基的制备： [0052] 固体培养基：将马铃薯葡萄糖琼脂培养基在121℃下灭菌20min，将灭菌后的培养基均匀的倒在培养皿中，凝固后得到固体培养基； [0053] 液态培养基：将马铃薯葡萄糖肉汤培养基放在250mL锥形瓶中，在121℃下灭菌20min，制得液体培养基； [0054] (2)淡水真菌扩大培养：将淡水真菌Chaetosphaeria thailandense菌丝接种到固体培养基上，用封口膜封口，倒置放在恒温培养箱中，在27℃下培养14天； [0055] (3)淡水真菌的液态发酵：将步骤(2)培养好的淡水真菌Chaetosphaeria thailandense用打孔器在固体培养基上打成直径6mm的菌饼，并接入液体培养基中，在恒温摇床上以27℃、160r/min的条件进行培养12天，得到发酵液； [0056] (4)次级代谢产物的提取：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯，功率180w，频率40KHZ条件下超声提取30min，提取后静置1天，用滤网过滤菌体，用分液漏斗分液，取上层乙酸乙酯层，得到萃取液； [0057] (5)萃取液的浓缩：将萃取液用滤纸过滤后，在旋转蒸发仪上以38℃、80r/min条件进行蒸发，得到淡水真菌的代谢产物。 [0058] 实施例3次级代谢产物的对食源性病原细菌的抑制实验 [0059] (1)细菌液体培养基的制备：称取LB肉汤培养基，加入蒸馏水溶解后，在高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌20min，冷却后待用； [0060] (2)病原菌的活化：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌或志贺菌分别接种于LB琼脂培养基上，37℃培养24h后，挑取单个菌落，接种于含5mL的LB液体培养基的15mL离心管中，置于37℃、160rpm恒温培养过夜； [0061] (3)病原细菌悬液的标准曲线：取活化的病原菌液4mL置于10000r/min，4℃下离心1min，加生理盐水混匀，再以4℃、10000r/min离心1min，吸弃上清液，重复两次后用5mL生理盐水重悬得到菌悬液，漩涡震荡混合均匀，用生理盐水进行梯度稀释，在波长600nm下测定稀释后的菌液吸光度，取吸光度值在0.2～0.6之间的7个不同浓度菌液，每份菌液都取100μL加到LB固体培养基上，涂布，在37℃恒温箱中倒置培养24h，对菌落数在30～300之间的平板进行菌落计数；根据菌落数及吸光度值，绘制标准曲线，得到计算公式： [0062] 革兰氏阳性菌(金葡为例)菌落：y＝613.68x–10.921； [0063] 革兰氏阴性菌(大肠为例)菌落：y＝142.4x+110.1； [0064] (4)细菌悬液的制备：根据病原细菌悬液的标准曲线，将病原细菌的浓度用生理盐5 水调整为2×10cfu/mL； [0065] (5)发酵提取物抑菌试验：称取10mg干燥的淡水真菌代谢产物，加入1mL DMSO进行5 溶解，配制成10mg/mL的浓度的样品；用生理盐水稀释细菌菌液，调整菌液浓度为10cfu/mL。吸取80μL的菌液，加到LB琼脂平板表面，涂布棒涂布均匀。用无菌牛津杯在培养基表面均匀地打孔，并用镊子将孔中琼脂块取出，使每个平板上均匀的分布4个直径8mm的小孔。然后选取其中3个小孔，在每个小孔中加入10μL的10mg/mL样品溶液，另一个小孔加入10μL DMSO作空白对照。封口膜封口后，正置放于37℃恒温培养箱中培养1d，观察抑菌圈，游标卡尺测量抑菌圈直径。每种致病菌测量三组数据取平均值，实验结果见图5和表1； [0066] 表1 [0067] [0068] [0069] 从上述结果可以看出：本发明淡水真菌新种Chaetosphaeria thailandense的代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果。 [0070] 由以上实施例可知，本发明提供了一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用，所述淡水真菌的保藏名称为V8，拉丁文为Chaetosphaeria thailandense，保藏日期：2021年5月10日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22419。本发明的淡水真菌及其次级代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌、沙门氏菌和志贺菌均有良好的抑菌效果，次级代谢产物的提取方法简单、易实现、周期短、成本低，具有广阔的市场应用前景。 [0071] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。