[0001] 与相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年4月17日提交的美国临时专利申请61/170,189号的权益，所述申请通过引用并入本文。发明领域

[0003] 本发明涉及新的杀虫Cry毒素以及它们用于控制昆虫的用途。

[0004] 发明背景

[0005] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis(B.t.))是土传细菌，其产生称为δ内毒素或Cry蛋白的杀虫晶体蛋白质。Cry蛋白是口服毒物，其通过作用于易感昆虫的中肠细胞而发挥功能。δ内毒素的扩充列表在http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/intro.html中得以维持和定期更新。

[0006] 欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis(Hübner))是对整个美国和加拿大的玉米的损害最大的虫害，并且每年造成由于作物产量损失和昆虫控制消费所导致的估计为10亿美元的收益损失(Witkowski等，2002)。表达编码Cry蛋白(最显著的是Cry1Ab、Cry1Ac或Cry1F)的基因的转基因玉米提供了商业水平的抗ECB功效。

[0007] 尽管抗ECB转基因玉米的成功，但产生抗性昆虫群体的可能性威胁着Cry蛋白在ECB控制中的长期持久性，并且产生了发现和开发新Cry蛋白以控制ECB和其他害虫的需求。对B.t.Cry蛋白的昆虫抗性可通过若干种机制产生(Heckel等，2007，Pigott and Ellar，2007)。已在昆虫中鉴定了Cry蛋白的多个受体蛋白质类型，并且在每一受体类型中存在多个实例。例如，对特定Cry蛋白的抗性可通过受体蛋白的钙粘蛋白结构域的毒素结合部分的突变而产生。抗性的其他方式可通过原毒素加工蛋白酶介导。因此，鳞翅目(Lepidoptera)物种对Cry毒素的抗性具有复杂的遗传基础，涉及至少4个不同的主要抗性基因。对Cry蛋白有抗性的鳞翅目昆虫已在田间在物种小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik，1994)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Janmaat和Myers 2003，2005)以及美洲棉铃虫(Helicoverpa zeae)(Tabashnik等，2008)中产生。开发新的高效力Cry蛋白质将能够提供控制ECB和其他虫害的其他工具。在转基因玉米中组合产生的具有不同作用模式的Cry蛋白能够预防ECB昆虫抗性的产生，并且保护B.t.技术用于害虫控制的长期有用性。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明提供了杀虫Cry毒素，包括本文称为DIG-3的毒素以及DIG-3的变体，编码这些毒素的核酸，应用该毒素控制害虫的方法，在转基因宿主细胞中产生该毒素的方法，以及产生该毒素的转基因植物。野生型DIG-3毒素的预测氨基酸序列在SEQ ID NO：2中给出。

[0010] 如实施例1中所述，从Dow AgroSciences LLC内部称为PS46L的B.t.菌株中分离到了编码DIG-3蛋白的核酸。确定了全长编码区的核酸序列，并从该核酸序列推导了全长蛋白质序列。DIG-3毒素与Cry1BII(Genbank Accession No.AAM93496)及其他苏云金芽孢杆菌Cry1B-型蛋白(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html)具有某些相似性。

[0011] 在本文中还描述了DIG-3毒素的杀虫活性变体，并将其统称为DIG-3毒素。

[0012] DIG-3毒素也可与用于控制其他虫害的RNAi方法联合使用。例如，DIG-3可与抑制玉米根虫关键基因或虫害关键基因的dsRNA联合用于转基因植物中。此类靶基因例如包括，液泡ATP酶、ARF-1、Act42A、CHD3、EF-1α和TFIIB。合适的靶基因的实例是液泡ATP酶，如WO 2007/035650中所公开的那样。

[0013] 本文报告的出人意料的发现是DIG-3毒素对欧洲玉米螟及小菜蛾的抗Cry1F和Cry1A毒素的群体也是有活性的。因此，DIG-3毒素是用于控制鳞翅目害虫的理想候选者。该毒素可单独使用，或与诸如Cry1F、Cry1Ab和Cry1Ac的其他Cry毒素联合使用，以控制抗性昆虫群的产生。

[0014] SEQ ID NO：2的杀虫活性片段，以及编码此类片段的核苷酸是本发明的另一方面。

[0015] 在一个实施方案中，本发明提供了分离的DIG-3毒素多肽，其包含选自下组的核心毒素片段：

[0016] (a)包含SEQ ID NO：2的残基113至643的氨基酸序列的多肽；

[0017] (b)包含与SEQ ID NO：2的残基113至643的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

[0018] (c)包含具有至多20个不会不利地影响由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性的氨基酸取代、缺失或修饰的SEQ ID NO：2的残基113至643的氨基酸序列的多肽。

[0019] 在一个实施方案中，本发明提供了分离的DIG-3毒素多肽，其包含选自以下的核心毒素片段：

[0020] (a)包含SEQ ID NO：2的残基73至643的氨基酸序列的多肽；

[0021] (b)包含与SEQ ID NO：2的残基73至643的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

[0022] (c)包含具有至多20个不会不利地影响由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性的氨基酸取代、缺失或修饰的SEQ ID NO：2的残基73至643的氨基酸序列的多肽。

[0023] 在另一个实施方案中，本发明提供了分离的DIG-3毒素多肽，其包含选自以下的DIG-3核心毒素片段：

[0024] (a)包含SEQ ID NO：2的残基1至643的氨基酸序列的多肽；

[0025] (b)包含与SEQ ID NO：2的残基1至643的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；

[0026] (c)包含具有至多20个不会不利地影响由SEQ ID NO：2编码的毒素的表达或活性的氨基酸取代、缺失或修饰的SEQ ID NO：2的残基1至643的氨基酸序列的多肽。

[0027] 通过“分离的”，申请人的意思是多肽或DNA分子已通过人工从它们的天然环境中移出，并被置于不同的环境当中。

[0028] 在另一实施方案中，本发明提供了包含DIG-3毒素的植物。

[0029] 在另一实施方案中，本发明提供了控制害虫群体的方法，包括使所述群体与杀虫有效量的DIG-3毒素接触。

[0030] 在另一实施方案中，本发明提供了编码DIG-3毒素的分离的核酸。

[0031] 在另一实施方案中，本发明提供了DNA构建体，其包含与非衍生自苏云金芽孢杆菌的、并能够在植物中驱动表达的启动子可操作连接的编码DIG-3毒素的核苷酸序列。本发明还提供了转基因植物，其包含稳定地掺入其基因组的该DNA构建体，以及用于保护植物免遭害虫的方法，包括将该构建体导入所述植物。

[0032] 序列简述

[0033] SEQ ID NO：1编码全长DIG-3毒素的DNA序列；3771nt。

[0034] SEQ ID NO：2全长DIG-3蛋白序列；1256aa。

[0035] SEQ ID NO：3植物优化的全长DIG-3DNA序列；3771nt。

[0036] SEQ ID NO：4Cry1Ab原毒素片段；545aa。

[0037] SEQ ID NO：5嵌合毒素：DIG-3核心毒素片段/Cry1Ab原毒素片段；1188aa。

[0038] SEQ ID NO：6针对双子叶植物优化的编码Cry1Ab原毒素片段的DNA序列；1635nt。

[0039] SEQ ID NO：7针对玉米优化的编码Cry1Ab原毒素片段的DNA序列；1635nt。

[0040] 发明详述

[0041] DIG-3毒素以及杀虫活性变体。除了SEQ ID NO：2的全长DIG-3毒素之外，本发明还包括了杀虫活性变体。通过术语“变体”，发明人意图包括片段、某些缺失和插入突变体、以及某些融合蛋白。DIG-3是经典的三结构域Cry毒素。作为描述包括在本发明中的DIG-3毒素变体的前言，简要地综述一般的三结构域Cry毒素和具体的DIG-3蛋白毒素的结构是有用的。

[0042] 多数苏云金芽孢杆菌δ-内毒素晶体蛋白分子包括两个功能片段。蛋白酶抗性核心毒素是第一个片段，并相应于该蛋白质分子的约前一半。该完整的～130kDa的原毒素分子在昆虫消化道中被蛋白酶迅速地加工为抗性核心片段。通过这一加工消除掉的片段在本文中称为“原毒素片段”。相信该原毒素片段参与了毒素的晶体形成(Arvidson等，1989)。该原毒素片段因此可能通过减少毒素分子的蛋白酶加工(Haider等，1986)或通过降低毒素可溶性(Aronson等，1991)，以限制核心对昆虫的可接近性，从而表达出部分对该毒素的昆虫特异性。即使在某类型之中，B.t.毒素在长度上，以及在从核心毒素片段至原毒素片段的转换的精确位置上也有某些程度的差异。从核心毒素片段至原毒素片段的转换通常会出现在全长毒素的约50％至约60％之间。SEQ ID NO：2公开了全长DIG-3多肽的1256个氨基酸的序列，其中N-端643个氨基酸包含DIG-3核心毒素片段。SEQ ID NO：1的5’-端
1929个核苷酸包含该核心毒素片段的编码区。

[0043] 已确定了Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1、Cry3Bb1、Cry4Aa、Cry4Ba和Cry8Ea1的三维晶体结构。这些核心毒素的结构是非常相似的，并且包含具有下述特征的三个不同的结构域(de Maagd等，2003中综述)。

[0044] 结构域I是7个α螺旋的丛，其中α-螺旋5由6个两亲螺旋环绕。这一结构域涉及孔形成，并且与包括溶血素和大肠杆菌素在内的其他孔形成蛋白共享同源性。DIG-3蛋白的结构域I包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基56至278。

[0045] 结构域II由一起包装为β棱柱的三个反向平行的β片层形成。这一结构域的环在结合昆虫中肠受体当中起着重要作用。在Cry1A蛋白中，位于结构域II β片层顶点的暴露于表面的环(surface exposed loop)参与了与鳞翅目昆虫钙粘蛋白的结合。Cry3Aa结构域II的环以类似的方式与马铃薯叶甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(Say)(马铃薯甲虫(Corolado potato beetle))的膜相关金属蛋白酶结合(Ochoa-Campuzano等，2007)。结构域II与包括卵黄和jacaline在内的某些糖结合蛋白共享同源性。DIG-3蛋白的结构域II包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基283至493。

[0046] 结构域III是两个反向平行β片层的β夹心(sandwich)。这一结构域在结构上与蛋白质的糖结合结构域相关，诸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶和唾液酸酶等。结构域III结合某些类型的受体蛋白，并且可能参与和第二类受体相互作用的寡聚毒素前-孔的插入，在Cry1A蛋白的情况下，所述第二类受体的实例是氨肽酶和碱性磷酸酶(Pigott和Ellar，2007)。已在鞘翅目(Coleopetera)中鉴定了类似的Cry结构域III受体。保守的B.t.序列区段2和3分别位于结构域2的N端和C端附近。因此，这些保守的序列区段2和3是所述三个功能结构域之间的近似边界区域。这些具有保守的DNA和蛋白质同源性的区域已被开发用于工程化重组B.t.毒素(US专利号6090931、WO 91/01087、WO 95/06730、WO1998022595)。DIG-3蛋白的结构域III包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基503至641。

[0047] 现已报道结构域I的α-螺旋1在受体结合后即被移除。Aronson等(1999)证实了与BBMV结合的Cry1Ac受到保护不被蛋白酶K从残基59开始(正在α-螺旋1之后)切割；Cry1Ab引证了类似的结果。Gomez等(2002)发现，在与BBMV受体结合后形成的Cry1Ab寡聚物缺乏结构域I的α-螺旋1。而且，Soberon等(2007)显示，Cry1Ab和Cry1Ac的缺乏包含三维Cry结构上的α-螺旋1的约60个氨基酸的N-端缺失突变体能够在缺乏钙粘蛋白结合的情况下组装分子量约60kDa的单体至前孔中。已报道这些N-端缺失突变体对Cry-抗性昆虫幼虫有活性。此外，Diaz-Mendoza等(2007)描述了保持了对地中海玉米螟(西非蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))的活性的Cry1Ab的43kDa和46kDa片段。已证实这些片段包括氨基酸残基116至423；然而，未说明精确的氨基酸序列，并且这些蛋白水解片段的活性机制也是未知的。Gomez等(2002)、Soberon等(2007)和Diaz-Mendoza等(2007)的结果与Hofte等(1986)的不同，Hofte等报道了从Cry1Ab的N端缺失36个氨基酸导致杀虫活性的丧失。

[0048] 我们通过比较DIG-3蛋白序列和结构已知的Cry8Ea1的蛋白质序列，推导了DIG-3毒素的结构域I中α-螺旋1、α-螺旋2A、α-螺旋2B和α-螺旋3的起点和终点，以及它们之间间隔子区域的位置。这些位置描述于表1中。

[0049] 表1

[0050] 投影的DIG-3蛋白α-螺旋的氨基酸坐标

[0051]

[0052] DIG-3的氨基端缺失变体。在其一个方面，本发明提供了DIG-3变体，其中缺失了α-螺旋1、α-螺旋2A和α-螺旋2B的全部或部分，以改进杀虫活性以及避免昆虫产生抗性。进行了这些修饰以提供具有改良特性的DIG-3变体，诸如改良的靶害虫谱、效力和昆虫抗性管理。在本发明的一些实施方案中，该修饰可能影响原毒素活化和孔形成的效率，导致昆虫中毒。更具体地，为提供具有改良特性的DIG-3变体，描述了移除部分编码DIG-3蛋白N-端的核酸序列的逐步缺失。该缺失移除了结构域I中的全部α-螺旋1以及全部或部分α-螺旋2，而保留了α-螺旋3至7的结构完整性。本发明因此部分地涉及Cry蛋白效力的改进，这是通过为了更有效的孔形成而工程化结构域1的α-螺旋成分而获得的。更具体地，本发明部分地涉及改良的DIG-3蛋白质，其被设计为在含有与Cry1蛋白结构域I中的α-螺旋1及α-螺旋2的推定二级结构同源性的区域中具有N端缺失。

[0053] 为改进DIG-3毒素杀虫特性的缺失可起始于预测的α-螺旋2A起点之前，并可终止在α-螺旋2B终点之后，但优选不扩展至α-螺旋3中。

[0054] 在N-端缺失变体编码序列的设计中，将编码甲硫氨酸的ATG起始密码子插入在设计以编码该缺失变体的核苷酸序列5’端。对于设计用于转基因植物的序列，坚持Varshavsky(1997)的“N-端规则”可能是有益的。其教导，当作为蛋白质的N-端残基显露时，一些氨基酸可能对真核细胞中蛋白质的不稳定性和降解有贡献。例如，从对酵母和哺乳动物细胞的观察中收集的数据表明，N-端去稳定氨基酸是F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E以及可能的P。尽管蛋白质降解机制的特性在生物之间可能会有些不同，但上述N-端去稳定氨基酸身份的保守性提示类似的机制可能在植物细胞中起作用。例如，Worley等(1998)发现在植物中，N-端规则包括碱性和芳香族残基。有这样的可能性，即，通过植物蛋白酶的在该B.t.杀虫蛋白α-螺旋3起点附近的蛋白水解切割可能暴露了去稳定的N-端氨基酸。此类加工可能使得经切割的蛋白质迅速降解，并将该B.t.杀虫蛋白聚集限制在不足以有效控制昆虫的水平。因此，对于以去稳定氨基酸之一开始的N-端缺失变体，申请人优选在翻译起始甲硫氨酸和该去稳定氨基酸之间添加指定G(甘氨酸)氨基酸的密码子。

[0055] 实施例2给出了根据本发明的DIG-3的氨基-端缺失变体的特定实例。其他保持毒性的有用片段可通过全长溶解结晶蛋白质的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化而得以鉴定。毒性DIG-3蛋白片段的其他实例可通过DIG-3编码区域的片段编码。昆虫活性DIG-3变体大部分会具有短的N-端截断和长的C-端截断。通过本领域可常规获得的技术，确定经胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理的可溶晶体蛋白质的N-端氨基酸序列，从而可方便地确定最小的毒性片段的N端终点。

[0056] 嵌合毒素。应用了与另一Cry毒素的原毒素片段融合的一种Cry毒素的核心毒素片段的嵌合蛋白在之前已有报道。DIG-3变体包括包含了在核心毒素片段终点之后的一些位点与异源原毒素片段融合的DIG-3毒素的N-端核心毒素片段(其可以是全长的，或具有上述N-端缺失)的毒素。向异源原毒素片段的转换可大约出现在天然核心毒素/原毒素连接处，或备选地，天然原毒素的部分(延伸越过核心毒素片段)可与向出现在下游的异源原毒素的转换一起保留。作为实例，本发明的嵌合毒素具有DIG-3的完整核心毒素片段(氨基酸1-643)以及异源原毒素片段(氨基酸643至C-端)。在优选的实施方案中，该异源原毒素片段衍生自Cry1Abδ内毒素，如SEQ ID NO：5所示。

[0057] SEQ ID NO：4公开了可用于本发明DIG-3变体的Cry1Ab原毒素片段的545个氨基酸的序列。关注这一原毒素片段的最后约100至150个氨基酸，将其包含在本发明的嵌合毒素内是最关键的。

[0058] 蛋白酶敏感变体。昆虫消化道蛋白酶通常在帮助昆虫从饮食蛋白质中获得所需氨基酸中发挥作用。最了解的昆虫消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其似乎是最常见的类型(Englemann和Geraerts(1980))，尤其是在鳞翅目昆虫物种中。鞘翅目昆虫具有比鳞翅目昆虫消化道更中性至酸性的消化道。多数鞘翅母昆虫幼虫和成虫(例如马铃薯甲虫)具有稍偏酸性的中肠，以及半胱氨酸蛋白酶提供了主要的蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更精确地，Thie和Houseman(1990)在马铃薯甲虫中鉴定和表征了半胱氨酸蛋白酶：组织蛋白酶B样和组织蛋白酶H样，以及天冬酰胺蛋白酶：组织蛋白酶D样。Gillikin等(1992)表征了西方玉米根虫幼虫消化道中的蛋白水解活性，并发现主要是半胱氨酸蛋白酶。美国专利号7230167公开了归因于组织蛋白酶G的蛋白酶活性存在于西方玉米根虫中。昆虫消化道蛋白酶的多样性和不同的活性水平可能影响昆虫对特定B.t.毒素的敏感性。

[0059] 在本发明的另一实施方案中，可在期望的位置设计蛋白酶切割位点，以影响某些虫害的易感幼虫的中肠内的蛋白质加工。这些蛋白酶切割位点可通过诸如化学基因合成或剪接重叠PCR(Horton等，1989)的方法引入。例如，可任选地在Cry蛋白结构中的特定位点任选地插入丝氨酸蛋白酶识别序列，以实现易感幼虫的中肠中在期望缺失点处的蛋白质加工。可以此种方式应用的丝氨酸蛋白酶包括鳞翅目昆虫中肠丝氨酸蛋白酶，诸如胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等(Christeller等，1992)。此外，可工程化改造通过对由未分级幼虫中肠蛋白酶制备物产生的Cry蛋白质消化产物进行测序、或通过与刷状缘膜囊结合从而经验地鉴定的缺失位点，以实现蛋白质活化。通过基因缺失或通过引入蛋白酶切割位点产生的经修饰的Cry蛋白具有改良的对鳞翅目害虫和其它靶标害虫的活性，所述鳞翅目害虫包括欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜贪夜蛾(Spodoptera exigua)、小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis)、Loxagrotis albicosta。

[0060] 通过在期望的加工位点工程化改造合适的识别序列，还可进一步利用鞘翅目昆虫丝氨酸蛋白酶，诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和组织蛋白酶G样蛋白酶；鞘翅目昆虫半胱氨酸蛋白酶，诸如组织蛋白酶(B-样、L-样、O-样以及K-样蛋白酶)(Koiwa等，(2000)和Bown等，(2004))；鞘翅目昆虫金属蛋白酶，诸如ADAM10[Ochoa-Campuzano等，(2007)]；以及鞘翅目昆虫天冬氨酸蛋白酶，诸如组织蛋白酶D-样和E-样、胃蛋白酶、plasmepsin和凝乳酶，从而实现某些虫害的易感幼虫中肠内的Cry蛋白加工。

[0061] 引入此类蛋白酶切割位点的优选位置可以是在α-螺旋2B和α-螺旋3之间的“间隔子”区域内，例如在全长DIG-3蛋白(SEQ ID NO：2和表1)的氨基酸109至113内。通过基因缺失或通过引入蛋白酶切割位点产生的经修饰的Cry蛋白具有改进的对虫害的活性，所述虫害包括但不限于西方玉米根虫、南方玉米根虫和北方玉米根虫等。

[0062] 存在多种能够确定包括多肽N端或C端残基的氨基酸的序列的技术。例如，可顺序地使用自动Edman降解方法以确定多至30个氨基酸残基的N端氨基酸序列，具有每个残基98％的准确率。此外，确定包含多肽羧基末端的氨基酸的序列也是可能的[Bailey等，(1992)；美国专利号6046053]。因此，在一些实施方案中，可表征通过蛋白酶水解加工方式(例如，通过从昆虫消化道中制备的蛋白酶)活化的B.t.Cry蛋白，并鉴定该活化毒素片段的N端或C端氨基酸。通过在编码序列的合适位置处引入或消除蛋白酶加工位点以允许或消除较大变体蛋白质被昆虫、植物或微生物蛋白酶蛋白水解切割，从而产生的DIG-3变体也在本发明的范围之内。应理解此类操作的最终结果是产生具有与完整(全长)毒素蛋白具有相同或比之更好的活性的毒素片段分子。

[0063] DIG-3毒素的结构域。预期DIG-3毒素的单独的结构域(以及与此类结构域90％、95％或97％相同的变体)可用于形成与来自其他Cry毒素的结构域的组合，以提供具有增加的害虫毒性谱、改善的效能或升高的蛋白质稳定性的新毒素。DIG-3蛋白的结构域I由SEQ ID NO：2的氨基酸残基56至278组成。DIG-3蛋白的结构域II由SEQ ID NO：2的氨基酸残基283至493组成。DIG-3蛋白的结构域III由SEQ ID NO：2的氨基酸残基503至
641组成。结构域对换或改组是产生经改变的δ-内毒素蛋白的机制。结构域II和III可在δ-内毒素蛋白之间对换，产生具有改良的杀害虫活性或靶标谱的杂合或嵌合毒素。结构域II参与受体结合，并且DIG-3结构域II与其他Cry1B毒素的有很大不同。结构域III结合某些类型的受体蛋白并且可能参与低聚物毒素前孔的插入。已显示在其他毒素中某些结构域III的取代产生了更好的针对甜菜贪夜蛾(Spodoptera exigua)毒性(de Maagd等，
1996)，以及存在设计Cry毒素结构域对换的指引(Knight等，2004)。

[0064] 用于产生重组蛋白及测试它们杀害虫活性的方法是本领域公知的(例如，参见Naimov 等，(2001)；de Maagd 等，(1996)；Ge 等，(1991)；Schnepf 等，(1990)；Rang 等，(1999))。已研究了来自Cry1A和Cry3A蛋白的结构域I插入膜中并形成孔的能力。结构域I的α-螺旋4和α-螺旋5在膜插入和孔形成中起着关键作用[Walters等，(1993)；Gazit等，(1998)；Nunez-Valdez等，(2001)]，而其他α螺旋可能如伞的肋条那样与膜表面接触(Bravo等，(2007)；Gazit等，(1998))。

[0065] 通过进行有限数目的氨基酸缺失、取代或添加而产生的DIG-3变体。可容易地以顺序地方式进行对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸缺失、取代和添加，并通过生物测定法测试此类改变对杀虫活性的影响。假如改变的数目有限，则此类测试不会涉及不合理的实验。本发明包括其中进行了至多10、至多15或至多20个独立的氨基酸添加、缺失或取代的核心毒素片段(SEQ ID NO：2的氨基酸1-643，或SEQ ID NO：2的氨基酸73-643)的杀虫活性变体。

[0066] 本发明包括具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1-643或SEQ ID NO：2的氨基酸73-643有90％、95％或95％相同的核心毒素片段的DIG-3变体。

[0067] 可通过进行随机突变制备变体，或可设计变体。在设计突变体的情况下，当在毒素的负责生物活性或参与三维构型(其最终负责生物活性)确定的关键区域中保持氨基酸同一性时，存在很高的可能性产生与天然毒素具有类似活性的变体。如果取代是保守的时，也会产生保持活性的高可能性。可以将氨基酸置于下面的类别：非极性的、不带电的极性的、碱性的和酸性的。将一个类别的氨基酸用相同类型的另一氨基酸取代的保守取代最不可能实质上地改变该变体的生物活性。表2提供了属于每个类别的氨基酸的实例列表。

[0068] 表2

[0069]

[0070]

[0071] 在一些情况中，还可以进行非保守取代。关键因素是这些取代必须不显著减小该毒素的生物活性。变体包括由于诱变而在氨基酸序列上不同的多肽。本发明包含的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即保持杀虫活性。

[0072] 还可设计这样的变体蛋白，即其在序列水平上不同，但维持了相同或类似的整体关键三维结构、表面电荷分布等。例如参见，美国专利号7058515；Larson等(2002)；Stemmer(1994a、1994b、1995)以及Crameri等(1996a、1996b、1997)。

[0073] 核酸。分离的编码DIG-3毒素的核酸是本发明的另一方面。这包括编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的核酸，及其互补链，以及编码SEQ ID NO：2的杀虫变体的其他核酸。由于遗传密码子的简并性，多个不同的DNA序列可编码本文公开的氨基酸序列。产生这些编码相同的或基本相同的毒素的可选DNA序列在本领域受过训练的技术人员的范围之内。

[0074] 基因合成。编码本文描述的经改进的Cry蛋白的DNA序列可通过各种本领域公知的方法制得。例如，可通过亚磷酸三酯和亚磷酰胺化学来制得合成的基因片段或合成的基因(Caruthers等，1987)，并且可利用商业供应商按需进行DNA合成。编码全长DIG-3蛋白的序列可用多种方式进行组装，例如包括，通过限制性片段的连接或重叠寡核苷酸的聚合酶链式反应组装(Stewart和Burgin，2005)。此外，可通过应用位点特异性末端寡核苷酸的PCR扩增制得编码末端缺失的序列。

[0075] 例如，可通过多个供应商的任一个当前实践的方法，通过合成构建，制得编码DIG-3毒素的核酸。(例如参见美国专利号7482119B2)。这些核酸或其部分或变体可合成地构建，例如通过使用基因合成仪以及例如美国专利号5380831的设计方法。备选地，合成或天然存在的基因的变化可应用制备点突变的标准分子生物学技术容易地构建。使用可通过商业途径获得的外切核酸酶或者内切核酸酶，根据标准方法可以制备这些基因的片段。例如，可以用诸如Bal31的酶或者位点定向诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。而且，可以使用多种限制酶得到编码活性毒素片段的基因片段。

[0076] 在给出了DIG-3毒素氨基酸序列的情况下，可应用预期宿主优选的密码子通过逆翻译该编码序列，并然后应用替代密码子移除可能产生问题的序列以及提供周期性终止密码子以消除非编码阅读框中的长开放编码序列来改善该序列，从而设计编码序列。

[0077] 量化序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将所述序列以最佳比较目的进行比对。两个序列间的百分比同一性是由所述序列共有的相同位置数的函数(即，百分比同一性＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方案中，该两个序列一样长。两个序列间的百分比同一性可应用类似于以下描述的那些得以确定，允许或不允许空位。在计算百分比同一性时，通常计算精确的匹配。

[0078] 可应用数学算法完成两个序列间百分比同一性的确定。此类算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)的、如Karlin和Altschul(1993)改进的、并整合至BLASTN和BLASTX程序中的算法。BLAST检索可方便地用于鉴定核酸或蛋白数据库中与查询序列同源(相似)的序列。可进行BLASTN检索(得分＝100，字长＝12)以鉴定与本发明要求保护的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可进行BLASTX检索(得分＝50，字长＝3)以鉴定与本发明要求保护的杀虫蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。

[0079] 空位BLAST(Gapped BLAST)(Altschul等，1997)可用于获得为比较目的的空位比对。可选地，PSI-Blast可用于进行迭代检索，其检测分子间的距离关系(Altschul等，1997)。当应用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

[0080] 用于比较序列的数学算法的非限制性实例是ClustalW算法(Thompson等，1994)。ClustalW比较序列并比对整个氨基酸或DNA序列，并因此可提供有关整个氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在多个可商购DNA/氨基酸分析软件包中使用，诸如Vector NTI Program Suite(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。
当用ALIGNX比对氨基酸序列时，可方便地使用缺省设置，即10的空位开放罚分、0.1空位延伸罚分以及blosum63mt2比较矩阵，从而评估两个序列间的百分比氨基酸类似性(一致性)或同一性。当使用ALIGNX比对DNA序列时，可方便地使用缺省设置，即15的空位开放罚分、6.6的空位延伸罚分以及swgapdnamt比较矩阵，以评估两个序列间的百分比同一性。

[0081] 用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是Myers和Miller(1988)的算法。该算法已整合至wSTRETCHER程序中，所述程序是wEMBOSS序列比对软件包(可在http://emboss.sourceforge.net/获得)的一部分。wSTRETCHER应用标准动态规划算法(其使用线性空间(linear space))的修正版计算两个序列的最佳全局比对。用于计算比对的取代矩阵、空位插入罚分和空位延伸罚分可以具体指定。当使用wSTRETCHER程序比较核苷酸序列时，可与打分矩阵文件EDNAFULL一起使用16的空位开放罚分和4的空位延伸罚分。当用于比较氨基酸序列时，可与EBLOSUM62打分矩阵文件一起使用12的空位开放罚分和2的空位延伸罚分。

[0082] 用于比较序列的数学算法的其它非限制性实例是Needleman和Wunsch(1970)的算法，其整合至序列比对软件包GAP版本10和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)中。GAP版本10可应用以下参数从而用于确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列，应用50的空位权重(GAP Weight)和3的长度权重(Length Weight)，以及nwsgapdna.cmp打分矩阵，获得％同一性和％相似性。对于氨基酸序列比较，应用8的空位权重和2的长度权重，以及BLOSUM62打分矩阵，决定％同一性或％相似性。

[0083] wNEEDLE读取两个输入序列，在它们的全长上找出最佳比对(包括空位)，并在文件中写入它们的最佳全局序列比对。该算法应用含有每一种可能的残基或核苷酸匹配的值的打分矩阵，探索所有可能的比对并选择最佳的。wNEEDLE寻找具有最大可能得分的比对，其中比对的得分等于获自打分矩阵的匹配总分减去从比对序列中的开放和延伸空位产生的罚分。取代矩阵和空位开放及延伸罚分是用户指定的。当比较氨基酸序列时，使用10的缺省空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EBLOSUM62比较矩阵。当应用wNEEDLE比较DNA序列时，使用10的空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EDNAFULL比较矩阵。

[0084] 也可使用等价的程序。“等价程序”预期了任何的序列比较程序，其中对于任何讨论的两个序列，所述程序产生这样的比对，即当与由ALIGNX、wNEEDLE或wSTRETCHER产生的相应比对相比较时，所述比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配及相同的百分比序列同一性。所述％同一性是两个序列间相同的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比，以及％相似性是两个序列间的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比。

[0085] 也可通过检查手工地进行比对。

[0086] 重组宿主。可以将本发明的毒素编码基因导入多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫蛋白的细胞内产生和保持。应用合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可将微生物施用于害虫的环境中，微生物可以在那里增殖，并且被摄食。结果是对害虫的控制。可选地，可以在延长毒素的活性和稳定细胞的条件下处理作为毒素基因宿主的微生物。所处理的细胞保留毒性活性，然后可以应用于目标害虫的环境。

[0087] 当通过合适的载体将B.t.毒素基因导入微生物宿主，并且将所述宿主以活的状态应用于环境时，使用某些宿主微生物是必须的。选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面(phylloplane)、叶圈(phyllosphere)、根际(rhizosphere)和/或根面(rhizoplane))的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境(作物和其他昆虫栖息地)与野生型本土微生物成功地竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定保持和表达，以及如希望的那样，提供使杀虫剂免于环境降解和失活的改进保护。

[0088] 已知多种微生物栖息在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。尤其关注的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)。尤其关注的诸如以下的植物圈细菌种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(以前为Rhizobium meliloti)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)；以及诸如以下的植物圈酵母种：深红酵母(Rhodotorula rubra)、胶粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗仑氏隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、红色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。还重要的是着色的微生物。

[0089] 控制害虫的方法

[0090] 当昆虫接触通过转基因植物表达、配制的蛋白质组合物、可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质或者其他递送系统递送的有效量的毒素时，结果通常是昆虫死亡，或昆虫不再进食使得昆虫可获得所述毒素的来源。

[0091] 可以多种方式“施与”或提供主题蛋白质毒素与靶标昆虫接触。例如，可使用转基因植物(其中蛋白质由该植物表达，并存在于其中)，并且其为本领域公知的。还可选择性实现毒素基因在植物特定组织中的表达，诸如根、叶等。这例如可通过使用组织特异性启动子而实现。喷涂使用是另一实例，也是本领域公知的。可合适地配制该主题蛋白质用于预期的终端用途，并且然后喷雾(或以其它方式施与)至植物和/或植物周围/至待保护的植物附近——在发现侵染之前、发现靶标昆虫之后、之前及之后等。例如，还可使用诱饵颗粒，其也是本领域公知的。

[0092] 转基因植物

[0093] 该主题蛋白质可用于实际地保护任何类型的植物免遭鳞翅目昆虫的损害。此类植物的非限制性实例包括玉米、向日葵、大豆、棉花、双低菜(canola)、稻、高粱、小麦、大麦、植物、观赏植物、椒(包括辣椒)、糖甜菜、果树以及草皮，仅略举数例。转化植物的方法是本领域公知的，并且在实施例中描述了示范性的转化方法。

[0094] 本发明优选的实施方案是用编码该主题杀虫蛋白或其变体的基因转化植物。经转化的植物由于在该转化植物的细胞中存在控制量的该主题杀虫蛋白或其变体，因此对昆虫靶标害虫的攻击有抗性。通过将编码B.t.杀虫毒素杀虫特征的遗传材料整合至特定害虫摄食的植物的基因组中，成虫或幼虫在进食该食物植物后会死亡。已转化了单子叶植物和双子叶植物类别中的大量成员。转基因农作物以及果树和蔬菜是商业上感兴趣的。此类作物包括但不限于玉米、稻、大豆、双低菜、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。存在多种将外源遗传材料导入植物细胞，以及获得稳定保持并表达该引入的基因的技术。此类技术包括将包被在微粒上的遗传物质直接导入细胞中(美国专利号4945050和美国专利号5141131)。可以使用土壤杆菌技术转化植物，参见美国专利号5177010、美国专利号5104310、欧洲专利申请号0131624B1、欧洲专利申请号120516、欧洲专利申请号159418B1、欧洲专利申请号176112、美国专利号5149645、美国专利号5469976、美国专利号
5464763、美国专利号4940838、美国专利号4693976、欧洲专利申请号116718、欧洲专利申请号290799、欧洲专利申请号320500、欧洲专利申请号604662、欧洲专利申请号627752、欧洲专利申请号0267159、欧洲专利申请号0292435、美国专利号5231019、美国专利号
5463174、美国专利号4762785、美国专利号5004863以及美国专利号5159135。其他转化技术包括WHISKERSTM技术，参见美国专利号5302523和美国专利号5464765。电穿孔技术已经用于转化植物，参见WO 87/06614、美国专利号5472869、美国专利号5384253、WO 9209696和WO 9321335。所有这些转化专利和公开均通过引用并入。除了多种用于转化植物的技术之外，与外源基因接触的组织类型也可以不同。此类组织将包括但不限于胚发生组织、I型和II型愈伤组织、胚轴、分生组织等。应用本领域技术人员范围内的合适技术，几乎所有植物组织均可在去分化期间转化。

[0095] 编码DIG-3毒素的基因可应用各种如上公开的本领域公知的技术插入植物细胞中。例如，包含在大肠杆菌中起作用的允许对转化微生物细胞进行选择的标记物和复制系统的大量克隆载体可用于制备和修饰用于插入到高等植物中的外来基因。此类操作可包括例如，插入突变、截短、添加或取代，如预期用途所期望的那样。该载体例如包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以将编码Cry蛋白或其变体的序列插入到载体中的适当限制性位点。所得到的质粒用于转化入大肠杆菌细胞，将得到的细胞在适当的营养培养基中进行培养，然后收获并裂解，从而回收可工作量的质粒。通常实施序列分析、限制片段分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法作为分析的方法。每一次操作之后，切割所使用的DNA序列并且连接到下一个DNA序列中。可以将每一个操作的DNA序列克隆到相同的或者其他的质粒中。

[0096] 对于含T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途已经得以广泛研究并在EP120516；Lee和Gelvin(2008)；Fraley等(1986)以及An等(1985)中得以充分地叙述。

[0097] 一旦插入的DNA被整合进入基因组，则它在随后的世代中是相对稳定的。用于转化植物细胞的载体通常含有编码赋予转化的植物细胞抗除草剂或者抗生素的蛋白质的可选择标记基因，所述除草剂或抗生素诸如尤其是双丙氨磷(bialaphos)、卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素等。单个应用的可选择标记基因因此应当允许选择转化了的细胞，同时通过选择化合物抑制不含所述插入DNA的细胞的生长。

[0098] 大量的技术可用于将DNA插入到宿主植物细胞中。这些技术包括用通过作为转化剂的根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)递送的T-DNA转化。此外，也可使用植物原生质体与含有待递送DNA的脂质体的融合、直接注射DNA、基因枪转化(微粒轰击)或电穿孔，以及其他可能的方法。

[0099] 在本发明优选的实施方案中，用其中针对植物优化了蛋白质编码区域的密码子选择的基因转化植物。例如参见美国专利号5380831，其在此通过引用并入。而且，有利的是，使用编码截短毒素的植物。截短的毒素通常编码全长毒素的约55％至约80％。产生用于植物中的合成B.t.基因的方法是本领域公知的(Stewart，2007)。

[0100] 无论转化技术如何，优选将该基因掺入通过在载体中包含植物启动子从而适于在植物细胞中表达B.t杀虫毒素基因和变体的基因转移载体中。除了植物启动子之外，可在植物细胞中有效地使用来自各种来源的启动子以表达外源基因。例如，可使用细菌来源的启动子，诸如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子以及甘露碱合酶启动子。可使用植物病毒来源的启动子，例如，花椰菜花叶病毒35S和19S启动子、来自木薯叶脉花叶病毒的启动子等。植物启动子包括但不限于核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆蛋白启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子和组织特异性启动子。启动子还可含有可改善转录效率的某些增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可使用组成型启动子。组成型启动子在几乎所有的细胞类型并且在几乎所有的时间引导持续的基因表达(例如，肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型中的基因表达，诸如叶子或种子(例如，玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP(酰基载体蛋白)启动子)，也可使用这些启动子。也可使用在植物发育的某些阶段活化，以及在特定植物组织及器官中活化的启动子。此类启动子的实例包括但不限于根特异性的、花粉特异性的、胚特异性的、玉米穗丝特异性的、棉纤维特异性的、种子胚乳特异性的、韧皮部特异性的等等启动子。

[0101] 在某些情况下，期望使用可诱导的启动子。可诱导启动子负责响应特定信号而表达，诸如：物理刺激(例如，热休克基因)；光(例如，RUBP羧化酶)；激素(例如，糖皮质激素)；抗生素(例如，四环素)；代谢物；以及胁迫(例如，干旱)。可使用在植物中起作用的其他期望的转录和翻译元件，诸如5’非翻译前导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸附加信号序列。多种植物特异性基因转移载体是本领域公知的。

[0102] 含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物在遍及北美的玉米和棉花植物中是很流行的，并且这些性状的使用正在全球扩张。已由多个种子公司开发了合并有IR和除草剂耐受性(HT)性状的商业转基因作物。这些包括由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状诸如是对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂，诸如磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶、磺酰苯胺类等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，诸如双丙氨磷(bialaphos)、草铵膦等；4-羟基苯基丙酮酸酯双加氧酶(HPPD)抑制剂，诸如甲基磺草酮(mesotrione)、异 唑草酮(isoxaflutole)等；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂，诸如草甘膦(glyphosate)等，以及乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如氟吡氯禾灵/氟吡甲禾灵(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、氯甲草/禾草灵(diclofop)等的耐受性。其他的实例是已知的，其中转基因提供的蛋白质给植物提供了对除草剂化学类的耐受性，所述除草剂化学类诸如苯氧基酸除草剂和吡啶基氧醋酸酯植物生长素除草剂(参见WO 2007/053482A2)，或苯氧基酸除草剂和芳基氧苯氧基丙酸酯除草剂(参见WO2005107437A2，A3)。通过IR性状控制多种害虫问题的能力是有价值的商业产品概念，而且如果在相同的植物中合并昆虫控制性状和杂草控制性状，则增强了这一产品概念的便利性。此外，通过由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状，诸如本发明的那些，与一种或多种附加的HT性状，诸如上面提及的那些，加上一种或多种额外的输入性状(例如，由B.t.衍生的或其他杀虫蛋白赋予的其他昆虫抗性，由诸如RNAi等机制赋予的昆虫抗性，线虫抗性，疾病抗性，胁迫耐受性，改进的氮利用等)，或输出性状(例如，高油含量、健康油组成、营养改良等)组合，可获得改良的价值。此类组合可通过常规育种(育种堆叠)或涉及同时导入多个基因的新转化事件(分子堆叠)的结合而获得。有益性包括在作物植物中管理害虫的能力和经改进的杂草控制能力，其中所述作物植物还给生产者和/或消费者提供第二有益性。因此，本发明可与其他性状组合使用，从而提供改进的作物品质的完整农学包，其具有灵活且划算地控制任意数量的农学问题的能力。

[0103] 靶昆虫

[0104] 本发明的DIG-3毒素尤其适用于控制鳞翅目昆虫。鳞翅目昆虫是农业、园艺和家庭害虫的重要群体，其每年引起非常大量的损失。该昆虫目包括食叶和食根的幼虫和成虫。鳞翅目虫害包括，但不限于：小蜡螟(Achoroia grisella)、西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana)、黑头长翅卷蛾(Acleris variana)、棉褐带卷叶蛾(Adoxophyes orana)、小地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、秋星尺蠖(Alsophila pometaria)、脐橙螟(Amyelois transitella)、地中海斑螟(Anagasta kuehniella)、桃条麦蛾(Anarsia lineatella)、橙纹犀额蛾(Anisota senatoria)、柞蚕(Antheraea pernyi)、大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属(Archips sp.)、带卷蛾属(Argyrotaenia sp.)、Athetis mindara、家蚕(Bombyx mori)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、粉斑螟(Cadra cautella)、色卷蛾属(Choristoneura sp.)、Cochylls hospes、苜蓿黄蝶(Colias eurytheme)、米蛾(Corcyra cephalonica)、Cydia latiferreanus、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、Datana integerrima、落叶松毛虫(Dendrolimus sibericus)、葡萄小卷叶野螟(Desmi feneralis)、甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜绢野螟(Diaphania nitidalis)、西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella，西南玉米螟(southwestern corn borner))、小蔗杆草螟(Diatraea saccharalis，甘蔗螟(sugarcane borner))、白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)、Eoreuma loftini、烟草粉螟(Esphestia elutella)、Erannis tilaria、盐泽灯蛾(Estigmene acrea)、Eulia salubricola、Eupocoellia ambiguella、女 贞 细 卷 蛾 (Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、蜡螟(Galleria mellonella)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、黑拟蛉蛾(Harrisina americana)、Helicoverpa subflexa、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea，棉铃虫)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens，烟草夜蛾)、新墨西哥草原毛虫(Hemileuca oliviae)、向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)、美国白蛾(Hyphantia cunea)、Keiferia lycopersicella、Lambdina fiscellaria fiscellaria、Lambdina fiscellaria lugubrosa、 雪 毒 蛾(Leucoma salicis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、Loxagrotis albicosta(西部豆地老虎)、草地螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、天幕毛虫属(Malacosoma sp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、Mamestra configurata(bertha armyworm)、Manduca quinquemaculata、烟 草 天 蛾 (Manduca sexta；tobacco hornworm)、豆野螟(Maruca testulalis)、Melanchra picta、秋尺蛾(Operophtera brumata)、古毒蛾属(Orgyia sp.)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis；
European corn borer)、Paleacrita vernata、Papiapema nebris(普通钻心虫)、Papilio cresphontes、红 铃 麦 蛾 (Pectinophora gossypiella)、Phryganidia californica、Phyllonorycter blancardella、暗脉菜粉蝶(Pieris napi)、菜粉蝶(Pieris rapae)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、Platynota flouendana、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、Platyptilia carduidactyla、印度谷螟(Plodia interpunctella)、小菜蛾(Plutella xylostella)、Pontia protodice、一点粘虫(Pseudaletia unipuncta，粘虫)、大豆尺夜蛾(Pseudoplasia includens)、Rachiplusia nu(阿根廷尺蠖)、Sabulodes aegrotata、Schizura concinna、麦蛾(Sitotroga cerealella)、苹白小卷蛾(Spilonta ocellana)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)、Thaurnstopoea pityocampa、Ensola bisselliella、粉纹夜蛾(Trichoplusia hi)、温室野螟(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。

[0105] 还预期了DIG-3毒素控制作物植物的鞘翅目害虫的用途。在一些实施方案中，Cry蛋白可经济地用于控制包括但不限于以下的虫害：例如，根虫，诸如Diabrotica undecimpunctata howardi (南方玉米根虫)、Diabrotica longicornis barberi(北方玉米根虫)和Diabrotica virgifera(西方玉米根虫)；以及蛴螬，诸如圆头犀金龟(Cyclocephala borealis，northern masked chafer)、圆头无斑犀金龟(Cyclocephala immaculata，southern masked chafer)和 日 本 丽 金 龟 (Popillia japonica，Japa Cyclocephala immaculate nese beetle)的幼虫。

[0106] 还预期了DIG-3毒素用于控制寄生线虫的用途，所述寄生线虫包括但不限于：根结线虫(root knot nematode；Meloidogyne icognita)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。

[0107] DIG-3毒素的抗体检测

[0108] 抗毒素抗体。可应用本领域的标准方法容易地制备针对本文公开的毒素、或针对这些毒素的等价毒素或片段的抗体。此类抗体可用于检测DIG-3毒素的存在。

[0109] 一旦分离了B.t.杀虫毒素，则可通过本领域公知的常规方法产生对该毒素特异性的抗体。在数周或数月的期间内重复注射至所选择的宿主会诱发免疫应答，并产生显著的抗B.t.毒素血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，更高度优选的物种是兔、山羊、绵羊和小鼠。从此类经免疫动物获取的血液可通过已建立的方法加工，从而得到与B.t.杀虫毒素反应的抗血清(多克隆抗体)。然后可根据本领域已知的技术，通过吸附至毒素从而亲和纯化抗血清。亲和纯化的抗血清可使用本领域已知的方法通过分离该抗血清内的免疫球蛋白级分从而进一步得以纯化。得到的材料会是与B.t.杀虫毒素反应的免疫球蛋白的异质群体。

[0110] 抗B.t.毒素抗体还可通过制备半合成免疫原而产生，所述半合成免疫原由与免疫原性载体缀合的B.t.杀虫毒素的合成肽片段组成。可用于制备肽片段的多种方案和仪器是本领域公知的。许多合适的免疫原性载体诸如牛血清白蛋白或钥孔 血蓝蛋白也是本领域公知的，用于偶联免疫原和载体蛋白的技术也是公知的。一旦构建了半合成免疫原，则制备对B.t.杀虫毒素片段特异性的抗体的方法与制备和天然B.t.毒素反应的抗体的方法是相同的。

[0111] 抗B.t.毒素单克隆抗体(MAbs)可容易地应用纯化的B.t.杀虫毒素制备。用于产生MAbs的方法已实施20多年，并且是本领域普通技术人员公知的。重复腹膜内或皮下注射佐剂中的纯化B.t.杀虫毒素会在多数动物中诱发免疫应答。从动物中取出超免疫B-淋巴细胞，并与能够无限培养的合适的融合配偶体细胞系融合。其B淋巴细胞可被超免疫并可用于产生MAbs的优选动物是哺乳动物。更优选的动物是大鼠和小鼠，以及最优选的是BALB/c小鼠品系。

[0112] 许多哺乳动物细胞系适用于产生杂交瘤的合适融合配偶体。许多此类细胞系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)及商业供应者处获得。优选的融合配偶体细胞系衍生自小鼠骨髓瘤，并且 Friendly骨髓瘤-653细胞系(Ventrex，Portland，ME)是最优选的。一旦融合，则在选择生长培养基中培养得到的杂交瘤1至2周。两个公知的选择系统可用于从混合的杂交瘤培养物中消除未融合的骨髓瘤细胞、或两个骨髓瘤细胞间的融合。选择系统的选择取决于免疫的小鼠品系以及所使用的杂交瘤融合配偶体。可使用Taggart和Samloff(1983)描述的AAT选择系统；然而，由Littlefield(1964)描述的HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)是优选的，因为其可与上述优选的小鼠品系及融合配偶体相容。筛选使用过的生长培养基中的免疫特异性MAb分泌。酶联免疫吸附测试(ELISA)法最适于这一目的；尽管适用于大体积筛选的放射免疫测试法也是可接受的。可进行被设计用于连续地减少相当数量的无关或不那么期望的培养物的多重筛选。可针对与已知B.t.杀虫毒素的交叉反应性筛选分泌与B.t.杀虫毒素反应的MAb的培养物。可应用商业提供的测定法鉴定优先与优选的B.t.杀虫毒素结合的MAb的同种型。优选的MAb是IgG类，更高优选的MAb是IgG1和IgG2a同种亚型。

[0113] 可亚克隆数次分泌优选的MAbs的杂交瘤培养物，以建立单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核、非贴附细胞培养物的已知方法包括有限稀释、软琼脂糖和荧光激活细胞分选技术。在每次亚克隆后，优选针对抗体分泌和同种型再次分析得到的培养物，以确保建立了稳定分泌优选MAb的培养物。

[0114] 抗B.t.毒素抗体可用于检测本发明要求保护的B.t.杀虫毒素及其变体或片段的各种方法中。公知用报告基团标记的抗体可用于鉴定各种环境中抗原的存在。用放射性同位素标记的抗体已在放射免疫测定法中用了数十年，其以高精度和灵敏度鉴定各种生物学流体中抗原的存在。最近，酶标记的抗体已在ELISA测定法中用作放射标记的抗体的替代。此外，可将对本发明的B.t.杀虫毒素有免疫反应性的抗体结合至固定化物质，诸如聚苯乙烯孔或颗粒，并用于确定测试样本中是否存在B.t.毒素的免疫测定法中。

[0115] 应用核酸探针的检测

[0116] 用于鉴定本发明的毒素和基因的其他方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列是依靠恰当的放射性标记从而使得其能够被检测或者可以如例如美国专利号6268132中所述的制作成固有荧光性的。如本领域所熟知，如果探针分子与核酸样品通过在该两个分子间形成强碱基配对键而杂交，可以合理假设该探针和样品具有实质性的序列同源性。优选地，通过本领域公知的技术，在严格条件下进行杂交，例如如Keller和Manak(1993)所描述的那样。检测的探针提供了以已知的方式确定杂交是否发生的手段。此种探针分析提供了鉴定本发明编码毒素的基因的快速方法。作为本发明探针使用的核苷酸片段可以使用DNA合成仪和标准方法进行合成。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物，用于扩增本发明的基因。

[0117] 核酸杂交

[0118] 如分子生物学领域技术人员公知的那样，两个核酸的相似性可通过它们的杂交倾向而得以表征。如本文所使用的术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样条件，在该条件下探针以比与其他序列更高的可检测程度(例如，比背景高至少2倍)与其靶序列杂交(退火)。严格条件是序列依赖的，并且在不同的环境下会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格程度，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可调节严格条件，以允许序列中的一些错配，从而检测较低程度的相似性(异源探测)。一般地，探针少于1000个核苷酸长，优选少于500个核苷酸长。

[0119] 一般地，严格条件将是以下这些：其中在pH7.0至pH8.3下盐浓度低于约1.5M Na离子，一般为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)而言在至少约30℃、而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)而言在至少约60℃的温度。严格条件也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂而实现。示例性的低严格条件包括用30％至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，并在50℃至55℃在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在55℃至
60℃在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在60℃至65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常为约4至约12小时。

[0120] 特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA/DNA杂交，热熔点(Tm)是其中50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，则Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交条件和/或洗涤条件以促进具有期望同一性的序列的退火。例如，若寻找具有＞90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。一般地，严格条件选择为比特定序列和它的互补序列在确定离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，高严格条件可应用在比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可应用在比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的杂交和/或洗涤；以及低严格条件可应用在比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤；

[0121] Tm(单位为℃)可实验确定或可通过计算估计。对于DNA-DNA杂合物，可从Meinkoth和Wahl(1984)的方程估计Tm：

[0122] Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；

[0123] 其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对计的杂合物长度。

[0124] 备选地，Tm由以下公式描述(Beltz等，1983)。

[0125] Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L[0126] 其中，[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胸苷核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对计的杂合物长度。

[0127] 应用这些方程、杂交和洗涤组合物、以及期望的Tm，本领域普通技术人员能够理解，内在描述了杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果期望的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，优选增加SSC浓度，使得可使用更高的温度。
核酸杂交的广泛指引可在Tijssen(1993)和Ausubel等(1995)中找到，还参见Sambrook等(1989)。

[0128] 可通过标准方法(Sambrook等，同上)进行应用放射标记的基因特异性探针，在Southern印迹上对固定化的DNA的杂交。用于标记多核苷酸探针的放射性同位素可包括32P、33P、14C或3H。将放射性同位素掺入多核苷酸探针分子可通过分子生物学领域技术人员公知的多种方法的任一种完成。(参见，Sambrook等，同上)。一般地，在允许检测与所要求保护的毒素编码基因具有同源性的靶序列的严格条件下进行杂交和随后的洗涤。对于双链DNA基因探针，可在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL变性DNA中，在比DNA杂合物的Tm低20℃-25℃下进行过夜杂交[20X SSPE是3M NaCl、0.2M NaHPO4和
0.02M EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)；100XDenhardt溶液是20gm/L聚乙烯吡咯烷酮、20gm/L Ficoll 400型和20gm/L牛血清白蛋白(级分V)]。

[0129] 通常如下进行洗涤：

[0130] 室温下1X SSPE，0.1％SDS中15分钟两次(低严格洗涤)。

[0131] 在Tm-20℃下0.2X SSPE，0.1％SDS中15分钟一次(中等严格洗涤)。

[0132] 对于寡核苷酸探针，在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在低于杂合物的Tm 10℃-20℃下进行过夜杂交。通过以下公式确定寡核苷酸探针的Tm(Suggs等人，1981)：

[0133] Tm(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)

[0134] 通常如下进行洗涤：

[0135] 室温下1X SSPE，0.1％SDS中15分钟两次(低严格洗涤)。

[0136] 在杂交温度下1X SSPE，0.1％SDS中15分钟一次(中等严格洗涤)。

[0137] 可通过除放射性标记之外的方法使用于杂交的探针分子及探针与靶分子之间形成的杂合分子可检测。此类备选的方法包含在本发明的范围之内。

[0138] 本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都完整引入本文，直到它们与本说明书的明确教导不一致的程度。除非明确指出或暗示，本文所使用的“一种/一个”(“a”、“an”)和“该/所述”(“the”)的意思是“至少一种/一个”。本文通过使用术语“遗传材料”，其意思是包括所有的基因、核酸、DNA和RNA。

[0139] 为命名多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸和引物的核苷酸残基，以及命名蛋白质的氨基酸残基，在本文件中使用了标准的IUPAC简写。核酸序列以标准的5’至3’方向呈现，以及蛋白质序列以标准的氨基(N)端至羧基(C)端方向呈现。

[0140] 下面是阐明用于实践本发明的方法的实施例。本文描述的这些实施例和实施方案应该解释为仅用于阐明的目的，并且在其教导下的各种修饰和改变对于本领域技术人员而言是容易想到的，并且包括在本申请的精神和范围之内，并且包括在所附权利要求的范围之内。这些实施例不能被理解为是限制性的。除非另外注释，所有的百分数是以重量计，并且所有溶剂混合物比例是以体积计。所有的温度是摄氏度。

[0141] 实施例1

[0142] 分离编码DIG-3毒素的基因

[0143] 通过PCR，应用与SEQ ID NO：1的碱基1286至1311杂交的简并正向引物、以及与SEQ ID NO：1的碱基2480至2499的互补序列杂交的错配正向引物，从B.t.菌株PS46L的基因组DNA中分离了本文称为DIG-3的杀虫Cry蛋白。这对引物用于扩增1214bp的片段，相应于SEQ ID NO：1的核苷酸1286至2499。这一序列用作锚定位点，以应用适于TMGenomeWalker Universal试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)的方法开始进行基因组步移。确定了跨越DIG-3编码区的片段的核酸序列。SEQ ID NO：1是编码全长DIG-3蛋白的
3771bp核苷酸序列。SEQ ID NO：2是从SEQ ID NO：1推导的全长DIG-3蛋白的氨基酸序列。注意到在芽孢杆菌属物种中，蛋白质编码区(诸如SEQ ID NO：1的蛋白质编码区)可能以TTG密码子开始，其在翻译上呈现为氨基酸甲硫氨酸。

[0144] 实施例2

[0145] 从DIG-3缺失结构域Iα-螺旋

[0146] 为改进DIG-3毒素的杀虫特性，进行了系列、逐步缺失，其每一步移除DIG-3蛋白N端的一部分。这些缺失移除了结构域I中的部分或全部α-螺旋1和部分或全部α-螺旋2，而保持了α-螺旋3至α-螺旋7的结构完整性。

[0147] 如下设计缺失。这一实施例应用了编码全长DIG-3蛋白的全长嵌合DNA序列(例如，分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1)，以阐明具有67个特定变体的设计原理。其使用了SEQ ID NO：5(编码与Cry1Ab原毒素片段融合的DIG-3核心毒素片段的DNA)的嵌合序列，以提供额外的67个特定变体。本领域技术人员会理解，可类似地操作编码完整DIG-3蛋白质或其N端部分的其他DNA序列，以实现预期的结果。为设计第一个缺失变体的编码序列，移除了编码α-螺旋1直至α-螺旋2A的起始附近的脯氨酸(即，SEQ ID NO：2的全长DIG-3蛋白的P73)密码子的所有碱基。因此，SEQ ID NO：1碱基1至216的消除移除了SEQ ID NO：2的氨基酸1至72的编码序列。在起始处(即，在相应于全长蛋白质氨基酸73的密码子之前)再引入翻译起始ATG(甲硫氨酸)密码子，提供了包含3555个碱基的开放阅读框的缺失变体编码序列，其编码包含1185个氨基酸的缺失变体DIG-3蛋白(即，甲硫氨酸加上全长DIG-3蛋白的氨基酸73至1256)。移除额外的相应于SEQ ID NO：2全长DIG-3蛋白质的残基73至112的单个氨基酸的密码子的系列、逐步缺失提供了缺乏部分或全部α-螺旋2A及α-螺旋2B的变体。因此，第二个设计的缺失变体编码序列需要消除SEQ IDNO：1的碱基1至219，由此移除氨基酸1-73的编码序列。再次通过在剩余编码序列的起始处再引入翻译起始甲硫氨酸密码子，从而实现功能性开封阅读框的重建，由此提供了具有3552个碱基的开放阅读框的第二缺失变体编码序列，其编码包含1184个氨基酸的缺失变体DIG-3蛋白(即，甲硫氨酸加上全长DIG-3蛋白的氨基酸74至1256)。最后设计的缺失变体编码序列需要移除SEQID NO：1的碱基1至336，由此消除氨基酸1-112的编码序列，并且在再引入翻译起始甲硫氨酸密码子之后，提供了具有3435个碱基的开放阅读框的缺失变体编码序列，其编码1145个氨基酸的缺失变体DIG-3蛋白(即，甲硫氨酸加上全长DIG-3蛋白的氨基酸113至1256)。如例示的那样，在消除缺失序列后，在剩余编码序列的开始处添加起始甲硫氨酸密码子，从而重建有功能的开放阅读框。还如所述的那样，在缺失序列的移除使得全长蛋白剩余部分的N端暴露了如上述提供的不稳定性决定氨基酸之一的情况下，则在甲硫氨酸密码子和不稳定性决定氨基酸的密码子之间添加甘氨酸密码子。

[0148] 表3描述了根据上述策略设计的特定变体。

[0149] 表3

[0150] SEQ ID NO：2的全长DIG-3蛋白的缺失变体蛋白质序列以及SEQ ID NO：5的融合蛋白序列

[0151]

[0152]

[0153] 根据意图用于在植物中表达的合成基因的一般原则设计编码表3所述毒素的核酸，如上述的那样。

[0154] 实施例3

[0155] DIG-3B.t.杀虫蛋白编码序列的植物优化版本的设计

[0156] 设计并合成了具有植物密码子偏好的DNA序列，以在转基因单子叶和双子叶植物中产生DIG-3蛋白。从获自GenBank储存的序列的706个蛋白质编码序列(CD)计算了玉米(Zea mays L.)的密码子使用表。烟草(Nicotiana tabacum，1268CDs)、欧洲油菜(Brassica napus，530CDs)、棉花(Gossypium hirsutum，197CDs)和大豆(Glycine max；ca.1000CDs)的密码子使用表从网页http://www.kazusa.or.jp/codon/的数据库下载。在忽略任何使用少于任一种植物类型中的氨基酸的全部密码子使用约10％的冗余密码子之后，计算包含了对于玉米和双子叶植物数据集两者均常见的(以合适的权重平均相对量)高度使用的密码子的偏好密码子集。为衍生出编码DIG-3蛋白的植物优化序列，对实验确定的DIG-3DNA序列进行密码子取代，使得得到的DNA序列具有植物优化密码子偏好表中的总密码子组成。进一步改进该序列，以消除不期望的限制酶识别位点、潜在的植物内含子剪接位点、A/T或C/G残基的长段，以及其他可能干扰该编码区在植物细胞中的RNA稳定性、转录或翻译的基序。进行其他改变以引入期望的限制酶识别位点，以及消除长的内部开放阅读框(除+1之外的阅读框)。这些改变均在保持植物偏好密码子组成的限制下进行。期望序列的合成由供应商进行(DNA2.0，Menlo Park，CA)。

[0157] 就产生合成基因而言的其他指引例如可在WO 97/13402和美国专利号5380831中找到。

[0158] 针对植物优化的编码全长DIG-3毒素的DNA序列在SEQ ID NO：3中给出。针对双子叶植物优化的编码Cry1Ab原毒素片段的DNA序列如SEQ IDNO：6公开的那样。针对玉米优化的编码Cry1Ab原毒素片段的DNA序列如SEQ ID NO：7公开的那样。

[0159] 实施例4

[0160] 构建编码DIG-3杀虫毒素的表达质粒并在细菌宿主中表达

[0161] 使用标准克隆方法构建荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，Pf)表达质粒，所述质粒被工程化以产生由针对植物优化的编码区编码的全长DIG-3蛋白。从New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)获得限制性内切酶，并将T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。应用 Xtra Kit(Macherey-Nagel Inc，Bethlehem，PA)或PlasmidMidi (Qiagen)，根据供应商的说明进行质粒制备。应用Millipore -DA
筒(Billerica，MA)在琼脂糖Tris乙酸凝胶电泳后纯化DNA片段。

[0162] 基本克隆策略承担将DIG-3毒素编码序列(CDS)亚克隆至pDOW1169的SpeI和XhoI限制性位点之间，由此其被置于来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的rrnBT1T2终止子和Ptac启动子的表达控制之下。pDOW1169是在限制酶识别位点之前具有RSF1010复制起始点、pyrF基因和核糖体结合位点的中等拷贝质粒，可将含有蛋白质编码区的DNA片段引入所述限制酶识别位点中(美国申请20080193974)。通过电穿孔将称QI为pDAB4171的表达质粒转化至DC454(具有突变ΔpyrF和lsc::lacI 的近似野生型荧光假单胞菌菌株)或其衍生物，在SOC-大豆水解产物培养基中回收，并铺板到选择培养基上(缺乏尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等，同上)。微生物操作的细节可在通过引用并入本文的Squires等，(2004)；美国专利申请20060008877；美国专利申请20080193974和美国专利申请20080058262中得到。首先通过PCR筛选菌落，然后通过限制性消化小量制备的质粒DNA分析阳性克隆。测序所选择的含有插入物的克隆的质粒DNA，通过应用BigTerminator版本3.1如供应商(Applied Biosystems/Invitrogen)推荐地那样测序，或通TM
过与商业测序供应商(MWG Biotech，Huntsville，AL)的合同测序。应用Sequencher 软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)组装和分析序列数据。

[0163] 在摇瓶中的生长和表达分析。通过摇瓶培养含有表达构建体(例如，克隆DP2826)荧光假单胞菌菌株，从而完成用于表征和昆虫生物测试的DIG-3毒素的生产。应用培养于补充有1％葡萄糖和痕量元素的M9培养基中的种子培养物接种50mL含有5％甘油的规定的基本培养基(Teknova Catalog No.3D7426，Hollister，CA)。振荡下在30°初始培养24小时后，通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)从而诱导经由Ptac启动子的DIG-3毒素基因表达。在诱导的时候以及在诱导后不同的时间取样培养物。通过600nm处的光密度(OD600)测量细胞密度。还可利用适于荧光假单胞菌生长的其他培养基，例如，如在Huang等(2007)和美国专利申请20060008877中所描述的那样。

[0164] 摇瓶样本的细胞分级和SDS-PAGE分析。在每一取样时间，将样本的细胞密度调节为OD600＝20，并在14000xg离心1mL等分试样5分钟。在-80°冷冻细胞沉TM
淀。 应 用 EasyLyse Bacterial Protein Extraction Solution(
Biotechnologies，Madison，WI)从冷冻摇瓶细胞沉淀样品中产生可溶和不可溶级分。将每TM
一细胞沉淀重悬于1mL EasyLyse 溶液中，并在裂解缓冲液中进一步1∶4稀释，并在室温下振荡温育30分钟。4°下14,000rpm离心裂解物20分钟，并回收上清液作为可溶级分。
然后将沉淀(不可溶级分)重悬于等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM Na2HPO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)中。

[0165] 将样本与含β-巯基乙醇的2X Laemmli样本缓冲液(Sambrook等，同上)以1∶1混合，并煮沸5分钟，之后上样至Criterion Bis-Tris 12％凝胶(Bio-Rad Inc.，Hercules，CA.)。在推荐的XT MOPS缓冲液中进行电泳。用Bio-Safe考马斯染料根据生产商(Bio-Rad)的方案染色凝胶，并应用Alpha Innotech Imaging系统(San Leandro，CA)成像。

[0166] 内含体制备。对来自产生不溶B.t.杀虫蛋白(如通过SDS-PAGE和MALDI-MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry(基质辅助激光解吸/电离质谱))证实的那样)的荧光假单胞菌发酵的细胞进行Cry内含体(IB)制备。在37°水浴中解冻荧光假单胞菌发酵沉淀。将细胞于裂解缓冲液(50mM Tris，pH
7.5，200mM NaCl，20mM EDTA二钠盐(乙二胺四乙酸)，1％Triton X-100和5mM二硫苏糖醇(DTT)；在即将使用前加入5mL/L细菌蛋白酶抑制剂混合物(P8465Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))中重悬成25％w/v。应用手持匀化器以最低设置(Tissue Tearor，BioSpec Products，Inc.，Bartlesville，OK)使细胞悬浮。通过用金属匙混合从而将溶菌酶(25mg SigmaL7651，来自鸡蛋清)加入到细胞悬浮物中，并在室温下温育该悬浮物1小时。在冰上冷却该悬浮物15分钟，然后应用Branson Sonifier 250声处理(两个1-分钟期，50％负载周期，30％输出)。通过显微镜检查细胞裂解。如需要的话再加入25mg溶菌酶，并重复温育和声处理。当通过显微镜确认了细胞裂解，则在11,500xg裂解物产物25分钟(4°)，以形成IB沉淀，并弃去上清液。用100mL裂解缓冲液重悬IB沉淀，如上用手持混合器匀化并离心。通过重悬(在50mL裂解缓冲液中)、匀化、声处理和离心重复洗涤IB沉淀，直到上清液变成无色，并且IB沉淀变得结实且颜色为灰白色。最后一次洗涤，将IB沉淀重悬于无菌过滤(0.22μm)的含2mM EDTA的双蒸水中，并离心。将最终的沉淀重悬于无菌过滤的含
2mM EDTA的蒸馏水中，并以1mL等分试样储存于-80°。

[0167] 通过解冻1mL IB沉淀的等分试样，并用无菌过滤蒸馏水1∶20稀释，从而完成IB制备物中蛋白质的SDS-PAGE分析和定量。稀释的样本然后用4X还原样本缓冲液[250mM Tris，pH6.8、40％甘油(v/v)、0.4％溴酚蓝(w/v)、8％SDS(w/v)和8％β-巯基乙醇(v/v)]煮沸，并上样至 4-20％Tris-甘氨酸，12+2孔凝胶(Invitrogen)上，用1X Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(BioRad)运行。以200伏运行该凝胶60分钟，然后用考马斯蓝(在45％甲醇、10％乙酸中的50％G-250/50％R-250)染色，并用蒸馏水中的7％乙酸、5％甲醇脱色。通过将条带密度计值与在同一个凝胶上运行产生标准曲线的牛血清白蛋白(BSA)样本进行比较，从而完成对靶条带的量化。

[0168] 内含体的增溶。以Eppendorf 5415C型微型离心机的最高设置(约14,000xg)离心6mL来自Pf克隆DP2826的内含体悬浮液(含32mg/mL DIG-3蛋白)，以沉淀该内含体。移除储存缓冲液上清液，并在50mL锥形管中用25mL 100mM碳酸钠缓冲液(pH11)置换。应用移液管重悬内含体，并涡旋振荡以彻底混合。将该试管放置至轻轻振荡的平台上，4°过夜，以提取靶蛋白。在4°以30,000xg离心提取物30分钟，并应用Amicon Ultra-15再生纤维素离心过滤装置(30,000分子量截断；Millipore)将得到的悬浮液浓缩5倍。然后应用一次性PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将样本缓冲液更换为10mM CAPS[3-(环己氨基)1-丙磺酸]pH 10。

[0169] 凝胶电泳。通过在含5mM作为还原剂的二硫苏糖醇的 LDS样本缓冲液(Invitrogen)中1∶50稀释，并在95°加热4分钟，从而制备浓缩提取物用于电泳。将样本上样至4-12％ 凝胶的两个泳道中，其旁边有范围为0.2至2μg/泳道的5个
BSA标准品(用于产生标准曲线)。应用MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen)，施加200V的电压，直到示踪染料到达凝胶底部。用在45％甲醇、10％乙酸中的0.2％考马斯蓝G-250染色凝胶，然后脱色，首先用45％甲醇、10％乙酸简单脱色，然后用7％乙酸、5％甲醇长时间脱色，直到背景干净。脱色后，用Biorad Fluor-S MultiImager扫描凝胶。应用该仪器的Quantity One v.4.5.2软件获得染色蛋白条带的背景扣除体积，并产生用于计算储存溶液中DIG-3蛋白浓度的BSA标准曲线。

[0170] 实施例5

[0171] 在荧光假单胞菌中产生的经修饰的DIG-3蛋白的杀虫活性

[0172] 已证实DIG-3B.t.杀虫毒素对鳞翅目物种有效，所述鳞翅目物种包括欧洲玉米螟(ECB；Ostrinia nubilalis(Hübner))、cry1F-抗性ECB(rECB)、小菜蛾(DBM；Plutella xylostella(Linnaeus))、cry1A-抗性DBM(rDBM)、棉铃虫(CEW；Helicoverpa zea(Boddie))、小地老虎(BCW；Agrotis ipsilon(Hufnagel))、烟草夜蛾(TBW；Heliothis virescens(Fabricius))和粉纹夜蛾(CL；Trichoplusia ni(Hübner))。还测试了DIG-3蛋白对草地贪夜蛾(FAW，Spodoptera frugiperda)、Cry1F-抗性FAW(rFAW)和西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera virgifera LeConte)的活性。

[0173] 样本制备和生物测定。将10mM CAPS pH10中的内含体制备物在10mMCAPS pH10中适当地稀释，并且所有的生物测定均含有由这一缓冲液组成的对照处理，将其作为检查死亡率或生长抑制的背景。

[0174] 通过凝胶电泳，应用BSA产生凝胶光密度法标准曲线，从而估计生物测定缓冲液中的蛋白质浓度，其应用BioRad成像系统(具有Quantity One软件版本4.5.2的Fluor-S MultiImager)测得。应用基于考马斯蓝的染料染色凝胶基质中的蛋白质，并在读数前脱色。

[0175] 在生物测定法中测试纯化蛋白质的杀虫活性，在人造昆虫膳食上应用新生鳞翅目幼虫进行该生物测定。从商业养虫室(Benzon Research Inc.，Carlisle，PA)保持的群体获得卵，并从这些卵中孵育出BCW、CEW、CL、DBM、rDBM、ECB、FAW和TBW的幼虫。WCR卵获自Crop Characteristics，Inc.(Farmington，MN)。rECB和rFAW的幼虫从收集自专有群体(Dow AgroSciences LLC，Indianapolis，IN)的卵孵育得到。

[0176] 该生 物 测定 在 专门 设 计用 于 昆虫 生 物测 定 的128孔塑 料 托盘(C-DInternational，Pitman，NJ)中进行。每孔含有1.0mL多物种鳞翅目膳食(Southland Products，Lake Village，AR)。通过移液管将40μL蛋白质样本等分试样递送至每孔的2 2 2
1.5cm 膳食表面上(26.7μL/cm)。膳食浓度计算为每平方厘米(cm)孔中表面积的DIG-3蛋白质的量(ng)。将经处理的托盘置于通风橱中，直至膳食表面的液体被蒸发，或被吸收至膳食中。

[0177] 在羽化(eclosion)后数小时内，用沾湿的驼毛刷拾起单个幼虫并置于经处理的膳食上，每个孔一个幼虫。然后用透明塑料的粘性片密封受侵染的孔，通风以允许气体交换(C-D International，Pitman，NJ)。将生物测定托盘放置在受控的环境条件(28℃，～40％相对湿度，16∶8[光∶暗])下5天，此后记录暴露于每一蛋白样本的昆虫总数、死亡昆虫数以及存活昆虫的体重。计算每一处理的死亡率百分比和生长抑制百分比。如下计算生长抑制(GI)：

[0178] GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

[0179] 其中，TWIT是处理中昆虫的总重量，

[0180] TNIT是处理中昆虫的总数，

[0181] TWIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫总重，以及

[0182] TNIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫总数。

[0183] 将GI50确定为其中GI值为50％的膳食中的DIG-3蛋白浓度。将LC50(50％致死浓度)记录为其中50％的测试昆虫被杀死的膳食中的DIG-3蛋白质浓度。应用JMP软件(SAS，Cary，NC)进行统计分析(单因素ANOVA)。

[0184] 表6展示了针对欧洲玉米螟及cry1F-抗性欧洲玉米螟(rECB)的DIG-3蛋白的生物测定测试结果。预料不到且令人惊讶的发现是rECB测试昆虫如野生型ECB昆虫一样对DIG-3蛋白的作用易感。

[0185] 表6

[0186] 针对ECB和rECB计算的LC50和GI50值，置信区间(CI)为95％

[0187]昆虫 LC50(ng/cm2) 95％CI GI50(ng/cm2) 95％CI
ECB 591.9 308.1-1315.3 122.6 45.6-328.4
rECB 953.6 534.1-1953.6 270.9 53.0-1382.2

[0188] 表7展示了对广谱的鳞翅目和鞘翅目害虫(WCR)的生物测定结果。DIG-3蛋白对小菜蛾及rDBM均具有预料不到且令人惊讶的活性。此外，DIG-3Cry蛋白对控制多种其他鳞翅目昆虫的生长也有效。

[0189] 表7

[0190] 由测试害虫摄食的DIG-3蛋白的杀虫和生长抑制效果

[0191]2 *
测试昆虫 在9000ng/cm 的反应 统计分析
DBM 100％死亡率
rDBM 100％死亡率
CL 75％死亡率，显著GI (GI)P＜0.001，df＝1，α＝0.05
CEW 显著GI (GI)P＝0.02，df＝1，α＝0.05
TBW 可见GI，一些死亡率 不能提供
BCW 可见GI 不能提供
FAW 没有观察到活性
rFAW 没有观察到活性
WCR 没有观察到活性

[0192]

[0193] *GI＝生长抑制。P-值＝检验统计量。df＝自由度，α水平0.05＝检验显著水平

[0194] 实施例6

[0195] 土壤杆菌转化

[0196] 在二元植物转化和表达质粒的构建中使用了标准克隆技术。限制性内切核酸酶和T4DNA连接酶获自NEB。应用 质粒制备试剂盒或 AXXtra Midi试剂盒(两者均来自Macherey-Nagel)，根据生产商的说明进行质粒制备。应用PCR纯化试剂盒或QIAEX 凝胶提取试剂盒(两者均来自Qiagen)在凝胶分
离后纯化DNA片段。

[0197] 包含编码天然或修饰形式的DIG-3蛋白、或其片段的核苷酸序列的DNA片段可通过商业供应商(例如，DNA2.0，Menlo Park，CA)合成，并作为标准质粒载体中的克隆片段提供，或可通过对其他含有合适核苷酸序列的构建体的标准分子生物学操作而获得。可鉴定DIG-3编码区内部的独特限制位点，并可合成包含DIG-3编码区的限制位点之间的序列的DNA片段，每一个此类片段编码特定的缺失、插入或其他DIG-3变化。可将编码经修饰的DIG-3片段的DNA片段与其他DIG-3编码区片段或其他Cry编码区片段在适当的限制位点处连接，以获得编码期望的全长DIG-3蛋白、缺失或变体DIG-3蛋白或融合蛋白的编码区。例如，可鉴定位于第一个DIG-3编码区开始处的合适的限制识别位点，以及该DIG-3编码区内部的第二限制位点。该第一DIG-3编码区在这些限制位点的切割会产生包含部分该第一DIG-3编码区的DNA片段。对另一DIG-3编码区或其他Cry编码区特异性的、其两侧为类似坐落的相容限制位点的第二DNA片段可用于与该第一DNA限制片段组合，以构建变体或融合克隆。

[0198] 在非限制性实施例中，基础克隆策略可亚克隆全长或经修饰的DIG-3编码序列(CDS)至植物表达质粒的NcoI和SacI限制位点中。得到的植物表达盒含有在植物表达元件(例如，植物表达启动子、3’端翻译终止和聚腺苷酸附加决定子等)控制下的适当的DIG-3编码区，将其亚克隆至二元载体质粒中，例如应用 技术或标准限制酶片段TM克隆方法。如果使用 技术的话，则例如可使用LR Clonase (Invitrogen)从而将全长和经修饰的基因植物表达盒重组至二元植物转化质粒中。应用含有细菌基因的二元植物转化载体是方便的，当该质粒存在于大肠杆菌和土壤杆菌细胞中时，所述细菌基因赋予针对抗生素大观霉素的抗性。应用含有在期望的宿主植物中有功能的植物可表达的可选择标记基因的二元载体质粒也是方便的。植物可表达的可选择标记基因的实例包括但不限于编码转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aphII)的那些，其赋予对抗生素卡那霉素、新霉素和G418的抗性；以及编码针对草甘膦、潮霉素、氨甲喋呤、草胺膦(phosphinothricin)(双丙氨磷)、咪唑啉酮、磺脲类和三唑并嘧啶(诸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴苯腈(bromoxynil)、达拉朋(dalapon)等)的抗性或耐受性的那些。

[0199] 制备根癌土壤杆菌Z707S(Z707的链霉素抗性衍生物，Hepburn等，1985)的电-感受态细胞，并应用电穿孔转化(Weigel和Glazebrook，2002)。电穿孔后，添加1mL YEP肉汤(gm/L：酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)至试管中，并将细胞-YEP悬浮液转移至15mL小管(cuvette)中，在水浴中28°在恒定搅拌下温育4小时。将细胞涂板至含有大观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的YEP加琼脂(25gm/L)上，并在28°温育该板2-4天。选择充分分开的单个克隆，在如前述那样的含大观霉素和链霉素的新鲜YEP+琼脂板上划线，并在28°温育1-3天。

[0200] 应用载体特异性引物、以制备自所选择的土壤杆菌菌落的模板质粒DNA，通过PCR分析证实DIG-3基因插入物在二元植物转化载体中的存在。应用Qiagen Mini Preps，根据生产商的说明，提取15mL在YEP(具有如前所述的大观霉素和链霉素)中生长的过夜培养物的4mL等分试样的细胞沉淀。来自在土壤杆菌电穿孔转化中使用的二元载体的质粒DNA被包含在内作为对照。应用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶根据生产商的说明，以0.5X浓度完成PCR反应。在MJ Research Peltier热循环仪上进行PCR反应，所述热循环仪用以下条件设定程序：步骤1)94°3分钟；步骤2)94°45秒；步骤3)55°30秒；步骤4)72°1分钟/kb预期产物长度；步骤5)29次至步骤2；步骤6)72°10分钟。循环后在4°保持该反应。通过琼脂糖凝胶电泳(例如，0.7％至1％琼脂糖，w/v)分析扩增产物，并通过溴化乙锭染色显现。选择其PCR产物与质粒对照相同的菌落。

[0201] 备选地，通过土壤杆菌操作领域普通技术人员公知的标准分子生物学方法，对制备自候选土壤杆菌分离株的质粒DNA进行限制消化指纹图谱作图，从而完成含DIG-3基因插入物的二元植物转化载体的质粒结构。

[0202] 通过土壤杆菌介导转化方法获得转化植物的领域的普通技术人员将能够理解，还可有利的应用除Z707S之外的其他土壤杆菌菌株，并且菌株的选择将取决于待转化宿主植物物种的身份。

[0203] 实施例7

[0204] 在双子叶植物中产生DIG-3B.t.杀虫蛋白和变体

[0205] 拟南芥转化。应用浸花法(Weigel和Glazebrook，2002)转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-01。用所选择的土壤杆菌菌落接种1mL至15mL含有适当用于选择的抗生素的YEP肉汤的培养基。培养物在28°温育过夜，以220rpm恒定搅拌。将每种培养物用于接种两个500mL的含有适当用于选择的抗生素的YEP肉汤培养基，新培养物在恒定搅拌下在28°温育过夜。室温下以约8700x g沉淀细胞10分钟，弃去产生的上清液。将细胞沉淀轻轻地重悬于500mL含有以下物质的渗滤培养基中：1/2x Murashige和Skoog盐(Sigma-Aldrich)/Gamborg B5维生素(Gold BioTechnology，St.Louis，MO)、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/升的在DMSO中的1mg/mL储存液)和300μL/升Silwet L-77。将约1个月大的植物浸入该培养基中15秒，小心地确保浸没了最新的花序。侧放植物，并覆盖(透明或不透明)24小时，用水洗涤，并直立放置。使植物在22°、16小时光/8小时暗的光周期下生长。浸泡后约4周，收获种子。

[0206] 拟南芥生长和选择。使新鲜收获的T1种子在室温下在干燥剂的存在下干燥至少7天。将种子悬浮于0.1％琼脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中，然后在4°分层(stratify)2天。为准备种植，用细蛭石覆盖在10.5英寸x21英寸萌发托盘(T.O.Plastics Inc.，Clearwater，MN)中的Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.，Bellevue，WA)，用Hoagland溶液(Hoagland和Arnon，1950)地下灌溉直至潮湿，然后允许排水24小时。将分层的种子播种至蛭石上，并用潮湿的顶盖(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)2
覆盖7天。在光强度为120-150μmol/m 秒的长白昼条件(16小时光/8小时暗)下及恒定温度(22°)和湿度(40-50％)下，在Conviron(CMP4030型或CMP3244型；Controlled Environments Limited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中进行种子萌发和植物生长。开始用Hoagland溶液给植物浇水，随后用去离子水浇水，以保持土壤湿润但不潮湿。

[0207] 播种5-6天后移除顶盖，并用化学选择剂喷涂植物，以杀死从未转化的种子萌发的植物。例如，若由二元植物转化载体提供的植物可表达的可选择标记基因是pat或bar基因(Wehrmann等，1996)，则可通过喷涂1000X的Finale溶液(5.78％草胺膦(glufosinate ammonium)，Farnam Companies Inc.，Phoenix，AZ.)选择经转化的植物。以5-7天的时间间隔进行随后的两次喷雾。最后一次喷雾后7-10天鉴定存活者(有活力地生长的植物)，并将其移植至用Sunshine Mix LP5准备的花盆中。移植的植物用保湿罩(humidity dome)覆盖3-4天，并置于上述生长条件下的Conviron中。

[0208] 双子叶植物转化所属领域的技术人员会理解，当使用其他植物可表达的可选择标记基因(例如，除草剂耐受性基因)时，其他的选择转化植物的方法也是可利用的。

[0209] 转基因拟南芥的昆虫生物测定。在人工膳食覆盖测定法中证实了表达经修饰的Cry蛋白的转基因拟南芥品系对敏感的昆虫种类是有效的。通过适当的方法对提取自转基因和非转基因拟南芥品系的蛋白质进行定量，并将样本体积调整至标准蛋白浓度。如上所述那样在人工膳食上进行生物测定。非转基因拟南芥和/或缓冲液及水被包括在测试中，作为背景检查处理。

[0210] 实施例8

[0211] 用于产生超级二元载体(superbinary vectors)的土壤杆菌转化

[0212] 土壤杆菌超级二元系统可方便地用于转化单子叶植物宿主。构建和证实超级二元载体的方法已被充分公开，并且通过引用并入本文(Operating Manual for Plasmid pSB1，3.1版，可从Japan Tobacco，Inc.，Tokyo，Japan获得)。应用标准分子生物学和微生物学方法产生超级二元质粒。超级二元质粒结构的核实/确认应用如上述对于二元载体所述的方法完成，并可如Operating Manual for Plasmid pSB1中建议的那样对所述方法进行修改。

[0213] 实施例9

[0214] 在单子叶植物中产生DIG-3B.t.杀虫蛋白和变体

[0215] 土壤杆菌介导的玉米转化。将来自High II F1杂交的种子(Armstrong等，1991)种植在含有95％Metro-Mix 360无土培养基(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)和5％粘土/壤土的混合物的5加仑花盆中。使植物在应用了高压钠和金属卤化物灯组合的温室中生长，光周期为16∶8小时光∶暗。为获得用于转化的未成熟F2胚，进行人工近缘授粉(sib-pollination)。在授粉后8-10天，当胚为约1.0至2.0mm大小时，分离未成熟的胚。

[0216] 感染和共培养。如下对玉米穗进行表面消毒：用液体皂洗涤(scrub)，浸入70％乙醇中2分钟，并且然后浸入20％商业漂白剂(0.1％次氯酸钠)中30分钟，然后用无菌水润洗。如下制备含有超级二元载体的土壤杆菌细胞的悬浮液：将1-2环在含有100mg/L大观霉素、10mg/L四环素和250mg/L链霉素的YEP固体培养基上在28°生长了2-3天的细菌转移至5mL含有100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基(LS基础培养基(Linsmaier和Skoog，1965)、N6维生素(Chu等，1975)、1.5mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、68.5gm/L蔗糖、
36.0gm/L葡萄糖、6mM L-脯氨酸，pH 5.2)中。涡旋振荡该溶液，直到获得均匀的悬浮液，然后将浓度调节至约200Klett单位(应用具有紫色滤片的Klett-Summerson比色计)的最终密度，或550nm处的约0.4的光学密度。将未成熟的胚直接分离至含有2mL感染培养基的微量离心管中。移除该培养基，并更换为1mL密度为200Klett单位的土壤杆菌溶液，并在室温下温育该土壤杆菌和胚溶液5分钟，并然后转移至共培养培养基(LS基础培养基，N6维生素、1.5mg/L 2，4-D、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯氨酸、0.85mg/LAgNO3、100μM乙酰丁香酮、3.0gm/L Gellan胶(PhytoTechnology Laboratories.，Lenexa，KS)，pH 5.8)中，在
25°在黑暗条件下保持5天。

[0217] 共培养后，将胚转移至选择培养基中，此后在约8周的期间获得经转化的分离株。为选择用含有植物可表达的pat或bar可选择标记基因的超二元质粒转化的玉米组织，与双丙氨磷(Gold BioTechnology)一起使用LS基培养基(LS基础培养基，N6维生素、1.5mg/L 2，4-D、0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)甲磺酸一水合物；PhytoTechnologies Labr.)、
30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯氨酸、1.0mg/L AgNO3、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/L Gellan胶，pH5.7)。将胚转移至含有3mg/L双丙氨磷的选择培养基中，直到获得胚发生分离株。通过以
2周的时间间隔将其转移至新鲜选择培养基中，从而使回收的分离株变大，用于再生和进一步分析。

[0218] 玉米转化所属领域的技术人员会理解，当使用其他植物可表达可选择标记基因(例如，除草剂耐受基因)时，其他选择转化植物的方法也是可利用的。

[0219] 再生和种子产生。为进行再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素、30gm/L蔗糖、5mg/L苄氨基嘌呤、0.25mg/L 2，4-D、3mg/L双丙氨磷、250mg/L头孢噻肟、-2 -12.5gm/L Gellan胶，pH5.7)中，在弱光条件(14μEm s )下保持1周，然后在强光条件(约-2 -1
89μEm s )下一周。然后将组织转移至“36”再生培养基(除了缺乏植物生长调节因子外，与诱导培养基相同)。当小植物长至3-5cm长时，将它们转移至含有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt盐及维生素(1972)；PhytoTechnologies Labr.)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖和2.0gm/L Gellan胶，pH 5.8)的玻璃培养管中，以允许它们进一步生长并发育枝和根。
将植物移植至与本文早前所描述的相同的土壤混合物中，并在温室中使其生长至开花。进行人工授粉，以进行种子产生。

[0220] 实施例10

[0221] 转基因玉米的生物测定

[0222] 通过常规生物测定方法(例如参见，Huang等，2006)证实了植物细胞中产生的DIG-3蛋白和变体的生物活性。例如，人们可通过将衍生自产DIG-3毒素植物的各种植物组织或组织块饲喂受控饲喂环境中的靶昆虫，从而能够证实效力。备选地，可从衍生自产DIG-3毒素植物的各种植物组织中制备蛋白质提取物，并在如本文之前描述的人工膳食生物测定中掺入该提取的蛋白质。应当理解，需将此类饲喂测试的结果与应用适当对照组织类似进行的生物测定相比较，其中所述对照组织来自不产生DIG-3蛋白或变体的宿主植物；或与其他对照样本相比较。

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