Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用

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Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用
申请号	CN202211087400.1	申请日	2022-09-07	公开(公告)号	CN115323028A	公开(公告)日	2022-11-11
申请人	福建农林大学;			发明人	邱君志; 朱志强; 谭震; 杨晨杰; 陈金慧; 刘森; 陈宇熹; 蒲慧丽; 任冠儒; 赵杰;
摘要	本发明公开了一种Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用，包括：活化菌株，初级培养，次级培养，菌体研磨，乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物，将粗提物进行反相硅胶柱层析，以甲醇：水梯度洗脱，再通过多次200‑300目硅胶柱层析纯化，收集洗脱液浓缩，得到目标产物。经1H NMR、13C NMR、COSY、HMBC、HSQC谱图分析证明A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol首次在该菌种代谢物中提取到。
权利要求	1.Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1）将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在160～180 r/min、20 28℃条件下连续培养5 10天，按15wt% 20wt%接种量转接到大米培养基中，继续在20～28~ ~ ~℃条件下静置培养28～40天得到菌丝体； 2）将步骤1）得到的菌丝体在35 40℃下干燥后研磨成粉状，用1 2倍体积的乙酸乙酯浸~ ~泡12 24小时，超声40 60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1 2倍体积的乙酸乙酯，超~ ~ ~声40 60分钟，收集萃取液重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏； ~ 3）将粗提物浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C18进行拌样，干法装柱，以甲醇：水体积比1:9‑9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩获得组分A； 4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200‑300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过 200‑300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为 4:1部分洗脱液，再过200‑300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状A'‑Neogammacer‑ 21‑en‑15α‑ol，即藿烷型三萜类化合物。 2.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤1）中大米培养基组成为：大米100 g,木屑10 g,加入纯水120 mL；经121℃高压灭菌 20 min后使用。 3.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤1）中菌块的大小为0.5×0.5 cm，接种量为4块。 4.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤2）中超声的功率为400 W，频率为35 KHz。 5.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤3）中使用的反相硅胶C18粒径40‑60 μm，孔径120 Å。 6.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1。 7.根据权利要求1所述的Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，其特征在于：步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1，石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1。 8.一种如权利要求1‑7任一项所述的制备方法制得的Raffaelea lauricola次级代谢产物在抑制人乳腺癌肿瘤细胞MCF‑7增殖的药物中的应用。
说明书全文	Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用技术领域 [0001] 本发明属于从菌株分离活性物质的技术领域，具体涉及Raffaelea lauricola次级代谢产物（藿烷型三萜类化合物A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol）的制备方法及其抑制人乳腺癌细胞株MCF‑7的新用途。背景技术 [0002] Raffaelea lauricola是食菌小蠹（Ambrosia beetle）携带的高致病性伴生真菌，是导致树木枯萎病的病原真菌，学者们长期致力于研究其致病机理，伴随着研究的持续深入，已在该属其他物种中获得一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上潜在极大应用价值。 [0003] A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol是藿烷型三萜类物质，而藿烷型三萜类物质多具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性。可以修饰A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的化学结构进而生成各种新的活性物质。到目前为止，尚未发现在Raffaelea lauricola中分离到A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的报道。发明内容 [0004] 本发明的目的是提供一种Raffaelea lauricola次级代谢产物及其抑制人乳腺癌细胞株MCF‑7的新用途，所述代谢产物为：藿烷型三萜类化合物A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol。 [0005] 所述Raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，采取的技术方案如下：1)将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在，在140～180 r/min、20 28℃条件下连续培养5 10天，按15wt% 20wt%接种量转接到改良的大米培养基~ ~ ~ 中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体。 [0006] 2）将步骤1）得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎，用1 2倍体积的乙酸乙酯浸~泡12 24小时，超声40 60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1 2倍体积的乙酸乙酯，超~ ~ ~ 声40 60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。 ~ [0007] 3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C18进行拌样，干法装柱，以甲醇：水体积比1:9‑9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分A。 [0008] 4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200‑300 目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1 开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200‑300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比 4:1部分洗脱液，再过200‑300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状A'‑Neogammacer‑ 21‑en‑15α‑ol，其结构式如下所示：。 [0009] 进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基的组成为：大米100 g,木屑10 g，加入纯水120 mL，121℃高压灭菌20 min。 [0010] 进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5×0.5 cm，接种量为4块。 [0011] 进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 W，频率为35 KHz。 [0012] 进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶C18粒径40‑60 μm，孔径120 Å。 [0013] 进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1；石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1。 [0014] 本发明的显著优点：本发明分离纯化简单，成本低，易操作；制得的化合物纯度高，且重复性好。附图说明 [0015] 图1为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的1H NMR谱（CDCl3）；13 图2为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的 C NMR谱（CDCl3）；图3为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的DEPT135谱（CDCl3）；图4为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的COSY谱（CDCl3）；图5为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑olHMBC谱（CDCl3）；图6为A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的HSQC谱（CDCl3）。具体实施方式 [0016] 为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。 [0017] 本发明所使用的Raffaelea lauricola菌株编号为Hulcr7161。 [0018] 实施例1活性次级代谢产物A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol的分离1)取Raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为 0.5×0.5 cm的菌块4 块接种到PDB培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g,纯水100ml,装入250 mL 锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在160 r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g,木屑10 g,加入纯水120 mL，121℃高压灭菌，20 min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。 [0019] 2)收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩旋蒸得到粗提物浸膏。 [0020] 3)将浸膏溶解于氯仿，使用40‑60 μm粒径反相C18硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。 [0021] 4)用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200‑300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10: 1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200‑300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1），收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过 200‑300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为 20:1, 10:1, 8:1, 5:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol。 [0022] 经计算其提取率为1.320%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量×100%）。 [0023] 实施例2 A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol对人乳腺癌细胞株MCF‑7的抑制作用1）采用MTT法测定化合物的抗肿瘤活性，即MCF‑7细胞使用RPMI1640培养基均在饱和湿度培养箱培养，条件设置为37℃、5% CO2。上述2种培养基中均已添加10%的胎牛血清、 5 青霉素(1×10 IU/L)和链霉素(100 mg/L)，培养至对数生长期后可用于实验。 [0024] 2) 于96孔板中每孔180 μL含5×103个细胞，根据二倍稀释法设置待测化合物浓度（200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 μM）以DMSO稀释，阳性对照为顺铂(cisplatin)，阴性对照为DMSO溶液，在37℃培养箱内培养48 h，每孔加入20 μL的MTT溶液，再培养4 h，吸去孔内液体，加入DMSO震荡充分溶解甲瓒，在570 nm波长下测定吸光值（A）。 [0025] 3) 按公式计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=[(A对照–A实验)/(A对照‑A空白)]×100%。结果见表1。 [0026] 表1目标活性物对人乳腺癌细胞的抑制活性通过GraphPad Prism 8软件计算，得出目标活性化合物IC50＝55.38 μg/mL，IC50即抑制率达到50％时的药物浓度，说明活性代谢产物A'‑Neogammacer‑21‑en‑15α‑ol浓度达到55.38 μg/mL时对人乳腺癌细胞株的生长抑制率为50%。 [0027] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。