本发明提供扩增、测量和/或检测样品中反刍动物DNA的方法和试剂盒。
本发明的一个实施方案提供扩增样品(例如动物饲料、动物饲料成分、化妆品、 营养保健品、疫苗、胶体灌输液或其组合)中反刍动物DNA的方法，包括使来自样 品的核酸与RNA酶(如RNA酶A、RNA酶B、RNA酶D、RNA酶E、RNA酶H、 RNA酶I、RNA酶P、RNA酶S、RNA酶T、RNA酶V及其组合)接触从而产生 RNA酶处理的核酸；用第一反刍动物特异性引物和第二反刍动物特异性引物扩增 RNA酶处理的核酸以扩增样品中存在的反刍动物DNA，从而产生第一种扩增反刍动 物DNA。在一些实施方案中，所述方法还包括检测扩增的反刍动物DNA。在一些实 施方案中，所述方法还包括用第三反刍动物特异性引物和第四反刍动物特异性引物扩 增第一种扩增的反刍动物DNA。在一些实施方案中，在使所述核酸与RNA酶接触之 前从样品中分离核酸。在一些实施方案中，待检测的反刍动物DNA来自牛、绵羊、 山羊、麋鹿、鹿及其组合。在一些实施方案中，RNA酶处理的核酸通过将所述分离 的核酸与所述RNA酶在约30℃-约40℃接触约15分钟-约120分钟而制备。在另一 些实施方案中，RNA酶处理的核酸通过将所述分离的核酸与所述RNA酶在约37℃ 接触约60分钟而制备。在一些实施方案中，反刍动物DNA包含线粒体DNA序列(如 细胞色素c、细胞色素b、12S RNA、ATP酶亚基8、ATP酶亚基6、ATP合成酶、 亚基8，及其亚序列)。在一些实施方案中，反刍动物特异性引物对是SEQ ID NO：1 和2；SEQ ID NO：3和4；或SEQ ID NO：11和12。在一些实施方案中，样品是动物 饲料(如牛油、乳或其组分)。在一些实施方案中，动物饲料是牛饲料(如包含约0.5 ％-约30％、约0.75％-约20％、或约1％牛油)。在一些实施方案中，所述方法还包 括检测扩增产物(如通过检测与扩增产物结合的荧光基团发出的信号或通过检测与扩 增产物结合的寡核苷酸探针发出的信号)。
本发明的另一个实施方案还提供检测反刍动物DNA的试剂盒。所述试剂盒典型 地包含至少一对反刍动物特异性引物、RNA酶(如RNA酶A、RNA酶B、RNA酶 D、RNA酶E、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶P、RNA酶S、RNA酶T、RNA酶 V及其组合)和使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含第二对反刍动物特 异性引物。
本发明的进一步实施方案包括分离的核酸，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4、11、 12、13或14所示核酸序列。
本发明的组合物和方法在下面更详细描述。

图1表示来自实施例4所述扩增产物熔点分析的数据。
图2是总结污染物对核酸扩增抑制作用的表(表1)。用皮克量的对照DNA(人 DNA—HDNA)测定PCR抑制。在7个未稀释牛饲料提取物中间HDNA的最小皮克 量变化100倍。稀释提取物(1:100)增加检测DNA的扩增。牛饲料No.2、3、4和 6中最小检测水平提高10倍；饲料No.1、5和7中保持相同。
图3是总结从牛饲料提取DNA的纯度分析的表(表2)。测定评估提取材料的量 和纯度检测DNA以外物质的存在。煮沸和离心提取物对非特异性DNA的量、 260/280nm比率或对PCR结果没有影响。平均260/280nm分光光度比率是2.11(STD DEV：+/-0.09；范围：1.40-2.37)，且4/126提取物低于1.8。>2.0的比率暗示RNA可 能是污染物。DNA(荧光计测定)和核酸(分光光度计计算)之间的差异是10 μg/ml-40μg/ml倍高核酸含量。凝胶电泳证明用RNA酶处理提取物除去了RNA，而 DNA带和分子量低于2,000bp的带仍保留。
图4是总结(1)RNA酶处理；和(2)饲料类型和牛肉骨粉(BMBM)浓度对 牛mtDNA检测的影响的表(表3)。RNA酶处理提高饲料No.3、5、6和7中B-mtDNA 检测灵敏度和B-mtDNA检测一致性。在添加0.10％ BMBM的饲料No.1和2样品 中检测到B-mtDNA。在添加0.1％ BMBM的饲料No.1、2和7样品中检测到 B-mtDNA。在添加0.05％ BMBM的饲料No.1样品中检测到B-mtDNA。在添加0.02 ％ BMBM并用RNA酶处理的所有饲料中检测到B-mtDNA。排除饲料No.3，在添 加0.1％ BMBM的所有饲料中检测到B-mtDNA。
图5是总结RNA酶处理对假阴性结果数的影响的表(表4)。总的来说，RNA酶 处理使假阴性结果降低75％，(42/105至10/105)。含最高浓度BMBM(2％、1％和 0.5％)的饲料样品中假阴性结果降低100％(22/63至0/63)。含最低浓度BMBM(0.2 ％和0.1％)的饲料样品中假阴性结果降低50％(20/42至10/42)。含0％ BMBM的 所有饲料样品都是阴性。
图6显示用一组FRET探针(SEQ ID NO：13和14)和引物(SEQ ID NO：11和 12)在单个PCR反应中检测牛、绵羊和山羊的DNA之间的差异，探针和引物的设 计使得所有三种反刍动物的DNA都扩增，并且探针将结合所有三种扩增子，但具有 不同程度同源性。FRET探针结合具有100％同源性的牛靶序列、具有93％同源性的 山羊靶序列和具有88％同源性的绵羊靶序列。同源性差异导致三种不同熔链曲线温 度(Tm)，分别对应牛、山羊或绵羊。
图7显示比较基于PCR的方法和基于抗体的方法检测5种代表性牛饲料中是否 存在牛干血(BDB)和牛肉和骨粉(BMBM)的数据。所示结果是三次重复测试的 结果。所有未添加的饲料用两种方法都是阴性的。
图8显示证明牛DNA标准品的PCR反应效率的数据，所述牛DNA标准品系列 稀释入疫苗样品的DNA提取物中。

I.引言
本发明提供扩增、测量和/或检测样品(如动物饲料、动物饲料成分、化妆品、营 养保健品、疫苗、胶体灌输液或其组合)中反刍动物DNA的方法和试剂盒。在一些 实施方案中，本发明提供扩增、测量和/或检测动物饲料或动物饲料成分中反刍动物 DNA的方法。本发明基于令人惊奇的发现，样品(例如，诸如用于检测是否存在反 刍动物DNA的动物饲料、化妆品、营养保健品或疫苗的样品)中存在的RNA干扰 检测样品中反刍动物DNA的扩增反应。发明人发现：用RNA酶处理来自样品的核 酸提高检测反刍动物DNA的扩增反应的一致性和灵敏度。尤其是，发明人发现：当 这种核酸进行检测反刍动物DNA的扩增反应时，用RNA酶处理来自样品(如检测 是否存在反刍动物DNA的样品)的核酸降低假阴性的发生率。
II.定义
本文所用“样品”表示怀疑含反刍动物多肽或编码反刍动物多肽的核酸的任何来 源的样品。这些样品可以用本文所述方法检测，例如包括反刍动物饲料、宠物食品、 化妆品、人食品、营养保健品、疫苗或胶体灌输液。样品可以来自实验室来源或非实 验室来源。样品可以悬于或溶解于液体材料如缓冲液、提取剂、溶剂等。样品也包括 动物和人体液如全血、血组分、血清、血浆、脑脊液、淋巴液、乳；和生物液如细胞 提取物、细胞培养上清液；固定的组织样品；和固定的细胞样品。
本文所述“反刍动物”表示具有分成多室(即瘤胃、网胃、重瓣胃和皱胃)的胃 并能消化纤维素的哺乳动物。反刍动物的实例包括，例如，牛、绵羊、山羊、鹿、麋 鹿、水牛、美洲野牛、大羊驼(llamas)、羊驼(alpacas)、单峰驼、骆驼、牦牛、驯 鹿、长颈鹿等。
本文所用“动物饲料”和“动物饲料成分”表示向动物提供营养的任何组合物或 其部分。动物饲料的一般成分例如包括蛋白质、碳水化合物和脂肪。动物饲料的具体 成分例如包括玉米、牛油、血和/或其组分、乳和/或其组分、糖蜜/糖(如原糖或精制 糖、甜菜、甘蔗和柑桔的糖蜜，及其组合)、胡萝卜、糖块、谷物(如小麦、燕麦、 大麦、小黑麦、水稻、玉米/玉蜀黍、高梁、黑麦及其组合)、已加工谷物成分(如麸、 糠、磨粉、小麦胚、酒糟、malt combings、饼干、面包、玉米片、精制麦麸及其组 合)、结荚植物/豆科植物(如豆科植物的多汁或成熟干种子和未成熟豆荚，例如包括 豌豆、扁豆、小扁豆、大豆和羽扁豆，及其组合)、油料种子(如棉籽、葵花籽、红 花籽、油菜籽、亚麻籽和芝麻籽，及其组合)；植物蛋白粉(如油籽粉、花生饼粉、 大豆粉、椰子饼粉、棕榈仁粉及其组合)；水果副产品(如柑桔果肉、菠萝果肉、仁 果果渣、葡萄果渣、葡萄皮渣及其组合)、牧草(如禾本科草和豆科牧草和混合禾本 科草/豆科牧草)、草料(fodder)(如种子、干草、豆科植物青贮饲料和秸秆、禾本 科草和谷类、甘蔗顶及其组合)、草料(forage)(如谷类草料、油籽草料、豆类草料 及其组合)、苜蓿(如新鲜、干、中花及其组合)、大麦粒、干甜菜果肉、蓝草、酒糟 (如湿、干及其组合)、雀麦草、晚雀麦草干草、柑桔果肉(如干、青贮及其组合)、 三叶草(如干草、青贮及其组合)、椰子粉、玉米(如玉米棒子、穗、玉米粒、青贮 料及其组合)、玉米麸饲料、棉籽(如棉籽壳、整棉籽、棉籽粉及其组合)、干酒糟、 鱼粉、玉米片饲料、羔羊粉、胡枝子(如新鲜、干草及其组合)、亚麻仁粉、肉和骨 粉(如来自牛、绵羊、山羊、家禽及其组合)、乳(鲜、干、脱脂及其组合)、狗尾草、 象草、鸭茅、花生粉；天然肠衣、含包括牛胶原的“粘合剂”的食品。动物饲料还可 以包括补充成分，例如，矿物质、维生素和营养保健品。动物饲料例如包括牛饲料、 绵羊饲料、山羊饲料、狗饲料、猫饲料、鹿饲料、麋鹿饲料等。动物饲料和动物饲料 成分被认为是正常不含反刍动物DNA的组合物。
本文所用“动物”表示任何脊椎动物。动物包括哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行 类、反刍动物、灵长类(如人、大猩猩和黑猩猩)。动物包括家养动物(如牛、绵羊、 山羊、猪、鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、母珠鸡、猫和狗)以及非家养动物(如麋鹿、 鹿、驯鹿和长颈鹿)。动物可以在野外(即在其天然环境中)或可以饲养在动物园。 本文所用定义内的其它动物包括，例如，象、犀牛、河马、狮、虎、熊、美洲豹(cougar)、 美洲狮(puma)、山猫等。
本文所用“化妆品”或“药妆品”表示意图擦涂、倒、洒或喷、掺入或通过其它 方式施用于人体以清洁、美化、增加吸引力或改变容貌的任何化合物。化妆品类型实 例包括，例如皮肤调理剂、润肤剂、粘合剂和发甲调理剂。化妆品实例包括，例如， 皮肤保湿品(例如包括爽身水、爽肤水和抗皱霜)、皮肤清洁品、粉刺护理品(包例 如括皮肤保湿品、皮肤清洁品、养肤液和掩饰用化妆品)、香水、唇部滋润产品、唇 膏、口红、指甲油、眼部和脸部彩妆制品、香波、头发调理剂、烫发剂、染发剂、牙 膏、胶原植入物和除臭剂，以及意图用作化妆品成分的任何材料。
本文所用“营养保健品”表示是食品或食品部分并提供医疗或健康益处的任何物 质，所述医疗或健康益处包括预防和治疗疾病。营养保健品例如包括分离的营养物、 膳食补充剂和遗传工程设计食品的专门饮食、草药制品和加工食品如谷物、汤和饮料、 从食物中分离或纯化的产品和一般以药物形式销售通常不与食品相关并证明有生理 利益或提供抗慢性病保护的产品。营养保健品也包括用营养素、维生素或草药补充剂 增强营养的任何食品。营养保健品实例包括营养补充剂如氨基酸(例如包括酪氨酸、 色氨酸)；油和脂肪酸(例如包括亚油酸和Omega 3油)；矿物质/辅酶/微量元素(例 如包括铁、辅酶Q10、锌)；维生素(例如包括抗坏血酸、维生素E)；蛋白质(乳清) 粉/饮料；基于植物的/草药(例如包括苜蓿、植物营养品、锯榈)；草药和顺势疗法药 物(例如包括多榔菊、金丝桃)；结肠炎治疗(例如包括含牛初乳如灌肠剂的那些)； 关节炎治疗(例如包括含牛葡萄糖胺—软骨素的那些)；关节软骨替换(例如包括含 牛软骨的那些)；消化助剂(胆汁盐、大蒜油)；和体重控制产品(例如包括含牛蛋白 质如胶原、明胶和乳清蛋白的那些)。
本文所用“疫苗”表示包含传染性或免疫原性因子的制剂，给予所述制剂以刺激 应答(例如免疫应答)，这种应答将保护给予的个体免于传染性因子引起的疾病。可 以给予疫苗的个体包括本文定义的任何动物。疫苗包括治疗性疫苗以及预防性(即预 防性)疫苗，治疗性疫苗在感染后给予并意图降低或停止疾病进程，预防性疫苗意图 预防初始的感染。用于疫苗的传染因子可以是整体杀死的(灭活的)、减活的(弱化 的)或人工(如重组)制造的细菌、病毒或真菌。疫苗实例包括，例如，大肠杆菌菌 苗J5株(Upjohn)、UltraBac7(肖氏梭菌—败毒梭菌—诺氏梭菌—索氏梭菌—产气 荚膜梭菌C&D型菌苗—类毒素)(Pfizer)、Spirovav(哈德焦钩端螺旋体菌苗) (Pfizer)、Leptoferm-5(犬钩端螺旋体—流感伤寒钩端螺旋体—哈德焦钩端螺旋体 —出血黄疸钩端螺旋体—波摩那钩端螺旋体菌苗)(Pfizer)、ScourGuard 3(牛轮状 病毒-冠状病毒-死病毒)产气荚膜梭菌C型—大肠杆菌菌苗—类毒素)(Pfizer)、 Bovi-Shield Gold(牛鼻气管炎—病毒腹泻—副流感—呼吸道合胞体病毒疫苗改良活 病毒)犬钩端螺旋体—流感伤寒钩端螺旋体—哈德焦钩端螺旋体—出血黄疸钩端螺旋 体—波摩那钩端螺旋体菌苗(Pfizer)、Defensor3狂犬病疫苗死病毒(Pfizer)，和 Vanguard Plus 5犬瘟热—腺病毒2型—冠状病毒—副流感—细小病毒疫苗改良活死 病毒钩端螺旋体菌苗(Pfizer)。
本文所用“胶体灌输液”表示当给予患者时能引起血容量、心输出、心博量、血 压、尿输出和氧递送显著增加的液体。胶体灌输液的实例包括，例如，血浆增容剂。 血浆增容剂是血替代产品，用于外科治疗或创伤出血护理、急性创伤或手术、烧伤、 败血症、腹膜炎、胰腺炎或挤压伤期间维持患者循环血容量。血浆增容剂的实例包括， 例如，白蛋白、基于明胶的制品如和基于胶原的制品。血浆增容剂可以 来源于天然产品或可以重组产生。
本文所用“RNA酶”表示催化核糖核酸水解(即降解)的酶。合适的RNA酶例 如包括RNA酶A、RNA酶B、RNA酶D、RNA酶E、RNA酶H、RNA酶I、RNA 酶P、RNA酶S、RNA酶T和RNA酶V。RNA酶水解单链和双链形式的RNA，并 识别特定核糖核酸残基。例如，RNA酶A切割单链C和U残基的3’；RNA酶D水 解双链RNA；RNA酶H特异性降解RNA：DNA杂合体中的RNA；RNA酶I通过切 割每个磷酸二酯键优先降解单链RNA成单个核苷3’单磷酸；RNA酶T1切割单链G 残基的3’；RNA酶V1切割碱基配对的核苷酸。
本文所用“PCR抑制剂”表示影响PCR扩增过程，即通过干扰扩增过程自身的 任何部分或通过干扰扩增产物检测的任何化合物。PCR抑制剂可以物理即机械性干 扰PCR反应或扩增产物检测。作为替代方案，PCR抑制剂可以化学干扰PCR反应 或扩增产物检测。
“扩增反应”表示导致模板核酸序列的拷贝数增加的任何化学反应，包括酶促反 应。扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)(见美国专利 4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、链置换扩增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691(1992)； Walker PCR Methods Appl3(1)：1(1993))、转录介导的扩增(Phyffer，et al.，J.Clin. Microbiol.34：834(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.33：1856(1995))、基于核 酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature 350(6313)：91(1991))、滚环扩增(RCA) (Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)：75(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)：35(1999)) 和分支DNA信号扩增(bDNA)(例如见Iqbal et al.，Mol.Cell Probes 13(4)：315 (1999))。
“扩增”表示将溶液置于一定条件下，如果所有反应成分都是完整的，该条件足 以允许多核苷酸扩增。扩增反应的成分例如包括引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷 酸等。因此，例如，如果引物被降解，扩增步骤不产生产物。
本文所用“检测”表示检测扩增产物，即用本领域已知方法生成的产物。合适的 检测方法详细描述于本文。检测扩增产物可以是直接或间接的，并可以用本领域已知 的任何方法完成。还可以用本领域已知方法测量(即定量)扩增产物。
“扩增试剂”表示用于扩增反应的试剂。这些试剂例如可以包括寡核苷酸引物； 基于硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、巴比妥、Tris等的缓冲剂(见美国专利No.5,508,178)； 盐如氯化钾或钠；镁；三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)；核酸聚合酶如Taq DNA聚合酶； 以及DMSO；和稳定剂如明胶、牛血清白蛋白和非离子去污剂(如Tween-20)。
术语“引物”表示在扩增反应中引发合成多核苷酸的核酸序列。典型地，引物包 含少于约100个核苷酸，优选包含少于约30个核苷酸。引物实例有约5-约25个核苷 酸。引物“完整性”表示引物引发扩增反应的能力。例如，引物序列降解如被核酸内 切酶降解之后引物完整性通常不再完整。
“探针”或“寡核苷酸探针”表示能与感兴趣多核苷酸序列杂交并允许检测所选 多核苷酸序列的多核苷酸序列。例如，“探针”可以包含与荧光或放射性试剂连接的 多核苷酸，从而允许检测这些试剂。
术语“亚序列”表示第二序列范围内连续的但不包括第二序列的所有核苷酸的核 苷酸序列。
“靶”或“靶序列”表示希望在扩增反应中扩增的单链或双链多核苷酸序列。如 果两个靶序列含不一致的多核苷酸序列，则它们不相同。靶序列可以是线粒体DNA 或非线粒体DNA。合适的线粒体靶序列例如包括细胞色素B、细胞色素C、12S RNA、 ATP酶亚基8、ATP酶亚基6、ATP合成酶、亚基8，及其亚序列，及其组合。
术语“核酸”或“多核苷酸”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸及其聚合物。该术语包括含已知核苷酸类似物或修饰骨架残基或连接键的核酸，它 们可以是合成、天然存在和非天然存在的，与参考核酸具有相似结合性质，并且以和 参考核苷酸相似的方式被代谢。这些类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷 酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。
当如下所述比对最大对应性时，如果两种核酸序列或多肽中核苷酸或氨基酸残基 的序列分别相同，则说两序列是“一致的”。术语“与…互补”此处用于表示所有第 一序列与参考多核苷酸序列的至少一部分互补。
序列比较的最佳匹配可以通过Smith and Waterman Add.APL.Math.2：482 (1981)的局部同源性算法；Needle man and Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的同 源性比对算法；Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相 似性搜索方法；这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)或观察进行。
“序列一致性百分比”通过在比较窗比较两个最适匹配序列来确定，其中当与参 考序列(不包含添加或缺失)比较进行两序列的最佳匹配时，比较窗中多核苷酸序列 的部分可以包含添加或缺失(即间隙)。百分比的计算如下：确定两序列中出现相同 核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目而得到匹配位置的数目，匹配位置数除以比较窗 中位置总数，并将结果乘以100得到序列一致性百分比。两序列之间的百分一致性可 以由25％-100％之间的任意整数表示。更优选的实施方案包括至少：25％、30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或 99％。
适于确定百分序列一致性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，描述 于Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403(1990)。执行BALST分析的软件可通过美国国 立生物技术信息中心(http://ww w.ncbi.nlm..nih.gov/)公开获得。这种算法包括：首先 通过识别查询序列中长W的短字来确定高分值序列对(HSPs)，当与数据库序列中 相同长度的字进行比对时，它匹配或满足一些正值阈值评分T。T称为相似性字评分 阈值(Altschul et al.，同上)。这些初始的邻近字匹配(word hit)作为启动搜索的种 子以发现含它们的更长HSPs。字匹配沿每个序列向两方向扩展，直到累计比对评分 可以增加。当累计比对评分从所达到最大值下降量X时；当由于一或多个负评分残 基比对的累计而使累计评分到零或零以下时；或达到任意序列的末端时；字匹配的双 向扩展停止。BLAST算法中参数W，T和X决定了比对的灵敏性和速度。BLAST程 序使用默认字长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4，和比较 两条链。
术语“氨基酸”表示天然存在和合成的氨基酸，以及以天然存在氨基酸相似方式 发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的 氨基酸，以及之后被修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物表示与天然氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、 氨基和R基结合的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。 这些类似物具有修饰R基(如正亮氨酸)或修饰肽骨架，但保留与天然氨基酸相同 的基本化学结构。氨基酸模拟物表示具有与氨基酸一般化学结构不同的结构、但以天 然氨基酸相似方式发挥功能的化合物。
本文中氨基酸可以表示为IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知三字母符 号或单字母符号。与之相似，核苷酸可以表示为共同接受的单字母编码。混合核苷酸 例如按Eur.J.Biochem.(1985)150：1所述表示。
III.发明方法
本发明的一个实施方案提供扩增、检测和/或测量样品(如反刍动物饲料、宠物食 品、化妆品、人食品和营养保健品)中反刍动物DNA的方法。特别感兴趣的靶反刍 动物DNA序列包括线粒体DNA序列和非线粒体DNA序列。合适的线粒体DNA序 列例如包括编码以下的序列：细胞色素c、细胞色素b、12S RNA、ATP酶亚基8、 ATP酶亚基6、ATP合成酶、亚基8，及其亚序列及其组合。
A.RNA酶处理
根据本发明方法，在适于RNA酶降解动物饲料中存在的任何RNA的条件(如适 当时间、温度和pH)下使来自样品的核酸与RNA酶接触，从而减少和/或消除用于 扩增动物饲料中反刍动物DNA的扩增反应的抑制剂。典型地，RNA酶与核酸接触约 15至约120分钟，更典型地约30至约90分钟，甚至更典型地约45至约75分钟， 最典型地约60分钟。典型地，RNA酶与核酸在约30℃至约42℃接触，更典型在约 35℃至约40℃接触，最典型在约37℃接触。典型地，RNA酶与核酸在约pH6.5至约 8.0接触，更典型在约pH6.8至约7.5接触，最典型在约pH7.0接触。典型地，约0.01 至约1μgRNA酶与核酸接触，更典型地约0.025至约0.5μgRNA酶与核酸接触，更 典型地约0.4至约0.25μg RNA酶与核酸接触，最典型地约0.05μg RNA酶与核酸接 触。在一些实施方案中，在RNA酶与核酸接触之前，RNA酶被加热至约100℃以破 坏任何污染的DNA酶。
本领域技术人员将会知道，可以在从动物饲料中提取核酸之前、之中或之后将 RNA酶与核酸接触。本领域技术人员也将会知道，本领域已知的任何RNA酶可用于 本发明方法。合适的RNA酶例如包括RNA酶A、RNA酶B、RNA酶E、RNA酶 H、RNA酶I、RNA酶P、RNA酶S、RNA酶T、RNA酶V及其组合。很多RNA 酶及RNA酶组合可商业获得。例如，Roche Diagnostics Corporation的无DNA酶的 RNA酶(目录号1119915)可方便地用于本发明方法。
B.核酸提取
可以用本领域已知任何方法和/或商品试剂盒从样品中提取核酸。例如，异硫氰酸 胍提取，描述于Tartaglia et al.，J.Food Prot.61(5)：513-518(1998)；chelex提取，描 述于Wang et al.，Mol.Cell.Probes 14：1-5(2000)；从Whatman滤纸提取，描述于美 国专利No.5,496,562；从基于纤维素的FTA滤纸提取，描述于Orlandi and Lampe，J. Clin.Microbiology，38(6)：2271-2277(2000)和Burgoyne et al.，5th International Symposium on Human Identification，1994(Hoenecke et al.，eds.)可以用于从样品中 提取核酸。此外，Neogen Kit(Neogen Catalog No.8100)、Qiagen Stool Kit(Qiagen Catalog No.51504)、Qiagen Plant Kit(Qiagen Catalog No.69181)和Whatman FTA 卡(例如Whatman Catalog Nos.WB120055；WB120056；WB120205；WB120206； WB120208；WB120210)可以方便地用于从任何样品中提取核酸。
在一个优选实施方案中，用基于纤维素的FTA卡提取核酸。FTA卡典型地包含 裂解细胞膜和变性蛋白质的化合物。将样品施加到FTA卡并使之干燥。DNA被俘获 到FTA卡的基质内并在室温下稳定长达14年。为了从样品(如动物饲料、人食品、 疫苗、化妆品或营养保健品)中提取核酸用于PCR分析，根据制造商说明从FTA卡 上取孔片(如1-2mm孔片)并洗涤FTA卡。然后将洗涤后的孔片直接放入PCR反 应中或用本领域已知的任何方法从孔片上洗脱DNA。液体样品可以不需预处理而直 接施加到卡上。更复杂的样品(如固体样品)可能需要在施加到FTA卡之前进行处 理。典型地约1μl至约1000μl、更典型地约2.5μl至约500μl、更典型地约5μl至 约250μl、更典型地约7.5μl至约100μl、最典型地约10μl至约65μl样品可以置于 FTA卡上。
公开本发明中一般使用方法的基础文本包括：MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Sambrook et al.eds.3d ed.2001)；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND Applications(Innis et al.，eds，1990)；GENE TRANSFER AND EXPRESSION：A LABORATORY MANUAL(Kriegler，1990)；和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel et al.，eds.， 1994))。
C.扩增反应成分
1.寡核苷酸
用于本发明的寡核苷酸以及设计用于检测扩增产物的寡核苷酸可以使用本领域 已知方法化学合成。这些寡核苷酸可以用放射性同位素、化学发光基团或荧光基团标 记。这种标记可用于用本发明的方法和组合物表征和检测扩增产物。
典型地，靶引物存在于扩增反应混合物中浓度约0.1μM至约1.0μM，更典型约 0.25μM至约0.9μM，甚至更典型约0.5μM至约0.75μM，最典型约0.6μM。引物 长度可以是约8至约100个核苷酸长，更典型约10至约75个核苷酸长，更典型约 12至约50个核苷酸长，更典型约15至约30个核苷酸长，最典型约19个核苷酸长。 优选地，本发明引物都具有大致相同的熔链温度。典型地，引物扩增表现高种间变异 的反刍动物DNA序列。合适的靶序列例如包括细胞色素B、细胞色素C、12S RNA、 ATP酶亚基8、ATP酶亚基6、ATP合成酶、亚基8，及其亚序列，及其组合。
2.缓冲剂
可用的缓冲剂是基于硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、巴比妥、Tris等的缓冲剂。(见美 国专利No.5,508,178)。反应pH应该维持在约4.5至约9.5范围内。(见美国专利 No.5,508,178)。用于扩增反应的标准缓冲液是10-50mM之间、pH约8.3-8.8的Tris 碱缓冲液(见Innis et al.，同上)。
本领域技术人员将会知道缓冲液条件应该设计为允许所有感兴趣反应工作。因 此，缓冲液条件可以设计为支持扩增反应以及任何随后的限制酶反应。通过单独和组 合地测试这些反应，可以测试具体的反应缓冲液支持各种反应的能力。
3.盐浓度
反应中存在的盐浓度可以影响引物退火到靶核酸上的能力。(见Innis et al.)。可 以向反应混合物中加入浓度高达约50mM的氯化钾以促进引物退火。也可以加入氯 化钠以促进引物退火。(见Innis et al.)。
4.镁离子浓度
反应中镁离子浓度可以影响靶序列扩增。(见Innis et al.)。引物退火、链变性、 扩增特异性、引物二聚体形成和酶活性都是受镁浓度影响的参数的实例。(见Innis et al.)。扩增反应应该含比dNTP浓度过量约0.5-2.5mM的镁浓度。反应中存在镁螯合 剂可以影响最佳镁浓度。可以在一定镁浓度范围进行一系列扩增反应以确定最佳镁浓 度。最佳镁浓度可根据靶核酸的性质和所用引物以及其它参数而变化。
5.三磷酸脱氧核苷浓度
向反应中加入三磷酸脱氧核苷(dNTP)至终浓度约20μM-约300μM。典型地， 四种dNTP(G、A、C、T)中每种以等浓度存在。(见Innis et al.)。
6.核酸聚合酶
多种DNA依赖的聚合酶可商业获得，它们用本发明的方法和组合物将发挥功能。 例如，可用Taq DNA聚合酶扩增靶DNA序列。可以使用热稳定DNA聚合酶来源作 为酶组分进行PCR测试，所述热稳定DNA聚合酶来源合适地包括Taq DNA聚合酶， 它可以是从水生栖热菌纯化的天然酶和/或该酶的遗传工程形式。其它商业可得的聚 合酶例如包括由Promega或Pharmacia销售的Taq聚合酶。可用于本发明的热稳定 DNA聚合酶的其它实例包括从例如栖热菌属和火球菌属获得的DNA聚合酶。所述聚 合酶的浓度范围可以是1-5单位/反应混合物。反应混合物典型在15-100μl之间。
在一些实施方案中，可以使用“热启动”聚合酶以防止当反应温度刚开始增加时 错误引发事件的延伸。热启动聚合酶例如可以具有需要热活化步骤(典型95℃约10-15 分钟)的热不稳定的加合物，或可以具有与聚合酶结合的抗体以防止活化。
7.其它试剂
有时向反应中加入其它试剂以实现期望结果。例如，DMSO可以加入反应中，但 据报道它抑制Taq DNA聚合酶活性。然而，对于在同一反应中扩增多个靶序列推荐 使用DMSO。(见Innis et al.同上)。稳定剂如明胶、牛血清白蛋白和非离子去污剂 (如Tween-20)通常加入扩增反应中。(见Innis et al.同上)。
D.扩增
用反应扩增RNA或DNA模板是公知的(见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis et al.，eds， 1990))。方法如聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)可用于直接从动 物饲料和动物饲料成分中扩增靶DNA序列的核酸序列。反应优选在热循环仪中进行， 热循环仪有助于在期望温度的保温时间。可以设计简并寡核苷酸使用编码靶DNA序 列的已知序列扩增所述同源性靶DNA序列。可以将限制性内切酶位点引入引物中。
示例性PCR反应条件典型地包括两或三步循环。两步循环具有变性步骤，接着 是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，接着是杂交步骤，接着是分离的延伸步 骤。对于PCR，约36℃的温度对于低严谨性扩增是典型的，尽管退火温度可以根据 引物长度在约32℃和48℃之间变化。对于高严谨性PCR扩增，约62℃的温度是典 型的，尽管高严谨性退火温度可以根据引物长度和特异性在约50℃至约65℃之间的 范围。对于高和低严谨性扩增典型的循环条件包括90℃-95℃变性阶段15秒-2分钟、 退火阶段持续10秒-2分钟，和约72℃延伸阶段持续5秒-2分钟。
在一些实施方案中，扩增反应是例如Aradaib et al.，Vet.Sci.Animal Husbandry 37(1-2)：13-23(1998)和Aradaib et al.，Vet.Sci.Animal Husbandry 37(1-2)：144-150 (1998)所述的巢式PCR。进行两步扩增。第一步扩增使用一对“外部”引物(如SEQ ID NO：7和10)，设计用于扩增靶序列的高度保守性区域。第二步扩增使用一对“内 部”(即“巢式”)引物(如SEQ ID NO：8和9)，设计用于扩增包含于第一步扩增产 物内的靶序列的部分。
等温扩增反应也是已知的并可用于本发明方法。等温扩增反应的实例包括链置换 扩增(SDA)(Walker，et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691(1992)；Walker PCR Methods Appl 3(1)：1(1993))、转录介导的扩增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol. 34：834(1996)；Vuorinen，et al.，J.Clin.Microbiol.33：1856(1995))、基于核酸序列的扩 增(NASBA)(Compton，Nature350(6313)：91(1991))和分支DNA信号扩增(bDNA) (例如见Iqbal et al.，Mol.Cell Probes 13(4)：315(1999))。在一个优选实施方案中，使 用滚环扩增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)：75(1999)；Hatch et al.，Genet.Anal. 15(2)：35(1999))。本领域技术人员已知的其它扩增方法包括CPR(循环探针反应)、 SSR(自持续性序列复制)、SDA(链置换扩增)、QBR(Q-Beta复制酶)、Re-AMP (以前的RAMP)、RCR(修复链式反应)、TAS(基于转录的扩增系统)和HCS(杂 交捕获系统)。可以将本领域技术人员已知的任何扩增方法与本发明方法一起使用， 只要两条引物存在靶序列的两端即可。
E.检测扩增产物
可用本领域已知的任何方法检测扩增产物，这些方法例如包括固相测试、阴离子 交换高效液相色谱和荧光标记扩增核酸(见MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Sambrook et al.eds.3d ed.2001)；Reischl and Kochanowski Mol.Biotechnol.3(1)：55-71(1995))。本领域已知的扩增产物凝胶电泳后 进行标准分析也可以用于检测和定量扩增产物。合适的基于凝胶电泳的技术包括，例 如，凝胶电泳后在荧光自动化DNA测序仪上定量扩增产物(例如见Porcher et al.， Biotechniques 13(1)：106-14(1992))；荧光分析(例如见Innis et al.，同上)、嵌入型染 料染色凝胶的计算机图像分析(例如见Schneeberger et al.，PCR Methods Appl.4(4)： 234-8(1995))；和扩增期间掺入放射性测量(例如见Innis et al.，同上)。其它合适的 检测扩增产物的方法包括使用双标记探针，如用报告和淬灭染料双标记的探针，它仅 在与靶序列结合时发荧光；和用荧光共振能量转移(FRET)技术，其中用供体或受 体标记分子标记的探针在互相邻近的扩增片段内结合，仅当两个探针都与其靶序列结 合时发荧光。合适的报告和淬灭剂例如包括黑洞淬灭染料(BHQ)、TAMRA、FAM、 CY3、CY5、荧光素、HEX、JOE、LightCycler Red、Oregon Green、罗丹明、罗 丹明绿、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、德克萨斯红和分子信标(Molecular Beacons)。
扩增和检测步骤可以依次或同时进行。在一个优选实施方案中，用实时PCR检 测靶序列。例如，在优选实施方案中，用Green I的实时PCR可用于扩增和 检测靶核酸(例如见Ponchel et al.，BMC Biotechnol.3：18(2003))。Green I 仅当与双链DNA(dsDNA)结合时发荧光。因此，荧光信号强度依赖于扩增产物中 存在的双链DNA量。检测的特异性可以方便地用熔链曲线分析确认。
在另一个优选实施方案中，FRET探针和引物可用于检测反刍动物DNA。本领域 技术人员将会知道所述引物和探针可以方便地设计成与Lightcycler系统(Roche Molecular Biochemicals)一起使用。例如，单组引物(如SEQ ID NO：11和12)和 探针(SEQ ID NO：13和14)可以方便地设计使得多种反刍动物(如牛、山羊、绵羊、 麋鹿和鹿等)的DNA扩增，并且探针将结合所有扩增子，但这些扩增子具有不同程 度的同源性。同源性差异导致不同的熔链温度(Tm)，分别对应单个反刍动物物种。
IV.本发明的试剂盒
本发明还提供扩增反刍动物DNA的试剂盒。这种试剂盒典型地包含扩增反刍动 物DNA必需的两或多种成分。成分可以是化合物、试剂、容器和/或装置。例如，试 剂盒内的一个容器含有第一组引物，如SEQ ID NO：1和2；3和4；或5和6，试剂 盒内的另一个容器可以含有第二组引物，如SEQ ID NO：1和2；3和4；或5和6。 此外，试剂盒包含使用说明，即在本文所述扩增和/或检测反应中使用所述引物的说 明。
试剂盒还可以包含任何的本文所述提取、扩增、检测反应成分或缓冲液。试剂盒 还可以包含合适的RNA酶(如RNA酶A、RNA酶B、RNA酶D、RNA酶E、RNA 酶H、RNA酶I、RNA酶P、RNA酶S、RNA酶T、RNA酶V及其组合)用于本 发明的方法中。
实施例
将用以下实施例进一步举例说明本发明的实施方案。这些实施例提供举例说明， 但不限制要求保护的本发明。
实施例1：材料和方法：
制备牛饲料：按照权威分析方法(例如见JAOC，16thE dition published by AOAC， International Suite 400，2200 Wilson Blvd.，Arlington VA 22201 1995，§§965.16and 950.02)，将七种代表性牛饲料样品在Wiley磨(Arthur H Thomas Co，Swedesboro，NJ， model 3375-E10)中磨成细粉末。所述7种饲料包含以下成分：
饲料No.1(“完成”配料I)：80％浓缩物(玉米)，20％粗料，无糖蜜和牛油；
成分                          ％干物质
青贮苜蓿                      4.63
苜蓿干草                      12.96
小麦剁碎料(Wheatlage)         3.70
青贮玉米                      25.74
杏仁壳                        4.63
柑桔果肉(湿)                  3.70
玉米片                        18.15
玉米种子(整)                  8.33
大豆粉                        4.44
油菜饼粉                      2.78
过瘤胃大豆粉                  4.63
过瘤胃蛋白质混合物(鱼/血)     1.48
矿物质混合物                  3.89
饲料No.2(“完成”配料II)：80％浓缩物(玉米)，20％粗料，有糖蜜和牛油；
成分                           ％干物质
青贮苜蓿                       4.63
苜蓿干草                       12.96
小麦剁碎料                     3.70
青贮玉米                       25.74
杏仁壳                         4.63
柑桔果肉(湿)                   3.70
玉米片                         18.15
玉米种子(整)                   8.33
大豆粉                         4.44
油菜饼粉                       2.78
过瘤胃大豆粉                   4.63
过瘤胃蛋白质混合物(鱼/血)      1.48
矿物质混合物                   3.89
脂肪(牛油)                     0.5
糖蜜                           0.43
饲料No.3(“起始”配料)：40％浓缩物(玉米)，60％粗料；
成分                         ％干物质
苜蓿干草                     17.96
燕麦干草                     13.13
青贮玉米                     27.63
小麦剁碎料                   10.36
矿物质                       6.04
油菜饼粉                     11.05
柑桔果肉(湿)                 5.18
玉米片                       5.64
饲料No.4(“生长”配料)：60％浓缩物(玉米)和40％粗料和奶牛场饲料样品；
成分                         ％干物质
研磨玉米                     38.6
棉籽饼粉                     1.4
苜蓿干草                     12.0
青贮玉米                     44.0
矿物质混合物                 4.0
饲料No.5(“成年低产乳”配料)：
成分                          ％干物质
青贮苜蓿                      7.14
苜蓿干草                      15.48
青贮玉米                      28.57
杏仁壳                        2.86
柑桔果肉(湿)                  4.29
玉米片                        16.67
玉米种子(整)                  9.52
大豆粉                        4.76
过瘤胃大豆粉                  4.29
矿物质混合物                  4.76
糖蜜/脂肪混合物               1.67
饲料No.6(3-6月牛配料)：
成分                          ％干物质
麦秸                          11.49
青贮苜蓿                      17.01
产奶牛剩料＊                  22.99
小麦剁碎料                    32.18
油菜饼粉                      2.30
柑桔果肉(湿)                  4.60
玉米片                        6.90
矿物质                        2.53
＊产奶牛剩料是高产配料(完成配料)中未消耗的饲料，收集并与本小母牛配料 混合。
饲料No.7(商品牛断奶配料)：
成分                          ％干物质
苜蓿干草                      16.09
青贮玉米                      30.65
小麦剁碎料                    19.16
大豆粉                        9.96
玉米片                        19.16
矿物质                        4.98
为了确认饲料中不存在微量牛制品，在相同饲料添加提取的肉和骨粉的同时，分 析所有饲料(未添加并标为含0％牛肉和骨髓“BMBM”)。提取的牛肉和骨粉(BMBM) 与以上7种饲料混合，得到含2％、1％、0.5％、0.2％和0.1％ BMBM wt/wt的饲料。 包括未添加的每种饲料的样品(0％ BMBM)作为阴性对照。选择一种牛饲料(饲 料1)含有0.05％和0.01％ BMBM并仅提取一次。
用Qiagen试剂盒进行DNA提取和分析：因为它致力于解决样品中存在PCR抑 制剂，我们选择Qiagen Stool Kit(QIamp DNA Stool Mini Kit，目录号51504，Qiagen Inc Valencia，CA)进行我们的提取。使用标准取样操作，用少量修改的Qiagen Stool Kit操作方案提取非特异性DNA(例如见J.Official Analy.Chem.，§§ 965.16 and 950.02(Assoc.Official Analy.Chem.16th ed.(1995)))。简单的说，增加用于消化的试 剂量以补偿粉末饲料的吸收性，并且仅使用100μL进行洗脱。阳性对照是用Qiagen Stool Kit从BMBM中提取的牛线粒体DNA(B-mtDNA)；阴性对照是未添加BMBM 的饲料(0％ BMBM)。
用Neogen试剂盒进行DNA提取和分析：对添加牛饲料并按Neogen试剂盒说明 进行DNA提取(Neogen Corporation，Lansing，MI，AgriScreen for Ruminant Feed， 目录号8100)。PCR之前，定量添加和未添加牛饲料的提取产物并估计其纯度。用荧 光计(Hoefer Pharmacia Biotech，San Francisco，CA，model，TK-0-100)定量DNA。 用分光光度计(Amersham Biosciences，San Francisco，CA，model Ultraspec 2100)测 量DNA纯度(即260/280nm比率)。在一次试验中，所选提取物的试样置于沸水浴 中10分钟。通过用RNA酶(无DNA的RNA酶—Roche Diagnostics Corporation Indianapolis，IN，Catalogue 1 119 915)消化三个选择样品进一步分析DNA纯度，其 中将0.05μg RNA酶加入10μl提取材料中并在37℃保温60分钟。然后将样品在95 ℃保温10分钟以灭活RNA酶，然后与未处理的提取物一起电泳(1.2％琼脂糖，含 溴化乙锭，在60V电泳50分钟)，使用DNA标记物(Invitrogen 100bp DNA Ladder， 目录号10380，Carlsbad，CA)进行比较。所有牛饲料提取物如上用RNA酶消化，并 用以下PCR方案对未处理和RNA酶处理的提取物进行PCR。
PCR：用杂交探针和人DNA(HDNA)对照试剂盒(Roche，Applied Sciences， Indianapolis，IN)对所有7种含0％ BMBM的饲料样品进行荧光PCR。18μl反应 混合物含4mM MgCl2、β-珠蛋白引物、LC Red 640或LC Red 705和杂交探针(Roche， Applied Sciences)。测试饲料按与所加PCR级水按1:3.8的比例加入反应混合物中。 加入2μl体积中的3pg、30pg、300pg、3ng和30ng浓度的人对照试剂盒DNA作 为模板DNA。使用的热循环设置如下：变性步骤95℃持续30秒；随后45个循环的 95℃持续0秒、55℃持续10秒和72℃持续5秒；和冷却期40℃维持30秒。每组中 用PCR级水作阴性对照。另外，单独做一组反应混合物中不加饲料的对照。
实施例2：鉴定牛饲料中作为抑制PCR扩增反刍动物DNA的污染物的RNA
用人DNA作为内部PCR对照进行的测试显示抑制PCR的物质存在于牛饲料的 提取产物中。抑制由检测到的最小皮克量的HDNA指示(图2：表1)。在7种未稀 释牛饲料提取中HDNA的最小皮克量变化100倍。稀释提取物(1：100)增加检测到 HDNA的扩增。饲料No.2、3、4和6中最小检测水平增加10倍；而对于饲料No.1、 5和7则最小检测水平无变化。对于每种饲料样品加入已知量的内对照如HDNA使 得可检测任何抑制物质和解释阴性结果。不同牛饲料的未稀释和稀释提取产物的 HDNA检测水平差异确认了存在可能通过稀释去除的抑制性物质。
也使用基于免疫酶的测试商品(Neogen)测试饲料中反刍动物污染物。Neogen 测试不能在低于1％水平检测添加了的牛制品，并且仅检测到7种饲料中的一种。更 具体地，Neogen测试仅对于添加1％ BMBM的一种饲料中的B-mtDNA是阳性的。 相比之下，通过PCR，我们能在添加0.2％ BMBM的所有样品的RNA酶处理的提 取物中检测到B-mtDNA，除了饲料No.3以外我们能在添加0.1％ BMBM的所有牛 饲料中检测到N-mtDNA。我们在添加0.05％ BMBM的饲料1中检测到B-mtDNA。 有可能在抑制剂低的其它添加0.5％ BMBM的饲料(如饲料No.2和7)中检测到 B-mtDNA。因此我们的PCR测试具有高于Neogen试剂盒检测限的更高灵敏度。
我们研究了抑制性物质的基本特征。抑制性物质首先被怀疑是酶性和/或蛋白质性 的，然而煮沸对扩增提取的核酸没有作用的证据排除了这种可能性。
测量提取核酸的260/280nm比率(平均2.11)指示核酸被RNA污染。通过RNA 酶消化提取物和未处理及处理样品一起电泳确认了核酸的RNA污染。分子量低于 2,000bp的带提示降解的DNA。尽管优选用仅检测DNA的荧光计定量DNA；260nm 分光光度计的读出值测量DNA和RNA。核酸测量值(分光光度计260nm)是荧光 计DNA定量的10-40倍。在很多提取物中测量的这种过量的污染RNA可能单独通 过机械方式干扰扩增反应，即物理干扰扩增反应成分。降解DNA的存在引起的干扰 一般将导致假阳性结果，然而，在整个试验中我们未遇到任何假阳性。另一个可能的 解释是降解的DNA代表一些靶DNA，因此将B-mtDNA的量降低到扩增必需量以下。 这可能导致RNA酶处理的牛饲料No.3、4、5、6和7中见到的在0.2％和0.1％ BMBM 的较低浓度下见到的假阴性结果。更好保存DNA完整性的提取方法和柱纯化和浓缩 之前用RNA酶处理牛饲料理论上能增加洗脱液中B-mtDNA的量并进一步提高检测 水平。
因此，我们已经证实存在从7种代表性牛饲料类型中与非特异性DNA同时提取 的PCR抑制性物质。而且，我们已经表征并鉴定了RNA是主要的抑制性物质。
实施例3：扩增和检测多种动物饲料和饲料成分中的反刍动物DNA
用Lightcycler(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN)对含2％、1％、0.5％、 0.2％、0.1％和0％牛肉和骨粉(BMBM)的所有7种代表性饲料进行荧光PCR。同 时对每种未处理和RNA酶处理的样品进行分析。哺乳动物细胞mtDNA的高产率、 mtDNA的高突变率和mtDNA的遗传学保守性使得线粒体DNA高度适用作对反刍动 物DNA例如牛DNA特异的靶序列(例如见Robin and Wong，J.Cell Physiol. 136：507-13(1988)和Saccone et al.，Gene 261：153-9(2000).)。引物CSL1和CSR2扩 增283bp产物：CSL1BGAATTTCGGTTCCCTCCTG和CSR2B GGCTATTACTGTGAGCAGA。5μl体积的提取饲料DNA加入15μl反应物中，所 述反应物中含有3.5mM MgCl2、0.6mM每种引物和 GreenI荧光染料。所 用的热循环设置如下：变性步骤95℃持续30秒；随后40个循环的95℃持续0秒、 56℃持续10秒和72℃持续12秒；熔链期95℃维持0秒、65℃维持10秒和95℃维 持0秒；和冷却期40℃维持60秒。PCR阴性(无DNA酶/RNA酶的水)和阳性(BMBM) 对照与饲料样品一起操作。
另外，用可产生428bp产物的山羊特异性引物对样品进行PCR：GSL1 B TCATACATATCGGACGACGT和GSR2 B CAAGAATTAGTAGCATGGCG。15μl 反应混合物含3mM MgCl2、0.8mM两种引物和FastStart Green I染料 (Roche Applied Sciences)。所用热循环设置如下：变性步骤95℃持续10分钟；随 后45个循环的95℃持续10秒、57℃持续5秒和72℃持续25秒；熔链期95℃持续0 秒、65℃持续15秒和95℃持续0秒；和冷却期40℃持续30秒。
此外，用Qiagen Stool试剂盒提取从通常用于动物饲料中的5种动物来源的提炼 产品。所用产品是猪干血、鱼粉、羔羊粉、禽粉和牛干血。7种牛饲料样品的每种添 加2％wt/wt的每种产品。对它们提取非特异性DNA，用RNA酶处理并用牛特异性 引物CSL1和CSR2进行PCR，其中用BMBM作为阳性PCR对照。5μL体积模板 DNA(“未知”样品)加入15μL反应混合物中，所述反应混合物中含有3.5mM MgCl2、 0.6mM每种引物和 Green I染料。所用热循环设置如下：变性步骤95℃持 续30秒；随后40个循环的95℃持续0秒、56℃持续10秒和72℃持续12秒；熔链 期95℃持续0秒、65℃持续10秒和95℃持续0秒；和冷却期40℃维持60秒。
B-mtDNA扩增仅发生于三种饲料中，与在最低水平检测到B-mtDNA的饲料相 同，即添加0.1％ BMBM的饲料。从其它物种、尤其是紧密相关的反刍动物物种的 提取产品中不能检测到mtDNA，证明PCR技术中高度特异性引物的优点。在7种 牛饲料中的4种中用牛干血检测不到可以解释为：白细胞是全血中存在的唯一核酸材 料，因此干血产品中存在低量的B-mtDNA。牛饲料No.1、2和7中三种阳性牛干血 是相同的3种饲料，当添加BMBM时具有最低可检测量的B-mtDNA。这表明这些 饲料中的RNA酶处理是完全成功的，并且如果提取产品也含有低量抑制性物质仍可 以检测到低量的扩增子。用山羊引物获得的阴性结果也证实了山羊特异性引物的特异 性，尤其是在mtDNA来自紧密相关反刍动物的情况下。
因此，我们已经测量了在用荧光PCR技术检测B-mtDNA中去除RNA的作用。
实施例4：扩增和检测牛饲料中的反刍动物DNA
向牛饲料1中添加0.1％、0.05％、0.01％和0.001％BMBM。提取产物在与7种 RNA酶处理的饲料样品相同的条件下在Lightcylcer上进行分析。熔链曲线分析(图 1)直观地证明靶序列的扩增。熔链温度和阳性对照的交叉点分别是85.28和19.05。 含0.05％和0.1％ BMBM的饲料样品中的扩增产物都具有相同的熔链温度(85.28) 并分别具有25.67和24.96的交叉点。对相同的提取产物进行凝胶电泳(1.2％琼脂糖， 含溴化乙锭，在60V持续50分钟)。DNA ladder(Invitrogen 100bp Ladder，目录号 10380，Carlsbad，CA)用于比较。
向牛饲料中添加预定量的牛肉和骨粉(BMBM)。用RNA酶处理提取产物并用荧 光Lightcycler技术扩增牛特异性线粒体DNA(B-mtDNA)。B-mtDNA的最小检测 水平随提取物的RNA酶处理、BMBM的浓度(％)和饲料复杂性而变化。每种样 品的RNA酶处理使整体假阴性结果降低75％。RNA酶处理使含2％、1％和0.5％ BMBM的样品中假阴性结果降低100％。在0.2％和0.1％水平假阴性结果降低50％。
确认283bp产物的扩增验证了牛特异性引物和实时Light cycler技术的应用(图 1)。来自添加1％和0.5％ BMBM的牛饲料和两种阳性BMBM对照的PCR产物在 相同温度处显示强峰，尽管交叉点稍微降低(可以理解，因为提取物中扩增原 (ampligen)的浓度低于阳性对照)。来自添加0.01％和0.001％ BMBM的牛饲料的 PCR产物没有扩增。PCR产物的凝胶电泳证明了相同结果。300bp DNA ladder带与 来自添加0.1％和0.05％ BMBM的牛饲料的PCR产物显示的带相当，并且与两个阳 性对照BMBM产物的相当，但阴性对照和添加0.01％和0.001％ BMBM的牛饲料 的PCR产物中缺少对应带。
实施例5：FRET探针技术在实时荧光PCR检测和区分反刍动物DNA中的应用
为了在单个PCR反应中检测和区分牛、绵羊和山羊DNA，设计了一组FRET探 针(SEQ ID NO：13和14)和引物(SEQ ID NO：11和12)，并以Roche所述用 Lightcycler系统进行突变分析相似的方式使用(Roche Molecular Biochemicals)。
用Roche Lightcycler的突变分析技术基于以下原理：在加热PCR产物期间序列 特异性FRET探针将在确定温度处熔链。探针从靶DNA上解离的温度(通常定义为 Tm，50％探针从靶DNA上解离的温度)直接相关于探针和靶序列之间的序列同源 性以及探针大小。探针和靶序列之间100％序列同源时，探针将在高至最大温度处保 持与靶序列退火。如果探针与靶序列之间有单碱基错配，退火探针的稳定性将降低， 从而导致探针从靶序列熔链的温度降低。Roche描述了通过比较结果熔链曲线的差异 筛选野生型和突变体DNA的这种方法。
我们使用这种方法的改进来区分单组引物扩增的DNA之间的序列差异，从而允 许从一次PCR扩增的结果中鉴定牛、绵羊和山羊DNA。设计单组引物和探针使得所 有三种反刍动物物种的DNA都将扩增，并且探针将与所有三种扩增子结合但具有不 同程度的同源性。FRET探针结合牛靶序列具有100％同源性，山羊靶序列具有93 ％同源性，绵羊靶序列具有88％同源性。同源性差异导致三种不同的熔链曲线温度 (Tm)，每种分别对应牛、山羊或绵羊。结果显示于图6。
FRET探针技术可以方便地与本文所述RNA酶处理联合使用用于扩增和检测反 刍动物DNA。
实施例6：采用巢式PCR扩增反刍动物DNA
例如Aradaib et al.，Vet.Sci.Animal Husbandry 37(1-2)：13-23(1998)和Aradaib et al.，Vet.Sci.Animal Husbandry 37(1-2)：144-150(1998)中所述的巢式PCR也可用于扩 增靶核酸序列。使用一对“外部”引物(例如SEQ ID NO：7和10)的第一扩增步骤用 于扩增靶序列(如细胞色素b)的高度保守性区域。使用一对“内部”(即“巢式”)引 物(例如SEQ ID NO：5和6；或8和9)的第二扩增步骤用于扩增靶序列(如细胞色 素b)的包含在第一扩增产物内的部分。
具体地，SEQ ID NO：7和10可用于从反刍动物细胞色素b扩增736bp序列。SEQ ID NO：8和9可用于扩增483bp反刍动物细胞色素b序列，该序列包含在用SEQ ID NO：7和10扩增的736bp序列之内。SEQ ID NO：5和6可用于扩增606bp绵羊细胞色 素b序列，该序列包含在用SEQ ID NO：7和10扩增的736bp序列之内。
巢式PCR可以方便的与本文所述RNA酶处理结合用于扩增和检测反刍动物 DNA。
这些研究致力于检测动物饲料或动物饲料成分中禁用成分中遇到的“现实生活” 条件和问题。具体地说，它确认了用不同复杂性的牛饲料获得不同的结果。这些差异 是由于随靶DNA同时提取的抑制性物质。提取期间采用的降低抑制剂量的典型措施可 能不完全有效，因此检测任何PCR抑制剂存在的内部对照可以包括在反应混合物中。 鉴定和减少或消除引起抑制的物质能提高一致性和检测。
向饲料“添加”提炼的动物制品代表向牛饲料中掺入最常用的成分，再次模拟现 场条件。
当考虑抑制性物质的存在时，使用高特异性引物组合荧光实时PCR技术提供检 测和鉴定各种牛饲料中所含微量禁用制品的解决方案的能力。
实施例7：比较基于PCR和基于抗体检测牛饲料的牛副产品污染物
我们比较了基于聚合酶链式反应(PCR)的检测样品中反刍动物核酸的方法(例 如见Sawyer et al.，J.Foodborne Pathogens and Disease 1(2)：105-113(2004)和以上实施 例3)以及基于抗体的检测样品中反刍动物肽的方法(即 for Ruminant Detection(Neogen Corporation，Lansing MI))。使用添加禁用添加剂牛肉和骨粉 (BMBM)或牛干血(BDB)的相同饲料的两种不同技术的比较证明，更灵敏的定量 PCR分析更可能进行更小量污染的一致性检测。
更具体地，我们研究了两种技术在检测多种牛饲料中牛组织存在与否的效果，并 比较了向五种代表性牛饲料添加预定浓度牛肉和骨粉(BMBM)或牛干血(BDB)的 的结果。在PCR分析之前，用改进的商品试剂盒(Qiagen Plant Kit，Qiagen Inc，Valencia， CA)进行样品消化和DNA提取。检测和分析用Lightcycler(Roche Applied Sciences， Indianapolis，IN)通过荧光PCR完成并对各种浓度的BMBM和BDB进行。以上实施 例5详细描述了用牛特异性线粒体引物和荧光共振能量转移(FRET)探针进行的定量 PCR。根据制造商说明使用试剂盒。
本研究中包括5种代表性牛饲料。每种饲料中浓缩料与粗料的比例如下述：
#1 完成配料I：80％：20％，无糖蜜和牛油；
#2 完成配料II：80％：20％，有糖蜜和牛油；
#3 起始牛配料：40％：60％；
#4 生长牛配料：60％：40％；和
#5 断奶牛配料：70％：30％(“CalfMaker”Alderman-Cave Milling and Grain Company of New Mexico，Roswell，NM)颗粒商品配料
按各自操作指导向饲料“添加”商品化供应的牛肉和骨粉(BMBM)，或牛干血 (BDB)。包括“未添加”饲料作为阴性对照。
根据制造商对 Strip Test Kit的说明加工5种牛饲料的一组样品。通过向 含10克饲料的提取容器中直接加入适量BMBM或BDB来添加饲料。涡旋添加后样品， 然后煮沸10分钟。小份液体转入微离心管；插入测试条并使显色持续精确的10分钟。
5种牛饲料的另一组样品如下加工：在PCR分析之前，将每种饲料样品研磨成细 粉，并通过加入适量BMBM或BDB进行添加。用Qiagen Plant Kit的少许修改进行 DNA消化和提取，其中修改操作方案以适应更大样品体积(0.22gm)，以调节到粉碎 器柱洗脱液体积的比例加入无DNA和RNA的RNA酶(Roche Applied Sciences， Indianapolis，IN)。取提取DNA的等份并进行PCR分析。结果示于图7。
如上解释，在消化期间从饲料释放的抑制剂如RNA可能引起假阴性PCR结果。 在PCR之前用RNA酶处理提取的DNA导致持续地更灵敏的检测水平(Sawyer et al.， 2004，同上)。含最高量粗料的饲料显示最经常与PCR抑制剂的存在相关。PCR结果 的不一致在测试的其它饲料和饲料#3(60％粗料)之间持续观察到，和饲料#4(40％ 粗料)之间程度较低(Sawyer et al.，2004，同上)。这种不能持续实现其它饲料的低检 测水平用两种技术都观察到。
用于PCR分析的牛线粒体DNA引物仅检测有核细胞。因为只有白细胞是有核的 而红细胞构成干血的大部分，检测添加BDB的饲料中的反刍动物DNA更困难。肉和 骨粉产品含有更多有核细胞。因而，在添加BMBM的饲料中比在添加相同百分比的 BDB的饲料中更可能检测到反刍动物DNA。与之相似，饲料#2和#3中包括的牛油在 未添加的阴性对照中保持检测不到，这是因为有核细胞的极小量和饲料中存在的低浓 度(1.5％-2.5％“脂肪”)。
PCR技术在“添加”1％以及添加1/10(0.1％)的所有5种饲料中持续性检测到 BMBM。相似地检测到1％水平的BDB；然而当在0.1％ BDB“添加”水平分析时所 有饲料样品都是阴性的。
基于抗体的 Strip Test在饲料#1、#2、#4和#5中检测到1％水平的BMBM， 但在饲料#3中是不确定的。在所有饲料中都未检测到0.1％水平的BMBM。在所有5 种饲料中都未检测到5％水平(是PCR检测水平的5倍)的BDB。因为我们发现 Test在添加5％BMBM的饲料中产生阴性结果，这是肉眼观察阳性的浓度，我们没有 测试添加1％BMBM的样品。不能持续性检测1％“添加”水平的BMBM和5％“添 加”水平的BDB是 Test的缺点。
 Test最小检测水平的结果是主观的和不确定的。所有情况下，5分钟内 可见明确的阳性对照线，然而大多数测试样品需要10分钟来显示刚刚可识别的测试样 品线。有些样品中，测试样品线的强度增加并在延长的10-15分钟内更明显，但所有情 况下都不能达到阳性测试线的强度。样品线的较晚显示使得用保存试条维持准确和持 久性记录是有疑问的。
所以， Test对于检测较低或未知污染水平的样品中反刍动物污染不能认 为是可靠的。因此，我们的结论是PCR提供更可靠的、全面的工具。
实施例8：开发和评价实时荧光PCR测试用于检测商品牛饲料种牛污染物
开发了用靶向反刍动物特异性线粒体细胞色素b基因的引物和FRET探针的实时 荧光聚合酶链式反应测试，用于检测牛饲料中禁用的反刍动物材料如牛肉和骨粉 (BMBM)，并对两种不同类型的牛饲料进行了评价。与基于PCR测试牛饲料相关的 共同问题包括存在高水平PCR抑制剂和需要某些样品预处理技术以进行DNA提取。 我们已经开发了从牛饲料中提取DNA的样品前处理技术，它不需要将饲料样品研磨成 细粉末并利用样品之间被处理掉的材料，因此降低了交叉污染的可能。所述DNA提取 方法利用Whatman 卡技术，可适用于样品高通量分析并允许室温保存，可建立 样品档案长达14年。随后用RNA酶处理Whatman 卡并经Chelex-100提取 (BioRad，Hercules，Ca)，从而去除潜在的PCR抑制剂并从卡洗脱DNA用于下 游PCR分析。在对添加已知浓度牛肉和骨粉(BMBM)的牛起始混合物和小母牛起始 配料饲料样品进行的30次试验期间评价检测限。PCR检测测试以100％灵敏度、100 ％特异性和100％可信度检测到0.05％wt/wt BMBM污染。在两种类型的饲料中也都检 测到0.005％和0.001％wt/wt浓度的BMBM污染，但具有不同水平的可信度。
实施例9：RNA酶处理对用FTA/三次DNA提取方案的PCR牛饲料测试的影响
为了确定RNA酶处理对实时荧光PCR测试检测牛饲料中反刍动物污染物如牛肉 和骨粉(BMBM)的诊断准确性的影响，我们对30种样品加和不加RNA酶处理进行 分析并进行统计分析。
样品制备：制备三十份重复样品，其中向小母牛起始配料中加入0.001％wt/wt浓 度的商业供应BMBM。为了获得0.001％ BMBM，在Mettler AE 160分析天平上称 0.003g BMBM并加入300g小母牛起始配料中。然后从300g添加后的小母牛起始配料 中称取10g量用于DNA提取。
从牛饲料中提取DNA：10g饲料样品放入50ml无菌Falcon管(Fisher Scientific， Pittsburgh，Pa)中。加入25ml体积的由5M异硫氰酸胍、50mM Tris-Cl、25mM EDTA、 0.5％Sarkosyl、0.2M β-巯基乙醇组成的细胞裂解缓冲液(Chakravorty and Tyagi， FEMS Microbiol.Lett.205：113-117(2001))并涡旋样品。样品在室温(RT)保温10分 钟。将样品放入离心机中在17,000xg离心1分钟，以从高度吸收性牛饲料中回收细胞 裂解缓冲液。用宽口吸液头取65μl体积的细胞裂解缓冲液并点在Whatman 卡 (Whatman，Clifton，NJ，Cat# WB 12 0206)上并在室温干燥1小时。用2mm Whatman 打孔器获得两个分离的2mm含样品圆片。三十份2mm圆片中的每一个分别放入1.5ml 无菌管中并标记为1-30RNA酶处理和1-30非RNA酶处理。
RNA酶处理：浓度0.05μg/μl的100μl RNA酶(无DNA的RNA酶；Roche Applied Science，Indianapolis，IN，Cat# 1119915)加入每个标记1-30RNA酶处理的1.5ml无菌 管中。将管放入加热块中并在37℃保温1小时。保温以后从管中取100μl RNA酶并弃 掉。加入200μl Instagene(BioRad，Hercules，Ca and Cat# 732-0630)并将样品放入 56℃加热块中保持30分钟。从加热块中取出样品并涡旋10秒。然后将样品置于100 ℃加热块中维持8分钟。然后涡旋样品并在12,000xg离心3分钟。取出上清并置入新 的无菌1.5ml管中用于PCR分析。
非RNA酶处理：200μl FTA纯化试剂(Cat# WB12 0204)加入每个标记1-30非 RNA酶处理的1.5ml无菌离心管中。然后室温保温管5分钟。然后弃去FTA纯化试剂 并重复操作，总计两次洗涤。然后加入200μl TE-1缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)并室温保温管5分钟。弃去TE-1缓冲液并重复操作，总计两次洗涤。 加入200μl Instagene(BioRad，Hercules，Ca，Cat# 732-0630)并将样品放入56℃加热 块中维持30分钟。从加热块中取出样品并涡旋10秒。然后将样品置于100℃加热块中 维持8分钟。然后涡旋样品并在12,000xg离心3分钟。取出上清并置入新的无菌1.5ml 管中用于PCR分析。
标准FRET PCR操作：用最终浓度的以下成分进行PCR反应：0.5μM正向引物、 0.5μM反向引物、0.2μM荧光素标记探针、0.4μM LC-Red640标记探针、3mM MgCl2 和1X LightCycler Fast Start DNA杂交探针总混合物。5μl体积的DNA样品加入反应 混合物中使每个反应的总体积为20μl。用Corbett Roto-Gene3000同时进行所有六十 个PCR反应。循环条件是：95℃持续10分钟(变性和Taq聚合酶活化)，接着50个 循环的扩增程序：95℃持续0秒、55℃持续12秒和72℃持续14秒。在每个55℃步骤 结束时监测LC-Red640。扩增程序后是1个熔链循环：95℃持续30秒、38℃持续30 秒和80℃持续0秒，转变速度0.1℃/秒。
基于扩增曲线和62℃和63℃之间熔链温度(Tm)的熔链曲线的存在确定PCR 阳性结果。62℃和63℃之间的Tm代表探针和牛mtDNA序列之间100％同源性杂交。
我们检测使用和不使用RNA酶处理的小母牛起始配料中0.001％wt/wt浓度 BMBM来源的反刍动物DNA的测试结果用McNemar’s相关性比例检验(Remington and Schork：Statistics with Applications to the Biological & Health Sciences，1970)进行 比较。当与不用RNA酶处理样品进行比较时，使用RNA酶处理和PCR阳性结果比例 之间在90％置信水平有显著影响(0.05表6：添加0.001％wt/wt BMBM的小母牛起始配料的三十个样品用RNA酶处理 和不用RNA酶处理的PCR结果。
                      RNA酶处理

0.05表7：添加0.001％wt/wt BMBM的小母牛起始配料用RNA酶处理和不用RNA 酶处理的各样品PCR结果。
    小母牛起始配料：研碎并添加0.001％BMBM
  样品号 无RNA酶的PCR结果 有RNA酶的PCR结果 1 阴性 阴性 2 阴性 阳性 3 阴性 阳性 4 阴性 阳性 5 阴性 阳性 6 阴性 阴性 7 阴性 阴性 8 阴性 阴性 9 阴性 阴性 10 阴性 阴性 11 阴性 阴性 12 阴性 阳性 13 阴性 阴性
  14 阴性 阴性 15 阴性 阴性 16 阴性 阴性 17 阳性 阴性 18 阳性 阴性 19 阴性 阴性 20 阴性 阳性 21 阴性 阴性 22 阴性 阴性 23 阴性 阴性 24 阴性 阴性 25 阴性 阴性 26 阴性 阳性 27 阴性 阴性 28 阴性 阴性 29 阴性 阴性 30 阴性 阳性
实施例10：用RNA酶处理和FTA/三次DNA提取方案检测疫苗样品中反刍动物DNA
为了评价当应用于大肠杆菌菌苗J5株疫苗(Upjohn)时当前牛PCR检测试验的 检测限并评价大肠杆菌菌苗J5株疫苗(Upjohn)对用实时荧光定量PCR靶向牛线粒 体细胞色素b基因的PCR反应效率的影响，进行以下实验。
牛DNA标准品：通过从牛肉和骨粉(BMBM)中提取DNA制备牛DNA标准品 并用分光光度计定量。
从大肠杆菌J5株疫苗(Upjohn)中提取DNA：65μL大肠杆菌J5疫苗施加到 FTA卡上并按照实施例9所述DNA提取方案操作。然后用分光光度计定量DNA提取 物。使用浓度和260/280nm比率以验证DNA分离自大肠杆菌J5疫苗。
制备系列稀释物：制备一系列四个十倍系列稀释液，其中10μL牛DNA标准品 稀释于90μL大肠杆菌J5DNA提取物中。
实时PCR：对四个系列稀释液进行PCR，其中包括未稀释牛DNA标准品。重复 实验总计进行三次。
测定牛DNA标准品的浓度是50ng/μl，260/280比率是2.00；从大肠杆菌J5疫苗 提取的DNA的浓度测定为6.57ng/μl，260/280比率是1.77。
对于实时PCR，使用与DNA浓度的对数相关的阈值以作图(图8)。基于该线的 斜率计算PCR反应效率。经三次试验，PCR测试能检测5pg/μL的牛DNA，平均PCR 效率99％(表8)。
表8.系列稀释于大肠杆菌菌苗J5株疫苗(Upjohn)DNA提取物的牛DNA标准 品的PCR反应效率。
  实验编号 PCR反应效率 1 98％ 2 100％ 3 99％
可以理解，本文所述实施例和实施方案目的仅是举例说明，基于它们的各种修饰 和变化将被建议给本领域技术人员并且包括在本申请的范围内，并且认为位于附加的 权利要求范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容为所有目的经 引用并入本文。
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2004年1月30日提交的美国临时专利申请No.60/540,757的优先 权，其全部公开内容经引用并入本文。
联邦赞助研究和开发下所作发明权利的声明
不适用。
非正式序列表
SEQ ID NO：1
牛特异性引物1
GAATTTCGGTTCCCTCCTG
SEQ ID NO：2
牛特异性引物2
GGCTATTACTGTGAGCAGA.
SEQ ID NO：3
山羊特异性引物1
TCATACATATCGGACGACGT and.
SEQ ID NO：4
山羊特异性引物2
CAAGAATTAGTAGCATGGCG
SEQ ID NO：5
绵羊特异性引物1
cat ttg ctt aat ttt aca gat tct a
SEQ ID NO：6
绵羊特异性引物2
cat gag gat gag gat tag tag gat agc a
SEQ ID NO：7
反刍动物特异性引物1
tcg aaa gtc cca ccc act aataaa aat tg
SEQ ID NO：8
反刍动物特异性引物2
ttg aag ctc cgt ttg cgt gta t
SEQ ID NO：9
反刍动物特异性引物3
tca gat tca ttc gac taa att tgt g
SEQ ID NO：10
反刍动物特异性引物4
gga ggt tgg gcg caa ata gta ct
SEQ ID NO：11
第二代反刍动物引物1
tac acg caa acg gag c
SEQ ID NO：12
第二代反刍动物引物2
gag cct gtt tcg tgg a
SEQ ID NO：13
FRET探针1(荧光素)
caa tcc cat aca tcg gca caa ac-label
SEQ ID NO：14
FRET探针2(Red640)
agt cga atg aat ctg agg cgg-label