豆科牧草和谷物饲料是反刍动物通用的饲料。虽然豆科牧草和谷物 饲料比禾本科牧草含有更高含量的可消化物质，但豆科牧草和谷物饲料 均含有大量的可部分消化或难于消化的部分，主要由植物细胞壁构成。 饲料的细胞壁组分常统称为总纤维部分。
豆科牧草含有多至40％的总纤维。谷物饲料的总纤维组分一般多达 饲料总干物质量的20％(Van Soest，1982)。饲料的其余干物质主要 由非结构性碳水化合物构成，易于被反刍动物消化。在谷物饲料和豆科 牧草中，饲料的非结构性碳水化合物组分的90至100％可消化或转化为 导致动物生长的能量。在谷物饲料中总纤维组分仅约25％可消化，而在 豆科饲料中，总纤维组分约40％可消化(Van Soest，1982)。
豆科牧草或谷物饲料的细胞壁，或总纤维部分主要是不易降解的纤 维素、半纤维素和木质素。虽然反刍动物自身不分泌能消化这些物质的 酶，但在瘤胃中的细菌和真菌产生能降解细胞壁物质的酶。瘤胃的纤维 消化程度是不定的，它取决于饲料类型和瘤胃微生物的纤维裂解活性。 豆科牧草和谷物饲料的总纤维的纤维素和半纤维素组分可被瘤胃细菌产 生的纤维素酶和木聚糖酶消化。在半纤维素和纤维素的可消化性的决定 因素中有半纤维素和纤维素与不可消化的木质素缔合的程度和性质。纤 维素酶和木聚糖酶将纤维素和半纤维素溶解为糖，后者又被瘤胃细菌代 谢为挥发性脂肪酸，反刍动物可将脂肪酸用作直接的能量源。在高纤维 牧草的情况下，少于半数的牧草可被消化，未消化部分被排泄。这导致 产生大量的粪便。
改进饲料的可消化性是所期望的，因为这可导致动物更快地增长且 减少粪便产量。由于豆科牧草和谷物饲料的非结构性碳水化合物部分已 是可高度消化的了，几乎没有改进的余地。因而改进饲料可消化性的最 大机会来自提高可消化性差的总纤维部分的可消化性。目前还未有被许 可的饲料添加剂能增强反刍动物对纤维类饲料的可消化性。
由于高度水解蛋白的瘤胃环境，将能降解植物细胞壁物质的酶输送 到瘤胃是一个难题。如果将自身为蛋白质的纤维裂解酶如纤维素酶和木 聚糖酶简单地加入到饲料中，在它们可增加被吃进的饲料的纤维消化率 之前，纤维裂解酶在瘤胃中被快速地消化掉了(Chesson，1994， McAllister et al.，1994)。将纤维裂解酶直接添加到瘤胃环境中也不 会有益处，因为瘤胃含有细菌、真菌和原生动物，它们产生公知在存在 于任何环境中有最大活性的纤维素酶和木聚糖酶(Gilbert，1992)。因 而只有当使用极高数量的酶时，才能预期实现给反刍动物饲喂纤维裂解 酶的任何益处。只有在很高的酶数量下才会有所添加的酶的小比例部分 不被快速水解，并且其数量足以来增加瘤胃中自然发生的纤维裂解活 性。这样的方法是不实际的和不经济的。
用酶对牧草进行预先消化已被用作牧草青贮过程中保存及强化营养 价值的技术。PCT申请No.PCT/FI 91/00118(SSV-Development Oy，申请日为1991年4月18日)叙述了在青贮时向湿的草本植物(水 分含量为50-75％)中添加选自果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉 酶、阿拉伯糖苷酶、角质酶(cutinase)、脂肪酶和酯酶的一或多种纤 维裂解酶。这导致植物细胞壁的预先消化并随后增加了乳酸菌的产酸能 力。牧草的pH值保持在低于4至4.5的范围内，排除了有害细菌种类的 生长。相似地，德国专利申请No.DD 296407 A5叙述了青贮时在新鲜 草木植物中应用纤维裂解酶的混合物。日本专利No.6,075,238教导在贮 存于真空包装中的具有高水分含量的饲料中添加酶/微生物接种物以实 现微生物发酵。
由于酶的活性所要求的饲料的高水分含量(大于30％)，饲料的预 先消化是不希望的。湿饲料固有是不稳定的，因为它们易于被霉菌生长 而污染和腐败。由高水分含量导致的饲料重量增加，使运输不易进行， 而且过量的水分要求饲料在加工前需另外进行千燥。这些限制使得以饲 料预先消化作为增加饲料可消化性的途径是不能被接受的。因而在将饲 料保持在低水分含量的同时来增加饲料的可消化性是有益的。
防止酶的胃或瘤胃失活的技术也是公知的。加拿大专利No 1,322, 159(Ying，1993年9月14日授权)教导用不溶于酸的聚合物涂覆酶 和使酶胶囊化来使酶穿经瘤胃。相似地，U.S.专利No.3,492,398 (Marco等，1970年1月27日授权)教导了氨基聚酰胺树脂涂层。
由所选择的真菌苗株而制备的纤维素酶/木聚糖酶饲料添加剂已用 于治疗家禽的消化障碍综合症(PCT申请No.PCT/DT 90/00256 (Novo Nordisk A/S，申请日1990年10月5日))。
已尝试通过直接将纤维裂解酶加入到饲料中或以酶添加物的形式与 饲料一起饲喂来提高反刍动物饲料的可消化性，但这只获得了有限的成 功。现有技术中所述的多数添加物需要一些加工步骤，包括饲料增湿、 热处理、干燥、及添加其它添加剂和稳定剂。欧洲专利申请No.8815409.2 (Suomen Sokeri Oy，申请日1988年4月4日)叙述了在水分含量 为15-60％的家畜饲料中添加未公开的酶添加物，随后在低于100℃ 的温度下进行联合的水热和酶处理。然后干燥饲料物质以使酶稳定并改 进饲料物质的耐贮性。
U.S.专利No.5,314,692(Haarasilta等，1994年5月24日授权) 叙述了一种热稳定的酶预混合物，其中含有总量为1至60％的选自淀粉 酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶等的酶和40至 99％的谷粉或其它淀粉。该酶预混合物造粒并设计成以0.01至0.05％的 浓度与其它饲料混合。该酶预混合物是热稳定的，在饲料加工温度下不 表现出显著的酶降解。
U.K.专利申请No.2,261,877(Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd.， 申请日1992年11月18日)叙述了一种浓缩的动物饲料添加剂，其中含 有破坏植物组织的酶和至少一种必需氨基酸，它能有效地增加奶产量、 改进奶质、促进生长、改进肉质、并提高繁殖率。
德国专利申请No.DD 296407 A5叙述了在黑小麦底物上培养毒霉属 类真菌特定菌株的方法。该方法包括在15至60℃的温度下在高于25％ 的水分含量下预水解。生成的酶复合物含有纤维素酶、半纤维素酶、淀 粉酶、果胶酶、蛋白酶、和β-1，4-葡聚糖酶。该物质磨碎以提供一 种饲料添加物。
Feng等人(1992，No.1)证明将含有纤维素酶、木聚糖酶和半纤 维素酶的、未具体说明的“高数量”酶混合物应用于干燥的成熟禾本科 牧草分别使体外干物质(DM)和中性去污剂纤维(NDF)可消化性提 高12和20％。“较低”数量的纤维素酶和半纤维素酶使体外DM可消 化性提高8％。对现场DM和NDF可消化性进行了测量但未报导结果， 可能是因为未观察到效应。该参考文献说明，需要“高”数量的三类酶 的组合来改进成熟的干燥禾本科干草的可消化性。所述的酶在体外和现 场消化研究即将开始前添加。
Feng等人(1992，No.2)教导在即将饲喂之前将市售含纤维素 酶、半纤维素酶和木聚糖酶的酶混合物应用于干燥的成熟禾本科干草。 经与该作者的私下交流，本发明人确信其所使用的酶混合物是称为Grass -Zyme的市售产品，它除纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶外还包括 其它类的酶例如葡萄糖氧化酶和淀粉酶。与未经处理的干草对比，这种 预处理使干草DM摄入量增加12％。通过酶预处理使DM和NDF可消 化性也得以改进。在即将饲喂之前用酶混合物对干草预处理增加了现场 NDF消化速率。当在吃预处理干草的小牛的瘤胃中现场培养未处理的干 草时，未观察到有何益处。这些结果表明，酶预处理导致在摄取之前牧 草的部分消化，而不是增加瘤胃酶活性。
由现有技术显而易见，现仍需求一种酶添加物来增强反刍动物的谷 物和豆科牧草饲料的可消化性。这种添加物应易于应用于饲料，不需要 复杂、花费大、或耗时的加工步骤。理想的是，这种添加剂应可在临近 饲喂时或在更早一些时添加于饲料，以将饲料加工成商业上可接受的形 态。这种添加物因而不应预消化或水解饲料，而是与饲料形成稳定的复 合物，使得可保存和贮藏该饲料组合物。该补加物应在低或中等酶数量 下得到最佳的牧草可消化性以使之实用且经济。
发明概述
本发明人发现，当以本发明人发现的方法用特定比例及活性值的纤 维降解酶即纤维素酶和木聚糖酶来处理豆科牧草或谷物饲料(饲料物 质)，意外地导致增加了饲料物质可消化性和动物生长。与应用过量的 酶相比，当使用的酶的数量处于确定的优选范围内时获得了优异的结 果。已证实，对于改进饲料物质可消化性和动物生长，木聚糖酶和纤维 素酶活性间有未预料到的协同效应，由于因应用本发明酶组合物所导致 的饲料物质可消化性和动物生长的改进大于分别应用木聚糖酶和纤维素 酶的普通添加剂改进。当以除本发明人所发现的以外的方法应用本发明 酶混合物时，未观察到优异、协同效果。
本发明提供了一种将纤维降解酶的混合物引入干燥、加工过或未加 工过的饲料物质中的方法，以制备稳定的用于反刍动物的饲料组合物。 当给反刍动物饲喂时，该方法增强了饲料物质的可消化性。本发明延伸 到含有纤维降解酶的特定混合物的酶添加物及按照本发明方法用该酶添 加物处理牧草所制备的饲料组合物。本文所使用的“反刍动物”包括牛、 羊、山羊、鹿、野牛、水牛和骆驼。饲料物质可消化性增加导致动物性 能增加，其表现是改进了增重速率和奶产量，饲料能量更有效地转化为 肉或奶，保持相同程度的产率所需的饲料减少，要求更大能量摄入的动 物实现了更大的饲料摄入量，降低了对补加的能量源如谷物和脂肪的需 要，并减少了粪便产量。
在一个优选实施方案中，本发明的酶溶于水溶液中且在加工饲料 时，施加到干燥的饲料物质中。所述的酶可呈各自独立的溶液施加或可 呈含有酶混合物的单一溶液来施加。所述水溶液优选是pH为4.5至7.0 之间的弱缓冲剂。将所述酶水溶液施加到饲料物质中以涂覆饲料物质并 使所述水溶液在饲料物质上均匀分布。典型的是，将所述酶溶液喷在饲 料物质上，同时对饲料物质进行混合以促进酶溶液的均匀分布。所述的 酶不使饲料物质水解或预消化而是粘附在饲料物质上，形成稳定的酶/饲 料复合物(饲料组合物)。如饲料物质足够干燥使得可将含有被溶解的 酶的水溶液显著吸收于该饲料物质中，则所述的酶仅是吸附在该饲料物 质上。已确定，饲料物质的水分含量优选应低于15％(w/w)以发生恰 当的吸收作用。水分在饲料中占据空间。当水分蒸发时，在饲料中形成 孔隙，本发明酶添加物就吸收在该孔隙中，从而占据蒸发掉的水分的空 间。如果饲料的水分含量显著大于15％，所述酶添加物不能在饲料中吸 收。再有，如饲料的水分含量保持在高于约18-20％，它易于霉败。 野外干燥的豆科牧草或谷物饲料一般水分含量为约12％。需要在5至80 ℃的温度下用酶水溶液对饲料物质培养至少3小时、更优选至少8小时 来吸收酶水溶液并形成稳定的酶/饲料复合物，所生成的酶/饲料复合物的 稳定性可持续长至至少1年。饲料物质可在磨碎、切碎、调和、粉碎、 破碎、爆制、挤压、微粉碎、焙烧、压片、蒸煮或破裂处理之前或之后 加工，或在造粒、压块或压捆处理之后加工。饲料物质包括豆科干草、 作物残茬、和禾谷。
所述酶添加物包括呈一定优选比值和浓度的纤维素酶和木聚糖酶。 它还可包括果胶酶、酯酶、阿拉伯糖苷酶、和β-1，3葡聚糖酶，但它 不需要蛋白酶、脂肪酶或淀粉酶。纤维素酶和木聚糖酶可由任何广谱纤 维素酶和木聚糖酶组成，优选微生物来源的，以标准活性值施用。纤维 素酶的活性标准以滤纸降解为基准，以滤纸单位(FPU)活性来表达(每 分钟每单位酶由滤纸所生成的葡萄糖μmole数)。木聚糖酶活性以斯卑 尔脱燕麦木聚糖(oat spelts xylan)水解成木糖为基准并以国际单位 (IU)表达(每分钟每ml每酶单位产生的还原糖的μmole数)。确定 纤维素酶和木聚糖酶活性的试验在实施例6、7和8中给出。如上所讨 论，纤维素酶的活性是指外纤维素酶，并以FPU数来测量。内纤维素酶 也可适于用作按照本发明的纤维素酶，按实施例7所述以IU数来测量。 25IU的内纤维素酶活性等价于1FPU外纤维素酶的活性。
当在饲料组合物中提供的纤维素酶和木聚糖酶的数量足以使纤维素 酶活性与木聚糖酶活性的比值为约2至5FPU纤维素酶每100IU木聚糖 酶时，所叙述的制备饲料组合物的方法对于使饲料可消化性和动物性能 最大化是最有效的。
本发明人发现，纤维消化率和动物性能的增加取决于添加到饲料物 质中酶的总量(以每公斤饲料干物质酶的总活性来表达)和纤维素酶与 木聚糖酶的相对比例这两种因素。发现酶浓度与动物响应之间的关系是 非线性的，且对豆科牧草和谷物饲料是不同的。对于豆科牧草，例如苜 蓿干草，酶浓度为每kg饲料干物质16至120、更优选18至72FPU纤 维素酶和800至6000，更优选900至3600IU木聚糖酶有最大的性能。 对于谷物饲料，得到最大动物性能的酶浓度为每公斤饲料干物质10至 200、更优选40至160 FPU纤维素酶和500至10,000、更优选2000至 8000IU木聚糖酶。对于豆科牧草和谷物饲料，纤维素酶活性与木聚糖酶 活性的比值优选为2至5FPU纤维素酶每100IU木聚糖酶。
在另一广的方面，本发明延伸到特殊的反刍动物饲料组合物。总的 来说，该饲料组合物由低水分含量的饲料物质和与之紧密结合的纤维素 酶和木聚糖酶的混合物所组成以提供稳定的饲料/酶复合物。在饲料组合 物中纤维素酶活性与木聚糖酶活性的比值优选为2至5FPU纤维素酶每 100IU木聚糖酶。在一优选的实施方案中，饲科组合物是一种稳定的酶/ 饲料复合物，其中的酶提供每kg饲料物质60至120、更优选18至72FPU 纤维素酶活性和800至6,000、更优选900至3600IU木聚糖酶活性，而 且其中饲料物质是干的豆科牧草。在另一优选实施方案中，饲料组合物 是一种稳定的酶/饲料复合物，其中的酶提供每kg饲料物质10至200、 更优选40至160FPU纤维素酶活性和500至10,000、更优选2000至8000 IU木聚糖酶活性，而且其中饲料物质是干的谷物饲料。这些饲料组合物 可呈压块、颗粒、切碎、压捆、磨碎、调和、粉碎、破碎、爆制、挤压、 微粉碎、焙烧、压片、蒸煮或破裂形态。
在再另一实施方案中，本发明提供了在前述方法和饲料组合物中使 用的酶添加物。该酶添加物是纤维素酶与木聚糖酶的混合物，其中所含 的酶的数量为使得纤维素酶活性与木聚糖酶活性的比值为2至5FPU纤 维素酶每100IU木聚糖酶。该酶添加物可溶于水溶液中用来施加到饲料 物质中。优选该水溶液是pH为4.5至7.0的弱缓冲剂。
不受其所限制，本发明人相信本发明所引起的所述酶添加物中木聚 糖酶与纤维素酶之间的协同作用关系的机理并非来源于那些酶的简单的 纤维裂解活性。相对于属于添加的低量酶活性的豆科牧草和谷物饲料中 所含的总纤维来说，本文实施例中所确证的饲料转化比(干物质摄入量 (DMI)/平均日增重/(ADG))的改进是太大了。
人们期待着如将高酶数量施加到禾本科牧草在饲料可消化性上的改 进(如在Feng等人的参考文献中)。禾本科干草如Feng等人所试验用 的其总纤维高于豆科牧草或谷物饲料。在禾本科干草中约50％总纤维是 半纤维素(即木聚糖)。其余的50％总纤维是木质素和纤维素(Van Soest，1982)。例如，日光晒干的梯牧草属干草(International Reference No.1-04-885)含有70％的总纤维，包括29％的半纤维素和34％ 的纤维素(National Research Council，1982)。
如上所述，豆科牧草和谷物饲料的纤维组成与禾本科干草不同。豆 科牧草如苜蓿(International Reference No.1-00-068)含有50 ％总纤维，由11％半纤维素和28％纤维素组成。由于豆科牧草所含半 纤维素的比例低于禾本科干草，不能预料向豆科牧草中添加纤维素酶和 木聚糖酶能显著改进牧草的可消化性或反刍动物的增长速率。
相似地，谷物饲料如大麦(International Reference No.4-00- 549)含有相对少量的纤维(19％总纤维，其中5％是半纤维素)，它 们在瘤胃中很快被消化。消耗含谷物饲料高的日粮的反刍动物不能预计 添加酶会显著受益。
禾本科牧草与豆科牧草和谷物饲料的区别在于形态结构和化学组成 两方面(Nelson等，1994)。禾本类叶子提供结构和代谢两种功能而 豆科的叶子仅提供代谢功能。谷物饲料的形态结构与禾本科干草的很大 的不同之处在于谷物中相对少量的纤维位于皮壳并包围淀粉质的胚乳。
用来改进禾本科干草的营养价值的预处理方法不能有效地改进豆科 牧草的营养价值。例如，对单子叶植物(禾本科)作物残茬进行的24项 研究中，通过氢氧化钠处理使DM摄入量增加了22％，而在两项双子叶 植物(豆科)作物残茬研究中，DM摄入量仅增加6％(Berger等， 1994)。
禾本科和豆科牧草的纤维素组成基本上相似。但相对于豆科牧草来 说，禾本科的纤维素具有高浓度的木聚糖-木质素键。在豆科牧草中， 多糖(木聚糖和纤维素)与木质素更不连续的分区。其结果是，在豆科 牧草中木质素对消化纤维的物理阻断作用大于在禾本科中的。进一步在 纤维化学性质上的差别，使得与豆科牧草相比较，禾本科对化学处理有 更大的响应。能改进禾本科干草营养价值的酶处理不能期待对豆科牧草 或谷物饲料有效。在温带禾本科牧草(temperate grass forages)中半 纤维素∶纤维素的比值范围为0.57至0.70，而豆科的为0.32至0.40。 在豆科牧草中主要的半纤维素多糖是阿糖基木聚糖、木聚糖、阿拉伯聚 糖、和半乳聚糖，而在禾本科中主要的半纤维素多糖为木糖葡聚糖和阿 糖基木聚糖。木糖占禾本科半纤维素中糖的30％和豆科牧草半纤维素中 糖的20％。由于豆科牧草的半纤维素是比禾本科半纤维素更复杂的糖混 合物，所以预计需要更复杂的纤维裂解酶体系来降解豆科牧草半纤维 素。
如前面所讨论的，在现有技术工作的基础上，人们预计需要很高量 的纤维裂解酶来使饲料物的可消化性有显著的增加，特别是在具有较低 总纤维含量的豆科牧草和谷物饲料中，由于瘤胃是高度蛋白水解环境且 已具有产生高活性纤维裂解酶的微生物的高度进化的补充。提供较少比 例总纤维的豆科牧草和谷物饲料与禾本科牧草相比更不易表现出可消化 性的改进。
尽管有前述的因素，本发明人在较低的酶添加量下使豆科牧草和谷 物饲料的可消化性有了显著改进。观察到大麦饲料谷物的饲料转化比增 加了12％(实施例中表3)，表明谷物的总纤维组分的可消化性增加一 倍。观察到苜蓿(一种豆科牧草)的饲料转化比增加了17％(未处理干 草为9.92kg饲料/kg增重；用每kg干物质3600IU木聚糖酶和148FPU 纤维素酶处理的苜蓿干草为8.48kg饲料/kg增重)，表明总纤维可消化性 的改进。可消化性方面这些意外的改进并非是添加的纤维素酶和木聚糖 酶的普通的添加剂的酶效应所致。不受其约束，本发明人确信，本发明 的酶添加物在经处理的饲料颗粒上产生了瘤胃细菌的附着部位，从而强 化了饲料颗粒被自生瘤胃细菌定居并随后消化。
已公知，为适于用作饲料，在野外生长时植物必须耐受微生物侵害， 但在瘤胃内应易于被微生物穿透、定居和消化。在野外抵御微生物侵害 的防护性屏蔽和物质(即腊状表皮或酚酸)妨碍植物物质在瘤胃内的消 化。瘤胃微生物经弱防护性的植物结构如气孔或经由咀嚼或机械加工造 成的防护屏蔽物破坏处包围这些抵御物、(McAllister等，1994)。
一旦获得通道，瘤胃细菌就附着在内部组织上，形成生物膜 (biofilm)，并开始消化。初始的定居者释放消化产物，这又引诱另外 的细菌到达消化部位，形成能够消化内部植物组织的细菌复合聚结体。 因而，饲料的消化从其内部进行，且饲料物质的消化速率和程度常受瘤 胃微生物可到达内部组织的多少所决定(McAllister等，1994)。
本发明的酶添加物被饲料物质吸收，在饲料物质中防止了所述酶添 加物在蛋白水解性的瘤胃环境下溶解。本发明人相信，在饲料物质内， 所述的酶使瘤胃微生物的初始定居产生附着部位。进一步的推测是，更 高的酶处理量是无效的，因为所形成的附着部位被过量的纤维裂解酶所 阻断。过量的酶分子在附着部位的顶部粘合，产生对微生物附着和活动 的障碍物。
本发明人的意外发现有很大的应用价值，因为它使得按普通及简便 方法施用在更特定比值及活性值下的有效量的酶使饲料物质总纤维的可 消化性可得以改进，而所述总纤维对酶处理是较不敏感的。
附图简要说明
图1是饲喂干燥苜蓿牧草日粮的阉牛以kg为单位的平均日增重 (ADG)与每kg饲料物质的酶活性值的函数关系图。只示出了木聚糖酶 值。纤维素酶与木聚糖酶活性的比值恒定为4FPU纤维素酶活性每100IU 木聚糖酶活性。
图2是饲喂干燥梯牧草牧草日粮的阉牛以kg为单位的平均日增重 (ADG)与每kg饲料物质酶活性值的函数关系图。仅示出了木聚糖酶 值。纤维素酶与木聚糖酶活性的比值恒定为4FPU纤维素酶活性每100IU 木聚糖酶活性。
图3是饲喂干燥大麦青贮饲料日粮的阉牛以kg为单位的平均日增重 (ADG)与每kg饲料物质酶活性值的函数关系图。仅示出了木聚糖酶 值。纤维素酶与木聚糖酶活性的比值恒定为4FPU纤维素酶活性每100IU 木聚糖酶活性。
图4是在瘤胃液中培养的干燥苜蓿干草的中性去污剂纤维(NDF) 消失率与两个酶比值系列下酶添加物的纤维素酶∶木聚糖酶活性比值 的函数关系。
图5是在瘤胃液中培养的干燥苜蓿干草的NDF消失率与以IU木聚 糖酶：/FPU纤维素酶表达的酶添加物的纤维素酶∶木聚糖酶活性比值及 以每kg饲料干物质的IU木聚糖酶活性表达的添加的酶的数量两者之间 的三维函数关系图。
图6是在瘤胃液中培养的干燥苜蓿干草的干物质可消化性(NDF消 失率)与经酶处理的苜蓿酶处理后培养时间的函数关系图。
优选实施方案的详细说明
本发明提供了当给反刍动物饲喂时改进豆科牧草和干燥的谷物饲料 的可消化性的酶添加物，以及用酶添加物处理豆科牧草和谷物饲料以形 成稳定的酶/饲料复合物的方法。
在本文使用时，术语“干燥”如应用于饲料物质，意义是饲料物质 的水分含量低于15％(w/w)。
在本文使用时，“豆科牧草”意义是用作动物饲料的植物的切碎且 晒干的地上部分，所述植物是双子叶植物类，它是豆科植物成员。其非 限定性实施包括苜蓿、驴喜豆、三叶草和巢菜。“豆科牧草”包括其超 出50％的植物物质来源于豆科、最高有49％的其它种类植物物质的牧 草。
在本文使用时，“谷物饲料”意义是一般饲喂给反刍动物的植物的 种籽，它可包括或不包括种籽的外壳、荚或谷壳。谷物饲料非限定性的 实例包括大麦、小麦、玉米、高梁、黑小麦、黑麦、canola和大豆。
在本文使用时，“纤维素酶”意义是从纤维素中溶解糖的酶，“木 聚糖酶”意义是从半纤维素中溶解糖的酶。
在本文使用时，“饲料物质”意义是豆科牧草或谷物饲料。
在本文使用时，如应用于本发明的饲料组合物，“稳定的”意义是 在处理后至少约一年的时间木聚糖酶和纤维素酶保持活性且饲料物质不 变得发霉、腐败、发生预消化或其它类的变质。
在本文使用时，如应用于施加到饲料物质上的酶溶液，“涂覆”意 义是酶溶液基本均匀地分布在饲料物质上。饲料物质被酶溶液的涂覆可 以是不连续的。但平均而言酶溶液的分布基本上是均匀的。
所述酶添加物包括呈某些优选比值和浓度的纤维素酶和木聚糖酶。 它还可包括果胶酶、酯酶、阿拉伯糖苷酶、和β-1，3-葡聚糖酶。不 需要蛋白酶、脂酶或淀粉酶。
当以优选的酶活性和浓度比值提供木聚糖酶和纤维素酶时，已确定 酶添加物可最有效地增加饲料的可消化性。在本文使用时，如指添加到 饲料物质中的酶的浓度，“浓度”意义是包含用酶添加物处理的饲料物 质的饲料组合物的每kg干物质的酶的活性值。纤维素酶的活性以滤纸降 解为标准，以滤纸单位(FPU)活性(每分钟每单位酶由滤纸产生的葡 萄糖的μmole数)来表达。木聚糖酶活性是以斯卑尔脱燕麦木聚糖水解 成木糖为基准并以国际单位(IU)(每分钟每ml每酶单位产生的还原 糖的μmole数)表达。纤维素酶和木聚糖酶活性的测定列于实施例中。
当存在于酶添加物中的纤维素酶和木聚糖酶在优选的比值和浓度范 围内时，观察到纤维素酶和木聚糖酶对于用酶添加物处理的饲料物质的 可消化性有协同效应。所产生的可消化性的改进大于分别应用木聚糖酶 的纤维素酶处理饲料物质预计的可消化性的改进的简单加和所推测的结 果，当在酶添加物中提供的纤维素酶和木聚糖酶其比值和浓度低于或高 于本发明范围时，未观察到有协同效应。
对于豆科牧草如苜蓿干草，当存在于酶添加物中的纤维素酶和木聚 糖酶其比值为2至5FPU纤维素酶每100IU木聚糖酶时，经处理的饲料 物质的可消化性发现有最大的改进。在酶添加物中优选数量的纤维素酶 和木聚糖酶活性是这样的，即当按照本发明方法施加到干燥豆科牧草中 时，提供每kg饲料干物质16至120、更优选18至72 FPU的纤维素酶 活性和800至6000、更优选900至3600IU的木聚糖酶活性。
对于谷物饲料，最佳的纤维素酶与木聚糖酶比值为2至5 FPU纤维 素酶每100木聚糖酶。该酶添加物优选含有足够数量的纤维素酶和木聚 糖酶以提供每kg饲料干物质100至200、更优选40至60FPU的纤维素 酶活性和500至10,000、更优选2000至8000IU的木聚糖酶活性。
为达到所期望的协同效应和饲料物质可消化性的改进，应按确定的 步骤和参数来将纤维素酶和木聚糖酶施加到饲料物质中。因而本发明延 伸到用酶处理饲料物质以改进饲料物质可消化性的方法。在将酶溶于pH 为4.5至7.0的缓冲剂水溶液中的情况下，可消化性的改进和木聚糖酶与 纤维素酶的协同效用达到最大值。所述的酶可呈单独的溶液、更优选呈 混合物、呈一种水溶液。在5至80℃的环境温度下将所述水溶液均匀地 添加到水分含量低于约15％的干燥饲料物质中。所述湿润的饲料物质然 后应培养至少3小时、更优选至少8小时以稳定所生成的饲料/酶复合物 (饲料组合物)。    
按本发明方法对豆科牧草或谷物饲料的处理可与各种典型的饲料加 工步骤相结合，这些加工步骤可在酶处理之前或之后进行，非限定性而 言，这些加工步骤包括饲料的调和、爆制、焙烧、蒸煮、或破裂。当所 述的加工步骤导致压紧或压缩以致妨碍酶添加物在饲料物质中吸附时， 优选在该加工步骤之前进行酶处理。非限定而言，这类加工步骤包括饲 料造粒、压块或压捆。当加工步骤包括高温时，优选在该加工步骤之后 施加酶。
按本发明方法使用的纤维素酶和木聚糖酶可呈粉末或液体形态。如 呈液体，优选以水溶液形式来提供酶，例如溶于pH为4.5至7.0的缓冲 剂水溶液中。按照本发明，以干燥状态来提供豆科牧草或饲料谷物，优 选其水分含量低于15％(重量/重量)。野外干燥一般可达到这种干燥 程度，但有时也需要在谷物干燥机等中再进行干燥。根据豆科牧草或饲 料谷物的数量，将足够的粉末或液体木聚糖酶和纤维素酶在水或缓冲剂 溶液中稀释以提供所需的纤维素酶与木聚糖酶的比值及每kg饲料物质中 纤维素酶和木聚糖酶的所需活性值，可以分别独立地添加酶，或者以呈 确定的优选比值的预混合形态来提供。对用于稀释酶的水或缓冲剂的数 量无严格限制，只要使用的该数量不致于大到使饲料物质的水分含量增 加到高于约15-18％即可。
然后将稀释的酶溶液均匀地施加使其在饲料物质上分布(即通过喷 雾)。然后将如此形成的处理过的饲料组合物在优选5至80℃温度下培 养至少约3小时、更优选至少约8小时，以使酶吸收并粘附于饲料物质 中，使过量的水分蒸发，且使得形成稳定的饲料/酶复合物。所生成的饲 料组合物应在至少一年的时间保持稳定。
本发明进一步具体的实施方案和用途通过以下非限定性的实施例来 说明。
实施例1
将特定比值的木聚糖酶和纤维素酶施加
到干燥豆科牧草中使动物性能得以改进
对各自圈于独立饲养畜栏中的体重300kg(范围为235至367kg) 的72头生长阉牛配给三种牧草日粮(24头动物/日粮)：
1.苜蓿干草块；
2.梯牧草干草块；
3.大麦青贮饲料。
选择这些牧草来代表三种类型的牧草日粮：豆科干草(苜蓿)、禾 本科干草(梯牧草)和禾本科青贮饲料(大麦青贮饲料)。向各种日粮 中以3×6因子排列(3种日粮×6种酶浓度)添加分级数量的市售外 纤维素酶(Spezyme CP，Genencor，Rochester，NY)和木聚糖酶(木聚 糖酶B，Enzyme Development Corporation，New York，NY)。在每 种日粮内，给4头动物配给各酶数量(n＝4)。在压捆过程中以各种 不同数量将酶添加到苜蓿和梯牧草干草中(表1)。至少在饲喂7天前 将酶施加到牧草中。对于大麦青贮饲料，在即将饲喂之前以适宜的浓度 添加酶并混合。向各种日粮中添加蛋白质/矿物质添加物以提供至少12 ％的粗蛋白、适当的瘤胃不可降解的蛋白质、Ca、P和微量矿物质 (NRC，1984)。由于苜蓿压捆的粗蛋白含量显著高于梯牧草捆或大 麦青贮饲料，这些动物的总粗蛋白摄入量较高，但瘤胃不可降解的蛋白 质摄入量相近似。每日在1000h给动物提供一次饲料。饲料余量比随意 摄入量过量5至10％。
以7或14天的间隔在0800h对动物称重。通过实验确定各自的随意 进食量。接受干草捆的动物以手喂，接受大麦青贮饲料的动物使用自动 饲料混合机饲喂。在每周一、三和五饲喂之前收集饲料残渣(refusal) 并称重。将每周残渣复合物在55℃下干燥72h以确定干物质(DM)。
通过线性回归由活体体重计算平均日增重(ADG)。以日粮和酶添 加为主要影响对数据进行双向方差分析。因为日粮×酶一致性的相互作 用，以酶添加为主要影响且以初始重为协变量通过单向方差分析在各种 牧草内测定酶的影响。对以下非正交对比进行测试：低酶数量(数量1、 2和3)对对照组，高酶数量(数量5)对所有其它酶数量(包括对照组 -零数量酶)。
牧草化学组成列于表2。添加纤维裂解酶略微减少了梯牧草捆的 DNF和ADF，但苜蓿草捆则没有，表明禾本科在消化前有部分纤维水解 而豆科干草则未水解。添加酶对于苜蓿(P＝.15)和梯牧草捆(P ＝.065)的平均日增重有提高，但大麦青贮饲料则没有(P＝.67)(表 1)。然而，对酶添加的剂量响应是非线性的(参见图1、2和3)。
对于苜蓿、豆科牧草，低数量的纤维裂解酶使ADG增加。高数量的 纤维裂解酶是无效的。ADG的最大响应发生在3,600IU木聚糖酶/kg DM (图1)。在这一数值下，其ADG显著高于对照组(1.34vs 1.03kg/d)， 但在较低酶数量下ADG是相近似的(P＝.57)。当一起与对照组相对 比时，三种低酶浓度增加了(P＝.015)ADG。
对于梯牧草这种禾本科牧草来说，在最高的酶浓度下(12,000IU木 聚糖酶/kg DM)获得了ADG的最大响应(图2)。在这一数量下 (1.66kg/d)ADG高于(P＜.01)对照组(1.22kg/d)和所有较低酶数 量的。梯牧草干草的结果与现有技术观察到的一致。
如预计，在牧草中DM摄入量(“DMI”)有相当大的不同(表1)， 大麦青贮饲料的最低，苜蓿的最高。酶添加剂不影响苜蓿(P＝.60)或 大麦青贮饲料(P＝.23)的DMI。对于梯牧草，接受最高浓度酶的动 物的DMI高于(P＝.043)对照组和所有其它酶数量。相反，在即将饲 喂前添加纤维裂解酶对饲喂大麦青贮饲料的动物没有益处(图3)。
表1 酶数量对食用不同牧草的阉牛平均日增重(ADG；kg/d)
和干物质摄入量的影响(DMI；kg/d)     酶数量     牧草     苜蓿     梯牧草   大麦青贮饲料      ADG    DMI   ADG  DMI     ADG     DMI     0     1.03    10.2   1.22   8.8     1.11     7.4     900 IU*     37 FPU**     1.27    10.8   1.31   8.3     1.16     8.2     1,800 IU     74 FPU     1.28    10.6   1.12   7.5     0.99     6.8     3,600 IU     148 FPU     1.34    11.5   1.24   9.3     1.03     7.9     7,200 IU     296 FPU     1.19    11.1   1.27   8.6     1.11     7.0     14,400 IU     592 FPU     1.11    10.3   1.66   9.4     1.12     7.4
*IU＝木聚糖酶国际单位/kg DM
**FPU＝纤维素酶滤纸单位/kg DM
表2 用不同酶数量处理的苜蓿和梯牧草中酸性洗涤剂 纤维(ADF)和中性洗涤剂纤维(NDF) 每kg干物质   的酶数量     苜蓿     梯牧草    ADF(％)    NDF(％)     ADF(％)    NDF(％)     0   29.8±1.0   44.7±1.6   28.2±0.3   55.0±1.1   1,800 IU   木聚糖酶   74 FPU   纤维素酶   32.2±.03   44.1±0.1   26.3±0.0   53.6±0.1   14,400 IU   木聚糖酶   592 FPU   纤维素酶   28.4±3.0   42.6±4.0   26.0±0.5   52.8±0.8
实施例2
对干燥谷物饲料施用特定比值的木聚糖酶
和纤维素酶导致动物性能改善
对19头体重410kg、圈养在独自的饲养畜栏中的阉牛配给三种围栏 日粮：
1.大麦谷物-无酶；
2.含有6000IU木聚糖酶和200FPU纤维素酶/kg DM的大麦谷物；
3.含有2,400IU木聚糖酶和420FPU纤维素酶/kg DM的大麦谷物。
日粮由93％大麦精饲料和7％大麦青贮饲料(以DM为基准)组成。 将市售外纤维素酶(Spezyme CP，Genencor，Rochester，NY)和木聚糖 酶(木聚糖酶B，Enzyme Development Corporation，New York， NY)的混合物水溶液在饲喂前的至少24小时添加到干燥的大麦谷物 中。将大麦谷物蒸汽碾轧并随后在即将饲喂前与大麦青贮饲料混合。将 蛋白质/矿物质添加物添加到各种日粮中以提供最少12％的粗蛋白、适 当的瘤胃不可降解的蛋白质、Ca、P和微量矿物质(NRC，1984)。 每日在1000h给动物提供一次饲料。饲料余量比随意摄入量过量5至10 ％。
以7或14天的间隔在0800h对动物称重。通过实验确定各自的随意 饲料摄入量。接受干草捆的动物以手饲喂，接受大麦青贮饲料的动物使 用自动饲料混合机饲喂。在每周一、三和五饲喂之前收集饲料残渣并称 重。将每周的残渣复合物在55℃下干燥72h以确定DM。
饲喂98天后通过线性回归由活体体重计算平均日增重(ADG)。 以酶添加作为主要影响对数据进行单向方差分析。结果(表3)表明向 谷物饲料中添加酶使平均日增重提高6.3％，使饲料转化效率提高12.3 ％(P＜0.05)。与17.5FPU纤维素酶：100IU木聚糖酶添加物相比，以 3.3FPU纤维素酶：100IU木聚糖酶添加物获得了优异的效果。
表3
食用含有93％用纤维裂解酶处理的大麦谷物
(以DM为基准)的围栏阉牛的平均日增重     处理 平均日增重 (kg/d)   饲料效率 kg饲料/kg增重     0     1.43     7.11     6,000 IU*     200 FPU**     1.52     6.33     2,400 IU     420 FPU     1.40     7.13
*IU＝木聚糖酶国际单位/kg干物质
**FPU＝纤维素酶滤纸单位/kg DM
实施例3
特定比值的木聚糖酶和纤维素酶导致饲料消化得以改进。
使用除此以外的其它比值对消化率无改进或有相反的作用
在三项实验的头两项中，在培养24h后测定干燥的苜蓿干草的体外 中性洗涤剂纤维(NDF)消失率。将经烘干、粉碎的苜蓿干草试样在经 缓冲处理的瘤胃液(20％瘤胃液，80％缓冲剂)中培养，其中按上述 向所述瘤胃液中添加了纤维裂解酶。总酶(内纤维素酶+木聚糖酶)浓 度为6,000IU/kg，内纤维素酶∶木聚糖酶比值有变化(0∶100，25∶ 75，50∶50，75∶25和100∶0)。在第二项实验中，使用相同的方案， 不同之处是使用不同的内纤维素酶∶木聚糖酶比值(0∶100，5∶95， 10∶90，15∶85，20∶80，25∶75和100∶0)。在第三项实验中，使 用相同的方案，不同之处是使用Spezyme CP外纤维素酶来代替CEP内 纤维素酶。这项实验中的酶的数量列于表5中。
在所有实验中，瘤胃缓冲剂均是Goering和Van Soest(1970)的 磷酸盐/碳酸氢盐缓冲剂。向缓冲剂中添加常量矿物质、微量矿物质、蛋 白胨、和还原剂并用CO2使缓冲剂鼓泡直至在与瘤胃液混合之前彻底还 原。在39℃培养24h后，将试管内容物在沸腾中性洗涤剂溶液中萃取 1h，并将残余物在105℃干燥一夜(实验1)，或者在39℃下培养24h 后，将试管内容物通过预先称重的坩锅过滤并在105℃下干燥一夜以测 量DM消化率。以牧草和酶处理为主要影响使用双向ANOVA对体外结 果进行统计检验。通过对照组(无酶)与酶(不分比值)对比，将酶的 效果分离出来。
实验1和2。添加纤维裂解酶显著地增加了(P＜.01)NDF消失率。 降低纤维素酶∶木聚糖酶比值增加了纤维消失率，25∶75的纤维素酶∶ 木聚糖酶混合物的响应大于(P＜.01；表4)其它的酶比值。对于增加 NDF消失率来说，单独应用木聚糖酶效果最差，而应用100％纤维素酶 效果较佳。但应用纤维素酶和木聚糖酶有联合协同效应。单独应用纤维 素酶比单独应用木聚糖酶更有效，结合少量的纤维素酶(占总酶活性的5 至25％)导致NDF消化率增幅最大(图4)。总的来说，一种纤维裂 解酶混合物，其内纤维素酶占总活性的25％且木聚糖酶占总活性的75 ％，在实验1和2中分别导致26％和8.2％的改进。
表4 木聚糖酶和纤维素酶对苜蓿体外NDF消化率(24小时)的影响     纤维素酶 (IU CMCase每kg DM)     木聚糖酶 (IU每kg DM)   24小时 消化率(％)     0     0     39.1     6,000     0     47.8     4,500     1,500     46.0     3,000     3,000     47.3     1,500     4,500     49.3     0     6,000     44.9
实验3：这一实验的结果进一步证实了木聚糖酶与纤维素酶的协同 效应(表5和图5)。方法与实验1和2所用的相同，不同之处是使用 了外纤维素酶(Spezyme CP)。将粉碎的苜蓿用木聚糖酶和纤维素酶 的不同组合和数量在体外培养。表5；4栏含有单独使用木聚糖酶时所 观察到的DM消化值。5栏含有单独使用纤维素酶时观察到的数值。6 栏含有如木聚糖酶和纤维素酶作为添加剂以它们对苜蓿DM消化影响所 预计的DM消化率(单独使用纤维素酶加上单独使用木聚糖酶观察到的 消化率改进的总和)。7栏含有实际观察到的DM消化率。以百分比表 达的DM消化率的观察值与预计值之差为纤维素酶和木聚糖酶以联合、 协同方式发生作用所引起的改变。
表5 与分别添加木聚糖酶和纤维素酶相对比添加该两种 酶的组合物对苜蓿体外DM消化率的协同效应 木聚糖酶   IU/kg 纤维素酶 FPU/kg 木聚糖酶 与纤维素 酶比值 由木聚糖 酶预计的 ％DMD 由纤维素 酶预计的 ％DMD 预计的总 ％DMD 观察到的 ％DMD 由协同作用 改进％ 0 0 0  0 0  40.11  40.11  0 500 10 50∶1  41.19 42.37  43.45  45.02  3.9122851 500 12.5 40∶1  41.19 42.45  43.53  46.45  7.2763519 500 16.66667 30∶1  41.19 42.09  43.17  50.29  17.742337 500 25 20∶1  41.19 43.56  44.64  51.62  17.393471 1000 20 50∶1  42.44 44  46.33  48.86  6.3045103 1000 25 40∶1  42.44 43.56  45.89  54.61  21.72938 1000 33.33333 30∶1  42.44 44.87  47.2  58.09  27.136805 1000 50 20∶1  42.44 45.6  47.93  57.61  24.121605 1500 30 50∶1  43.98 44.09  47.96  53.82  14.602542 1500 37.5 40∶1  43.98 44.67  48.54  59.11  26.339397 1500 50 30∶1  43.98 45.6  49.47  63.14  34.064291 1500 75 20∶1  43.98 47.54  51.41  63.25  29.504112 2000 40 50∶1  44.79 45.31  49.99  56.85  17.094443 2000 50 40∶1  44.79 45.6  50.28  64.95  36.556192 2000 66.66667 30∶1  44.79 4627  50.95  65.16  35.409918 2000 100 20∶1  44.79 49.11  53.79  63.91  25.218041 4000 80 50∶1  45.82 48.62  54.33  60.48  15.325193 4000 100 40∶1  45.82 49.11  54.82  66.39  28.831298 4000 1333333 30∶1  45.82 50.24  55.95  66.53  26.364316 4000 200 20∶1  45.82 51.32  57.03  64.71  19.137802 8000 160 50∶1  44.05 50.65  54.59  56.77  5.4323449 8000 200 40∶1  44.05 51.32  55.26  56.31  2.6164964 8000 266.6667 30∶1  44.05 53.02  56.96  53.64  8.273112 8000 400 20∶1  44.05 54.28  58.22  53.35  12.13556 随着木聚糖酶和纤维素酶数量的增加(图5示出的仅是木聚糖酶活性) 酶的协同效应也增加。当木聚糖酶的添加数量为2,000IU/kg DM时出现 最大的协同效应。协同效应还受木聚糖酶∶纤维素酶比值影响。当木聚 糖酶∶纤维素酶(IU∶FPU)比值为30∶1至40∶1(2.5至3.3FPU纤 维素酶每100IU木聚糖酶)时出现最大的协同效应。例如，应用每kg DM 1,500IU的木聚糖酶和50FPU纤维素酶导致的消化率为63.1％(对比的 是，未处理的苜蓿的消化率为40.1％)，1,500IU木聚糖酶/0FPU纤维 素酶的消化率为43.98％，0IU木聚糖酶/50FPU纤维素酶处理的苜蓿的 消化率为45.6％。添加高木聚糖酶和纤维素酶活性实际上降低消化率。 例如施用每kg DM 8,000IU木聚糖酶和400FPU纤维素酶(20∶1比值) 导致的DM消化率为53.4％(对比的是，未处理苜蓿的消化率为40.1 ％)，8,000IU木聚糖酶/0FPU纤维素酶的消化率为44.05％，0IU木 聚糖酶/400FPU纤维素酶处理的苜蓿的消化率为54.3％。这些发现证 实，对于改进苜蓿的消化，木聚糖酶和纤维素酶有最佳数量和比值。使 用在这些指明的以外的不恰当的比值和数量将导致没有响应或甚至有负 面效应。
实施例4
在采食之前酶必须施加到干燥饲料物质中且必须吸收并粘附于 饲料物质中。需要一个最短的时间长度以稳定酶-饲料复合物。
通过实验来确定向苜蓿青贮饲料添加纤维裂解酶混合物对于物质摄 入量和消化率的影响，以及相对于湿的牧草来说，酶混合物对于干燥牧 草是否同样有效。
将二茬(Second-cut)苜蓿切碎并使用各含约700kg青贮饲料的 三个小型竖直实验青贮窖作为青贮饲料贮存。使用在Lethbridge的the Alberta Farm Machinery Research Institute制造的用于实验目的的 小型转鼓式干燥器将一部分青贮饲料干燥。在三个不同比次中将约850kg 的湿青贮饲料(干物质含量约为33％)在60至70℃下干燥约6至8小 时至水分含量低于15％。
在设计成5×5改进的拉丁方实验中以五个14天实验期使用5只阉 羊。配给日粮使得在实验结束时所有的羊都已接受了全部日粮。五种日 粮是：1)苜蓿青贮饲料，2)带有纤维裂解酶的苜蓿青贮饲料，3) 干燥的苜蓿青贮饲料，4)带有纤维裂解酶的干燥的苜蓿青贮饲料，和 5)苜蓿青贮饲料捆。
在这项研究中使用的纤维裂解酶混合物木聚糖酶(Xylanase B， Enzyme Development Corporation，New York，NY)和纤维素酶 (Spezyme CP，Genencor，Rochester，NY)的混合物，应用的数量为每 克饲料干物质3.75国际单位(IU)木聚糖酶和.25滤纸单位(FPU)纤 维素酶。该酶混合物在饲喂时施加。
在头两期内提供湿的苜蓿以避免腐败。以110％的随意采食量每天 两次提供饲料。每天收集并保留饲料残渣用于化学分析以测定随意采食 量。在每期的最后10天将羊圈养在收集板条箱中以便利每日粪便的总体 收集。
使用普通线性模型以模型中的羊和日粮分析牧草的每日干物质摄入 量和总干物质消化率数据。在模型中不包括阶段影响因为日粮不是按照 拉丁方设计真正的随机化的。
添加酶的有效性取决于青贮饲料是湿的或干燥的。在干燥的青贮饲 料的情况下添加酶混合物使干物质消化率增加2.9％(63.1vs.61.3％； P＜.04；表6)，但对湿的青贮饲料没有影响。饲喂干燥青贮饲料的动物 比饲喂湿青贮饲料的动物采食量更多，但添加酶对干物质摄入量没有影 响(P＞.05)。由于添加酶勉强增加了可消化干物质的摄入量。
这些结果表明，当以使酶粘附于底物上的方式施加时，酶添加剂增 加了牧草的消化率。在干燥的青贮饲料的情况下，当施加到牧草中时， 液体酶混合物立即被吸收，而湿的青贮饲料的高水分含量可妨碍酶的吸 收。被动物湿涎时或与瘤胃液接触时酶更易于从湿牧草中溶出。
在实施例1中，其中给牛饲喂大麦青贮饲料，在饲喂之前施加酶对 动物性能没有影响。在该研究中，在加工时将酶施加到干燥饲料(即梯 牧草和苜蓿草捆)是有效的。实施例1与实施例4两者均表明酶必须施 加到干燥饲料中。
表6 纤维裂解酶对苜蓿青贮饲料干物质(DM)消化率的影响
                   摄入量(kg/d)     消化率 苜蓿青贮饲料    酶    DM    可消化的DM   (％) 湿的            -    1.50    .93         61.8
            +    1.58    .97         61.8 干燥的          -    1.75    1.07        61.3a
            +    1.73    1.09        63.1b a，b添加到干燥青贮饲料中的酶的影响是显著的(P＜.04)
实施例5
酶/饲料复合物需要一最短的培养期以变的稳定
进行实验来确定纤维裂解酶混合物的稳定时间对苜蓿干草消化率 的影响。
将干燥的苜蓿干草的复合物试样粉碎以通过2mm筛网。将由木聚 糖酶(Xylanase B，Enzyme Development Corporation，New  York， NY)、纤维素酶(Spezyme CP，Genencor，Rochester，NY)、和10mM 乙酸盐缓冲剂(pH4.8)组成的纤维裂解酶溶液喷施到各饲料中。以 0.09mL/g饲料(以这为基准)的速率施加溶液。对于苜蓿，每kg干物质 添加2,000IU木聚糖酶和67FPU纤维素酶。使酶在饲料上稳定0、0.5、 1、2、4、6、8、12、24和32小时。经处理的牧草按照Goering 和Van Soest方法(1970)在经缓冲的(pH6.8)瘤胃液(20％瘤胃 液、80％缓冲剂)中培养。将经缓冲的瘤胃液添加到施加酶溶液5分钟内 的0h处理物中。最终的处理包括在将瘤胃液添加到饲料中后添加酶溶 液。在各稳定时间，培养无酶牧草的试样并用作该稳定时间的对照物。 需要这些对照物来消除相同实验物中瘤胃液接种物的变异性。所有培养 均分三份在39℃下进行24h。在培养之后，过滤试样以测定干物质消化 率。分析残余物的中性洗涤剂纤维(NDF)以测定纤维消化率。消化率 的结果以对应对照培养物的百分比来表示。
这项研究的结果示于图6。在长至24小时的培养时间各增量下，干 物质消失率增加至高于未处理的对照组。这些结果清楚地证明，需要一 段时间以使得酶/饲料复合物可稳定。对于长至2小时的时间，DM消化 率有微小的增加。在3小时内达到了满意的稳定化。在8小时达到了大 部分稳定效应，而稳定24小时出现了最大的稳定性和DM消化率。苜蓿 是干燥的，所以不涉及预消化。所观察到的响应是由于酶粘合到饲料上 且需要时间来形成这种稳定复合体而引起的。
实施例6
评价以滤纸单位表达的外纤维素酶活性 原理 在试样中的纤维素酶使底物滤纸水解，使用二硝基水杨酸通过分光光度 法分析如此释出的还原糖。 活性单位 滤纸活性单位是FPU(参见计算) 分析条件
底物                   滤纸
pH                      4.8
培养温度               50℃
培养时间               60分 设备
水浴                   50℃
水浴                   100℃
试管混合器(旋涡振荡器)
分光光度计 试剂 所有溶液均以去离子水、毫克(Milli-Q)或当量制备。 1.柠檬酸盐缓冲剂(0.05M，pH4.8)
制备在水中柠檬酸(C6H8O7·H2O；10.51g/l)和柠檬酸钠
(C6H5Na3O7·2H2O，14.71g/l)以0.05M溶液。用0.05M柠檬
酸溶液将0.05M柠檬酸盐溶液的pH调整至4.8(每1升柠檬酸钠溶
液需约667ml柠檬酸溶液)。 2.底物
Whatman No.1滤纸条，5mm W×120mmL(49.6-
50.5mg)。注：达到这一重量是重要的，这可通过掐掉滤纸条的边
角并称重来实现。 3.DNS试剂
将5.0g2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸(也称为3，5-二硝基水杨
酸-Merck 800141)溶于约4升水中。在连续磁力搅拌条件下，逐
渐添加8.0g NaOH并使其溶解。在连续搅拌条件下以水份量添加
150g Rochelle盐(Kna-tartrate，Merck 8087)。小心地将溶液
升温至45℃的最大温度。冷却至室温并在量瓶中用水稀释至
500ml。如溶液不清彻，经Whatman 1滤纸过滤。在室温下于暗色
瓶中贮存。 4.葡萄糖标准样
将1.00g葡萄糖(Merck 8337；贮存于干燥器中)溶于柠檬酸盐
缓冲剂中并在量瓶中使体积达到250ml。这一溶液在0.5ml中含有
2.0mg葡萄糖。 试样 将试样在柠檬酸盐缓冲剂中稀释。对每一研究的酶试样必须进
 行至少两次稀释。在反应条件下一次稀释应释出略多于且一次
 略少于(绝对量)2.0mg葡萄糖(与葡萄糖等当量的还原糖)。 分析 将滤纸条紧密地卷成小卷，放入干燥的试管(25ml)中，并使
 用吸移管添加1.0ml柠檬酸盐缓冲剂以保持滤纸被浸没。在50
 ℃下平衡5分钟。在时间为零时向试管中添加0.5ml试样并混
 合(滤纸条必须位于液面之下)。在50℃下培养恰好60分钟
 后，添加3.0ml DNS试剂并混合。将全部试管(全部试样，酶
 空白物、葡萄糖标准样和试剂混合物)一次都放入沸腾水浴中。
 沸腾恰好5分钟后，移出试管并冷却至室温。添加20ml水。通
 过彻底翻转试管数次进行混合。当纸浆沉降好后，即至少20分
 钟后，用吸移液管将溶液转移至比色杯中，并对所形成的颜色
 相对试剂空白物在540nm下检测。 酶空白物       1.0ml缓冲剂    试剂空白物    1.5ml缓冲剂
           0.5ml试样                    3.0ml DNS
           3.0ml DNS
葡萄糖标准样             1.0ml缓冲剂
                         0.5ml标准样
                         3.0ml DNS
沸腾5分钟，添加20ml水等。相对于试剂在540nm下检测试样、 酶空白物和葡萄糖标准样的吸光度。 计算
FPU单位是基于国际单位(注：FPU分析是非线性的，使用国际单 位本身是不正确的)。
1IU＝1μmol分-1转化的底物
   ＝1μmol分-1生成的产物(呈葡萄糖的还原糖，葡萄糖的分子
     量为180g mol-1)
在临界稀释条件下在FPU分析中释出的葡萄糖的绝对量是2.0mg。 这一数量的酶是由0.5ml酶在60分钟水解反应中生成的，等价于：
在半对数图纸上以试样吸光度(减除酶空白物后)对酶稀释度(总的 稀释体积除以稀释液中酶体积)作图。读出对应于标准样吸光度的各试 样的临界稀释度。
FPU/ml＝临界稀释度0.37
实施例7
分析以国际单位表达的内纤维素酶(羧甲基纤维素)活性 原理
在试样中的CMCase水解底物、羧甲基纤维素(CMC)，使用二硝 基水杨酸通过分光光度法分析如此释出的还原糖。 活性单位
单位以国际单位(IU)表达。在分析条件下一IU活性1分钟释出 1μmole的还原糖(以葡萄糖当量表达)。 分析条件
底物                 羧甲基纤维素
pH                    4.8
培养温度              50℃
培养时间              60分 设备
     水浴                 50℃
     水浴                 100℃
     试管混合器(旋涡振荡器)    
     分光光度计     试剂 所有溶液均以去离子水、Milli-Q或等效物制备。 1.柠檬酸盐缓冲剂(0.05M，pH4.8)
制备柠檬酸(C6H8O7·H2O；10.51g/l)和柠檬酸钠
(C6H5Na3O7·2H2O，14.71g/l)在水中的0.05M溶液。用0.05M
柠檬酸溶液将0.05M柠檬酸盐溶液的pH调整至4.8(每1升柠檬酸
钠溶液需约667ml柠檬酸溶液)。 2.底物-1％羧甲基纤维素
优选使用加热磁力搅拌器将1.0g CMC(介质粘度(Sigma No.C
-4888))溶入约80ml 0.05M柠檬酸钠缓冲剂中。加热至沸点并
以连续搅拌冷却，盖上盖子并缓冲搅拌一夜。用柠檬酸盐缓冲剂使
体积达到100ml。可在4℃贮存最长一周。 3. DNS试剂
将5.0g 2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸(也称为3，5-二硝基水杨
酸-Merck 800141)溶入约4升水中。在连续磁力搅拌条件下，逐
渐添加8.0g NaOH并使其溶解。在连续搅拌条件下，以水份量添
加150g Rochelle Salt(Kna-tartrate，Merck 8087)。小心地
使该溶液升温至45℃的最大温度。冷却至室温并在定量瓶中用水稀
释至500ml。如溶液不清彻，经Whatman 1滤纸过滤。在室温下
于暗色瓶中贮存。 试样
将试样在0.05M柠檬酸钠缓冲剂中稀释。适当的稀释液将产生0.3 -0.5的吸光度。 分析
向两只试管中添加1.8ml底物溶液并在50℃下平衡5分钟。向一只 试管中添加200μl经适当稀释了的酶溶液并用涡流式混合器混合。在50 ℃下恰好5分钟之后，向两只试管添加3.0ml DNS试剂并混合。向无 试样(酶空白物)条件下培养的试管中添加200μl试样溶液。将两只试 管一次置入沸腾水浴中。在沸腾恰好5分钟后移出试管并在冷却水中冷 却至室温。在540nm下相对于酶空白物测量试样吸光度。从标准曲线上 读出活性并乘以稀释系数。 标准
通过将0.180g葡萄糖(Merck 8337；贮存于干燥器中)溶入100ml 缓冲剂中来制备0.01M葡萄糖储备溶液。储备溶液可以分小等份在-20 ℃下冷冻；融化后必须细心地混合。由该储备溶液以柠檬酸盐缓冲剂制 备如下的稀释液：
          稀释度             葡萄糖
                            μmol/ml
          1∶1                10.0
          1∶2                 5.0
          1∶4                 2.5
          1∶5                 2.0
以与酶空白物相同的方式对各标准稀释液进行三重分析：移入试管 中1.8ml底物，在50℃下培养5分钟，添加3.0ml DNS和200μl标准 稀释液。通过添加200μl柠檬酸盐缓冲液来代替标准稀释液来制备试剂 空白物。将试管煮沸恰好5分钟，冷却并在540nm下相对于试剂空白物 来测量吸光度。对每一系列分析物制标准曲线。
实施例8
分析以国际单位表达的木聚糖酶活性 原理
在试样中的木聚糖酶水解底物、斯卑尔特燕麦木聚糖(oat spelt xylan)，使用二硝基水杨酸通过分光光度法测定释出的还原性碳水化合 物的数量。 活性单位
一个木聚糖酶单位(国际单位；IU)定义为在分析条件下1分钟内 使由斯卑尔特燕麦木聚糖产生对应于1μmole木糖(为还原糖当量)还原 能力的还原性碳水化合物的酶的数量。 分析条件
       底物                斯卑尔特燕麦木聚糖
        pH                  5.3
     培养温度            50℃±0.5℃
     培养时间            5分钟 设备
       水浴                50℃
       水浴                100℃
       试管混合器(旋涡振荡器)
       分光光度计 试剂 1.  0.05M柠檬酸钠缓冲剂，pH5.3、通过称量10.5g柠檬酸
(C6H8O7·xH2O)溶入1升去离子水并称量14.7g柠檬酸钠
(C6H5O7Na3.x2H2O)溶入1升去离子水来制备柠檬酸和柠檬酸钠
的0.05M溶液。向柠檬酸钠溶液中添加柠檬酸溶液直至混合物的pH
为5.3。 2.底物-1％斯卑尔特燕麦木聚糖
优选使用加热磁力搅拌器将1.0g木聚糖(Sigma No.X-0627)
溶入约80ml的0.05M柠檬酸盐缓冲剂中。加热至沸点并通过连续搅
拌冷却，涂覆并缓慢搅拌一夜。用柠檬酸盐缓冲剂使体积达到
100ml。可在4℃贮存最长一周。 3. DNS试剂
将20.0g 2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸(Merck 800141)悬浮于
约400ml去离子水中。在连续磁力搅拌的条件下，逐渐向这一悬浮
液中添加300ml NaOH溶液(32.0g NaOH溶于300ml去离子水
中)。该溶液可在水浴中小心地升温至45℃的最高温度直至其完全
清彻。在连续搅拌条件下以水份量添加600g Rochelle盐(Kna
-tartrate，Merck 8087)。最后，用去离子水将溶液稀释至2000ml。
如溶液不清彻，经滤纸(Whatman No.1)过滤。在室温下于暗色
瓶中贮存。 试样
将试样在0.05M柠檬酸钠缓冲剂中稀释。适当的稀释液将产生0.3 -0.5的吸光度。 分析
向两个试管中添加1.8ml底物溶液并在50℃下平衡5分钟。向一个 试管中添加200μl经适当稀释的酶溶液并用旋涡振荡混合器混合。在50 ℃下恰好5分钟之后，向两个试管中添加3.0ml DNS试剂并混合。向 无试样条件下培养的试管(酶空白物)中添加200μl试样溶液。将两只 试管一次均放入沸腾水浴中。沸腾恰好5分钟之后，移出试管并在冷水 中冷却至室温。在540nm下相对酶空白物测量试样吸光度。从标准曲线 上读出活性并乘以稀释因子。 标准
通过将0.150g木糖(Merck 8689；贮存于干燥器中)溶于100ml 缓冲剂中来制备0.01M木糖储备溶液。可以小等份在-20℃下冷冻储备 溶液；融化后必须小心地将试管混合。由储备溶液制备在柠檬酸盐缓冲 剂中的如下稀释液：
          稀释度             木糖
                          μmol/ml
          1∶1               10.0
          1∶2                5.0
          1∶4                2.5
          1∶5                2.0
以与酶空白物相同的方式对各标准稀释液进行三次分析。向试管中 移入1.8ml底物，在50℃下培养5分钟，添加3.0ml DNS和200μl标 准稀释液。通过添加200μl柠檬酸盐缓冲剂代替标准稀释液来制备试剂 空白物。将试管煮沸恰好5分钟，冷却并在540nm下相对于试剂空白物 来测量吸光度。对每一系列分析物制标准曲线。
实施例9
使用每ml提供90FPU纤维素酶活性和4300IU木聚糖酶活性的酶溶 液来处理水分含量为10％的苜蓿干草。将250ml酶混合物在50l水中稀 释并在压捆之前喷洒到苜蓿干草中。最终的饲料组合物的水分含量为15 ％，且所含的纤维素酶和木聚糖酶足以提供每kg饲料DM 25FPU纤维 素酶活性和1194IU木聚糖酶活性。
实施例10
用乙酸盐缓冲剂将200ml在乙酸盐缓冲剂(100mM乙酸钠；pH 5.0)中的每ml含8000IU木聚糖酶和200FPU纤维素酶的酶溶液稀释 至达1.0l。最终的溶液含有1600IU木聚糖酶/ml和40FPU纤维素酶 /ml。以1.0l/公吨的速率将所述溶液喷施到完整大麦谷物上。经处理的 谷物饲料含有的纤维素酶和木聚糖酶足以提供40FPU纤维素酶/kg谷物 饲料和1600IU木聚糖酶/kg谷物饲料。该谷物可随后在市售碾磨机中碾 磨加工。
实施例11
将4份具有10,000IU木聚糖酶活性/g的粉末与1份具有1000FPU 纤维素酶活性/g的粉末混合。最终的混合物含有8000IU木聚糖酶/g和 200FPU纤维素酶/g。将400g的该粉末溶于5.0l柠檬酸盐缓冲剂(50mM 柠檬酸钠；pH4.5)中。以5.0l/公吨的速率将酶溶液喷洒到苜蓿干草(8 ％水分含量)中。生成的饲料组合物所含纤维素酶和木聚糖酶足以提供 80 FPU纤维素酶/kg和3200IU木聚糖酶/kg苜蓿牧草。然后将生成的饲 料组合物在市售压捆机中经模具压制成草捆。
在本说明书中提及的所有出版物代表了本发明所属技术领域普通技 术人员的技术水平。所有出版物通过引用均引入本文，其程度如同将各 单独出版物指明并单独地指出通过引用引入一样。
虽然为清楚理解的目的通过示列和实施例以某种详细方式叙述了前 述发明，显然在所述权利要求中的范围内还可进行一些改变和改进。
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