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硝基氧基有机分子在饲料中减少反刍动物中甲烷排放和/或改善反刍动物性能的用途
申请号 CN201180061610.7 申请日 2011-12-20 公开(公告)号 CN103260424A 公开(公告)日 2013-08-21
申请人 帝斯曼知识产权资产管理有限公司; 发明人 史蒂芬娜·杜沃; 迈克·金德曼;
摘要 本发明涉及一种用来减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷产生和/或改善反刍动物性能的方法，其通过使用在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐作为活性化合物与饲料一起施用给动物。本发明还涉及这些化合物在饲料和饲料添加剂例如预混物、浓缩物和全混合日粮(TMR)或在丸剂形式中的用途。
权利要求

1.如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐作为动物饲养中减少从反刍动物消化活动引起的甲烷形成、和/或改善反刍动物性能的活性化合物的用途，其中Y为具有下列组成的有机分子：CaHbOdNeSg，其中

a包含在1和25之间，

b包含在2和51之间，

d包含在0和8之间，

e包含在0和5之间，

g包含在0和3之间，

其中式（II）所定义的硝基氧基链烷酸和/或其衍生物被排除在外，其中

u包含在0和23之间，并且如果u≠0，碳链是直链的、环状的、或支链的直链或环状脂族碳链，其可以是单不饱和的或多不饱和的，并呈任何同分异构体形式，Z独立地为O、NH或N-R3，其中如果R1≠H，Z-R1代表酯或仲酰胺衍生物，R1独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状链或支链的烷基或烯基基团，R2独立地为氢或包含1至23个碳原子的饱和直链或支链的烷基或烯基基团，R3独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状链或支链的烷基或烯基基团。

2.如权利要求1所述的用途，其中

a包含在1和10之间，

b包含在2和21之间，

d包含在0和6之间，

e包含在0和3之间，

g包含在0和1之间。

3.如权利要求1所述的用途，其中式（I）的所述至少一种有机分子为式（III）的化合物，其中

n包含在0和12之间、优选地包含在0和6之间，并且其中如果n≠0，碳链为直链的、环状的、或支链的脂族碳链，其可以是未取代的或被多至3个羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或硝基氧基基团、或烯基或炔基碳链取代，其为单不饱和的或多不饱和的并呈任何同分异构体形式，R4独立地为氢或包含1至12个碳原子、优选地1至6个碳原子的饱和直链、环状链或支链的烷基或烯基基团，X 为 氢、R5、R5 ≡ N、-OR5、-OCOR5、-NR5R6、-ONO2、-COOR5、-CONR5R6、-NHSO2R5、或-SO2NHR5，R5和R6独立地为氢、C1-C12直链、支链或环状的烷基链，其未经取代或被多至3个羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或硝基氧基基团、烯基或炔基碳链取代，其可以为单不饱和的或多不饱和的并呈任何同分异构体形式。

4.如权利要求1至3中任意一项所述的用途，其中式（I）的所述至少一种有机分子或其盐选自3-硝基氧基丙醇、外消旋-4-苯基丁烷-1,2-二基二硝酸酯、2-(羟甲基)-2-(硝基氧基甲基)-1,3-丙二醇、N-乙基-3-硝基氧基-丙磺酰胺、5-硝基氧基戊腈、5-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基丙基丙酸酯、1,3-双-硝基氧基丙烷、1,4-双-硝基氧基丁烷、

1,5-双-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基苯甲酸酯、3-硝基氧基-丙基己酸酯、3-硝基氧基-丙基5-硝基氧基己酸酯、硝酸苄酯、二硝酸异山梨酯、以及N-[2-(硝基氧基)乙基]-3-吡啶甲酰胺、2-硝基-5-硝基氧基甲基呋喃、以及双-(2-硝基氧基乙基)醚。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的用途，其中式（I）的所述至少一种有机分子或其盐选自3-硝基氧基丙醇、5-硝基氧基戊腈、5-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基丙基丙酸酯、

1,3-双-硝基氧基丙烷、1,4-双-硝基氧基丁烷、1,5-双-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基苯甲酸酯、3-硝基氧基-丙基己酸酯、3-硝基氧基-丙基5-硝基氧基己酸酯、二硝酸异山梨酯、和N-[2-(硝基氧基)乙基]-3-吡啶甲酰胺、以及双-(2-硝基氧基乙基)醚。

6.如权利要求1至5中任意一项所述的用途，其中式（I）的所述至少一种有机分子为

3-硝基氧基丙醇和1,3-双-硝基氧基丙烷的混合物。

7.如权利要求1至6中任意一项所述的用途，其中式（I）的所述至少一种有机分子或其盐与至少一种额外活性物质组合，所述额外活性物质选自二烯丙基二硫醚、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其衍生物。

8.如权利要求1至7中任意一项所述的用途，其中所述反刍动物选自牛、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

9.如权利要求1至8中任意一项所述的用途，其中当在代谢室中测量时，反刍动物按升每千克干物质摄入量计算的甲烷生成降低至少10%。

10.如权利要求1至9中任意一项所述的用途，其中被施用于反刍动物的如式（I）所定义的所述至少一种活性化合物的量为每kg饲料1mg至10g。

11.一种饲料组合物或饲料添加剂，其包含如权利要求1至6中任意一项所述的式（I）的至少一种有机分子。

12.如权利要求11所述的组合物，其为矿物预混物、维生素预混物、或包含维生素和矿物的预混物或丸剂。

13.一种用来减少反刍动物消化活动的甲烷生成、和/或改善反刍动物性能的方法，其包括给动物口服足量的如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐，其中Y为具有下列组成的有机分子：CaHbOdNeSg，其中

a包含在1和25之间，

b包含在2和51之间，

d包含在0和8之间，

e包含在0和5之间，

g包含在0和3之间，

其中式（II）所定义的硝基氧基链烷酸和/或其衍生物被排除在外，其中

u包含在0和23之间，并且如果u≠0，碳链是直链的、环状的、或支链的直链或环状脂族碳链，其可以是单不饱和的或多不饱和的并呈任何同分异构体形式，Z独立地为O、NH或N-R3，其中如果R1≠H，Z-R1代表酯或仲酰胺衍生物，R1独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状链或支链的烷基或烯基基团，R2独立地为氢或包含1至23个碳原子的饱和直链或支链的烷基或烯基基团，R3独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状链或支链的烷基或烯基基团。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述至少一种有机分子与至少一种额外活性物质一起被施用给动物，所述额外活性物质选自二烯丙基二硫醚、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其衍生物。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述反刍动物选自牛、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

16.如权利要求13至15中任意一项所述的方法，其中被施用于反刍动物的式（I）中定义的所述至少一种有机分子的量为每kg饲料1mg至10g。

17.如权利要求13至16中任意一项所述的方法，其中当在代谢室中测量时，反刍动物按升每千克干物质摄入量计算的甲烷生成降低至少10%。
说明书全文

硝基氧基有机分子在饲料中减少反刍动物中甲烷排放和/

或改善反刍动物性能的用途

[0001] 本发明涉及在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子用来减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷产生和/或改善反刍动物性能的用途。
[0002] 本发明还涉及包含上述分子的动物饲料或动物饲料组合物以及饲料添加剂。术语“饲料”或“饲料组合物”指适合或意在用于被动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。
[0003] 在本文中，反刍动物是偶蹄目哺乳动物，其通过最初在动物的第一胃（称为瘤胃）里软化、然后使半消化物质（现在称为反刍食物）反刍以及再咀嚼一遍来消化以植物为基础的食物。
[0004] 瘤胃发酵带来一些弊端。甲烷作为厌氧发酵的自然结果而产生，这代表宿主动物的能量损失。碳水化合物构成典型奶牛口粮中干物质的70-80%，并且尽管如此，从胃肠道吸收碳水化合物通常是非常有限的。其原因是碳水化合物在瘤胃中的广泛发酵，导致产生乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯作为主产物。这些产物是所谓的挥发性脂肪酸（VFA）的一部分。
[0005] 除能量损失外，甲烷也是温室气体，其比CO2更有力许多倍。其在大气中的浓度在整个上一世纪增加了一倍，并且继续惊人地增加。反刍动物是生物活动甲烷形成的主要贡献者，并且据估计，防止反刍动物的甲烷形成几乎使大气中的甲烷浓度稳定。
[0006] 此外，2009年哥本哈根气候峰会之前的《京都议定书》的评估增加了对减少甲烷排放作为多气体战略（multi-gas strategy）的一部分的优先级。目前用来减少甲烷形成的最有效的添加剂包含抗生素，其减少提供氢气（H2）给甲烷菌的微生物的增殖（Sauer等人1998.American Society of Animal Science;76:906-914）。然而，抗生素对甲烷形成的影响具有一定的缺点，因为微生物群落的快速适应和/或耐药性发展导致在短时间内（2至3周）完全丧失预期的效果，并且因为将抗生素用于非治疗用途在欧洲是禁止的。
[0007] 当使用体外瘤胃仿真模型测试时导致甲烷排放减少的非抗生素产品（胆汁酸衍生物）最近已经公布（WO 2010072584）。然而，产生适度减少甲烷排放所需的量与反刍动物饲料行业成本限制是不相容的。
[0008] 此外，一些天然植物提取物（大蒜:WO 2009150264、丝兰、肉桂、大黄……）已经在科学文献中描述，作为基于体外实验减少反刍动物中甲烷排放的有力的解决方案。然而，这些方案都不能使其成为商业产品，这是由于副作用（牛奶中残留物）、由于体内测试时缺乏有效性、或由于需要向动物供应非常大量的添加剂来显著减少甲烷。
[0009] 在这些情况下，仍然需要开发减少甲烷形成且符合可靠和普遍接受地实施并且不具药用性的新物质。除了减少甲烷排放外，这种物质还可以有助于通过提高饲料转化率、降低饲料摄入量、提高体重增加、和/或提高屠体或产奶量来改善反刍动物性能。
[0010] 本发明人现在惊奇地发现，为了主要减少甲烷的形成而不以对宿主动物有害的方式影响微生物发酵，本文中后面指定的化合物具有很大的潜力用在动物饲料中。此外，本发明的化合物在如饲料转化率、饲料摄取量、体重增加、屠体产量、或产奶量测得的整体动物性能方面还具有很大的好处。所述化合物比现有技术中所描述的那些化合物还更稳定、对动物和人更安全，导致持久的甲烷降低效果，它们不影响适口性，它们可以在工业规模上以与动物营养行业相容的成本来生产，并且最重要的是，它们不引起任何代谢物所受补动物的奶或肉中积累，并且它们在瘤胃中在非常低的浓度下是有活性的。
[0011] 具体地，本发明人已经观察到向反刍动物喂食在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子对减少从反刍动物的消化活动所引起的甲烷产生而不负面地影响总VFA产生是非常有效的，和/或对改善反刍动物性能是非常有效的。此外，本发明人已经表明，当硝基氧基被替换为具有类似物理化学性质的其他化学基团时，对甲烷产生的技术效果损失，这说明硝基氧基对本发明的甲烷减少起关键作用。
[0012] 从国际专利申请Nr.:PCT/EP2010/069338已知，硝基氧基-羧酸衍生物是体外和体内瘤胃甲烷生成的有效抑制剂。因此，这些分子具体在本发明中不请求保护。
[0013] 因此，本发明提供，如式（1）所定义的，在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐作为用来减少从反刍动物的消化活动所引起的甲烷形成和/或用来改善反刍动物性能的动物饲养中活性化合物的用途。
[0014] 本发明还提供一种减少从反刍动物的消化活动所引起的甲烷产生和/或改善反刍动物性能的方法，其包括给动物口服足量的如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐。口服应当理解为简单喂养或丸剂的人工给服。
[0015] 在本发明的所有实施方式中，在任意位置被至少一个硝基氧基取代的有机分子或其盐如式（I）的下列化合物定义：
[0016]
[0017] 其中Y为具有下列组成的有机分子：CaHbOdNeSg，
[0018] 其中
[0019] a包含在1和25之间、优选地1和10之间
[0020] b包含在2和51之间、优选地2和21之间
[0021] d包含在0和8之间、优选地0和6之间
[0022] e包含在0和5之间、优选地0和3之间
[0023] g包含在0和3之间、优选地0和1之间
[0024] 其中式（II）定义的硝基氧基链烷酸和/或其衍生物被排除在外，
[0025]
[0026] 其中
[0027] u包含在0和23之间，并且如果u≠0，碳链是直链的、环状的、或支链的直链或环状脂族碳链，其可以是单不饱和的或多不饱和的，以及呈任何同分异构体形式，
[0028] Z独立地为O、NH或N-R3，其中如果R1≠H，Z-R1代表酯或仲酰胺衍生物，
[0029] R1独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状或支链的烷基或烯基基团，
[0030] R2独立地为氢或包含1至23个碳原子的饱和直链或支链的烷基或烯基基团，
[0031] R3独立地为氢或包含1至10个碳原子的饱和直链、环状或支链的烷基或烯基基团。
[0032] 在另一个实施方式中，根据本发明的式（I）的优选化合物为其中a为包含在1和10之间、优选地a包含在3和8之间的化合物。
[0033] 在另一个实施方式中，根据本发明的式（I）的优选化合物为式（III）的化合物，[0034]
[0035] 其中
[0036] n包含在0和12之间、优选地包含在0和6之间，并且其中如果n≠0，碳链为直链的、环状的、或支链的脂族碳链，其可以是未取代的或被多至3个羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或硝基氧基基团、或烯基、或炔基碳链取代，其是单不饱和的或多不饱和的以及呈任何同分异构体形式，
[0037] R4独立地为氢或包含1至12个碳原子、优选地1至6个碳原子的饱和直链、环状或支链的烷基或烯基基团，
[0038] X为氢、R5、R5≡N、-OR5、-OCOR5、-NR5R6、-ONO2、-COOR5、-CONR5R6、-NHSO2R5、或-SO2NHR5，
[0039] R5和R6独立地为氢、C1-C12直链、支链或环状的烷基链，其未取代或被多至3个羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或硝基氧基基团、烯基、或炔基碳链取代，其可以为单不饱和的或多不饱和的以及呈任何同分异构体形式。
[0040] 对于本发明的所有实施方式，可以理解式（I）的化合物和式（III）的化合物可以是任何同分异构体形式。
[0041] 应当理解，在式（III）的化合物的上述定义中，当n>2时，碳链可以是直链或在沿碳链的任意位置上被支化。此外，碳链可以是在沿碳链的不同位置上被多个支链支化。此外，当n>3时，脂族碳链可以形成环状片段。该环状片段可以在任意位置（2、3、4）上携带硝基氧基片段，并且它还可以是在多个位置上被任何脂族基团支化的。支链的脂族基团优选地为甲基、乙基或丙基。
[0042] 此外，碳链还可以被多至3个羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或硝基氧基基团取代。
[0043] 在式（III）的衍生物的上述定义中，优选的烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、戊基、新戊基、己基、环己基、以及2-乙基己基和辛基。此外，包含三个或更多碳原子的任何烷基或烯基可以是直链、支链、或环状的。此外，对于直链或支链的C2-C10-亚烯基基团来说，要理解包括具有一个或（从C4起）多个双键的亚烯基，这种亚烯基基团的例子是式-CH=CH-、-CH=CH-CH2-、-CH=CH-(CH2)3-和-(CH=CH)2-的那些。
[0044] 在另一个实施方式中，根据本发明的式（I）的更优选化合物选自下列化合物以及其盐：3-硝基氧基丙醇、外消旋-4-苯基丁烷-1,2-二基二硝酸酯、2-(羟甲基)-2-(硝基氧基甲基)-1,3-丙二醇、N-乙基-3-硝基氧基-丙磺酰胺、5-硝基氧基戊腈、5-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基丙酸酯、1,3-双-硝基氧基丙烷、1,4-双-硝基氧基丁烷、1,5-双-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基苯甲酸酯、3-硝基氧基-丙基己酸酯、3-硝基氧基-丙基5-硝基氧基己酸酯、硝酸苄酯、二硝酸异山梨酯(isosorbid-dinitrate)、以及N-[2-(硝基氧基)乙基]-3-吡啶甲酰胺、2-硝基-5-硝基氧基甲基呋喃、以及双-(2-硝基氧基乙基)醚，如表1中所列：
[0045] 表1：根据本发明的式（I）的优选化合物
[0046]
[0047]
[0048] 在另一个实施方式中，基于它们在减少甲烷方面的效果程度，式（III）的甚至更优选化合物选自包含下列化合物及其盐的列表：3-硝基氧基丙醇、5-硝基氧基戊腈、5-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基丙酸酯、1,3-双-硝基氧基丙烷、1,4-双-硝基氧基丁烷、1,5-双-硝基氧基戊烷、3-硝基氧基-丙基苯甲酸酯、3-硝基氧基-丙基己酸酯、3-硝基氧基-丙基5-硝基氧基己酸酯、二硝酸异山梨酯、以及N-[2-(硝基氧基)乙基]-3-吡啶
甲酰胺、以及双-(2-硝基氧基乙基)醚，列于表2中：
[0049] 表2：根据本发明的式（I）的最优选化合物
[0050]
[0051]
[0052] 在另一个实施方式中，基于它们在减少甲烷和对生产工艺的影响程度，式（I）的最优选化合物为3-硝基氧基丙醇和1,3-双-硝基氧基丙烷的混合物。优选地，3-硝基氧基丙醇/1,3-双-硝基氧基丙烷的比例包含在1/10和1000/1之间、更优选1/5和100/1之间、最优选1/1和10/1之间。
[0053] 本发明的化合物还包括硝基氧基有机分子的盐。用于盐制备的优选阳离子选自由+ + + 2+ 2+ 2+ 2+ 4+钠（Na）、钾（K）、锂（Li）、镁（Mg ）、钙（Ca ）、钡（Ba ）、锶（Sr ）、以及铵（NH ）组成的组。
盐还可以由碱金属或碱土金属制备。
[0054] 原则上可以根据硝基氧基有机分子的本身已知的合成方法和/或基于实施例中所描述的方法生产本发明的化合物。
[0055] 在所有这些情况下，纯化产物（式(I)的化合物）的适当方法可以由本领域技术人员选择，即通过柱层析，或者可以通过本身已知的方法分离和纯化式（I）的化合物，例如加入溶剂诸如二乙醚或乙酸乙酯来诱发粗产物从反应后的混合物中分离并在Na2SO4下干燥所收集的粗产物。
[0056] 可以容易地在代谢室中通过本领域已知的方法（Grainger等人.,2007J.Dairy Science;90:2755-2766）测量反刍动物单个动物的甲烷排放。此外，还可以通过新兴技术采用激光束在舍圈水平上评估（McGinn等人,2009,Journal of Environmental
Quality;38:1796-1802）。可替换地，奶牛反刍动物产生的甲烷还可以通过根据WO
2009/156453测量牛奶中VFA分布来评估。
[0057] 反刍动物性能可以通过本领域公知的方法评估，并且通常以饲料转化率、饲料摄取量、体重增加、屠体产量、或产奶量来表征。
[0058] 本发明还涉及如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐与至少一种额外活性物质组合的用途，所述额外活性物质在瘤胃中的甲烷形成表现出类似效果，并且选自由二烯丙基二硫醚、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、去氧胆酸、鹅去氧胆酸以及其衍生物组成的组。
[0059] 可以与根据本发明的化合物一起给出的其他组分是，例如酵母、精油和离子载体诸如莫纳菌素、莫纳菌素钠。
[0060] 目前的设想是，将二烯丙基二硫醚、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、去氧胆酸、鹅去氧胆酸以及其衍生物独立地以例如每kg饲料0.01-500mg活性物质（ppm）的剂量范围施用。这些化合物要么是市售的，要么可以由技术人员采用现有技术中公知的工艺和方法容易地制备。
[0061] 根据本发明的反刍哺乳动物包括牛、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚、鹿牛羚。
[0062] 对于本发明的所有实施方式来说，驯养的牛、绵羊、山羊为更优选的物种。就本发明的目的而言，最优选的物种是驯养的牛。该术语包括所有种族的驯养牛和所有生产种类的牛，尤其是奶牛和肉牛。
[0063] 本发明还涉及如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐的用途，其中当在代谢室中测量时，反刍动物以升每千克干物质摄入量计算的甲烷产生降低至少10%。优选地甲烷减少至少15%、更优选至少20%、甚至更优选至少25%、最优选至少30%。还可以采用替代的甲烷排放测量，例如采用激光束或对于奶牛反刍动物将甲烷产生与牛奶中VFA分布相关联。
[0064] 本发明还涉及如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐的用途，其中当在常规性能试验中测量时，反刍动物饲料转化率降低至少1%。优选地，饲料转化率降低至少2%、更优选地至少2.5%、甚至更优选至少3%、最优选至少
3.5%。
[0065] 本发明还涉及如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐的用途，其中式（I）中定义的所述至少一种活性化合物施用于反刍动物的的量为从每kg饲料1mg至10g、优选地从每kg饲料10mg至1g、更优选地从每kg饲料50mg至500mg。然而，对于用在动物饲料中，如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的有机分子或其盐不需要那么纯；例如它可以包含其他化合物和衍生物。
[0066] 如上所示，本发明的化合物适用作反刍动物的饲料添加剂和动物饲料组合物用的化合物，并因此适用作这种饲料中的活性成分以减少动物消化道中的甲烷形成和/或改善反刍动物性能。
[0067] 为了实现它们作为反刍动物饲料用的这种成分的用途，该化合物可以通过本领域本身已知的饲料配制和处理方法掺入饲料中。
[0068] 因此，本发明的另一个方面是配方，即包含本文中上述定义的化合物的饲料添加剂和动物饲料组合物。因此，本发明还涉及包含至少一种式（I）的化合物或其盐的饲料组合物或饲料添加剂。优选地，饲料组合物或饲料添加剂为反刍动物基础混合物。在一个优选的实施方式中，组合物是矿物质预混物、包含维生素和矿物质的维生素预混物或丸剂。
[0069] 通过饲料摄取提供给动物的根据本发明的化合物的正常每日剂量取决于动物的种类及其状况。正常情况下，该剂量应该在从每kg饲料约1mg至约10g、优选地从约10mg至约1g、更优选地50mg至500mg化合物的范围内。
[0070] 如式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐可以与存在于动物饲料组合物（饮食）中的常规成分（例如碳酸钙、电解质如氯化铵、蛋白质如大豆粉、小麦、淀粉、向日葵粉、玉米、肉骨粉、氨基酸、动物脂肪、维生素和痕量矿物质）组合使用。
[0071] 本发明的组合物的特定例子如下：
[0072] -包含（a）至少一种选自表1的化合物和（b）至少一种脂溶性维生素、（c）至少一种水溶性维生素、（d）至少一种痕量矿物质、和/或（e）至少一种常量矿物质的动物饲料添加剂；
[0073] -包含至少一种选自表1的化合物且具有50至800g/kg饲料的粗蛋白含量的动物饲料组合物。
[0074] 因此，在一个优选的实施方式中，本发明涉及反刍动物饲料组合物或饲料添加剂。
[0075] 所谓的预混物是本发明的动物饲料添加剂的例子。预混物指一种或多种微量成分与稀释剂和/或载体的一种优选均匀的混合物。预混物被用来促进微量成分均匀分散在较大混合物中。
[0076] 除本发明的活性成分外，本发明的预混物还包含至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种痕量矿物质、和/或至少一种常量矿物质。换而言之，本发明的预混物包含根据本发明的至少一种化合物和至少一种选自脂溶性维生素、水溶性维生素、痕量矿物质和常量矿物质的额外组分。
[0077] 常量矿物质可以单独地添加到饲料中。因此，在一个特定的实施方式中，预混物包含本发明的活性成分和和至少一种选自脂溶性维生素、水溶性维生素和痕量矿物质的额外组分。
[0078] 下面是这些组分的一组非排他性例子：
[0079] -脂溶性维生素的例子为维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K诸如维生素K3。
[0080] -水溶性维生素的例子为维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸和叶酸和泛酸诸如D-泛酸钙。
[0081] -痕量矿物质的例子为锰、锌、铁、铜、碘、硒、和钴。
[0082] -常量矿物质的例子为钙、磷和钠。
[0083] 至于反刍动物（诸如牛）的饲料组合物以及其成分，反刍动物的饮食通常由易降解部分（命名为浓缩物）和富含纤维的不易降解部分（命名为干草、草料或粗饲料）组成。
[0084] 干草由干燥过的草、豆类或全谷物制成。草包括梯牧草、黑麦草、羊茅牧草等。豆类包括三叶草、苜蓿或紫花苜蓿、豌豆、蚕豆和野豌豆等。全谷物包括大麦、玉蜀黍（玉米）、燕麦、高粱等。其他草料作物包括甘蔗、芥兰、芸苔和白菜。此外，块根作物如萝卜、萝卜片、饲料甜菜（mangles）、饲用甜菜（fodder beet）、和甜菜（包括甜菜浆和甜菜糖蜜）被用来饲养反刍动物。其他作物还有块茎，例如土豆、木薯和甘薯。青贮饲料为富含纤维部分（例如来自草、豆类或全谷物）的青贮形式，从而用受控的厌氧发酵过程（自然发酵或添加剂处理）处理具有高水含量的材料。
[0085] 浓缩物主要由谷物（例如包括啤酒糟、酒糟的大麦，玉蜀黍，小麦，高粱）制成，而且常含有富含蛋白质的饲料成分，例如大豆、油菜籽、棕榈仁、棉籽和葵花籽。
[0086] 还可以用全混合日粮（TMR）喂养牛，其中所有的膳食组分，例如草料、青贮饲料和浓缩物在使用前混合。
[0087] 如上面提到的，预混物是饲料添加剂的例子，其可包含根据本发明的活性化合物。应当理解，化合物可以以不同的其他形式施用给动物。例如，化合物还可以被包含在丸剂中，而丸剂可被放置于瘤胃中并且在特定的一段时间内以规定好的剂量连续地释放规定量的活性化合物。
[0088] 本发明还涉及一种减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷产生和/或改善反刍动物性能的方法，其包括口服足量的如上述优选实施方式的式（I）所定义的在任意位置被至少一个硝基氧基取代的至少一种有机分子或其盐。
[0089] 此外，本发明还涉及如上所述的方法，其中式（I）的化合物与至少一种选自二烯丙基二硫醚、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、去氧胆酸、鹅去氧胆酸以及其衍生物的额外活性物质组合施用于动物。
[0090] 本发明还涉及如上所述的方法，其中反刍动物选自由牛、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、水牛、牦牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚、鹿牛羚组成的组，并且更优选地选自由牛、山羊和绵羊组成的组。
[0091] 本发明还涉及如上所述的方法，其中施用于反刍动物的式（I）定义的所述至少一种活性化合物的量为从每kg饲料约1mg至约10g、优选地从约10mg至约1g、更优选地从每kg饲料50mg至500mg化合物。
[0092] 本发明还涉及如上所述的方法，其中当在代谢室中测量时，反刍动物中以升每千克干物质摄入量计算的甲烷产生降低至少10%。优选地甲烷减少至少15%、更优选至少20%、甚至更优选至少25%、最优选至少30%。还可以采用替代的甲烷排放测量，例如采用激光束或对于奶牛反刍动物将甲烷产生与牛奶中VFA分布相关联。
[0093] 本发明还涉及如上所述的方法，其中当在常规性能试验中测量时，反刍动物饲料转化率降低至少1%。优选地，饲料转化率降低至少2%、更优选地至少2.5%、甚至更优选地至少3%、最优选至少3.5%。
[0094] 通过下面实施例进一步描述本发明，但这些实施例不应解释为限制本发明的范围。实施例
[0095] 实施例1：甲烷产生的体外试验
[0096] 采用修改的“Hohenheim饲料价值试验”（HFT，Hohenheim Forage value Test）来测试特定化合物对该体外系统模拟的瘤胃功能的影响。
[0097] 方法：
[0098] 将饲料送入具有瘤胃液组合物和缓冲液的适当混合物的注射器中。将该溶液在39℃下温育。8小时后，测定所产生的甲烷的量（和组成），并代入换算公式。
[0099] 试剂：
[0100] 常量元素溶液：
[0101] -6.2g磷酸二氢钾（KH2PO4）
[0102] -0.6g七水合硫酸镁（MgSO4*7H2O）
[0103] -9ml浓磷酸（1mol/l）
[0104] -溶解于蒸馏水至1L（pH约1.6）
[0105] 缓冲溶液：
[0106] -35.0g碳酸氢钠（NaHCO3）
[0107] -4.0g碳酸氢铵（(NH4)HCO3）
[0108] -溶解于蒸馏水至1L
[0109] 痕量元素溶液
[0110] -13.2g二水合氯化钙（CaCl2*2H2O）
[0111] -10.0g四水合二氯化锰（II）（MnCl2*4H2O）
[0112] -1.0g六水合二氯化钴（II）（CoCl2*6H2O）
[0113] -8.0g氯化铁（III）（FeCl3*6H2O）
[0114] -溶解在蒸馏水中至100ml
[0115] 钠盐溶液：
[0116] -100mg钠盐
[0117] -溶解在蒸馏水中至100ml
[0118] 还原溶液：
[0119] -先后将3ml氢氧化钠（c=1mol/l）和427.5mg硫化钠水合物（Na2S*H2O）加入到71.25ml H2O
[0120] -溶液必须在将其加入介质溶液之前不久制备
[0121] 步骤：
[0122] 样品称量：
[0123] 将饲料过筛至1mm，通常使用TMR（精料44%、干草6%、玉米青贮饲料37%和牧草青贮饲料13%），并准确称量至64个注射器中。这些注射器中的4个为底物对照，其显示未受测试化合物影响的气体产生。4个其他注射器是其中加入溴乙基磺酸盐至0.1mM的阳性对照。如果需要，4个注射器包含载体对照（如果测试化合物需要载体）。其余的注射器每4个一组包含测试物质。
[0124] 介质溶液的制备：
[0125] 在Woulff瓶中按照下列顺序混合如下组分：
[0126] -711ml的水
[0127] -0.18ml痕量元素溶液
[0128] -355.5ml缓冲溶液
[0129] -355.5ml常量元素溶液
[0130] 将完成的溶液加热至39℃，随后加入1.83ml钠盐溶液并在36℃下加入还原溶液。当指示剂变成无色时，加入瘤胃液。
[0131] 提取瘤胃液：
[0132] 在持续搅拌并通入CO2气体的条件下，将750ml瘤胃液加入到约1400ml介质溶液中。
[0133] 灌装注射器、温育温育并测定气体体积和VFA值：
[0134] 将经稀释的瘤胃液（24ml）加入到玻璃注射器中。所述注射器随后在39℃下温和搅拌温育8小时。8小时后，测定所产生的气体的体积，并使用气相色谱法测定气相中的甲烷百分比。
[0135] 结果
[0136] 被发酵的饲料是人工TMR（精料44%、干草6%、玉米青贮饲料37%和牧草青贮饲料13%）。将如实施例2至14中所述产生的化合物加入到发酵注射器中至浓度为2至0.005%干物质（DM）。结果列于下表。
[0137] 表3：使用根据本发明的一些化合物的2个实验的平均值所得到的甲烷减排效果（“对甲烷生成变化的影响”列中的整数(%)表示当与对照对比时所产生甲烷的降低；没有数值表示浓度未测定）
[0138]
[0139]
[0140] 实施例2：对比例：甲烷产生的体外试验
[0141] 与如实施例1中所述相同的体外试验已经采用一系列分子进行，其中硝基氧基已经替换为不同的有机基团。而且，也已经测试无机盐NaNO3。参见表4中的结果。此数据表明，只在硝基氧基存在于本系列中时，才观察到明显的甲烷减少活性。
[0142] 表4：与其中硝基氧基已经被替代的类似化合物相比，从采用根据本发明的3-硝基氧基丙醇的两个实验的平均所得到的甲烷减排效果。（“对甲烷生成变化的影响”列中的整数(%)表示当与对照对比时所产生甲烷的降低；没有数值表示浓度未测定）
[0143]
[0144] 实施例3：3-硝基氧基丙醇的合成
[0145]
[0146] 将溶解于100ml乙腈中的50.1mmol3-溴丙醇和125.25mmol硝酸银加入到避光的烧瓶中。将该悬浮液在70℃下搅拌21小时。冷却至室温后，过滤悬浮液并真空浓缩。将残留物溶解于水中，并用TMBE萃取两次。用水和盐水洗涤有机相，合并、用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余5.63g。
[0147] 使用2:1的庚烷/乙酸乙酯通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到4.82g（38.8mmol，77.4%）。
[0148] 实施例4：2-(羟甲基)-2-(硝基氧基甲基)-1,3-丙二醇的合成：
[0149]
[0150] 将溶解于20ml乙腈中的5mmol2-(溴甲基)-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和15mmol硝酸银加入到避光的烧瓶中。将该悬浮液在70℃下搅拌24小时。冷却至室温后，过滤悬浮液并在真空中除去溶剂，得到3.05g。
[0151] 使用50:1的二氯甲烷/甲醇通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到0.36g（1.99mmol，40.2%）。
[0152] 实施例5：外消旋-4-苯基丁烷-1,2-二基二硝酸酯的合成：
[0153]
[0154] 将溶解于40ml乙腈中的7.5mmol4-苯基-1-丁烯、20.3mmol硝酸银和7.5mmol矿脉（lode）加入到避光的烧瓶中。将该悬浮液在25℃下搅拌30分钟，然后在79℃下搅拌16小时。冷却至室温后，过滤悬浮液并用乙酸乙酯洗涤。将滤液用水萃取三次，并用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余1.92g。
[0155] 使用10:1的己烷/乙酸乙酯通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到0.52g（2.03mmol，27%）。
[0156] 实施例6：N-乙基-3-硝基氧基-丙磺酰胺的合成：
[0157]
[0158] 在烧瓶中，将17mmol的3-氯丙磺酰氯溶解于5ml的四氢呋喃中。在45分钟的时间内加入33.3mmol乙胺。之后，在真空中除去溶剂。将残留物溶解于水中，并用乙酸乙酯萃取三次。用盐水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂。
[0159] 将残留物溶解于50ml乙腈中，并加入60mmol硝酸银到避光的烧瓶中。将该悬浮液在70℃下搅拌41小时。冷却至室温后，过滤悬浮液并在真空中浓缩。将残留物溶解于二氯甲烷中，并用水萃取。用二氯甲烷再洗涤水相两次。用水和盐水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，得到3.05g（14.5mmol；84.5%）。
[0160] 实施例7：3-硝基氧基-丙基丙酸酯的合成：
[0161]
[0162] 将9.1mmol丙酰氯溶解于10ml TMBE中，并冷却至3℃。在3至6℃下5分钟的时间内滴加在5ml TMBE中的9.1mmol的三乙胺和8.25mmol的3-硝基氧基丙醇。在不冷却
下搅拌2小时30分钟后，用1N HCl萃取反应混合物，用水萃取两次，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余1.35g。
[0163] 使用4:1的己烷/乙酸乙酯通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到1.14g（6.4mmol，78.0%）。
[0164] 实施例8：3-硝基氧基-丙基苯甲酸酯的合成：
[0165]
[0166] 将溶解于10ml TMBE中的16.5mmol3-硝基氧基丙醇和18.2mmol三乙胺冷却至3℃。在3至6℃下7分钟的时间内滴加在5ml TMBE中18.2mmol的苯甲酰氯。在不冷却下
搅拌24小时30分钟后，用饱和NaHCO3、水、1N HCl萃取反应混合物，用水萃取两次，并用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余3.3g。
[0167] 使用从1:0至2:1的己烷/乙酸乙酯梯度液通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到0.66g（2.9mmol，17.7%）。
[0168] 实施例9：3-硝基氧基-丙基己酸酯的合成：
[0169]
[0170] 将溶解于10ml二乙醚中的20mmol3-硝基氧基丙醇和20mmol三乙胺冷却至0℃。在0至5℃下5分钟的时间内滴加18.2mmol己酰氯（hexoylchlorid）。在不冷却下搅拌19小时后，用1N HCl萃取反应混合物，并用水萃取两次，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余3.1g。
[0171] 使用4:1的庚烷/乙酸乙酯通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到2.4g（10.9mmol，60.0%）。
[0172] 实施例10：3-硝基氧基-丙基5-硝基氧基己酸酯的合成：
[0173]
[0174] 将溶解于10ml二乙醚中的20mmo3-硝基氧基丙醇和20mmol三乙胺冷却至0℃。在0至5℃下5分钟的时间内滴加18.2mmol的5-硝基氧基戊酰氯（5-nitrooxy
pentoylchlorid）。在不冷却下搅拌过夜后，用1N HCl萃取反应混合物，并用水萃取两次，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂。
[0175] 使用4:1的庚烷/乙酸乙酯通过快速柱层析在硅胶上纯化粗产品，得到2.4g（9.1mmol，50.0%）。
[0176] 实施例11：硝酸苄酯的合成：
[0177]
[0178] 将溶解于80ml乙腈中的10mmol苄基溴和25mmol硝酸银加入到避光的烧瓶中。将该悬浮液在70℃下搅拌5小时。冷却至室温后，过滤悬浮液并在真空中浓缩。将残留物溶解于二氯甲烷中，并用水萃取。用二氯甲烷再洗涤水相两次。用水和盐水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，得到1.55g（10.1mmol；100%）。
[0179] 实施例12：1,3-双-硝基氧基丙烷的合成：
[0180]
[0181] 向1,3-二溴丙烷（2.00g，1.0当量）在20.0mL无水乙腈中的溶液中加入硝酸银（3.70g，2.2当量）。在黑暗中70℃下加热反应混合物2小时。将所得混合物通过硅藻土过滤，并浓缩滤液。将残留物溶解于水（50.0mL）中，用二氯甲烷（2×50.0mL）萃取，用硫酸镁干燥，并在真空中蒸发溶剂，得到1.44g无色液体化合物（收率=87%）。
[0182] 实施例13：1,4-双-硝基氧基丁烷的合成：
[0183]
[0184] 向1,4-二溴丁烷（2.00g，1.0当量）在20.0mL无水乙腈中的溶液中加入硝酸银（3.50g，2.2当量）。在黑暗中70℃下加热反应混合物2小时。将所得混合物通过硅藻土过滤，并浓缩滤液。将残留物溶解于水（50.0mL）中，用二氯甲烷（2×50.0mL）萃取，用硫酸镁干燥。在真空中蒸发溶剂，得到1.49g无色液体化合物（收率=89%）。
[0185] 实施例14：1,5-双-硝基氧基戊烷的合成：
[0186]
[0187] 向1,5-二溴戊烷（2.00g，1.0当量）在20.0mL无水乙腈中的溶液中加入硝酸银（3.30g，2.2当量）。在黑暗中70℃下加热反应混合物2小时。将所得混合物通过硅藻土过滤，并浓缩滤液。将残留物溶解于水（50.0mL）中，用二氯甲烷（2×50.0mL）萃取，用硫酸镁干燥。在真空中蒸发溶剂，得到1.38g无色液体化合物（收率=82%）。
[0188] 实施例15：5-硝基氧基戊腈的合成：
[0189]
[0190] 向5-溴戊腈（4.00g，1.0当量）在40.0mL无水乙腈中的溶液中加入硝酸银（4.60g，1.1当量）。在黑暗中70℃下加热反应混合物2小时。将所得混合物通过硅藻土过滤，并浓缩滤液。将残留物溶解于水（50.0mL）中，用二氯甲烷（2×50.0mL）萃取，用硫酸镁干燥。在真空中蒸发溶剂，得到3.56g无色液体化合物（收率=99%）。
[0191] 实施例16：二-(2-硝基氧基乙基)醚的合成
[0192]
[0193] 将溶解于30ml乙腈中的16.05mmol二(2-溴乙基)醚和40.13mmol硝酸银加入到避光的烧瓶中。将该悬浮液在70℃下搅拌16h。冷却至室温后，过滤悬浮液并在真空中浓缩。将残留物溶解于水中，并用TMBE萃取两次。用水和盐水洗涤有机相，合并，用Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂，剩余3.06g。使用1:1的庚烷/乙酸乙酯在硅胶上过滤粗产品，得到2.94g（15.0mmol，93.4%）。
[0194] 实施例17：与乙基-3-硝基氧基丙酸酯相比，3-硝基氧基丙醇的体内效果
[0195] 材料和方法
[0196] 将10只绵羊瘤胃插管。做手术后一个月开始试验。三种处理：对照、添加剂1、添加剂2，二者都是单剂量。添加剂1为乙基-3-硝基氧基丙酸酯，添加剂2为本发明的3-硝基氧基丙醇。实验设计由每个时段中每种处理3只羊和3个连续时段的3×3拉丁方阵（Latin square）组成。每个时段包括28天适应处理加上在室内连续两天甲烷测量和瘤胃样品的收集。适应阶段的过程中，在第14天进行中期一天甲烷测量。此外，在第22天和23天中，在绵羊的瘤胃中孵育置于尼龙袋中的苜蓿干草和燕麦的样品，以测定干物质瘤胃分解。在室内甲烷测量的两天（第29天和第30天）中，早上喂食后两个小时收集瘤胃内容物样品，子采样，并立即冷冻，之后进行DNA的提取并测定挥发性脂肪酸和氨氮浓度。实验动物随机分配在三个小组中，每小组3只动物，并且给它们随机分配三种处理（对照、添加剂1、添加剂2）中的一种。这3个小组以两天间隔开始适应饮食，以使它们在室内甲烷测量前经过相同的适应天数。将动物分别饲养在可不断获取淡水的笼子中。在9’00和14’00时以两种等同餐食（equal meals）的能量维持水平的大约1.1倍将由切碎成15-20cm的苜蓿干草和燕麦以60:40比例外加矿物质-维生素补充剂所组成的饮食提供给动物。整个试验中每天监测每只动物的新鲜物质摄入。
[0197] 每天两次与饲料同时经由瘤胃插管提供添加剂。将对应量（两种添加剂均为每只动物每天100mg）的每种添加剂吸入10克碎燕麦（grounded oats）中，并且包在纤维素纸中，之后立即置于瘤胃中。由于活性分子是挥发的，在4℃下冷室中进行前面提到的步骤。
[0198] 甲烷测量和样品收集
[0199] 使用一组4个甲烷室。在第14、29和30天时，将动物置于甲烷测量室中。每个测量室为1.8m宽×1.8m深×1.5m高。室内空气温度保持在15和20℃之间。在每个室内，动物被单独约束在与适应期相同的笼子里。每天上午09’00时，清洁室地板时中断，并饲喂动物。这些中断对每天的甲烷排放影响很小，因为流量（flux）每天计算3次，然后平均得出23小时的排放值。测量每个室的进气管和排气管的空气流和甲烷浓度。一天内连续监测每个室的排气管的空气流速。对4个管（室1、2和3以及背景）中每一个的空气流进行子采样，并采用气体分析仪ADM MGA300（Spurling works,Herts,UK）连续测量甲烷浓度。需要11分钟对室（对于室1、2、3，3分钟；对于背景2分钟）中所有进气管和排气管的空气流依次采样。总之，通过新鲜空气进入流和室排出甲烷浓度的差别以及平均空气流速来计算每个测量日每个室的甲烷流量。
[0200] 瘤胃样品分析
[0201] 将瘤胃内容物样品冻干，并在进行DNA提取前通过采用珠磨式研磨机（小型珠磨式研磨机；BioSpec Products,Bartlesville,OK,USA）物理破碎来彻底混合，所述DNA提取使用 DNA Stool Mini Kit(Qiagen Ltd,West Sussex,UK)根据制造商的说明书对大约50mg的样品进行，但使用更高的温度（95℃）来溶解孵育。DNA样品被用作模板进行定量实时PCR（qPCR）扩增。总细菌、总原生动物、总产甲烷菌（methanogenic archaea）的丰度通过实时-PCR（qPCR）定量。不同的引物组被用于扩增16S rRNA基因靶向总细菌（Maeda等人,2003）和18S rRNA基因靶向总原生动物（Sylvester等人2005）。设计用于检测产甲烷菌的引物靶向甲基辅酶M还原酶（mcrA）基因（Denman等人，2007）。在总体积
23μl的扩增混合物中含有11.5μl2X RT-PCR supermix Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA,USA)、0.4μl每种引物和0.5μl样品。每对引物的扩增效率用下面的程序进行评估：95℃下循环5分钟，95℃下15秒、60℃下30秒、72℃下55秒的40个
循环，以及75℃下6秒用以荧光发射检测。通过将温度从55℃增加到95℃，并且每5℃
读一次数建立熔解曲线。每个靶向组的扩增通过下面的程序进行：95℃下循环5分钟，
95℃下15秒，60℃下15秒，72℃下45秒（包括荧光发射测量）的40个循环，以及以45℃为设定点温度和95℃为终点温度的熔解曲线。细菌、原生动物和产甲烷菌的绝对数量表TM
示为DNA拷贝数，通过使用质粒 (Invitrogen ,Carlsbad,CA,USA)作为
标准进行测定。对使用各组引物获得的PCR产物进行纯化，然后克隆至
TM
质粒(Invitrogen ,Carlsbad,CA,USA)中来生成重组质粒。经PCR核实预期引入的单
个菌落在具有抗生素和X-gal的固体培养基上过夜生长。之后，进行转化的大肠杆菌菌落的筛选，并随机选择出阳性的（positive）一些。在通过PCR检查引入片段在菌落中TM
存在后，在液体培养基中过夜大规模培养阳性菌落。使用Pure Link Miniprep试剂盒TM
(Invitrogen ,Carlsbad,CA,USA)提取属于这些培养物的质粒，然后测序来验证引入片段的存在。使用质粒DNA的浓度和具有引入物的载体的分子量来计算所述质粒提取物中存在
8 2
的16S rRNA基团的拷贝数量。浓质粒被连续稀释（10倍）以提供10-10 的拷贝数，从而生成标准曲线。
[0202] 采用16sRNA作为参考基因，使用相对丰度定量Denman and McSweeny(2006)所描述的产甲烷菌和原生动物。通过气相色谱分析挥发性脂肪酸，并用比色法根据我们实验室建立的方法来分析氨氮浓度（Martín-García等人，2004）。
[0203] 瘤胃降解率
[0204] 将3克2mm碎饲料置于孔径为50μm的5cm×10cm尼龙袋中（#R510Ankom in situ bags,Macedon NY）。测试动物饮食中使用的两种成分：燕麦和苜蓿干草。燕麦袋在瘤胃中孵育24小时，而那些苜蓿干草袋孵育48小时。基于不同饲料在瘤胃中的平均驻留时间，选择孵育时间。在第22天和23天每次喂食每只动物每个时段两个袋。早上喂养前立即将袋置于瘤胃中。在24小时或48小时，从瘤胃中将它们取出，用冷水洗涤并在-20℃下冷冻。在每个时段结束后，在洗涤机中采用快速冷水程序洗涤冷冻的袋子，包括尚未在瘤胃中孵育的每次喂食的两个袋用以考虑溶解性。洗涤后，将袋置于60℃下烘箱中48小时。计算作为随孵育时间的干物质损失率的瘤胃降解率。
[0205] 实验动物护理
[0206] 受过训练的人员在严格按照实验动物保护的Spanish guidelines（ActNo.1201/2005 of 10 October 2005），对绵羊进行所有管理和实验程序。考虑到动物福利条件，仔细监测室内的温度、湿度和空气情况。还连续监测CO2浓度，以使其保持在保证良好的空气质量和更新速率的范围内。当被分配到室中时，动物没有表现出任何紧张的行为。
[0207] 统计分析
[0208] 对于包含添加剂的影响，分析个体的甲烷排放量、VFA分布情况、乙酸酯与丙酸酯的比例、氨氮浓度、以及总细菌、总原生动物和总产甲烷菌的浓度的log10转换值和相对丰度。计算每个分析的平均标准误差（SEM）。使用最小显著差异（LSD）测试来进一步比较平均值。
[0209] 结果
[0210] 处理不影响（P>0.05）干物质摄入量，并且当动物被引入到甲烷室中第14天和第30天时，观察到摄入量略有减少。
[0211] 如针对摄入量所描述的，体重（室测量之前和之后记录的重量平均）在各处理中没有差异（P>0.05）（表5）。当两种添加剂被掺入饮食中时，甲烷排放（表示为升每kg新鲜物质摄入）在第14天时明显（P=0.020）减少。添加剂1和添加剂2与对照相比观察到的减少分别为14%和23%。当两周后、第29天和第30天记录甲烷排放时，仍然有数值的减少，但是并未达到统计显著性（第29天和第30天时P分别为0.061和0.183）。如果最后连续两天中记录的测量值集中在一起，添加的影响表现出与单独考虑数值时类似的趋势（P=0.092）。
[0212] 表5.添加剂1和2的添加对开始处理后第14天、第29天和第30天测量的绵羊的体重、摄入量和甲烷排放的影响。
[0213]时间 测量项 对照 添加剂1 添加剂2 SEM P值

第14天 摄入量,kg/天 0.819 0.849 0.867
CH4L/天 24.6 21.9 20.0
CH4L/kg摄入量 29.9 25.6 22.5 2.31 0.020

第29天 摄入量,kg/天 0.856 0.944 0.922
CH4L/天 22.0 20.9 18.3
CH4L/kg摄入量 25.8 21.7 19.6 2.12 0.061

第30天 摄入量,kg/天 0.760 0.925 0.747
CH4L/天 22.7 21.8 19.7
CH4L/kg摄入量 29.8 23.2 25.6 2.34 0.183

第29-30天 摄入量,kg/天 0.780 0.933 0.823
CH4L/天 21.8 21.5 19.1
CH4L/kg摄入量 28.2 22.6 23.1 2.17 0.092
[0214] a,b同一行中上标字母不同的值差异显著，
[0215] P<0.05。
[0216] *室测量前后称重的平均值
[0217] SEM：平均标准误差
[0218] 表6.添加剂1和2的添加对绵羊的瘤胃中燕麦（24小时）和苜蓿干草（48小时）的挥发性脂肪酸分布（mol/100mol）、氨氮浓度（mg/100ml）和干物质降解率（DMD，%）的影响[0219]
[0220]
[0221] a,b同一行中上标字母不同的值差异显著，
[0222] P<0.05。
[0223] SEM：平均标准误差
[0224] 在第29天和第30天收集的瘤胃样品的瘤胃发酵参数的研究表明，与对照相比，在接受两种添加剂的动物的瘤胃中发酵路径（表5）朝着更具丙酸酯型分布偏移。结果，两种处理中乙酸酯与丙酸酯的比例显著（P=0.002）减小。在各处理中氨氮浓度类似，并且在向动物供给的饮食的预期范围内。
[0225] 在第22天和第23天的瘤胃降解研究表明，添加剂处理对苜蓿干草和燕麦两者的瘤胃降解率没有影响。
[0226] 表7.添加剂1和2的添加对绵羊的瘤胃中的总细菌（16S rRNA）、原生动物（18S rRNA）、产甲烷菌（mcr△基因）的浓度（log基因拷贝数/g新鲜物质）的影响。对于原生动物和产甲烷菌还示出与总细菌有关的相对丰度（△Ct）。
[0227]对照 添加剂1 添加剂2 误差 P值
总细菌 7.45*1010 9.08*1010 9.74*1010
log10 10.8 10.9 11.0 0.123 0.607

总原生动物 2.84*1010 1.87*1010 2.51*1010
log10 10.4 10.2 10.2 0.212 0.702
ΔCt 1.65 1.58 1.55 0.267 0.984

产甲烷菌 3.54*108 2.86*108 2.86*108
log10 8.54 8.45 8.34 0.133 0.511
ΔCt 0.028 0.022 0.020 0.005 0.602
[0228] 在瘤胃中所分析的微生物群体的总浓度和相对浓度在各处理中没有表现出差别（P>0.05）。当原生动物和产甲烷菌两者的丰度相对于总细菌表达时，同样观察到没有影响。
[0229] 结论
[0230] 两种添加剂的使用导致甲烷产生显著减少，并且根据VFA分布，添加剂还促进了H2转移所涉及的代谢路径偏移。本试验的目标是为了证实处理动物一个月是否表现出处理两周所观察到的结果的持续性。当评估饲料添加剂的实际用途的适宜性时，这是至关重要的。在这项研究中，两种添加剂都表现出对一个月处理的甲烷排放存在影响，这进一步被发酵模式偏移所证实。
[0231] 在另一方面，发酵模式中的变化可能不仅是由于甲烷产生减少，而且可能由于纤维降解减小，而这又产生较少的乙酸酯，并因此降低乙酸酯与丙酸酯的比例。为了排除这种情况发生，通过在动物的瘤胃中孵育具有燕麦和苜蓿干草的尼龙袋来进行瘤胃降解率评估。结果表明与未经处理的动物相比，对干物质降解没有这种影响，这也得到了接受添加剂的动物中所记录的相同细菌和原生动物生物质的支持。
[0232] 实施例18：3-硝基氧基丙醇在奶牛体内的效果
[0233] 材料和方法
[0234] 动物：本研究使用第二胎次或更高胎次且体重从550至800kg的六头瘤胃瘘管的泌乳Holstein X Friesian奶牛。奶牛在研究开始时处于泌乳中期。
[0235] 实验饮食：在整个研究中向所有的奶牛提供单一的全混合日粮（TMR）饮食。试验期间奶牛自由采食（5%拒绝）。
[0236] 实验设计：泌乳中期（奶产量30升或更多）开始时，六头牛以3×3拉丁方阵设计（表8）随机分配到三种补充处理中的一种。处理期持续5周。
[0237] 表8：实验设计
[0238]
[0239]

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