[0001] 交叉引用

[0002] 本申请要求2014年10月31日提交的美国临时专利申请62/073,649号的权益，所述申请的公开明确通过引用并入本文。

[0003] 公开背景

[0004] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis(B.t.))是土传细菌，其产生称为δ内毒素或Cry蛋白的杀虫晶体蛋白质。Cry蛋白是口服毒物，其通过作用于易感昆虫的中肠细胞而发挥功能。一些Cry毒素已被证明具有针对线虫的活性。δ内毒素的一个扩充列表在Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名学网站上维持和定期更新(见Crickmore et al.1998、第808页)。

[0005] 鞘翅目是重要的农作物害虫群，每年对作物造成广泛的破坏。鞘翅目害虫的实例包括科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)，玉米根虫，苜蓿象鼻虫，贝尔象鼻虫和日本甲虫。科罗拉多马铃薯甲虫是一种经济上重要的害虫，以马铃薯、茄子、番茄、辣椒、烟草和其他茄科植物(nightshade family)的叶为食。科罗拉多马铃薯甲虫是造成严重的马铃薯脱叶问题，部分原因是它对许多类型的杀虫剂已经生成了抗性。Cry毒素，包括Cry3、Cry7和Cry8家族的成员，对鞘翅目昆虫具有杀虫活性。

[0006] 虽然目前在转基因植物中部署的Cry蛋白质的产生可以提供对上述害虫的强力保护，从而保护谷物产量，但在人工侵染试验中已经出现了成体害虫，表明幼虫控制不彻底。另外，抗虫昆虫种群的发展威胁着Cry蛋白在害虫控制中的长期耐久性。小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik，1994)，粉纹夜蛾(Janmaat和Myers，2003,2005)和谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(Tabashnik等人，2008)等抗Cry蛋白质鳞翅目昆虫已经在田间发生。鞘翅目昆虫同样在田间发现了Cry蛋白的抗性(Gassman et al.，PLoS ONE July 2011|Volume 6|Issue 7|e22629)。对B.t.Cry蛋白的昆虫抗性可通过若干种机制产生(Heckel等，2007，Pigott and Ellar，2007)。已在昆虫中鉴定了Cry蛋白的多个受体蛋白质类型，并且在每一受体类型中存在多个实例。例如，对特定Cry蛋白的抗性可通过受体蛋白的钙粘蛋白结构域的毒素结合部分的突变而产生。抗性的其他方式可通过原毒素加工蛋白酶介导。

[0007] 人们对开发可提供管理鞘翅目昆虫害虫的额外工具的新Cry蛋白质有兴趣。在转基因植物中组合产生具有不同作用模式的蛋白质，将阻止昆虫抗性的发展，并保持B.t.昆虫害虫防治技术的长期效用。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明基于杀虫毒素的发现，这些杀虫毒素基于本文中称为DIG-303的Cry蛋白毒素，包括DIG-303的变体，编码这些毒素的核酸，应用该毒素控制害虫的方法，在转基因宿主细胞中产生该毒素的方法，以及表达该毒素的转基因植物。SEQ ID NO:2中的天然DIG-303毒素的氨基酸序列表明，DIG-303归类到Cry32家族是最好的。

[0010] 如实施例1所述，从本文称为PS18A、也称为DBt10340的B.t.菌株中发现并分离了编码DIG-303蛋白的核酸。确定了全长编码区的核酸序列，并从核酸序列推导出全长蛋白质序列。编码DIG-303毒素的核酸序列在SEQ ID NO:1中给出。使用杀虫核心片段作为查询的BLAST搜索发现，DIG-303毒素蛋白与搜索时已知的最接近的Cry毒素的核心片段(AAG36711)具有小于60％的序列同一性，并且与最接近的公开序列(Axmi174ATX25337)具有小于70％的同源性。因此，DIG-303代表了Cry32蛋白家族内的一个新亚类。

[0011] DIG-303可以单独使用或者与其他Cry毒素组合使用，其他Cry毒素例如(事件DAS-59122-7)、Cry3Bb1(事件MON88017)、Cry3A(事件MIR604)、嵌合Cry3A/Cry1Ab(eCry3.1Ab、FR8A、事件5307、WO 2008/121633 A1)、CryET33和CryET34、Vip1A、Cry1Ia、CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、TIC809、TIC810、以及CryET74，以控制抗性鞘翅目昆虫群体的发生。此外，DIG-303毒素可以单独使用或者与其他可控制其他害虫群体的发生的Cry蛋白(例如Cry1F、Cry1Ab、Vip3A、Cry2A、Cry1Da、Cry1Ia、和Cry1Ac)联合使用，以控制鳞翅目抗性昆虫群体的发生。

[0012] DIG-303杀虫毒素也可与用于控制其他虫害的RNAi方法联合使用。例如，DIG-303杀虫毒素可在转基因植物中与抑制CPB、玉米根虫或其他昆虫害虫中的关键基因的dsRNA联合使用。此类靶基因包括例如，CPB中的ATP酶编码基因。其他此类靶基因包括，例如，玉米根虫中的液泡ATP酶、ARF-1、Act42A、CHD3、EF-1α、ROP、RNAPII、和TFIIB。合适的靶基因的实例是液泡ATP酶，如WO2007035650中所公开的那样。

[0013] 在一个实施方案中，本发明提供了分离的、经处理的、或经制剂化的DIG-303杀虫毒素多肽，其包含选自下组的核心毒素区段：

[0014] (a)SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列；

[0015] (b)与SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列；

[0016] (c)与SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；

[0017] (d)与SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；

[0018] (e)与SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列；

[0019] (f)与SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列；和

[0020] (g)SEQ ID NO:2的约1至约685的残基的氨基酸序列，具有多达20个对SEQ ID NO:2的毒素的表达或活性没有不利影响的氨基酸取代、缺失或修饰；或(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)和(g)的杀虫活性片段。

[0021] 在进一步的实施方案中，上述DIG-303杀虫毒素多肽可以连接到另一不同的cry毒素的C末端原毒素区段，例如，另一不同的cry毒素的其中核心毒素区段已被去除的C-末端区域。特别地，Cry1Ab或Cry1Ac/Cry1Ab嵌合毒素的C末端原毒素区段在本领域熟知有助于嵌合的cry核心毒素的稳定表达。

[0022] 在另一个实施方案中，本发明提供了纯化的，经处理的或制剂化的DIG-303杀虫毒素，其具有与天然毒素在天然状态下所具有的性质基本上不同的性质，其包含选自下组的DIG-303核心毒素区段：(a)包含SEQ ID NO:2的残基1至1257的氨基酸序列的多肽；(b)包含与SEQ ID NO:2的残基1至1257的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽；和(c)包含SEQ ID NO:2的残基1至1257的氨基酸序列、其中具有最多达20个不会不利地影响SEQ ID NO:2的毒素的表达或活性的氨基酸取代、缺失或修饰的多肽；或(a)、(b)、或(c)的杀虫活性片段。

[0023] 在另一个实施方案中，本发明提供包含DIG-303杀虫毒素的转基因植物。

[0024] 在另一实施方案中，本发明提供控制害虫群体的方法，包括使所述群体与杀虫有效量的DIG-303杀虫毒素接触。

[0025] 在另一实施方案中，本发明提供了编码DIG-303杀虫毒素的非天然存在的核酸。

[0026] 在另一实施方案中，本发明提供了DNA构建体，其包含编码DIG-303杀虫毒素的核苷酸序列，其中该序列与能够在植物中驱动表达的异源启动子可操作连接。本发明还提供了转基因植物，其包含稳定地掺入其基因组的该DNA构建体，以及用于保护植物免遭害虫的方法，包括将在所述植物中表达该构建体。

[0027] 就“分离的”或“纯化的”而言，，申请人意图表示核苷酸或多肽分子已经借助人力从其天然环境中被移出并放置在不同的环境中。因此，分离的核苷酸和多肽分子包括这样的DNA或蛋白质分子，其已经被纯化、浓缩或通过其它方式使得其基本上不含苏云金芽孢杆菌细胞材料。分离的DIG-303杀虫多肽或核苷酸分子的实施方案可以具有少于约30％，少于约20％，少于约10％，少于约9％，少于约8％，少于约7％，更少约6％，少于约5％，少于约4％，少于约3％或少于约2％，或少于约1％(以干重计)的污染蛋白质(例如来自苏云金芽孢杆菌者)。当分离的DIG-303杀虫多肽或核苷酸实施方案系重组产生时，培养基材料、化学前体和/或非DIG-303杀虫多肽或核苷酸占分离的DIG-303杀虫多肽或核苷酸的小于约30％，小于约20％，小于约10％，小于约5％，小于约4％，小于约3％或小于约2％，或小于约1％(以干重计)。

[0028] 序列简述

[0029] SEQ ID NO:1显示具有10个可变核苷酸的编码DIG-303毒素的DNA；3771nt。

[0030] SEQ ID NO:2显示具有10个可变氨基酸残基的DIG-303蛋白序列；1257aa。

[0031] SEQ ID NO:3是编码DIG-303毒素的玉米优化的DNA序列，其中36个5'核苷酸被缺失；3735nt。

[0032] SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:3编码的DIG-303蛋白质序列，其中12个N-末端氨基酸残基被缺失。1245aa

[0033] 公开详述

[0034] DIG-303杀虫毒素:除了SEQ ID NO:2的全长DIG-303毒素之外，本发明还包括了其杀虫活性变体。通过术语“变体”，发明人意图包括片段、某些缺失和插入突变体、以及某些融合或嵌合蛋白。DIG-303包括三个通常与Cry毒素相关的结构域。在描述包括在本发明中的DIG-303杀虫毒素变体之前，简要地概览三结构域Cry毒素和具体的DIG-303蛋白毒素的架构是有用的。

[0035] 多数苏云金芽孢杆菌δ-内毒素晶体蛋白分子包括两个功能区段。蛋白酶抗性核心毒素是第一个区段，并相应于该蛋白质分子的约前一半。完整的～130kDa的原毒素分子在昆虫消化道中被蛋白酶迅速地加工为抗性核心区段。被这一酶促加工过程除掉的C端区段在本文中称为“C端原毒素区段”。该C端原毒素区段被认为参与了毒素的晶体形成(Arvidson等，1989)。该C端原毒素区段因此可能通过减少毒素分子的蛋白酶加工(Haider等，1986)或通过降低毒素可溶性(Aronson等，1991)，以限制核心对昆虫的可接近性，从而表达出部分对该毒素的昆虫特异性。B.t.毒素，即使在一个类型之内，在长度上，以及在从核心毒素区段至C端原毒素区段的转换的精确位置上也有一定程度的差异。从从核心毒素区段至C端原毒素区段的转换通常会出现在全长毒素的约50％至约60％之间。SEQ ID NO:2公开了全长DIG-303多肽的1257个氨基酸的序列，其中N-端685个氨基酸构成DIG-303核心毒素区段。

[0036] 已确定了Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1、Cry3Bb1、Cry4Aa、Cry4Ba和Cry8Ea1的三维晶体结构。这些核心毒素的结构令人注意地相似，并且包含具有下述特征的三个不同的结构域(de Maagd等，2003中综述)。

[0037] 结构域I是7个α螺旋的束，其中螺旋5被六个两亲性螺旋环绕。已经有人提出这一结构域涉及孔形成，并且该结构域与包括溶血素和大肠杆菌素在内的其他孔形成蛋白享有同源性。DIG-303蛋白的结构域I包含SEQ ID NO:2的大致氨基酸残基1-300。

[0038] 结构域II由三个反向平行的β片层形成，该三个β片层被一起包装为β棱柱。这一结构域的环在结合昆虫中肠受体当中起着重要作用。在Cry1A蛋白中，位于结构域IIβ片层顶点的暴露于表面的环(surface exposed loop)参与了与鳞翅目昆虫钙粘蛋白的结合。Cry3Aa结构域II的环以类似的方式与科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)(Say)(CPB)的膜相关金属蛋白酶结合(Ochoa-Campuzano等，2007)。结构域II与包括卵黄和jacaline在内的某些糖结合蛋白共享同源性。DIG-303蛋白的结构域II包含SEQ ID NO:2的大致氨基酸残基300-525。

[0039] 结构域III是两个反向平行β片层的β夹心(sandwich)。这一结构域在结构上与诸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白质的糖结合结构域相关。

[0040] 保守的B.t.序列区块2和区块3分别位于结构域2的N端和C端附近。因此，这些保守的序列区块2和区块3是所述三个功能结构域之间大致的边界区域。这些具有保守的DNA和蛋白质同源性的区域已被开发用于工程化重组B.t.毒素(美国专利6090931、WO1991001087、WO1995006730、美国专利5736131、美国专利6204246、美国专利6780408、WO1998022595、美国专利申请20090143298，和美国专利7618942)。DIG-303蛋白的结构域III包含SEQ ID NO:2的大致氨基酸残基526-685。

[0041] 已报道，在鳞翅目昆虫中，Cry1A毒素结合某些类型的受体蛋白质，包括钙粘蛋白、氨基肽酶和碱性磷酸酶，其余的仍有待鉴定(Honée et al.、1991；Pigott and Ellar，2007)。在鞘翅目昆虫中，已经鉴定出Cry3Aa的两种受体；在科罗拉多马铃薯甲虫中已经鉴定出ADAM金属蛋白酶(Ochoa-Campuzano et al.、2007)，在拟步甲属(Tenebrio)中已经鉴定出一种钙粘蛋白(Fabrick et al.、2009)。鉴于苏云金芽孢杆菌毒素和害虫的多样性，预计更多的受体将被识别出来，这些受体将包括额外的蛋白质类型和膜表面取代基。

[0042] 现已报道，结构域I的α-螺旋1在受体结合后即被移除。Aronson等(1999)证实了与刷状缘膜囊泡(BBMV)结合的Cry1Ac受到保护不被蛋白酶K从残基59开始(正在α-螺旋1之后)切割；Cry1Ab引证了类似的结果。Gomez等(2002)发现，在与BBMV受体结合后形成的Cry1Ab寡聚物缺乏结构域I的α-螺旋1。而且，Soberon等(2007)显示，Cry1Ab和Cry1Ac的缺乏包含三维Cry结构上的α-螺旋1的约60个氨基酸的N-端缺失突变体能够在缺乏钙粘蛋白结合的情况下组装分子量约60kDa的单体至前孔中。已报道这些N-端缺失突变体对Cry-抗性昆虫幼虫有活性。此外，Diaz-Mendoza等(2007)描述了Cry1Ab的43kDa和46kDa片段，这些片段保持了对地中海玉米螟(西非蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))的活性。已证实这些片段包括Cry1Ab的氨基酸残基116至423；然而，其未描述具体的氨基酸序列，并且这些蛋白水解片段的活性机制也是未知的。Gomez等(2002)、Hofte等(1986)的结果与Soberon等(2007)和Diaz-Mendoza等(2007)的结果相反：Hofte等报道了从Cry1Ab的N端缺失36个氨基酸导致杀虫活性的丧失。

[0043] DIG-3的氨基端缺失变体：在其一个方面，本发明提供了DIG-303变体，其中一个或多个α-螺旋的全部或部分被缺失，以改进杀虫活性以及避免昆虫产生抗性。进行这些修饰是为了提供具有改良的特性(诸如改良的靶害虫谱、效力和昆虫抗性管理)的DIG-303变体。在本主题发明的一些实施方案中，修饰可能影响全长原毒素活化和孔形成的效率，导致昆虫中毒。更具体地，为提供具有改良特性的DIG-303变体，描述了移除部分编码N-端的DNA序列的逐步缺失。这样的缺失移除结构域I中的全部α-螺旋1以及全部或部分α-螺旋2，而保留α-螺旋3至7的结构完整性。因此，本发明部分地涉及通过对结构域1的α-螺旋成分进行工程改造提高孔形成的效率，从而改善Cry蛋白的效力。更具体地，本主题发明提供改良的DIG-
303蛋白质，其被设计为在与Cry1蛋白结构域I中的α-螺旋1和2具有推定的二级结构同源性的区域中具有N端缺失。

[0044] 在N-端缺失变体编码序列的设计中，将编码甲硫氨酸的ATG起始密码子插入在设计为表达该缺失变体的核苷酸序列的5’端。对于设计用于转基因植物的序列，恪守Varshavsky(1997)的“N-端规则”可能是有益的。其教导：某些氨基酸当显露为蛋白质的N-端残基时，可能促成真核细胞中蛋白质的失稳定和降解。例如，从对酵母和哺乳动物细胞的观察中收集的数据表明，N-端去稳定氨基酸是F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E，可能还有P。尽管蛋白质降解机制的具体细节在不同生物之间可能会有些不同，但上述N-端失稳性氨基酸身份的保守性提示类似的机制可能在植物细胞中起作用。例如，Worley等(1998)发现在植物中，N-端规则包括碱性和芳香族残基。有可能的是，在植物蛋白酶作用下该B.t.杀虫蛋白α-螺旋3起点附近的蛋白水解裂解可能暴露了失稳性的N-端氨基酸。这样的加工可能使得经裂解的蛋白质易于迅速降解，并限制该B.t.杀虫蛋白的积累，以致其水平不足以有效控制昆虫。因此，对于某些以一个失稳性氨基酸起始的N-端缺失变体的实例，可以在翻译起始密码子与该失稳性氨基酸之间添加编码G(甘氨酸)氨基酸的密码子。

[0045] 蛋白酶敏感变体昆虫消化道蛋白酶通常在帮助昆虫从饵食蛋白质中获得所需氨基酸中发挥作用。了解最多的昆虫消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其似乎是最常见的类型(Englemann和Geraerts(1980)，尤其是在鳞翅目昆虫物种中。鞘翅目昆虫具有比鳞翅目昆虫消化道更中性至酸性的消化道。多数鞘翅目昆虫幼虫和成虫(例如CPB)的中肠稍具酸性，以及半胱氨酸蛋白酶提供了主要的蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更确切地说，Thie和Houseman(1990)在CPB中鉴定和表征了半胱氨酸蛋白酶：组织蛋白酶B样和组织蛋白酶H样，以及天冬酰胺蛋白酶：组织蛋白酶D样。Gillikin等(1992)描述了西方玉米根虫幼虫消化道中的蛋白水解活性，并发现主要是半胱氨酸蛋白酶。美国专利号7230167公开了归因于组织蛋白酶G的蛋白酶活性存在于西方玉米根虫中。昆虫消化道蛋白酶的多样且不同的活性水平可能影响昆虫对特定B.t.毒素的敏感性。

[0046] 在本发明的另一实施方案中，可在期望的位置构建蛋白酶裂解位点，以影响某些易感害虫幼虫的中肠内的蛋白质加工。这些蛋白酶裂解位点可通过诸如化学基因合成或剪接重叠PCR(Horton等，1989)的方法引入。例如，可任选地在Cry蛋白结构中的特定位点任选地插入丝氨酸蛋白酶识别序列，以影响易感幼虫的中肠中在期望缺失点处的蛋白质加工。可以此种方式应用的丝氨酸蛋白酶包括鳞翅目昆虫中肠丝氨酸蛋白酶，诸如胰蛋白酶或胰蛋白酶样酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶等(Christeller等，1992)。此外，可以构建经验鉴定的缺失位点来实现蛋白质活化，缺失位点是通过对由未分级幼虫中肠蛋白酶制备物产生的Cry蛋白质消化产物进行测序、或通过与刷状缘膜囊的结合而经验鉴定的。通过基因缺失或通过引入蛋白酶裂解位点产生的经修饰的Cry蛋白具有改良的对鳞翅目害虫和其它靶标害虫的活性，所述鳞翅目害虫包括欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、Loxagrotis albicosta，以及鞘翅目害虫如西方玉米根虫、南方玉米根虫、北方玉米根虫(即叶甲属物种)，和其他靶昆虫。

[0047] 对属于相同家族的丝氨酸蛋白酶，诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶和组织蛋白酶G样蛋白酶；鞘翅目半胱氨酸蛋白酶，诸如组织蛋白酶(B-样、L-样、O-样以及K-样蛋白酶)(Koiwa等，(2000)和Bown等，(2004)]；鞘翅目金属蛋白酶，诸如ADAM10[Ochoa-Campuzano等，(2007))；以及鞘翅目天冬氨酸蛋白酶，诸如组织蛋白酶D-样和E-样、胃蛋白酶、plasmepsin和凝乳酶，可以通过在期望的加工位点工程构建合适的识别序列，以影响某些昆虫害虫的易感性幼虫的中肠内的Cry蛋白加工，来进一步加以利用。

[0048] 引入此类蛋白酶裂解位点的一个优选位置是在α-螺旋2B和α-螺旋3之间的“间隔物”区域内。另一个优选的引入蛋白酶切割位点的位置是在α-螺旋3和α-螺旋4之间的间隔物区域内。通过基因缺失或者通过导入蛋白酶切割位点而产生修饰的DIG-303杀虫毒素蛋白，以提供改进的对昆虫害虫的活性，所述昆虫害虫包括但不限于科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)、玉米根虫、苜蓿象鼻虫，贝尔象鼻虫和日本甲虫，等等。

[0049] 有多种技术可以用来确定多肽氨基酸序列(包括N端或C端残基)。例如，可顺序地使用自动Edman降解方法以确定至多30个氨基酸残基的N端氨基酸序列，每个残基的准确率98％。此外，确定包含多肽羧基末端的氨基酸序列也是可能的(Bailey等，1992；美国专利号
6046053)。因此，在一些实施方案中，可表征通过蛋白酶水解加工方式(例如，通过从昆虫消化道中制备的蛋白酶)活化的B.t.Cry蛋白酶，并鉴定该活化毒素片段的N端或C端氨基酸。
通过在编码序列的合适位置处引入或消除蛋白酶加工位点以允许或消除较大变体蛋白质被昆虫、植物或微生物蛋白酶蛋白水解裂解，从而产生的DIG-303变体也在本发明的范围之内。应理解此类操作的最终目的是产生具有与完整(全长)毒素蛋白具有相同或比之更好的活性的毒素片段分子。

[0050] DIG-303杀虫毒素的结构域：预期DIG-303杀虫毒素的单独的结构域(以及与此类结构域90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的变体)可用于形成与来自其他Cry毒素的结构域的组合，以提供新的具有增加的害虫毒性谱、改善的效能或升高的蛋白质稳定性的新毒素。DIG-303的结构域I大致包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基1至300。DIG-303的结构域II大致包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基301至525。DIG-3的结构域III大致包含SEQ ID NO:2的氨基酸残基526至685。结构域对换或位移是另一种产生改变的δ-内毒素蛋白的机制。δ-内毒素蛋白与δ-内毒素蛋白之间的结构域II和III可以对换，产生具有改良的杀害虫活性或靶标谱的杂种或嵌合毒素。结构域II参与受体结合，结构域III结合某些类型的受体蛋白并且可能参与低聚物毒素预孔(pre-pore)的插入。已显示在其他毒素中某些结构域III的取代产生了更好的抗甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)毒性(de Maagd等，
1996)，且存在设计Cry毒素结构域对换的指引(Knight等，2004)。

[0051] 用于产生重组蛋白及测试它们杀害虫活性的方法是本领域公知的(例如，参见Naimov等，2001；de Maagd等，1996；Ge等，1991；Schnepf等，1990；Rang等，(1999))。已研究了来自Cry1A和Cry3A蛋白的结构域I插入膜中并形成孔的能力。结构域I的α-螺旋4和5在膜插入和孔形成中起着关键作用(Walters等，1993；Gazit等，1998；Nunez-Valdez等，2001)，而其他螺旋可能如伞的肋条那样与膜表面接触(Bravo等，2007；Gazit等，1998)。

[0052] 通过进行少数氨基酸缺失、取代或添加而产生的DIG-303变体:可容易地以顺序地方式在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中进行氨基酸缺失、取代和添加，并通过生物测试法测试此类改变对杀虫活性的影响。假如改变的数目有限，则此类测试不会涉及不合理的实验。本发明包括核心毒素(大致为SEQ ID NO:2的氨基酸1-645)中已进行了至多10个、至多15个或至多20个氨基酸添加、缺失或取代的的杀虫活性变体。

[0053] 本发明包括具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1-685有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核心毒素区段的DIG-303杀虫毒素变体。可通过进行随机突变制备变体，或者可以设计变体。在设计突变体的情况下，当在毒素的负责生物活性或参与三维结构(其最终负责生物活性)确定的关键区域中保持氨基酸同一性时，产生与天然毒素具有类似活性的变体的可能性很高。如果取代是保守的，保持活性的概率也会很高。
一种氨基酸可以归为下述类别：非极性、不带电极性、碱性和酸性。保守取代，将一个类别的氨基酸取代为相同类型的另一氨基酸，对该变体的生物活性产生实质改变的可能性最小。
表1提供了属于每个类别的氨基酸的实例列表。

[0054] 表1

[0055]

[0056] 在一些情况中，还可以进行非保守取代。关键因素是这些取代必须不显著减小该毒素的生物活性。变体包括由于诱变而在氨基酸序列上不同的多肽。本发明包含的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即保持杀虫活性。

[0057] 还可设计这样的变体蛋白，即其在序列水平上不同，但维持了相同或类似的整体关键三维结构、表面电荷分布等。例如参见，美国专利号7058515；Larson等(2002)；Stemmer(1994a，1994b，1995)以及Crameri等(1996a，1996b，1997)。美国专利US 8,513,492B2[0058] 核酸:分离的编码DIG-303杀虫毒素的核酸是本发明的一个方面。这包括编码SEQ ID NO:2的核酸，及其互补链，以及编码SEQ ID NO:2的杀虫变体的其他核酸。术语“分离的”如本文上文所定义。由于遗传密码子的简并性，多个不同的DNA序列可编码本文公开的氨基酸序列。产生这些编码相同的或基本相同的毒素的备选DNA序列在本领域技术人员的范围之内。

[0059] 基因合成:编码本文描述的DIG-303杀虫毒素的DNA序列可通过各种本领域公知的方法制得。例如，可通过亚磷酸三酯和亚磷酰胺化学来制得合成的基因片段或合成的基因(Caruthers等，1987)，并且可利用商业供应商按需进行基因合成。全长基因可用多种方式进行组装，包括例如，通过限制性片段的连接或重叠寡核苷酸的聚合酶链式反应组装(Stewart和Burgin，005)。此外，可通过应用位点特异性终止寡核苷酸的PCR扩增制得末端基因缺失。

[0060] 例如，可通过多个供应商的任一种当前实施的方法，通过合成构建体，制得编码DIG-303杀虫毒素的核酸。(例如美国专利号7482119)。这些基因或其部分或变体可合成地构建，例如通过使用基因合成仪以及例如美国专利号5380831的设计方法。备选地，合成或天然存在的基因的变体可应用制备点突变的标准分子生物学技术容易地构建。使用可通过商业途径获得的外切核酸酶或者内切核酸酶，根据标准方法可以制备这些基因的片段。例如，可以用诸如Bal31的酶或者位点定向诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。而且，可以使用多种限制酶得到编码活性片段的基因片段。

[0061] 在给出了DIG-303杀虫毒素氨基酸序列情况下，可应用预期宿主优选的同义密码子通过逆翻译该编码序列，然后通过应用替代同义密码子移除可能在转录、翻译或mRNA稳定性方面产生问题的序列来精修该序列。此外，可以利用同义密码子来在非DIG-303阅读框(即阅读框2、3、4、5和6)中导入终止密码子以消除假的长开放编码序列。

[0062] 量化多肽或核酸序列同一性:如下确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比同一性：首先将序列以最佳比较目的进行比对。两个序列间的百分比同一性是由该序列共有的同一位置数的函数(即，百分比同一性＝同一位置数/总位置数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方案中，该两个序列一样长。两个序列间的百分比同一性可应用类似于以下描述的那些得以确定，允许或不允许空位。在计算百分比同一性时，一般计算精确的匹配。

[0063] 可应用数学算法完成两个序列间百分比同一性的确定。此类算法的非限制性实例是Altschul et al.(1990)，以及由Karlin和Altschul(1990)提出、由Karlin和Altschul(1993)改进、并整合至BLASTN和BLASTX程序中的算法。BLAST检索可方便地用于确定核酸或蛋白数据库中与查询序列同源(相似)的序列。可进行BLASTN检索(得分＝100，字长＝12)以鉴定与本发明要求保护的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可进行BLASTX检索(得分＝50，字长＝3)以鉴定与本发明要求保护的杀虫蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。

[0064] 空位BLAST(Gapped BLAST)(Altschul等，1997)可用于获得为比较目的的空位比对。备选地，PSI-Blast可用于进行迭代检索，其检测分子间的距离关系(Altschul等，1997)。当应用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各个程序的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

[0065] 用于比较序列的数学算法的非限制性实例是ClustalW算法(Thompson等，1994)。ClustalW比较序列并比对整个氨基酸或DNA序列，并因此可提供有关整个氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在多个可商购DNA/氨基酸分析软件包中使用，诸如Vector NTI Program Suite(Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。当用ALIGNX比对氨基酸序列时，可方便地使用缺省设置，即10的空位开放罚分、0.1空位延伸罚分以及blosum63mt2比较矩阵，从而评估两个序列间的百分比氨基酸类似性(一致性)或同一性。当使用ALIGNX比对DNA序列时，可方便地使用缺省设置，即15的空位开放罚分、6.6的空位延伸罚分以及swgapdnamt比较矩阵，以评估两个序列间的百分比同一性。

[0066] 用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是Myers和Miller(1988)的算法。该算法已整合至wSTRETCHER程序中，所述程序是wEMBOSS序列比对软件包(可在http://emboss.sourceforge.net/中获得)的一部分。wSTRETCHER应用标准动态规划算法(其使用线性空间)的修正版计算两个序列的最佳全局比对。用于计算比对的取代矩阵、空位插入罚分和空位延伸罚分可以具体指定。当使用wSTRETCHER比较核苷酸序列时，可与打分矩阵文件EDNAFULL一起使用16的空位开放罚分和4的空位延伸罚分。当用于比较氨基酸序列时，可与EBLOSUM62一起使用12的空位开放罚分和2的空位延伸罚分。

[0067] 用于比较序列的数学算法的其它非限制性实例是Needleman和Wunsch(1970)的算法，其整合至序列比对软件包GAP版本10和wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)中。GAP版本10可应用以下参数从而用于确定序列同一性或相似性：对于核苷酸序列，应用50的空位权重(GAP Weight)和3的长度权重(Length Weight)，以及nwsgapdna.cmp打分矩阵，建立％同一性和％相似性。对于氨基酸序列比较，应用8的空位权重和2的长度权重，以及BLOSUM62打分矩阵，建立％同一性或％相似性。

[0068] wNEEDLE读取两个输入序列，在它们的全长上找出最佳比对(包括空位)，并在文件中写入它们的最佳全局序列比对。该算法应用含有每一种可能的残基或核苷酸匹配的值的打分矩阵，探索所有可能的比对并选择最佳的。wNEEDLE寻找具有最大可能得分的比对，其中比对的得分等于获自打分矩阵的匹配总分减去从比对序列中的开放和延伸空位产生的罚分。取代矩阵和空位开放及延伸罚分是用户指定的。当比较氨基酸序列时，使用10的缺省空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EBLOSUM62比较矩阵。当应用wNEEDLE比较DNA序列时，使用10的缺省空位开放罚分、0.5的空位延伸罚分以及EDNAFULL比较矩阵。

[0069] 也可使用等价的程序。“等价程序”预期了任何的序列比较程序，其中对于任何讨论的两个序列，所述程序产生这样的比对，即当与由ALIGNX、wNEEDLE或wSTRETCHER产生的相应比对相比较时，所述比对具有同一的核苷酸或氨基酸残基匹配及同一的百分比序列同一性。所述％同一性是两个序列间同一的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比，以及％相似性是两个序列间的匹配除以报告的比对区(包括长度上的任何空位)的百分比。也可通过检查手工地进行比对。

[0070] 重组宿主:可以将本发明的毒素编码基因导入多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫蛋白质的细胞内产生和保持。应用合适的微生物宿主，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，可将微生物施用于害虫的环境中，微生物可以在那里增殖，并且被摄食。结果是害虫的控制。备选地，可以在延长毒素的活性和稳定重组宿主细胞的条件下处理含有毒素基因的微生物。经处理的细胞，其包含经过处理的、保留杀虫活性的本发明毒素多肽，可以应用于目标害虫的环境以控制害虫。

[0071] 当通过合适的DNA构建体，例如载体将B.t.毒素基因导入微生物宿主，并且将所述宿主以活的状态应用于环境时，使用某些宿主微生物是必须的。选择已知占据一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境(作物和其他昆虫栖息地)与野生型本土微生物成功地竞争，提供表达多肽杀虫剂的基因的稳定保持和表达，以及如希望的那样，改进保护杀虫剂免于环境降解和失活。

[0072] 已知多种微生物栖息在多种重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根际(植物根周围的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。尤其重要的是微生物，诸如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱菌属(Alcaligenes)。尤其重要的诸如以下的植物圈细菌种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia  marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter  xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium  meliloti)(以前为Rhizobium meliloti)、真养产碱菌
(Alcaligenes entrophus)、和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)。进一步感兴趣的是真菌，尤其是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、和短梗霉属(Aureobasidium)，尤其感兴趣的是以及诸如以下的植物圈酵母种：深红酵母(Rhodotorula rubra)、红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、变黄罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。还重要的是着色的微生物。一种高度优选的宿主是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。

[0073] 分离的毒素多肽和本发明的组合物：可以处理或制备本发明的DIG-303杀虫毒素多肽，例如以制备制剂化的农药组合物。制剂化的农药组合物的实例包括蛋白质组合物、可喷雾蛋白质组合物、诱饵基质或其它递送系统。在一个例子中，表达本发明的DIG-303杀虫毒素的B.t.细胞或重组宿主细胞可以使用标准的技术培养基和发酵技术培养。一旦发酵周期完成，可以通过本领域已知的方法从发酵液分离B.t.孢子或其它重组宿主细胞和/或毒素晶体。B.t.孢子或重组宿主细胞也可以在施用或配制施用于植物之前进行处理。例如，可以化学处理分离的B.t.孢子和/或毒素晶体以延长杀虫活性，由此包括本发明的经处理的多肽。在重组宿主中B.t.生长毒素多肽，然后处理B.t.以延长杀虫活性的方法是已知的并已公开。参见例如美国专利号4,695,462和4,695,455。

[0074] 本发明的分离或处理的DIG-303杀虫毒素可以制剂化成细碎的颗粒状固体颗粒，小丸，可湿性粉剂，粉尘(dust)，水悬浮液或分散体，乳剂，喷雾剂，液体浓缩物或其它杀虫剂制剂。这些杀虫剂制剂通过将本文的DIG-303杀虫剂多肽与佐剂，稀释剂，表面活性剂，分散剂，惰性载体和其它组分组合来制备，以便于处理和应用以控制一种或多种目标害虫。这样的制剂成分是本领域已知的，施用方法和确定提供期望的杀虫活性的B.t.孢子和/或分离的DIG-303多肽晶体的水平的方法亦是本领域已知的。

[0075] 控制害虫的方法：当昆虫接触通过杀虫剂组合物(例如制剂化的蛋白质组合物、可喷雾的蛋白质组合物、诱饵基质、转基因植物表达、或者其他递送系统)递送的有效量的本文公开的DIG-303毒素时，结果通常是昆虫死亡，或昆虫不再进食给昆虫提供该蛋白质的来源。

[0076] 可以多种方式“施与/施用”或提供主题蛋白质毒素与靶标昆虫接触。例如，本发明的DIG-303杀虫毒素可以在与辅料、稀释剂、载体等等一起配制，以例如提供细碎固体颗粒物、颗粒、小丸、可湿性粉剂、粉尘、水悬液或分散体、以及乳剂等形式的组合物之后施用。或者，可使用转基因植物(其中蛋白质由该植物表达，并存在于其中)来投放DIG-303杀虫多肽，此为本领域公知的。还可实现毒素基因在植物特定组织中的选择性表达，诸如根、叶等。这例如可通过使用组织特异性启动子而实现。喷洒使用是另一实例，也是本领域公知的。可合适地配制该主题蛋白质用于预期的终端用途，并且然后喷雾(或以其它方式施与)至植物和/或植物周围/至待保护的植物附近——在发现侵染之前、发现靶标昆虫之后、之前及之后等。例如，还可使用诱饵颗粒，其也是本领域公知的。

[0077] 转基因植物.本文中公开的DIG-303杀虫毒素可用于实际地保护任何类型的植物免遭昆虫害虫的损害。此类植物的非限制性实例包括马铃薯、茄子、辣椒、番茄，以及其他茄科植物。此类植物的其他实例包括玉米、向日葵、大豆、棉花、芸苔、稻、高粱、小麦、大麦、植物、观赏植物、胡椒(包括辣椒)、糖甜菜、果树以及草皮，仅略举数例。转化植物的方法是本领域公知的，并且在实施例中描述了示范性的转化方法。

[0078] 本发明优选的实施方案是用编码DIG-303杀虫毒素、杀虫蛋白质、或其变体的基因转化植物。经转化的植物由于在该转化植物的细胞中存在控制量的该主题杀虫蛋白或其变体，因此能耐受昆虫靶标害虫的攻击。通过将编码B.t.杀虫毒素杀虫特征的遗传材料整合至特定害虫摄食的植物的基因组中，成虫或幼虫在消费该食物植物后将死亡。已转化了大量的单子叶和双子叶植物。转基因农作物以及果树和蔬菜是商业上感兴趣的。此类作物包括但不限于玉米、稻、大豆、芸苔、向日葵、紫花苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。存在多种将外源遗传材料导入植物细胞，以及获得稳定保持并表达该引入的基因的技术。此类技术包括将包被在微粒上的遗传物质直接导入细胞中(美国专利号4945050和美国专利号5141131)。可以使用土壤杆菌技术转化植物，美国专利号5177010、欧洲专利号EP131624B1、欧洲专利号EP159418B1、欧洲专利号EP176112B1、美国专利号5149645、EP120516B1、美国专利号5464763、美国专利号4693976、欧洲专利号EP116718B1、欧洲专利号EP290799B1、欧洲专利号EP320500B1、欧洲专利号EP604662B1、美国专利号7060876、美国专利号6037526、美国专利号6376234、欧洲专利号EP292435B1、美国专利号5231019、美国专利号5463174、美国专利号4762785、美国专利号5608142，和美国专利号5159135。其他转化技术包括WHISKERSTM技术，见美国专利号5302523和美国专利号5464765。电穿孔技术也已被用于转化植物，参见WO1987006614、美国专利号5472869、美国专利号5384253、WO199209696、美国专利号6074877、WO1993021335，和美国专利号5679558。除了多种用于转化植物的技术之外，与外源基因接触的组织类型也可以不同。此类组织将包括但不限于胚胎组织、I型和II型愈伤组织、胚轴、分生组织等。应用本领域技术人员范围内的合适技术，几乎所有植物组织均可在分化期间转化。

[0079] 编码DIG-303杀虫毒素的基因可应用各种如上公开的本领域公知的技术插入植物细胞中。例如，包含在大肠杆菌中起作用的允许对转化微生物细胞进行选择的标记物和复制系统的大量克隆载体可用于制备和修饰用于插入到高等植物中的外来基因。此类操作可包括例如，插入突变、截短、添加或取代，如预期用途所期望的那样。该载体例如包括pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，可以将编码Cry蛋白或其变体的序列插入到载体的适当限制性位点。所得到的质粒用于转化大肠杆菌，将得到的细胞在适当的营养培养基中进行培养，然后收获并裂解，回收可工作量的质粒。通常实施序列分析、限制性分析、电泳和其他生物化学-分子生物学方法作为分析的方法。每一次操作之后，切割所使用的DNA序列并且连接到下一个DNA序列中。可以将每一个操作的DNA序列克隆到相同的或者其他的质粒中。

[0080] 对于含T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途已经得以广泛研究并在欧洲专利号EP120516B1；Lee和Gelvin(2008)；Fraley等(1986)以及An等(1985)中得以充分地叙述。

[0081] 一旦插入的DNA被整合进入基因组，则它在随后的世代中是相对稳定的。用于转化植物细胞的载体通常含有编码赋予转化的植物细胞抗除草剂或者抗生素的蛋白质的选择标记基因，诸如膦丝菌素、双丙膦、卡那霉素、新霉素、G418、博来霉素、潮霉素、或编码对草甘膦、甲氨蝶呤、吲哚啉酮、磺酰脲和三唑并嘧啶类除草剂，诸如氯磺隆、溴苯腈、茅草枯等的抗性或耐性的基因。进一步感兴趣的是赋予对除草剂如盖草能、喹禾灵、禾草灵等的耐性的基因，例如AAD基因(美国专利申请号20090093366)。单个应用的选择标记基因因此应当允许选择转化了的细胞，同时通过选择化合物抑制不含插入DNA的细胞的生长。

[0082] 大量的技术可用于将DNA插入到宿主植物细胞中。这些技术包括通过作为转化剂的根癌土壤杆菌或毛根土壤杆菌递送，用T-DNA转化。此外，也可使用植物原生质体与含有待递送DNA的脂质体的融合、直接注射DNA、基因枪转化(微粒轰击)或电穿孔，以及其他可能的方法。

[0083] 在本发明优选的实施方案中，用其中针对植物优化了蛋白质编码区域的密码子选择的基因转化植物。例如参见美国专利号5380831。例如，本发明的DIG-303杀虫毒素可以优化用于在双子叶植物中，例如在马铃薯，茄子，番茄，辣椒，烟草和其他茄科植物中表达。本发明的DIG-303杀虫毒素也可以优化用于在其他双子叶植物中表达，或在单子叶植物如玉米(Zea mays)中表达。而且，有利地使用编码截短毒素的植物。截短的毒素通常编码全长毒素的约55％至约80％。产生用于植物中的合成B.t.基因的方法是本领域公知的(Stewart，2007)。

[0084] 无论转化技术如何，优选将该基因掺入通过在载体中包含植物启动子从而适于在植物中表达B.t杀虫毒素基因和变体的基因转化载体中。除了植物启动子之外，可在植物细胞中有效地使用来自各种来源的启动子以表达外源基因。例如，可使用细菌来源的启动子，诸如章鱼氨酸合酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子以及甘露碱合酶启动子；可使用病毒来源的启动子，例如，花椰菜花叶(CaMV)病毒35S和19S启动子等等。植物衍生的启动子包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白质(conglycinin)启动子、菜豆蛋白启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子、和组织特异性启动子。启动子还可含有可改善转录效率的某些增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于ADH1-内含子1和ADH1-内含子6。可使用组成型启动子。组成型启动子在几乎所有的细胞类型并且在几乎所有的时间引导持续的基因表达(例如，肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责特定细胞或组织类型中的基因表达，诸如叶子或种子(例如，玉米醇蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP(酰基载体蛋白)，也可使用这些启动子。也可使用在植物发育的某些阶段活化，以及在特定植物组织及器官中活化的启动子。此类启动子的实例包括但不限于根特异性、花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝特异性、棉纤维特异性、种子胚乳特异性、韧皮部特异性的启动子。

[0085] 在某些条件下，期望使用可诱导的启动子。可诱导启动子负责响应特定信号而表达，诸如：物理刺激(例如，热休克基因)；光(例如，RUBP羧化酶)；激素(例如，糖皮质激素)；抗生素(例如，四环素)；代谢物；以及胁迫(例如，干旱)。可使用在植物中起作用的其他期望的转录和翻译元件，诸如5’非翻译引导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸附加信号序列。
多种植物特异性基因转运载体是本领域公知的。

[0086] 本发明包括不全能(非全能)的植物细胞，不是繁殖材料(例如，在一些实施方案中，叶细胞；某些实施方案中排除种子细胞)，并且不能分化成全植物的植物细胞。本发明包括除了具有再生成整个植物以外的其他用途的植物细胞。例如，所述植物细胞可用于产生蛋白质(例如本发明的DIG-303蛋白质)。因此，本发明的植物细胞包括具有全能性以外的用途(即，本发明的一些细胞不可再生成整个植物)的植物细胞。然而，一些实施方案确实包括种子细胞和可以再生成整个植物的植物细胞。

[0087] 含有抗虫性(IR)性状的转基因作物在北美的玉米和棉花植物中是很流行的，并且这些性状的使用正在全球扩张。已由多个种子公司开发了合并有IR和抗除草剂(HT)性状的商业转基因作物。这些包括由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状诸如是抗乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂，诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、sulfonanilides等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，诸如双丙磷(bialaphos)、草铵膦等；4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)抑制剂，诸如米斯通除草剂(mesotrione)、isoxaflutole等；5烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂，诸如草甘膦等，以及乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如盖草能(haloxyfop)、喹禾灵(quizalofop)、禾草灵(diclofop)等。其他的实例是已知的，其中转基因提供的蛋白质给植物提供了对除草剂化学类的抗性，诸如卤代苯氧酸除草剂和吡啶基氧醋酸酯植物生长素除草剂(参见WO2007053482)，或卤代苯氧酸除草剂和芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂(参见美国专利申请20090093366)。通过IR性状控制多种害虫问题的能力是有价值的商业产品概念，而且如果在相同的植物中合并昆虫控制性状和杂草控制性状，则增强了这一产品概念的便利性。此外，通过以下性状的单植物组合，可获得改良的价值：由B.t.杀虫蛋白赋予的IR性状，诸如本发明的那些；一种或多种附加的HT性状，诸如上面提及的那些；加上一种或多种额外的输入性状(例如，由B.t.衍生的或其他杀虫蛋白赋予的其他昆虫抗性，由诸如RNAi等机制赋予的昆虫抗性，线虫抗性，疾病抗性，胁迫耐受性，改进的氮利用等)，或输出性状(例如，高油含量、健康油组成、营养改良等)。此类组合可通过常规育种(育种堆)或涉及同时导入多个基因的转化事件的结合(分子堆或共转化)而获得。有益性包括在作物植物中提供管理害虫的能力和经改进的杂草控制能力，其中所述作物植物还给生产者和/或消费者提供第二有益性。因此，本发明可与其他性状组合使用，从而提供改进的作物品质的完整农学包，具有灵活且成本有效地控制任意数量的农学问题的能力。

[0088] 靶昆虫:本发明的DIG-303杀虫毒素特别适合用于控制昆虫害虫。鞘翅目是一群重要的农业、园艺和家庭害虫，每年造成极大量的损失。这一大目昆虫涵盖食叶和食根的幼虫和成虫，包括例如金花虫科(Chrysomelidae)、瓢虫科(Coccinellidae)、象鼻虫科(Curculionidae)、皮蠹科(Dermestidae)、叩甲科(Elateridae)、金龟子科(Scarabaeidae)、小蠹科(Scolytidae)、和拟步甲科(Tenebrionidae)等昆虫科的成员。这些科中包括金花虫科中的金花虫(leaf beetles)和潜叶虫(leaf miners)，马铃薯甲虫(例如科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata Say)、葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea Fabricius)、黑角负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)、向日葵叶甲
(Zygogramma exclamationis Fabricius))，和瓢虫科的甲虫(例如墨西哥豆瓢虫
(Epilachna varivestis Mulsant))。进一步的实例是金龟子(chafer)和金龟子科的其他甲虫(例如日本甲虫(Popillia  japonica  Newman)、北方圆头犀金龟(白蛴螬，
Cyclocephala borealis Arrow)、南方圆头犀金龟(白蛴螬，Cyclocephala immaculata Olivier)、欧洲金龟子(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)、白蛴螬(Phyllophaga crinita Burmeister)、胡萝卜甲虫(Ligyrus gibbosus De Geer)，以及丝爪鳃金龟属(Holotrichia spp)和鳃角金龟属(Melolontha)的金龟子)。鞘翅目害虫的更多实例有象鼻虫(例如苜蓿叶象甲(Anthonomus grandis Boheman)、稻水象甲(Lissorhoptrus 
oryzophilus Kuschel)、谷象(Sitophilus grananus Linnaeus)、米象(Sitophilus oryzae Linnaeus)、和三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius))。还包括玉米象虫(Sphenophorus maidis Chittenden)、跳甲(例如玉米跳甲(Chaetocnema pulicara Melsheimer)和十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze))，十一星瓜叶甲
(Diabrotica undecimpunctata)，和根虫(例如西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北方玉米根虫(Diabrotica barben Smith&Lawrence)和南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber))。鞘翅目害虫的更多实例有丽金龟亚科(Rutelinae)的甲虫(丽金龟)，例如异丽金龟属(Anomala)(包括A.marginata、
A.lucicola、A.oblivia和A.orientalis)。其他鞘翅目昆虫有皮蠹科的地毯甲虫，来自叩甲科的金针虫(例如梳爪叩甲属(Melanotus spp.)、单叶叩甲属(Conoderus spp.)、丘胸叩甲属(Limonius spp.)、细胸叩甲属(Agriotes spp.)、Ctenicera spp.、Aeolus spp.))、来自小蠹科的小蠹(bark beetles)；来自拟步甲科的甲虫(例如伪金针虫属(Eleodes spp))。上文列出的任何属(以及其他)，一般而言，也可以作为包含单独的DIG-303杀虫多肽或其与其他杀虫作用剂的组合的杀虫组合物的靶标作为本主题发明的一部分。这些属中的任何者的任何其他昆虫(作为靶标)也包括在本发明的范围内。

[0089] 考虑了DIG-303杀虫毒素用于控制作物植物的鞘翅目害虫的用途。在一些实施方案中，可以经济地部署Cry蛋白用于控制昆虫害虫，包括但不限于，例如，根虫，如西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北方玉米根虫(Diabrotica barberi Smith&Lawrence)、和南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)，以及蛴螬，如Cyclocephala borealis(北方圆头犀金龟)、圆头无斑犀金龟(Cyclocephala immaculate)(南方圆头犀金龟)和日本丽金龟(Popillia japonica)(日本甲虫)。

[0090] 鳞翅目是另一群重要的农业、园艺和家庭害虫，每年造成极大量的损失。本发明提供DIG-303毒素与其他杀虫剂组合用于控制该目中的昆虫害虫的用途在本发明的范围内。这一目昆虫涵盖食叶和食根的幼虫和成虫，包括例如灯蛾科(Arctiidae)、麦蛾科(Gelechiidae)、尺蛾科(Geometridae)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)、毒蛾科
(Lymantriidae)、夜蛾科(Noctuidae)、螟蛾科(Pyralidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、天蛾科(Sphingidae)、谷蛾科(Tineidae)、和卷叶蛾科(Tortricidae)等昆虫科的成员。鳞翅目害虫包括，但不限于：小蜡螟(Achoroia  grisella)、东部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana)、黑头长翅卷蛾(Acleris variana)、棉褐带卷叶蛾(Adoxophyes orana)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、Alabama argillacea、秋星尺蠖(Alsophila pometaria)、Amyelois transitella、地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、桃条麦蛾(Anarsia lineatella)、Anisota senatoria、柞蚕(Antheraea pernyi)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属(Archips sp.)、条卷蛾属(Argyrotaenia sp.)、Athetis mindara、家蚕(Bombyx mori)、棉潜叶蛾(Bucculatrix thurberiella)、粉斑螟(Cadra cautella)、色卷蛾属(Choristoneura sp.)、Cochylls hospes、苜蓿粉蝶(Colias eurytheme)、米蛾(Corcyra cephalonica)、Cydia latiferreanus、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、Datana integerrima、落叶松毛虫(Dendrolimus sibericus)、Desmi afeneralis、甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜绢野螟(Diaphania nitidalis)、西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella，巨座玉米螟)、小蔗螟(Diatraea saccharalis，甘蔗螟)、白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)、Eoreuma loftini、烟草粉螟(Esphestia elutella)、Erannis tilaria、细斑灯蛾(Estigmene acrea)、Eulia salubricola、Eupocoellia ambiguella、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、蜡螟(Galleria mellonella)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、黑拟蛉蛾(Harrisina americana)、Helicoverpa subflexa、谷实夜蛾(Helicoverpa zea，玉米夜蛾)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens，烟草夜蛾)、新墨西哥草原毛虫(Hemileuca oliviae)、向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)、美国白蛾(Hyphantia cunea)、Keiferial ycopersicella、Lambdina fiscellaria fiscellaria、Lambdina fiscellaria lugubrosa、雪毒蛾(Leucoma salicis)、葡萄浆果小卷蛾(Lobesia botrana)、Loxagrotis albicosta(西部豆地老虎)、草地螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、天幕毛虫属(Malacosoma sp.)、甘蓝灯蛾(Mamestra brassicae)、蓓带夜蛾(Mamestra configurata)、番茄天蛾(Manduca quinquemaculata)、烟草天蛾(Manduca sexta)、豆野螟(Maruca testulalis)、斑马纹夜蛾(Melanchra picta)、秋尺蛾(Operophtera brumata)、古毒蛾属(Orgyia sp.)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、Paleacrita vernata、Papiapema  nebris(普通钻心虫)、Papilio cresphontes、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、Phryganidia californica、Phyllonorycter blancardella、暗脉菜粉蝶(Pieris napi)、油菜菜粉蝶(Pieris rapae)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、Platynota flouendana、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、Platyptilia carduidactyla、印度谷螟(Plodia interpunctella)、小菜蛾(Plutella xylostella)、Pontia protodice、一点粘虫(Pseudaletia unipuncta、粘虫)、大豆夜蛾(Pseudoplasia includens)、Sabulodes aegrotata、Schizura concinna、麦蛾(Sitotroga cerealella)、苹白小卷蛾(Spilonta ocellana)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，秋粘虫)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua，beet armyworm)、松异舟蛾(Thaurnstopoea pityocampa)、Ensola bisselliella、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(甘蓝银纹夜蛾)、温室结网野螟(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails和苹果巢蛾
(Yponomeuta padella)。

[0091] 还考虑了DIG-303杀虫毒素用于控制寄生线虫的用途，所述寄生线虫包括但不限于：根癌线虫(Meloidogyne icognita)和大豆囊线虫病线虫[大豆异皮线(Heterodera glycines)]。

[0092] 抗毒素抗体:可应用本领域的标准方法容易地制备针对本文公开的毒素、或针对这些毒素的等价毒素或片段的抗体。此类抗体可用于检测DIG-303杀虫毒素的存在。

[0093] 一旦分离了B.t.杀虫毒素，则可通过本领域公知的方法产生对该毒素特异的抗体。在数周或数月的期间内重复注射至所选择的宿主将诱发免疫反应，并产生显著的抗B.t.毒素血清滴度。优选的宿主是哺乳动物物种，更优选的物种是兔、山羊、绵羊和小鼠。从此类免疫动物获取的血液可通过已建立的方法加工，从而得到与B.t.杀虫毒素反应的抗血清(多克隆抗体)。然后可根据本领域已知的技术，通过吸附至该毒素从而亲和纯化该抗血清。亲和纯化的抗血清可通过本领域已知的方法分离该抗血清内的免疫球蛋白级分从而进一步加以纯化。得到的材料将是与B.t.杀虫毒素反应的免疫球蛋白的异质的群体。

[0094] 抗B.t.毒素抗体还可通过制备半合成免疫原而产生，所述半合成免疫原由与免疫原性载体缀合的B.t.杀虫毒素的合成肽片段组成。可用于制备肽片段的多种方案和仪器是本领域公知的。许多合适的免疫原性载体诸如牛血清白蛋白或钥孔戚血蓝蛋白也是本领域公知的，用于偶联免疫原和载体蛋白的技术也是公知的。一旦构建了半合成免疫原，则制备对B.t.杀虫毒素片段特异的抗体的方法与制备和天然B.t.毒素反应的抗体的方法是相同的。

[0095] 抗B.t.毒素单克隆抗体(MAbs)可容易地应用纯化的B.t.杀虫毒素制备。用于产生MAbs的方法已实施20多年，并且是本领域普通技术人员公知的。重复腹膜内或皮下注射佐剂中的纯化B.t.杀虫毒素将在多数动物中诱发免疫反应。从动物中取出高免疫B-淋巴细胞，并与能够无限培养的合适的融合配偶体细胞系融合。优选的其B淋巴细胞可被高免疫并可用于产生MAbs的动物是哺乳动物。更优选的动物是大鼠和小鼠，最优选的是BALB/c小鼠株系。

[0096] 许多哺乳动物细胞系是用于产生杂交瘤细胞的合适融合配偶。许多此类细胞系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)及商业供应者处获得。优选的融合配偶细胞系衍生自小鼠骨髓瘤，并且 Friendly骨髓瘤-653细胞系(Ventrex、Portland，ME)是最优选的。一旦融合，则在选择生长培养基中培养得到的杂交瘤细胞1至2周。两个公知的选择系统可用于从混合的杂交瘤培养物中消除未混合的骨髓瘤细胞、或两个骨髓瘤细胞的融合。选择系统的选择取决于免疫的小鼠株以及所使用的杂交瘤融合配偶体。可使用Taggart和Samloff(1983)描述的AAT选择系统；然而，由Littlefield(1964)描述的HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)是优选的，因为其可与上述优选的小鼠株及融合配偶相容。然后对用过的生长培养基中筛选免疫特异性MAb分泌。酶联免疫吸附测试(ELISA)法最适于这一目的；但适用于大体积筛选的放射免疫测试法也是可接受的。可进行被设计用于连续地减少相当数量的无关或不太期望的培养基的多重筛选。可针对与已知B.t.杀虫毒素的交叉反应性筛选分泌与B.t.杀虫毒素反应的MAb的培养物。可应用商业提供的测试鉴定优先与优选的B.t.杀虫毒素结合的MAbs的同种型。优选的MAbs是IgG类，更高优选的MAbs是IgG1和IgG2a亚同种型。

[0097] 可亚克隆数次分泌优选的MAbs的杂交瘤培养物，以建立单克隆性和稳定性。用于亚克隆真核、非贴壁细胞培养物的已知方法包括有限稀释、软琼脂糖和荧光激活细胞分选术。在每次亚克隆后，优选针对抗体分泌和亚型再次分析得到的培养物，以确保建立了稳定分泌优选MAb的培养物。

[0098] 抗B.t.毒素抗体可用于检测本发明要求保护的B.t.杀虫毒素及其变体或片段的各种方法中。公知用报告基团标记的抗体可用于鉴定各种环境中抗原的存在。用放射性同位素标记的抗体已在放射免疫测试中用了数十年，其以高精度和灵敏度鉴定各种生物液体中抗原的存在。最近，酶标记的抗体已在ELISA测试中用作放射标记的抗体的替代手段。此外，可将与本发明B.t.杀虫毒素免疫反应的抗体结合至固定物质，诸如聚苯乙烯孔或颗粒，并用于确定测试样本中是否存在B.t.毒素的免疫测试法中。

[0099] 应用探针检测:用于鉴定本发明的毒素和基因的其他方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列是依靠恰当的放射性标记或者如美国专利号6268132中所述的制作成固有荧光性的，从而使得能够被检测。如本领域所熟知，如果探针分子与核酸样品通过在该两个分子间形成强碱基配对键而杂交，可以有理由认为该探针和样品具有相当的同源性。优选地，通过本领域公知的技术，在严格条件下进行杂交，例如如Keller和Manak(1993)所描述的那样。探针检测提供了以已知的方式确定杂交是否发生的方法。此种探针分析提供了鉴定本发明编码毒素的基因的快速方法。作为本发明探针使用的核苷酸片段可以使用DNA合成仪和标准方法进行合成。这些核苷酸序列还可以用作PCR引物，用于扩增本发明的基因。

[0100] 杂交:如分子生物学领域技术人员公知的那样，两个核酸分子的相似性可通过它们的杂交倾向来表征。如本文所使用的术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样条件，在该条件下探针以比与其他序列更高程度地(例如，比背景高至少2倍)可检测地与其靶序列杂交(退火)。严格条件是序列依赖的，并且在不同的环境下会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格程度，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可调节严格条件，以允许序列中的一些错配，从而检测较低程度的相似性(异源探测)。一般地，探针少于100个核苷酸长，优选少于500个核苷酸长。

[0101] 一般地，严格条件将是以下这些：其中在pH 7.0至pH 8.3下盐浓度低于约1.5M Na离子，一般为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)而言至少约30℃、对于长探针(例如，超过50个核苷酸)而言至少约60℃的温度。严格条件也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂而实现。示例性的低严格条件包括用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，并在50℃至55℃在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括用
40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在55℃至60℃在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括用50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃杂交，并在60℃至
65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常为约4至约12小时。

[0102] 特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA/DNA杂交，热溶解点(Tm)是其中50％的互补靶序列与优选匹配的探针杂交的温度(在确定的离子浓度和pH下)。每1％的错配，则Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交条件和/或洗涤条件以促进期望同一性的序列的退火。例如，若寻找具有>90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。一般地，严格条件选择为比特定序列和它的互补序列在确定离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，高严格条件可应用在比Tm低1℃、2℃、3℃或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可应用在比Tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下的杂交和/或洗涤；以及低严格条件可应用在比Tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下的杂交和/或洗涤；

[0103] Tm(单位为℃)可实验确定或可通过计算估计。对于DNA-DNA杂交，可从Meinkoth和Wahl(1984)等式估计Tm：

[0104] Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；

[0105] 其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比(w/v)，并且L是杂交的碱基对长度。

[0106] 备选地，Tm由以下公式描述(Beltz等，1983)。

[0107] Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-600/L

[0108] 其中，[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比(w/v)，并且L是杂交的碱基对长度。

[0109] 应用上述的等式、杂交和洗涤组分，以及期望的Tm，本领域技术人员能够理解，杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化均已被内在地规定。如果期望的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，优选增加SSC浓度，使得可使用更高的温度。核酸杂交的广泛指引可在Tijssen(1993)和Ausubel等(1995)中找到，还参见Sambrook等(1989)。

[0110] 可通过标准方法(Sambrook等，同上)进行应用放射标记的基因特异性探针，在DNA印迹上对固定的DNA的杂交。用于标记多核苷酸探针的放射性同位素可包括32P、33P、14C或3H。将放射性同位素掺入多核苷酸探针分子可通过分子生物学领域技术人员公知的多种方法的任一种完成。(参见，Sambrook等，同上)。一般地，在允许检测与所要求保护的毒性编码基因具有同源性的靶序列的严格条件下进行杂交和随后的洗涤。对于双链DNA基因探针，可在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/mL变性DNA中，在比DNA杂种分子的Tm低20℃-25℃下进行杂交过夜(20X SSPE是3M NaCl、0.2M NaHPO4和0.02M EDTA(乙二胺四乙酸钠盐)；100X Denhardt溶液是20gm/L聚乙烯吡咯烷酮、20gm/L Ficoll 400型和20gm/L牛血清白蛋白(级分V))。

[0111] 通常可以如下进行洗涤：

[0112] 室温下1X SSPE，0.1％SDS中15分钟两次(低严格洗涤)。

[0113] 在0.2X SSPE，0.1％SDS中-20℃洗涤一次15分钟(中等严格洗涤)。

[0114] 对于寡核苷酸探针，在在6X SSPE、5X Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中在低于杂种分子的Tm 10℃-20℃下进行杂交过夜。通过以下公式确定寡核苷酸探针的Tm(Suggs等人，1981)：

[0115] Tm(℃)＝2(T/A碱基对数目)+4(G/C碱基对数目)

[0116] 通常可以如下进行洗涤：

[0117] 室温下1X SSPE，0.1％SDS中15分钟两次(低严格洗涤)。

[0118] 在1X SSPE，0.1％SDS中杂交温度下洗涤一次15分钟(中等严格洗涤)。

[0119] 可通过除放射性标记之外的方法使用于杂交的探针分子及探针与靶分子之间形成的杂种分子可检测。此类备选的方法包含在本发明的范围之内。

[0120] 本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都完整引入本文，以它们没有与本说明书的明确教导不一致为限。

[0121] 本文通过使用术语“遗传材料”，其意思是包括所有的基因、核酸、DNA和RNA。术语“dsRNA”指双链RNA。为命名多核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸和引物的核苷酸残基，以及命名蛋白质的氨基酸残基，在本文间中使用了标准的IUPAC简写。核酸序列以标准的5’至3’方向呈现，以及蛋白质序列以标准的氨基(N)端至羧基(C)端方向呈现。

[0122] 本文描述的这些实施例和实施方案应该解释为仅用于阐明的目的，并且在其教导下的各种修饰和改变对于本领域技术人员而言是容易想到的，并且包括在本申请的精神和范围之内，并且包括在所附权利要求的范围之内。这些实施例不能被理解为是限制性的[0123] 除非另有明确说明，术语“一”和“该”在本文中使用时表示“至少一”。

[0124] 除非另外注释，所有的百分数是以重量计，并且所有溶剂混合物比例是以体积计。所有的温度是摄氏度。

[0125] 实施例1

[0126] 分离编码DIG-303毒素的基因

[0127] 除非另有说明，本实施例和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作通过例如Ausubel等人(1995)和Sambrook等人(1989)及其更新所公开的标准方法进行。从B.t.菌株PS18A，也称为DBt10340，分离了编码本文命名为DIG-303的杀虫Cry蛋白的核酸。设计了用于聚合酶链反应(PCR)的简并正向和反向引物，用这些引物从基因组DNA文库扩增出一个与Cry32同源的DNA片段。使用该扩增片段的测定的序列再进行基因组步移，获得DIG-303的完整开放阅读框。SEQ ID NO:1是编码全长DIG-303蛋白的3771bp核苷酸序列。SEQ ID NO:2是从SEQ ID NO:1推导的全长DIG-303蛋白的1257个氨基酸序列。

[0128] 实施例2

[0129] 在细菌宿主中表达DIG-303嵌合毒素

[0130] 使用标准克隆方法构建荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens，Pf)表达质粒，所述质粒被工程化以产生DIG-303嵌合毒素，由DIG-303核心毒素编码序列(编码氨基酸1-685)和如上所述的Cry1Ab C末端原毒素编码区段组成，二者分别由玉米优化的编码序列编码。从New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)获得限制性内切酶，并将T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。应用 质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc，
Bethlehem，PA)，根据供应商的说明进行质粒制备。在琼脂糖Tris乙酸凝胶电泳后应用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化DNA片段。线性化的载体用NEB Antarctic磷酸酶进行磷酸酶处理以强化重组分子的形成。

[0131] 基础克隆策略涉及将具有DIG-303Cry1Ab嵌合物编码序列(CDS)的DNA片段亚克隆至pDOW1169的例如SpeI和SalI限制性位点之间，由此该DIG-303嵌合物CDS被置于Ptac启动子和来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的rrnBT1T2终止子的表达控制之下。pDOW1169是中等拷贝质粒，具有RSF1010复制起始点、pyrF基因、和核糖体结合位点之后的限制酶识别位点，可将含有蛋白质编码区的DNA片段引入所述限制酶识别位点中(美国专利号7618799)。通过电穿孔将表达质粒转化至DC454(具有突变ΔpyrF和lsc::lacIQI的近野生型荧光假单胞菌)或其衍生物，在SOC-大豆水解产物培养基中回收，并置于选择培养基上(缺乏尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等，同上)。转化与选择方法的细节的一般性描述可在通过引用并入本文的Squires等，(2004)；美国专利申请号20060008877；美国专利号7681799和美国专利申请号20080058262中得到。通过对小提质粒DNA进行限制消化鉴定重组菌落。有多种适合荧光假单胞菌生长的培养基可供使用，例如，如Huang et al.2007和美国专利申请号20060008877所述。在来自荧光假单胞菌发酵的细胞中产生了不溶性的B.t.杀虫蛋白包涵体。

[0132] 通过摇瓶培养含有表达构建体荧光假单胞菌菌株，实现了用于表征和昆虫生物测试的DIG-303嵌合物的生产。用在补充有葡萄糖和痕量元素的M9培养基中生长的种子培养物接种最小培养基。振荡下在30°初始培养24小时后，通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)从而诱导DIG-303嵌合物编码序列的表达。在诱导的时候以及在诱导后不同的时间取样培养基。通过600nm处的光密度(OD600)测量细胞密度。有多种适合荧光假单胞菌生长的培养基可供使用，例如，如Huang et al.2007和美国专利申请号20060008877所述。在来自荧光假单胞菌发酵的细胞中产生了不溶性的B.t.杀虫蛋白包涵体。简而言之，裂解细胞，通过离心制备离心沉淀和上清液部分，将离心沉淀重新悬浮并通过在裂解缓冲液中再悬浮反复洗涤，直到上清液变得无色，并且IB离心沉淀物变得坚实且颜色呈灰白。将最终的离心沉淀洗涤，重悬于含有2mM EDTA的无菌过滤蒸馏水中，并储存在-80℃。通过柱层析富集上清液级分中的重组蛋白。

[0133] 通过SDS_PAGE分析制备物。通过将条带的光密度值与在相同凝胶上运行的牛血清白蛋白(BSA)样品进行比较来给靶条带定量，以产生标准曲线。然后使用一次性PD-10柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)将样品缓冲液变为pH10的10mM CAPS(3-(环己基氨基)1-丙磺酸)。

[0134] 浓缩的提取物通过SDS_PAGE进行分析并相对于背景扣除的BSA标准物定量，以产生标准曲线来计算DIG-303嵌合体的浓度。

[0135] 实施例3

[0136] 玉米密码子优化的序列SEQ ID NO:3的设计

[0137] 植物分子生物学领域的技术人员将理解，可以设计多种DNA序列来编码单个氨基酸序列。一个常用的增加感兴趣的蛋白质的编码区的表达的手段是以这样的方式定制编码区，使得其密码子组成类似于该基因确定要在其中表达的宿主的总体密码子组成。关于合成基因的设计和生产的指导可以在例如WO1997013402、美国专利号6,166,302和美国专利5,380,831中找到。

[0138] 设计并合成具有玉米密码子偏倚的DNA序列，用以在转基因单子叶植物中产生DIG-303杀虫蛋白。根据从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中存储的序列获得的数百种蛋白质编码序列计算玉米(Zea mays L.)的密码子使用表。省略任何使用量小于该氨基酸的总密码子用量的约10％的同义密码子，然后计算重定标(rescaled)的玉米密码子组。

[0139] 为了得到编码SEQ ID NO:3的DIG-303蛋白或其杀虫片段的玉米密码子优化的DNA序列，对天然DIG-303DNA序列(SEQ ID NO:1)进行了取代，使得所得的DNA序列具有玉米优化的密码子偏倚表的总密码子组成。对该序列进行进一步精修以消除不期望的限制酶识别位点、潜在的植物内含子剪接位点、长段的A/T或C/G残基，以及可能干扰编码的mRNA稳定性，转录或翻译的其它基序植物细胞中的区域。进行其他改变以引入所需的限制酶识别位点，并消除长内部开放阅读框架(+1以外的框架)。这些变化都是在保持玉米偏倚的重定标密码子组成约束条件之内进行的。

[0140] 实施例4

[0141] 在细菌宿主中构建编码DIG-303毒素的表达质粒

[0142] 使用标准克隆方法构建荧光假单胞菌(Pf)表达质粒，该质粒被工程改造从而产生由玉米优化的编码序列所编码的DIG-303。限制性内切核酸酶得自New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)，T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。按照供应商的指示，使用质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc，Bethlehem，PA)进行质粒制备。在琼脂糖Tris-乙酸凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化DNA片段。线性化载体用NEB Antarctic磷酸酶进行磷酸酶处理，以强化重组分子的形成。

[0143] 将具有如SEQ ID NO:3所示的DIG-303编码序列(CDS)的DNA片段亚克隆到pDOW1169中，例如SpeI和SalI限制性位点处，由此将DIG-303CDS置于Ptac启动子和来自质粒pKK223-3(PL Pharmacia，Milwaukee，WI)的rrnBT1T2终止子的表达控制下。pDOW1169是一种中等拷贝质粒，具有RSF1010复制起点、pyrF基因、以及核糖体结合位点之后的限制酶识别位点，其中限制酶识别位点中可以引入含有蛋白质编码区的DNA片段(美国专利号
7618799)。通过电穿孔将表达质粒(pDAB107162，含有DIG-303编码序列)转化入DC454(具有突变ΔpyrF和lsc::lacIQI的近野生型荧光假单胞菌菌株)或其衍生物，在SOC-大豆水解产物中恢复，然后在选择性培养基(缺乏尿嘧啶的M9葡萄糖琼脂，Sambrook等人，同上)上铺板。转化和选择方法一般描述于：Squires等人(2004)，美国专利申请号20060008877，美国专利号7681799和美国专利申请号20080058262，通过引用将它们并入本文。通过限制酶消化小提质粒DNA来鉴定重组菌落。所得的表达菌株在陶氏益农公司重组培养物收集处(Dow AgroSciences Recombinant Culture Collection)中称为DPf21990。

[0144] 实施例5

[0145] 制备DIG-303蛋白样品

[0146] 通过在含有表达质粒pDAB107162的摇瓶生长的荧光假单胞菌荧光菌菌株DPf21990中表达DIG-303，实现了用于表征和昆虫生物测定的DIG-303的生产。使用补充有葡萄糖和微量元素的M9培养基中生长的种子培养物接种限定的基本培养基。在30℃振荡初始温育24小时后，通过加入异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导DIG-303编码区的表达。在诱导时和诱导后的不同时间对培养物进行取样。通过600nm处的光密度(OD600)测量细胞密度。将最终的离心沉淀洗涤，重悬于含有2mM EDTA的无菌过滤蒸馏水中，并储存在-
80℃。通过离心收集包涵体(IB)离心沉淀，再悬浮，并反复通过重悬在裂解缓冲液中来洗涤，直到上清液变成无色，并且IB颗粒变得坚实且呈灰白色。

[0147] 通过SDS_PAGE分析IB制备物。通过将条带的光密度值与在相同凝胶上运行的牛血清白蛋白(BSA)样品进行比较来给靶条带定量，以产生标准曲线。随后使用10mM CAPS(3-(环己氨基)1-丙磺酸)缓冲液(pH10)从包涵体中提取靶蛋白，并在平台上轻轻摇动4℃过夜。将溶解的DIG-303离心，将得到的上清液浓缩。浓缩提取物通过SDS PAGE相对于背景扣除的BSA标准物进行分析和定量，以产生标准曲线以计算DIG-303的浓度。

[0148] 实施例6

[0149] DIG-303杀虫毒素的昆虫活性

[0150] 测试DIG-303，发现其对鞘翅目昆虫(科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata))的幼虫具有杀虫活性。

[0151] 在用第二龄科罗拉多马铃薯甲虫(CPB，Leptinotarsa decimlineata)幼虫进行的生物测定中，测试含有全细胞(表2)或纯化蛋白质(溶解的或作为包含体；表4)的溶液的杀虫活性。从Bayer Corp.(Pittsburg，PA)获得昆虫卵。

[0152] 生物测定在128孔塑料托盘中进行。每个孔含有0.5mL水琼脂和一个用软木凿子切割下来的1.5cm直径的“黑美人”茄子(Solanum melongena)叶盘。测试叶盘用40μl三倍稀释的DIG-303全细胞处理。用作杀虫活性阳性对照的叶盘用1μg/mL Cry3Aa全长原毒素处理。阴性对照叶盘用缓冲液处理或不处理。

[0153] 将经处理的叶盘保持在通风橱中，直到表面上的液体蒸发或被吸收到饵食中。在孵化后约2天，用润湿的骆驼毛刷取出个体幼虫，并将其放置在经处理的叶片上，每孔一只幼虫。然后用透明塑料粘合片将带虫的孔密封，粘合片是通气的，以允许气体交换(C-D International，Pitman，NJ)。上述每个处理完成了11～16个重复。温育两天后，记录叶盘损伤的估计百分比、死亡昆虫数量、和存活昆虫重量。生物测定盘保持在受控环境条件下(28℃，～40％相对湿度，16:8(光：暗))。计算每次处理的百分比死亡率和生长抑制百分比。生长抑制(GI)计算如下：

[0154] GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

[0155] 其中TWIT是处理中的昆虫总重量，TNIT是处理中的昆虫总数，TWIBC是背景检查中的昆虫的总重量(缓冲液对照)，TNIBC是背景检查中的昆虫总数(缓冲区对照)。生物测定结果总结在下表2和表4中。生物测定结果显示，对于全细胞DIG-303 1:10稀释处理(表2)，叶损伤较少，生长抑制增加。重复的生物测定表明摄入DIG-303制剂导致科罗拉多马铃薯甲虫的死亡和生长抑制(表4)。

[0156] 表2:在科罗拉多马铃薯甲虫上进行的DIG-303的全假单胞菌细胞活性生物测定在5日后的百分比死亡率、叶盘损伤比例、和生长抑制

[0157]

[0158] 测试DIG-303，发现其对鳞翅目昆虫小菜蛾(Plutella xylostella)的幼虫具有杀虫活性(表3)。在96孔生物测定盘(C-D International，Pitman，NJ)中进行小菜蛾(DBM)生物测定。将20μl等份的三倍稀释的全细胞悬浮液投放到每个孔中的多物种鳞翅目饵食(Southland Products，Lake Village，AR)的表面上。将经处理的托盘空气干燥，并将一条单独的幼虫(孵化后24至48小时)放置在处理过的饵食表面上。然后将带虫的孔用透明塑料的粘合片密封，通气以允许气体交换(C-D International，Pitman，NJ)。生物测定盘在受控的环境条件(28℃，40％相对湿度，16:8h光:暗光周期)下保持5天。重复的生物测定表明摄入DIG-303制备物导致了小菜蛾死亡(表3)。

[0159] 测试DIG-303，发现其对鞘翅目昆虫玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica vigifera vigifera))的幼虫具有杀虫活性(表5)。对于玉米根萤叶甲，遵循类似于DBM昆虫生物测定的方法，不同之处如下：生物测定在128孔生物测定盘中进行；使用Dow AgroSciences LLC专有的根虫饵食；且使用80-100μl等份处理饵食表面。在所有昆虫生物测定中记录了暴露于每个蛋白质样品的昆虫总数、死亡昆虫的数量、和存活的昆虫的重量。对于西方玉米根虫检测，使用胰蛋白酶活化的Cry3Aa和Cry34+Cry35作为阳性对照。阴性对照包括：水；未处理；Cry1F；20mM柠檬酸钠，p.H.3.5；和10mM CAPS，pH10。

[0160] 表3:在小菜蛾上进行的DIG-303的全假单胞菌细胞活性生物测定在5日后的百分比死亡率

[0161]处理 测试的昆虫数 ％死亡率
全细胞DIG-303 1:10稀释 7 71.43
全细胞DIG-303 1:30稀释 7 71.43
空载体(DPf5)1:10稀释 5 40
空载体(DPf5)1:30稀释 5 0
PBS 8 0
未处理 32 0
Cry1Ac(阳性对照) 2 100
Cry3Aa 2 100

[0162] 在鳞翅目昆虫上测试了从包涵体富集的DIG-303，使用与测试小菜蛾昆虫所用的方法类似的方法，对玉米螟(CEW)、欧洲玉米螟(ECB)和秋粘虫(FAW)进行了与DBM昆虫生物测定。没有观察到对CEW，ECB和FAW的活性(数据未显示)。

[0163] 表4.在科罗拉多马铃薯甲虫上测试来自包涵体溶解(10mM CAPS pH10)的DIG-303蛋白

[0164]

[0165] 表5.在128孔测定中在西方玉米根虫上测试来自包涵体溶解的DIG-303蛋白(10mM CAPS pH10)，每孔一只昆虫。

[0166]

[0167] 实施例7

[0168] 土壤杆菌转化

[0169] 在双元植物转化和表达质粒的构建中使用了标准克隆技术。限制性内切酶和T4DNA连接酶获自NEB。应用 质粒制备试剂盒或 AX Xtra Midi试剂盒(两者均来自Macherey-Nagel)，根据生产商的说明进行质粒制备。应用PCR纯化试剂盒或QIAEX II凝胶提取试剂盒(两者均来自Qiagen)在凝胶分离
后纯化DNA片段。

[0170] 包含编码DIG-303杀虫毒素的核苷酸序列的DNA由商业供应商(例如，DNA2.0，Menlo Park，CA)合成，并作为质粒载体中的克隆片段提供。编码其他DIG-303毒素的其他DNA序列通过对含有合适核苷酸序列的构建体的标准分子生物学操作而获得。将编码经修饰的DIG-303片段的DNA片段与其他DIG-303杀虫毒素编码区片段或其他B.t.(Cry)编码区片段在适当的限制位点处连接，以获得编码期望的全长DIG-303毒素蛋白。

[0171] 将DIG-303杀虫毒素的全长或经修饰的编码序列(CDS)亚克隆至植物表达质粒的NcoI和SacI限制位点中。得到的植物表达盒含有在植物表达元件(例如，植物表达启动子、3’端翻译终止和聚腺苷酸附加序列等)控制下的适当的Cry编码区，将其亚克隆至双元载体质粒中，例如应用 技术或标准限制酶片段克隆方法克隆。如果使用
技术，则可使用例如LR ClonaseTM(Invitrogen)将全长和经修饰的基因植物表达盒重组到双元植物转化质粒中。所述的双元植物转化载体包含细菌选择标记基因，该基因当该质粒存在于大肠杆菌和土壤杆菌细胞中时可赋予针对抗生素大观霉素的抗性。该双元载体质粒还包含在期望的宿主细胞中有功能的可植物表达的选择标记基因，即转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aphII)，其编码对卡那霉素、新霉素和G418等抗生素的抗性。

[0172] 制备根癌土壤杆菌Z707S(Z707的链霉素抗性衍生物，Hepburn等，1985)的电转化感受态细胞，并用电穿孔进行转化(Weigel和Glazebrook，2002)。电穿孔后，添加1mL YEP肉汤(gm/L:酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)至电转杯中，并将细胞-YEP悬浮液转移至15mL培养试管中，在水浴中28℃恒定搅拌下温育4小时。将细胞涂板至含有大观霉素(200μg/mL)和链霉素(250μg/mL)的YEP+琼脂(25gm/L)上，并在28℃温育该板2-4天。选择分离良好的单克隆，在含大观霉素和链霉素的YEP+琼脂板上划线，并在28℃温育1-3天。

[0173] 用自选定的土壤杆菌菌落制备的质粒DNA作为模板，应用载体特异性引物，通过PCR分析验证DIG-303杀虫毒素基因在双元植物转化载体中的存在。从15mL在YEP(如前所述含有大观霉素和链霉素)中的过夜培养物取4mL的等份，离心沉淀细胞，用Qiagen Spin Mini Preps根据生产商的说明进行提取。来自在土壤杆菌电穿孔转化中使用的双元载体的空质粒DNA被包含在内作为对照。应用来自Invitrogen的Taq DNA聚合酶，根据生产商的说明，以0.5X浓度完成PCR反应。PCR反应在MJ Research Peltier热循环仪上进行，所述热循环仪编程的条件如下：步骤1)94℃3分钟；步骤2)94℃45秒；步骤3)55℃30秒；步骤4)72℃1分钟/kb预期产物长度；步骤5)29次至步骤2；步骤6)72℃10分钟。循环后反应保持在4℃。通过琼脂糖凝胶电泳(例如，0.7％至1％琼脂糖，w/v)分析扩增产物，并通过溴化乙锭染色显现。选择其PCR产物与质粒对照相同的克隆。

[0174] 通过土壤杆菌操作领域的普通技术人员公知的标准分子生物学方法，对从候选土壤杆菌分离株制备的质粒DNA进行限制消化指纹图谱作图，完成另一个含DIG-3基因插入物的双元植物转化载体。

[0175] 实施例8

[0176] 在双子叶植物中产生DIG-303杀虫毒素

[0177] 拟南芥转化。应用花序浸渍法(Weigel和Glazebrook，2002)转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-01。用选定的土壤杆菌克隆接种1mL至15mL含有适当的选择用抗生素的YEP肉汤培养基。培养物在28℃220rpm恒定搅拌下温育过夜。用每一培养物接种两个500mL的含有适当的选择用抗生素的YEP肉汤培养基，新培养物在恒定搅拌下在28℃温育过夜。室温下以约8700x g沉淀细胞10分钟，弃去产生的上清液。将细胞沉淀轻柔地重悬于500mL含有以下物质的渗透培养基中：1/2x Murashige和Skoog盐(Sigma-Aldrich)/Gamborg B5维生素(Gold BioTechnology，St.Louis，MO)、10％(w/v)蔗糖、0.044μM苄氨基嘌呤(10μL/升的在DMSO中的1mg/mL储液)和300μL/升Silwet L-77。将约1个月大的植物浸入该培养基中15秒，小心地确保最新的花序被浸没。侧放植物，并覆盖(透明或不透明)24小时，用水洗涤，并直立放置。使植物在22℃、16小时光/8小时暗的光周期下生长。浸泡约4周后，收获种子。

[0178] 拟南芥生长和选择使新鲜收获的T1种子在室温下在干燥剂的存在下干燥至少7天。将种子悬浮于0.1％琼脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中，然后在4℃分层2天。为准备种植，用细蛭石覆盖在10.5英寸x21英寸发芽托盘(T.O.Plastics Inc.，Clearwater，MN)中的Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.、Bellevue，WA)，用Hoagland溶液(Hoagland和Arnon，1950)地下灌溉直至潮湿，然后放置排水24小时。将分层的种子播种至蛭石上，并用潮湿的顶盖(KORD Products，Bramalea，Ontario，Canada)覆盖7天。在光强度为120-150μmol/m2秒的长白昼条件(16小时光/8小时暗)下及恒定温度(22℃)和湿度(40-TM50％)下，让种子在Conviron 生长室(CMP4030型或CMP3244型；Controlled Environments Limited，Winnipeg，Manitoba，Canada)中发芽，并让植物生长。植物最初用Hoagland溶液浇灌，随后用去离子水浇灌，以保持土壤湿润但不潮湿。

[0179] 播种5-6天后移除顶盖，用化学选择剂喷洒植物，以杀死从未转化的种子萌出的植物。例如，若由双元植物转化载体提供的可植物表达的选择标记基因是pat或bar基因(Wehrmann等，1996)，则可通过喷洒1000X的Finale溶液(5.78％草胺磷，Farnam Companies Inc.，Phoenix，AZ.)选择转化植物。随后的两次喷雾间隔5-7天进行。最后一次喷雾后7-10天鉴定存活的植物(积极生长的植物)，并将其移栽至备有Sunshine Mix LP5的花盆中。移栽的植物用潮湿的顶盖覆盖3-4天，并置于上述生长条件下的ConvironTM生长室中。

[0180] 双子叶植物所属领域的技术人员将能够理解，当使用其他可植物表达的选择标记基因(例如，除草剂抗性基因)时，其他的选择转化植物的方法也是可用的。

[0181] 转基因拟南芥的害虫生物测试在人工膳食覆盖测试法中证实了表达DIG-303杀虫毒素的转基因拟南芥系对敏感的害虫种类是有效的。通过适当的方法对提取自转基因和非转基因拟南芥系的蛋白进行定量，并调整样品的体积以标准化蛋白浓度。如上所述那样在人工膳食上进行生物测试。测定中包含非转基因拟南芥和/或缓冲液及水，作为背景检查处理。

[0182] 实施例9

[0183] 用于产生超双元载体(superbinary vectors)的土壤杆菌转化

[0184] 土壤杆菌超双元系统可方便地用于转化单子叶植物。构建和验证超双元载体的方法是久已确立的，参见例如欧洲专利号EP604662B1和美国专利号7060876。应用标准分子生物学和微生物学方法产生超双元质粒。超双元质粒结构和核实/验证应用如上述双元载体所述的方法完成。

[0185] 实施例9

[0186] 在单子叶植物中产生DIG-303杀虫毒素

[0187] 土壤杆菌介导的玉米转化将来自High II F1杂交的种子(Armstrong等，1991)种植在含有95％Metro-Mix 360无土培养基(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)和5％粘土/壤土的混合物的5加仑花盆中。使植物在应用高压钠和金属卤化物灯组合的温室中生长，光周期为16:8小时光:暗。为获得用于转化的未成熟F2胚，进行人工同胞授粉。在授粉后8-10天，当胚为约1.0至2.0mm大小时，分离未成熟的胚。

[0188] 感染和共培养如下对玉米穗进行表面消毒：用液体皂洗涤，浸入70％乙醇中2分钟，然后浸入20％商业漂白剂(0.1％次氯酸钠)中30分钟，再用无菌水润洗。如下制备含有超双元载体的土壤杆菌细胞的悬浮液：将1-2环在含有100mg/L大观霉素、10mg/L四环素和250mg/L链霉素的YEP固体培养基上在28℃生长了2-3天的细菌转移至5mL含有100μM乙酰丁香酮的液体感染培养基(LS基础培养基(Linsmaier和Skoog，1965)、N6维生素(Chu等，
1975)、1.5mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、68.5gm/L蔗糖、36.0gm/L葡萄糖、6mM L-脯氨酸，pH 5.2)中。涡旋振荡该溶液，直到获得均匀的悬浮液，然后将浓度调节至最终密度为
200Klett单位(应用配置紫色滤片的Klett-Summerson比色计)或在600nm测得的相当的光密度(OD600)。将未成熟的胚直接分离至含有2mL感染培养基的微量离心管中。移除该培养基，并更换为1mL密度为200Klett单位或相当的OD600的土壤杆菌溶液，并在室温下温育该土壤杆菌和胚溶液5分钟，并然后转移至共培养培养基(LS基础培养基、N6维生素、1.5mg/L2,
4-D、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯氨酸、0.85mg/L AgNO3、100μM乙酰丁香酮、3.0gm/L吉兰糖胶(PhytoTechnology Laboratories.，Lenexa，KS)，pH 5.8)中，在25℃在黑暗条件下保持5天。

[0189] 共培养后，将胚转移至选择培养基中，此后在约8周的期间获得经转化的分离株。为选择已被含有可植物表达的pat或bar选择标记基因的超双元质粒转化的玉米组织，与双丙磷(Gold BioTechnology)一起使用LS基培养基(LS基础培养基，N6维生素、1.5mg/L 2,4-D、0.5gm/L MES(2-(N-吗啉代)甲磺酸一水合物；PhytoTechnologies Labr.)、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯氨酸、1.0mg/L AgNO3、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/L吉兰糖胶，pH 5.7)。将胚转移至含有3mg/L双丙磷的选择培养基中，直到获得生胚分离株。通过每隔2周将回收的分离株转移至新鲜选择培养基中来使分离株变大，用于再生和进一步分析。

[0190] 玉米转化所属领域的技术人员应当理解，当使用其他植物可表达的选择标记基因(例如，除草剂耐受基因)时，其他选择转化植物的方法也是可用的。

[0191] 再生和种子产生.为进行再生，将培养物转移至“28”诱导培养基(MS盐和维生素、30gm/L蔗糖、5mg/L苄氨基嘌呤、0.25mg/L 2、4-D、3mg/L双丙磷、250mg/L头孢噻肟、2.5gm/L吉兰糖胶，pH 5.7)中，在弱光条件(14μEm-2s-1)下保持1周，然后在强光条件(约89μEm-2s-1)下一周。然后将组织转移至“36”再生培养基(除了缺乏植物生长调节因子外，与诱导培养基相同)。当植物长至3-5cm长时，将它们转移至含有SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt(1972)盐及维生素；PhytoTechnologies Labr.)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖和2.0gm/L吉兰糖胶，pH 5.8)的玻璃培养管中，以允许它们进一步生长并发育枝条和根。将植物移植至与本文早前所描述的相同的土壤混合物中，并在温室中使其生长至开花。进行控制授粉以产生种子。

[0192] 实施例11

[0193] 转基因玉米的生物测定

[0194] 通过常规生物测定方法(例如参见，Huang等，2006)证实了植物细胞中产生的DIG-303杀虫毒素的生物活性。例如，通过将衍生自产DIG-303杀虫毒素植物的各种植物组织或组织块饲喂受控饲喂环境中的靶昆虫，可以证实效力。备选地，可从衍生自产DIG-303杀虫毒素植物的各种植物组织中制备蛋白质提取物，并将该提取的蛋白掺入如本文之前描述的人工膳食生物测定中。应当理解，此类饲喂测定的结果必须与应用适当对照组织类似进行的生物测定相比较，其中所述对照组织来自不产生DIG-303杀虫毒素的宿主植物；或与其他对照样品相比较。

[0195] 参考文献

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