哺乳动物表达载体

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哺乳动物表达载体
申请号	CN201510090564.3	申请日	2009-12-18	公开(公告)号	CN104694571B	公开(公告)日	2019-06-14
申请人	力奇制药公司;			发明人	A·弗兰基; D·戈赛尔;
摘要	本发明描述了包含调控元件和一种或多种选择标记基因的新组合的新的哺乳动物表达载体。所述载体允许至少一个，优选两个或更多目的基因的掺入，其之后的表达和使用例如G418和/或MTX选择转染的细胞。作为根据本发明的哺乳动物表达载体的实例的pDGPΔGOI载体显示了9555bp的序列，其一条链由SEQ ID NO:2代表。
权利要求	1.一种包含以下调控元件的哺乳动物表达载体： (a)SV40增强子/早期启动子区和 (b)Hbb内含子II，其中所述载体可通过将在(a)和(b)中定义的调控元件的控制下的至少一个目的基因插入显示9555bp的序列的pDGPΔGOI载体获得，所述pDGPΔGOI载体的一条链由SEQ ID NO: 2表示，其中所述调控元件和目的基因的顺序如下：5’-SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，目的基因-3’。 2.权利要求1的载体，其中所述载体为环形。 3.权利要求1或2的载体，其中所述至少一个目的基因编码免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链。 4.权利要求3的载体，其中所述载体还包含至少一种编码真核和/或原核选择标记的基因并且所述调控元件，目的基因和编码选择标记的基因的顺序如下：5'-SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，编码免疫球蛋白轻链的基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列；SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，编码免疫球蛋白重链的基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列；SV40增强子/早期启动子区，Tn5新霉素磷酸转移酶基因，合成的多聚腺苷酸化信号序列；SV40早期启动子，二氢叶酸还原酶基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列-3'。 5.一种载体系统，其包含至少两个如在权利要求1中定义的载体，其中所述至少两个载体各自包含至少一个目的基因。 6.权利要求5的载体系统，其中位于第一个载体上的第一个目的基因编码免疫球蛋白轻链，位于第二个载体上的第二个目的基因编码免疫球蛋白重链。 7.一种载体系统，其包含至少两个载体，其中第一个载体可通过将在SV40增强子/早期启动子区和Hbb内含子II的控制下的至少一个目的基因插入显示3830bp序列的pDGP-AΔGOI载体获得，所述pDGP-AΔGOI载体的一条链由SEQ ID NO:3表示，其中所述调控元件和目的基因的顺序如下：5’-SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，目的基因-3’，并且其中第二个载体包含编码赋予转染细胞抗性的选择标记的至少一种基因。 8.哺乳动物细胞，其包含权利要求2至4中任一项的表达载体或包含权利要求5至7中任一项的载体系统。 9.权利要求8的细胞，其中所述细胞为COP细胞、L细胞、C127细胞、Sp2/0细胞、NS-0细胞、NS-1细胞、NIH3T3细胞、PC12细胞、PC12h细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS1细胞、COS3细胞、COS7细胞、CV1细胞、Vero细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、PER C6细胞，或来自二倍体成纤维细胞、骨髓瘤细胞和HepG2的细胞。 10.一种产生权利要求9的细胞的离体方法，所述方法包括对哺乳动物细胞提供权利要求2至4中任一项的表达载体或权利要求5至7中任一项的载体系统的步骤。 11.一种生产至少一种目的多肽的离体方法，其中所述方法包括在允许表达所述至少一种目的多肽的条件下在细胞培养基中培养权利要求8的细胞的步骤。 12.权利要求11的方法，其中所述至少一种目的多肽被分泌至细胞培养基并且所述方法还包括从细胞培养基中分离所述至少一种目的多肽的步骤。
说明书全文	哺乳动物表达载体 [0001] 本申请是申请日为2009年12月18日、发明名称为“哺乳动物表达载体”的中国专利申请200980151764.8(国际申请号PCT/EP2009/067540)的分案申请。 [0002] 本发明描述用于整合进哺乳动物基因组的新的哺乳动物表达载体(含有或不含有目的基因，GOI)，所述载体包含新的调控元件组合。特别地，本发明描述了包含以下调控元件的表达载体：猿猴病毒40增强子和早期启动子区和Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物，其中所述表达载体能够接纳至少一个目的基因并使其表达。优选地，这样的表达载体包含至少一个选择标记基因(例如，包括目的基因的pDGP，见图1；例如，不含目的基因的pDGPΔGOI)。载体(不含目的基因)允许至少一个，优选两个或更多目的基因的掺入，其之后的表达和使用例如遗传霉素(G418)和/或甲氨蝶呤(MTX)选择转染的细胞。作为根据本发明的哺乳动物表达载体的实例的pDGPΔGOI载体显示了9555bp的序列，其一条链由SEQ ID NO:2代表。作为根据本发明的哺乳动物表达载体的另一个示例，pDGP-AΔGOI载体显示了3830bp的序列，其一条链由SEQ ID NO:3代表。 [0003] 目前必须在大量细胞库中进行多次连续选择步骤以在细胞克隆以前生成和筛选高产细胞库。因此培育细胞系是费时和费力的活动。 [0004] 有大量出版物论述了调控元件对表达水平的影响。 [0005] 早就知道位于GOI编码序列中或紧接在GOI编码序列之前的不同内含子序列的正面作用并在许多出版物(2,4,5,6)中描述。进行了致力于不同启动子的转录效率的研究并将CMV启动子鉴定为最有效的(2,3,4,5,6)。因此，目前在大多数哺乳动物表达载体中的GOI表达盒是由CMV启动子驱动的并在GOI编码序列紧接的上游具有内含子序列。 [0006] 就特定表达载体中的GOI表达盒和选择标记基因的组合而言，已报导并在功能上检验了几种组合(1)。对单克隆抗体(mAb)表达，描述了使用单独表达轻链和重链的2种载体以及含有2种mAb链的表达盒和在同一质粒上具有neo和dhfr表达盒的载体的解决方案(1)。 [0007] 在大多数情况下仅使用细胞内报告蛋白例如荧光素酶(2,5,6)测定瞬时表达水平。通过此方法很难预测调控元件和/或载体在整合进染色体后将如何影响分泌蛋白质的稳定表达水平，其中最终表达水平是转录、翻译、细胞内运输和分泌速度的复杂相互作用结果。尽管此问题对生物制药工业是最重要的，其在文献中很少涉及(3)。特别地，似乎从未讨论过调控元件和选择标记的特定组合与开发细胞系所需的时间和细胞系的开发效率的相关性。因此，本发明的主要目的是寻找在上述参数时间和效率方面比本领域已知的调控元件和选择标记组合更好的组合。 [0008] 由此，本发明克服了上述不足并提供了用于整合进各个哺乳动物基因组中的哺乳动物表达载体(特别是分别显示SEQ ID NO:2的序列的名为pDGPΔGOI的和显示SEQ ID NO:3的序列的名为pDGP-AΔGOI的载体(如果缺乏目的基因)；和名为pDGP和pDGP-A的载体(如果包括目的基因)，见图1和3)，其包含下列调控元件的新组合：猿猴病毒40(SV40)增强子和早期启动子区，Hbb内含子II，或该内含子的片段、衍生物和修饰物(其与文献例如Xu等人(2)中描述的嵌合内含子不同，因此绝对不能与其混淆)，和任选地至少一种选择标记基因(例如neo,dhfr)。这些表达载体适于接纳至少一个目的基因，并且如果接纳了目的基因，能使其表达并之后能使用至少一种合适的选择试剂(例如G418和/或MTX)选择转染的细胞。即使用G418的一步选择可选择以高量和以高度可重现方式表达由至少一种目的基因编码的至少一种多肽的细胞，由此显著减少开发细胞系的时间和工作量。 [0009] 作为边注，应当考虑以下因素：在现有技术中已知的在两个或更多选择步骤(其中之一通常为MTX选择)后整合进基因组的表达载体通常产生含有几个整合进其基因组的GOI拷贝的细胞，因此以增加的速度表达GOI。完全相反地，本发明的表达载体不需要将其多个拷贝整合进基因组和/或两轮或更多轮选择步骤以使哺乳动物宿主细胞以增加的速度表达GOI。这是根据本发明的调控元件组合的直接结果并在于增加的表达速度而与整合进基因组的基因拷贝数无关。因此本发明的优势是无需进行分别使用G418和MTX的至少一步选择步骤以获得令人满意的表达速度，但使用G418或MTX的仅一步选择(例如示例性选择系统)就足够。 [0010] 如本文使用的术语“Hbb内含子II”涉及显示人β-珠蛋白(hbb)基因的第二个内含子(Hbb内含子2)序列的任意核酸分子，其包括在所述hbb基因的Hbb内含子2上游紧接的10bp序列和在hbb基因的Hbb内含子2下游紧接的10bp序列。根据本发明，术语“Hbb内含子II的片段、衍生物和修饰物”包括能够在严格杂交条件下与Hbb内含子II杂交并(当与SV40增强子和早期启动子区组合时)具有与SV 40增强子/启动子组合中的Hbb内含子II相同的表达增强活性的核酸分子。特别地，术语“Hbb内含子II的片段、衍生物和修饰物”包括与显示SEQ ID NO:1序列的核酸分子链，或与互补物，或其片段在严格杂交条件下杂交的核酸分子，并且在相同的SV40增强子/启动子组合中其具有与显示SEQ ID NO:1序列的核酸分子相同的表达增强活性。根据本发明的优选实施方案，Hbb内含子II显示SEQ ID NO:1所示的序列。 [0011] 如何进行核酸分子的杂交实验是本领域熟知的，即本领域技术人员知道依照本发明她/他必须使用什么杂交条件。这些杂交条件在标准教科书例如Molecular Cloning A Laboratory Manual(Sambrook J.,Russell D.W.)Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.,Current Protocols in Molecular Biology(编:Ausubel F.M.,Brent R.,Kingston R.E.,Moore D.D.,Seidman J.G,Smith J.A.,Struhl K.)[Core publication in 1987–quarterly updated] 2007by John Wiley and Sons,Inc.中提及。 [0012] “严格杂交条件”指例如在包含50％甲酰胺，5x SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH 7.6),5x Denhardt's溶液,10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的已剪切的鲑精DNA的溶液中于40–60℃孵育过夜，接着在0.1x SSC中于约65℃洗涤滤器。也考虑在较低的严格度杂交条件下与显示SEQ ID NO:1的序列的核酸分子，或其互补物，或其部分杂交的核酸分子。杂交严格度和信号检测的变化主要通过操纵甲酰胺浓度(较低百分比的甲酰胺导致较低的严格度)；盐浓度或温度实现。例如，较低的严格度条件包括在包含6X SSPE(20X SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA,pH 7.4),0.5％SDS,30％甲酰胺,100mg/ml变性的已剪切的鲑精DNA的溶液中于37℃过夜孵育；接着在1X SSPE,0.1％SDS中洗涤。此外，为了获得甚至更低的严格度，在严格杂交后进行的洗涤可在较高盐浓度(例如5X SSC)下进行。值得一提的是可通过包括和/或替换用于在杂交实验中抑制背景的替代封闭试剂实现上述条件中的变化。一般的封闭试剂包括Denhardt's试剂，BLOTTO，肝素，变性的鲑精DNA和市售的专卖制剂。由于相容性的问题，加入特定封闭试剂可能需要上述杂交条件的修饰。 [0013] 因此，本发明的第一个方面包括提供用于整合进哺乳动物基因组的表达载体，所述表达载体包含以下调控元件：猿猴病毒40(SV40)增强子和早期启动子区和Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物，优选地所述内含子显示SEQ ID NO:1的序列，其中所述表达载体能够接纳至少一个目的基因并使其表达。 [0014] 本发明的该方面的优选实施方案为 [0015] (i)本发明的第一个方面的载体，其中所述载体包含至少一个编码真核和/或原核选择标记的基因，特别是来自Tn5的新霉素磷酸转移酶基因(neo)和/或二氢叶酸还原酶(dhfr)基因； [0016] (ii)本发明的第一个方面的载体，其中所述载体为环形； [0017] (iii)本发明的第一个方面的载体，其中所述载体包含在所述调控元件控制下的至少一个目的基因； [0018] (iv)本发明的第一个方面的载体，其中至少一个目的基因为编码免疫球蛋白轻链的基因和/或编码免疫球蛋白重链的基因； [0019] (v)本发明的第一个方面的载体，其中调控元件，目的基因和编码选择标记的基因的顺序如下：5'-SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物，编码免疫球蛋白轻链的基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列；SV40增强子/早期启动子区，Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物，编码免疫球蛋白重链的基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列；SV40增强子/早期启动子区，Tn5新霉素磷酸转移酶基因，合成的多聚腺苷酸化信号序列，不含增强子序列的SV40早期启动子，二氢叶酸还原酶基因，SV40多聚腺苷酸化信号序列-3'； [0020] (vi)本发明的第一个方面的载体，其中所述载体包含至少一个原核选择标记基因，例如抗生素抗性基因例如氨苄青霉素抗性基因，和/或本领域技术人员已知的可有利地包含在哺乳动物表达载体中的另外的调控元件；和 [0021] (vii)本发明的第一个方面的载体，其中所述载体为显示9555bp序列的pDGPΔGOI载体，其一条链由SEQ ID NO:2的序列代表。 [0022] 本发明的第二个方面为产生本发明的第一个方面的表达载体的方法，其中所述方法包括将以下遗传元件(a)和(b)排列在包含表达载体发挥功能和整合进哺乳动物宿主基因组通常所需的其他元件的载体中的步骤：(a)猿猴病毒40增强子和早期启动子区和(b)Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物。 [0023] 本发明的该第二个方面的优选实施方案为进一步包括排列(c)至少一个目的基因以使所述载体赋予其表达和/或(d)至少一个选择标记基因的步骤的方法。根据另一个优选的实施方案，至少一个选择标记基因是来自Tn5的新霉素磷酸转移酶基因和/或二氢叶酸还原酶基因。 [0024] 本发明的第三个方面是包含至少两个如优选的实施方案(i),(ii)和(iii)中任一项定义的载体的载体系统，其中至少两个载体各自包含至少一个目的基因。优选这样的载体系统，其中位于第一个载体中的第一个目的基因编码免疫球蛋白轻链，位于第二个载体中的第二个目的基因编码免疫球蛋白重链。本发明还考虑的另一个载体系统包含至少两个载体，其中第一个载体根据本发明的第一个方面但没有真核选择标记，其中第二个载体包含编码赋予转染细胞抗性的选择标记的至少一个基因。 [0025] 本发明的第四个方面是包含本发明的第一个方面的优选实施方案(i),(ii),(iii),(iv),(v),(vi)和(vii)中任一项的表达载体或根据本发明的第三个方面的载体系统的哺乳动物细胞。基本上任意哺乳动物细胞可与本发明共同使用，只要其允许多肽的重组表达。 [0026] 根据本发明的该第四个方面的优选实施方案，此类细胞为COP细胞、L细胞、C127细胞、Sp2/0细胞、NS-0细胞、NS-1细胞、NIH3T3细胞、PC12细胞、PC12h细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS1细胞、COS3细胞、COS7细胞、CV1细胞、Vero细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、PERC6细胞，或来自二倍体成纤维细胞、骨髓瘤细胞和HepG2的细胞。 [0027] 本发明的第五个方面涉及产生本发明的第四个方面的细胞的方法，所述方法包括为哺乳动物细胞提供本发明的第一个方面的优选实施方案(i),(ii),(iii),(iv),(v),(vi)和(vii)中任一项的表达载体或根据本发明的第三个方面的载体系统，和优选地用所述载体或载体系统转染哺乳动物细胞的步骤。 [0028] 本发明的第六个方面是产生至少一种目的多肽的方法，其中所述方法包括在允许表达所述至少一种目的多肽的条件下在细胞培养基中培养本发明的第四个方面的细胞的步骤。 [0029] 根据本发明的该第六个方面的优选实施方案，通过培养根据本发明的第四个方面的CHO细胞产生至少一种目的多肽。根据本发明的载体特别适于在啮齿类细胞例如CHO细胞中产生多肽。根据本发明的该第六个方面的另一个优选实施方案，此类方法还包括从细胞培养基中分离所述至少一种目的多肽的步骤。 [0030] 本发明的第七个方面涉及Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物的用途，但优选显示SEQ ID NO:1的序列的Hbb内含子II的用途，所述内含子优选地与SV40增强子和早期启动子区在哺乳动物表达载体组合以增强哺乳动物表达系统中的异源基因的表达。 [0031] 根据本发明的第七个方面的优选实施方案，此类用途由Hbb内含子II、其片段、衍生物和修饰物在编码异源基因的序列和驱动异源基因表达的SV40增强子和早期启动子区之间的位置定义。 [0032] 本发明的第八个方面涉及根据本发明的载体在蛋白质的高通量筛选方法中的用途。 [0033] 蛋白质例如氨基酸序列不同的候选蛋白质的不同变体的筛选(检测)是开发新的治疗蛋白质(生物药物)的传统早期步骤。此筛选程序的目的是评估和之后最优化待测目的蛋白质的分子特征例如生物活性、免疫原性、聚集行为、表达潜力、翻译后修饰等等。 [0034] 目前在大多数情况下，进行上述评估所需的蛋白质的量通过在HEK(人胚胎肾)细胞例如HEK293细胞中的瞬时蛋白质表达得到。然而由于特别的调控原因，在生物药物的情况下CHO细胞最常用作最终的生产细胞。尽管存在此不一致，工业和学术界的研究者仍使用目前的方法，因为与CHO细胞相比在HEK细胞中的瞬时蛋白质表达几乎从一开始就可得到相对高的蛋白质滴度，由此避免了为得到稳定转染的CHO细胞所需要的漫长选择过程。然而，此传统方法的一个主要缺点是筛选(检测)系统和最终生产系统使用不同来源(人对仓鼠细胞)的宿主细胞。当在最终生产系统中表达目的蛋白质时，此筛选和生产系统的不一致当然需要使用不同培养基、过程条件等，导致少得多的(如果有的话)有关例如聚集行为、表达水平、翻译后修饰的预测等的可比较(即相关)数据。因此，需要组合快速和高滴度蛋白质表达的优势(例如通过在HEK细胞中的瞬时蛋白质表达得到的)和对已从大部分对应最终生产系统的蛋白质表达系统中得到的目的蛋白质进行早期评估的优势的筛选/检测系统。 [0035] 通过根据本发明的载体解决了上面的问题，因为其能够在仅经过短暂选择期的(例如，在含有G418的培养基中经过2周的选择)稳定转染的细胞中表达大量的目的蛋白质。因此，本发明的载体可有利地用于直接在生产系统(例如CHO细胞)中和最终将用于产生最终生物药物的细胞培养(例如培养基和过程)条件下表达目的蛋白质(例如不同蛋白质变体)用于检测/筛选目的。特别是在多种候选药物蛋白质(例如蛋白质变体)的早期开发期，此方法消除了大量的时间损失，其否则将与所述候选蛋白质的各个稳定转染的生产细胞系的产生相关。同时，此新方法产生了在生产以及临床前和临床研究中与蛋白质质量和以后的行为的预测相关的更可比较的(即相关)数据。 [0036] 本发明的特别优选的实施方案包括以下方法和用途： [0037] A.产生权利要求1或2的表达载体的方法，其中所述方法包括将调控元件(a)和(b)排列至包含用于功能性表达载体通常所需的如下其他元件的载体的步骤：(a)猿猴病毒40增强子和早期启动子区和(b)Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物。 [0038] B.A的方法，其中所述方法还包括排列(c)至少一个目的基因以使所述载体能够赋予其表达和/或(d)至少一个编码选择标记的基因的步骤。 [0039] C.B的方法，其中所述至少一个选择标记基因是来自Tn5的新霉素磷酸转移酶基因和/或二氢叶酸还原酶基因。 [0040] D.在哺乳动物表达载体中与驱动异源基因表达的猿猴病毒40增强子和早期启动子区组合的Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物在增强哺乳动物表达系统中的异源基因表达中的用途。 [0041] E.D的用途，其中Hbb内含子II显示SEQ ID NO:1的序列。 [0042] F.D或E的用途，其中Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物位于编码异源基因和SV40增强子和早期启动子区序列之间。 [0043] 显示两个或多个GOI表达盒的本发明的哺乳动物表达载体对表达多聚体，特别是异源多聚体蛋白质(包括单克隆抗体)特别有用。只显示1个GOI表达盒的本发明的载体可有利的用于表达单体蛋白质例如细胞因子和激素，包括红细胞生成因子例如达依泊汀α。当将表达多聚体蛋白质，特别是单克隆抗体时，也考虑由本发明的至少两个载体组成的载体系统，其中第一个载体包含第一个目的基因，第二个载体包含第二个目的基因。优选地，在所述载体系统中，位于第一个载体上的所述第一个目的基因编码免疫球蛋白轻链，位于第二个载体上的所述第二个目的基因编码免疫球蛋白重链。 [0044] 根据本发明的哺乳动物载体适于单体和多聚体蛋白质例如抗体的(重组)生产。通常使用本发明的哺乳动物载体可生产的(重组)蛋白质包括包含与以下蛋白质之一的全部或部分相同或基本类似的氨基酸序列的蛋白质：Flt3配体，CD40配体，红细胞生成刺激蛋白例如红细胞生成素(EPO)，达依泊汀，包括达依泊汀α和血小板生成素，降钙素，瘦蛋白，Fas配体，NF-κB受体激活剂的配体(RANKL)，肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，胸腺间质来源的淋巴细胞生成素，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，生长因子包括肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，角化细胞生长因子，巨核细胞生长和发育因子，RANTES，生长激素，胰岛素，促胰岛素，胰岛素样生长因子，甲状旁腺激素，干扰素包括α-干扰素，β-干扰素和γ-干扰素，神经生长因子，脑源性神经营养因子，突触结合蛋白样蛋白(SLP1-5)，神经营养因子-3"胰高血糖素，白介素包括IL-1,IL-1a,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL- 14,IL-15,IL-16,IL-17和IL-18，集落刺激因子，淋巴毒素-p，肿瘤坏死因子(TNF)，白血病抑制因子，制瘤素-M和细胞表面分子ELK和HeK的多种配体(例如eph-相关激酶的配体或LERKS)。 [0045] 使用本发明的哺乳动物载体可生产的其他蛋白质包括包含上述蛋白质中任一种的受体、上述蛋白质中任一种的这样的受体的拮抗剂和与这些受体或拮抗剂基本类似的蛋白质的氨基酸序列的全部或部分的蛋白质。 [0046] 另外，使用本发明的哺乳动物载体可生产的蛋白质包括包含分化抗原(被称为CD蛋白质)或其配体或与它们中的任一种基本类似的蛋白质的氨基酸序列的全部或部分的蛋白质。此类抗原的实例为包括CD20,CD22,CD27,CD30,CD39,CD40的分化抗原及其配体。 [0047] 使用本发明的哺乳动物载体也可生产酶活性蛋白质或其配体。实例包括包含以下蛋白质或其配体或与这些中的一种基本类似的蛋白质的全部或部分的蛋白质：金属蛋白酶-解联蛋白家族成员、激素、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、脱脂载脂蛋白E、脱脂载脂蛋白A-1、珠蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、TNF-α转化酶，上述酶中任一种的配体和多种其他酶及其配体。 [0048] 本发明的哺乳动物载体也可用于生产体外选择的嵌合蛋白以与特定靶蛋白结合并修饰其活性，和其抗体或部分和嵌合抗体，即具有与一个或多个鼠可变抗体免疫球蛋白结构域偶联的人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体，其片段或基本上类似的蛋白质。本发明的哺乳动物载体也可用于生产包含抗体和细胞毒性或发光物质的缀合物。使用本发明的哺乳动物载体可生产的抗体、体外选择的嵌合蛋白或抗体/细胞毒素或抗体/发光团缀合物的实例包括这样的抗体，其识别包括但不限于上述蛋白质和/或以下抗原的蛋白质中的任意一种或组合：CD2,CD3,CD4,CD8,CD11a,CD14,CD18,CD20,CD22,CD23,CD25,CD33,CD40,CD44,CD52,CD80(B7.1),CD86(B7.2),CD147,IL-la,IL-1,IL-2,IL-3,IL-7,IL-4,IL-5,IL-8,IL-10,IL-2受体,IL-4受体,IL-6受体,IL-13受体,IL-18受体亚基,PDGF-β,和其类似物,VEGF,TGF,TGF-β2,TGF-p1,EGF受体、VEGF受体,肝细胞生长因子,护骨蛋白配体,干扰素γ,B淋巴细胞刺激物,C5补体,IgE,肿瘤抗原CA125,肿瘤抗原MUC1,PEM抗原,ErbB2/HER-2,在患者血清中以提高的水平存在的肿瘤相关表位,癌相关表位或乳腺、结肠、鳞状上皮细胞、前列腺、胰腺、肺和/或肾癌细胞和/或黑色素瘤、神经胶质瘤或神经母细胞瘤细胞、肿瘤的坏死核心细胞上表达的蛋白质,整联蛋白α4β7,整联蛋白VLA-4,B2整联蛋白,TRAIL受体1, 2,3和4,RANK,RANK配体,TNF-α,粘附分子VAP-1,上皮细胞粘附分子(EpCAM),细胞内粘附分子-3(ICAM-3),leukointegrin粘附素,血小板糖蛋白gp IIb/IIIa,心肌球蛋白重链,甲状旁腺激素,MHC I,癌胚抗原(CEA),甲胎蛋白(AFP),肿瘤坏死因子(TNF),Fc-y-1受体,HLA-DR 10β,HLA-DR抗原,L-选择蛋白,和IFN-γ。 [0049] 本发明的哺乳动物载体也可用于生产包含上述蛋白质或基本上类似的蛋白质中的任一种的重组融合蛋白。例如，使用本发明的哺乳动物载体可生产包含上述蛋白质之一外加多聚化结构域例如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、抗体的Fc部分或基本上类似的蛋白质的重组融合蛋白。在这些重组融合蛋白中特别包括这样的蛋白质，其中TNFR或RANK的至少一部分与抗体的Fc部分融合。 [0050] 可以理解，本领域技术人员完全能够确定与本发明有关的考虑使用的多种其他蛋白质。 [0051] 在根据本发明的载体(特别是在pDGPΔGOI/pDGP)中包含的遗传元件(见图1使用的缩写)为： [0052] ●SV40enh/prom：猿猴病毒40增强子和早期启动子区； [0053] ●Hbb内含子II，或其片段、衍生物和修饰物，如上面定义的。 [0054] 在根据本发明的载体(特别是在pDGPΔGOI/pDGP)中可包含的遗传元件(见图1使用的缩写)为： [0055] ●neo:氨基糖苷-3’-磷酸转移酶(APH 3’II)基因，又名新霉素磷酸转移酶基因,来自Tn5；APH 3’II使抗生素遗传霉素(G418)失活； [0056] ●dhfr:二氢叶酸还原酶基因； [0057] ●SV40polyA:来自SV40的多聚腺苷酸化信号序列； [0058] ●synth polyA:基于兔β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信号的合成的多聚腺苷酸化信号 [0059] 图1图示了作为本发明的示例实施方案(具有至少一个目的基因的载体)的pDGP载体。其包含两个分别显示了基本上相同的结构和调控元件的GOI表达盒，只是待表达的基因不同：分别是单克隆抗体(抗-CD20-抗体)的轻链和重链，因此所述表达盒能够在哺乳动物细胞中表达两个不同的目的基因。 [0060] 图3图示了作为本发明的另一个示例实施方案(具有一个目的基因的载体)的pDGP-A载体。其包含显示在上述调控元件的新和创造性组合控制下的达依泊汀α(其是一种激素或红细胞生成因子)基因的1个GOI表达盒。 [0061] 目的基因通常是cDNA序列，但也可为(基因组)DNA序列。 [0062] 如上所述，根据本发明的载体(特别是pDGPΔGOI/pDGP和pDGP-AΔGOI/pDGP-A)也可包含编码选择标记的基因/表达盒。优选的选择标记是由neo基因/表达盒编码的新霉素磷酸转移酶和由dhfr基因/表达盒编码的二氢叶酸还原酶。编码可选择标记的基因/表达盒允许用例如遗传霉素(G418)和甲氨蝶呤(MTX)选择转染的细胞。pDGP的neo表达盒包含由SV40增强子和早期启动子区驱动的新霉素磷酸转移酶基因并由合成的多聚腺苷酸化信号序列进一步转录调节(如图1中所见)。新霉素磷酸转移酶基因来源于细菌，如果处于上述调控元件的控制下则在哺乳细胞中表达。完全相反地，pDGP的dhfr表达盒包含由SV40早期启动子区(不含增强子序列)驱动的dhfr基因并由以3'-至5'-方向的SV40多聚腺苷酸化信号进一步转录调节。二氢叶酸还原酶(DHFR)是二氢叶酸向四氢叶酸的转化中所需的，后者进一步是细胞中的核酸合成所需的。通过甲氨蝶呤对二氢叶酸还原酶的不可逆抑制实现有效的细胞选择。因此，用pDGP载体成功转染的哺乳动物细胞(因此过表达DHFR蛋白质)能够在补充甲氨蝶呤的培养基中生长。 [0063] 图1图示了依照本发明的优选实施方案的载体(载体pDGP)，其包含两个目的基因，即mAb HC和mAb LC(mAb：单克隆抗体；HC：重链；LC：轻链)。 [0064] 图2图示了对照载体。 [0065] 图3图示了依照本发明的优选实施方案的载体(载体pDGP-A)，其包含1个目的基因，即达依泊汀α(缩写：Darbe alfa)。 [0066] 图4图示了另一个对照载体，即对照载体1，其中GOI(达依泊汀α)的表达处于CMV增强子/启动子(CMV enh/prom)和Hbb内含子II的调控下。 [0067] 图5图示了另一个对照载体，即对照载体2，其中GOI(达依泊汀α)的表达仅处于SV40增强子/启动子(SV40enh/prom)调控下(不含任何内含子序列)。 [0068] 为了检测根据本发明的pDGP表达载体的性能，发明人比较了pDGP(图1所示)和对照载体(图2所示)。pDGP和对照载体都包含相同的两个目的基因：(抗-CD20抗体的)mAb HC和mAb LC。将两个载体转染进相同的宿主细胞系(例如CHO K1PD,COS1,CV1,Vero,HeLa,HEK-293,PER C6)。然后在G418和MTX存在下对细胞进行连续的选择步骤。在每个选择步骤之后测定和比较在标准摇瓶批次中的mAb滴度。实验的细节在下面给出。 [0069] 为了进一步检测根据本发明的pDGP-A表达载体的性能，发明人比较了pDGP-A(图3所示)和对照载体1和2(分别在图4和5中所示)。pDGP-A和对照载体1和2都包含相同的目的基因：达依泊汀α，一种激素(红细胞生成因子)。将载体转染进相同的宿主细胞系(例如CHO K1PD,COS1,CV1,Vero,HeLa,HEK-293,PER C6)。与上述pDGP载体相反，表达载体pDGP-A、对照载体1和对照载体2分别包含单个GOI表达盒且不包含任何真核选择标记基因。因此，共转染了包含新霉素抗性基因的Neo载体以在含有遗传霉素(G418)的培养基中进行一步选择。实验的细节在下面给出。 [0070] 实验 [0071] 根据本发明的哺乳动物载体可用于生产多种不同的(重组)蛋白质。以下实施例分别说明了多聚体和单体蛋白质的重组表达的一般实验设定。特别地，通过使用针对CD20的单克隆抗体和达依泊汀α，一种激素(红细胞生成因子)作为可使用根据本发明的哺乳动物载体表达的示例性蛋白质收集了下文显示的数据。 [0072] 实施例1：多聚体蛋白质(单克隆抗-CD20抗体)的表达 [0073] 表达载体设计和构建 [0074] 使用载体NTI 9.0评估软件通过电脑设计了在此研究中使用的载体。构建载体例如pDGP载体和对照载体(图2)所需的片段在Geneart AG,Regensburg,Germany制备。本领域技术人员应当理解根据本发明教导的一些载体组装是可行的。由于根据本发明的载体的各个元件是本领域已知的，可通过例如测序或扩增和适当地克隆基础遗传元件和表达盒组装合适的载体。因此，应当理解得到各个载体的一些其他实施方案和方法是合适的和容易得到的。 [0075] 在各个表达载体中驱动4个表达盒的表达的调控性遗传元件列于表1。 [0076] 表1：pDGP/对照载体中包含的调控性遗传元件列表 [0077] [0078] 用于转染的载体制备 [0079] 使用单切限制性内切酶SwaI(ATTT AAAT,Roche,货号11371525001)线性化2种表达载体。每个反应中以5U/μg DNA浓度使用SwaI消化最多100μg的载体DNA。在反应混合物中加入合适量的10x反应缓冲液和H2O。反应混合物在25℃孵育4小时-过夜。消化后在层流室中进行DNA沉淀，如下所述： [0080] ●加入1倍体积的异丙醇 [0081] ●充分涡旋 [0082] ●以21000x g于4℃离心30分钟 [0083] ●弃上清液 [0084] ●小心地加入1倍体积的无菌冰冷70％乙醇 [0085] ●以最高速于4℃离心1分钟 [0086] ●弃上清液 [0087] ●在室温下风干沉淀物5-30分钟(在层流中) [0088] ●在100μl无菌水中重悬DNA。 [0089] 消化后，使用NanoDrop ND-1000测定线性DNA的纯度(OD 260/280)和浓度。对消化的DNA进行凝胶电泳(0.8％琼脂糖凝胶，Invitrogen)以检查线性化。 [0090] 宿主细胞 [0091] 使用CHO K1PD,COS1,CV1,Vero,HeLa,HEK-293,PER C6细胞。 [0092] CHO K1PD细胞系是来自ATCC(货号CCL-61.3)的CHO K1细胞系的亚群。使原始的细胞系在DM122培养基中适应无血清悬浮培养。在应用CHO K1PD细胞的所有实验中使用DM122生长培养基。 [0093] 转染 [0094] 在细胞转染中使用Amaxa系统(Nucleofector试剂盒V,货号:VCA-1003)。一次转染不超过5个库以提供充足的时间用于所有必需的细胞操作。详细方案见下： [0095] 1.在转染时，细胞应当多达2x106/ml并具有≥90％的活力。 [0096] 2.每次转染使用5x106个细胞。 [0097] 3.对细胞计数并在50ml离心管中在室温下以90xg离心10分钟。 [0098] 4.小心地去除培养基并在100μl溶液V(Amaxa试剂盒中包含的)中重悬细胞沉淀。 [0099] 5.加入DNA(3μg)并轻轻混合。 [0100] 6.将步骤5的混合物加入转染小管并将其置于Amaxa Nucleofector仪器中。 [0101] 7.使用Amaxa程序U 23转染细胞。 [0102] 8.为了在摇瓶中培养细胞(例如CHO K1PD)，在小管中加入一些生长培养基并用20ml生长培养基小心地将细胞转移至125ml摇瓶中。用新鲜的生长培养基漂洗小管1次或2次并将其加入摇瓶。在摇床中于37℃,10％CO2孵育细胞24–48小时。 [0103] 生长培养基和G418/MTX选择 [0104] 在用于培养哺乳动物细胞的合适培养基中培养细胞(例如CHO K1PD,COS1,CV1,Vero,HeLa,HEK-293,PER C6细胞)，例如当在实验中使用CHO K1PD时使用补充8mM L-谷氨酰胺(Sigma,货号G7513)的DM122生长培养基。 [0105] 在另外补充G418(遗传霉素，Gibco,货号10131-027；终浓度:0.8mg/ml)和/或甲氨蝶呤(甲氨蝶呤水合物，Sigma,货号M8407150；终浓度:150或250nM)的相同培养基中进行选择步骤。 [0106] G418选择是转染后的第一个选择步骤。在转染后2-5天当细胞活力超过60％时将G418加入细胞。G418选择通常需要2-4周。一旦细胞活力达到至少85％就进行MTX选择。 [0107] 在G418预选择的细胞上使用2x105个活细胞/ml的接种密度开始MTX选择。使用上面所示的MTX浓度(150/250nM)进行两个选择子步骤。MTX选择通常需要2至3周，直到细胞活力达到超过85％。 [0108] 细胞的解冻/冷冻 [0109] 在37℃解冻细胞并以约105活细胞/ml的初始细胞密度逐滴直接接种至含有50ml预热培养基的250ml摇瓶中。在37℃,10％CO2,110rpm下培养细胞。 [0110] 在活力>90％的指数生长期冷冻细胞。在包含7.5％DMSO的条件培养基中每小管冷冻5-10x106个活细胞。首先，在室温以180xg离心细胞培养物5分钟。其次，部分去除上清液。然后，在剩余上清液中加入DMSO至7.5％的终浓度。轻轻地重悬细胞沉淀。在Cryo小管中加入1ml细胞悬浮液并转移至在Mr.Frosty cryo盒中-80℃深冷器。在1个月之内将Cryo小管中的冷冻细胞转移至液氮容器。 [0111] 细胞的培养和处理 [0112] 每2-3天以1-1.5x105个活细胞/ml的密度将细胞分传并加入合适的预热生长培养基中以维持指数生长。 [0113] 培养条件：37℃,90-110rpm(用于125&250ml摇瓶),10％CO2(用于DM122培养基)。 [0114] mAb表达的检测 [0115] 在每个选择步骤(G418,MTX)之后，在适当补充的培养基(例如DM122)中进行10天的批量实验以评估mAb的表达。以1.5x105个活细胞/ml的最终密度在125ml摇瓶中接种细胞。总培养体积为25ml。在振荡培养箱中培养细胞(37℃,110rpm,10％CO2)。在第10天，取出1ml细胞培养上清液样品用于测量mAb滴度。通过AC(使用A蛋白的亲和层析)测定mAb含量。 [0116] 结果 [0117] 表2显示了在不同选择步骤以后转染了pDGP载体的细胞的10天批量滴度。 [0118] 表2:10天批量滴度；在不同选择步骤以后转染了pDGP载体的细胞 [0119]实验 G418 150nM MTX 250nM MTX 滴度(mg/l) 滴度(mg/l) 滴度(mg/l) 1 94 246 281 2 80 249 284 3 94 225 288 4 96 229 303 5 91 218 309 6 84 7 74 212 339 8 89 216 289 9 89 10 94 243 260 [0120] 表3显示了在不同选择步骤以后转染了对照载体的细胞的10天批量滴度。 [0121] 表3:10天批量滴度；在不同选择步骤以后转染了对照载体的细胞 [0122] [0123] [0124] 在G418选择后，与转染了对照载体的细胞相比，在转染了pDGP的细胞中测量到4-5倍的更高滴度。在MTX选择后，在2种实验方式中测量到平均相同的滴度。然而，与转染了对照载体的细胞(±50％)相比，在转染了pDGP的细胞(±10％)中得到的滴度更具重复性。 [0125] 实施例2：单体蛋白质的表达(达依泊汀α) [0126] 表达载体的设计和构建 [0127] 如实施例1中所述设计和制备在此研究中使用的载体和片段。 [0128] 使用上述pDGP GOI载体的进一步衍生物pDGP-A GOI载体进行达依泊汀α的表达实验。pDGP-A GOI载体包含与上述pDGP GOI载体(和实施例1的pDGP载体)调控元件的相同的新和创造性组合，所述元件当插入时驱动GOI的表达：猿猴病毒40增强子和早期启动子区和Hbb内含子II。在本实施例中，将达依泊汀α插入pDGP-A GOI作为示例性目的蛋白。此外，在此研究中使用对照载体1，对照载体2和Neo载体(见下)。 [0129] 与实施例1中使用的pDGP载体相反，上述表达载体(除了Neo载体以外)中的每一个包含单个GOI表达盒且不包含任何真核选择标记基因。因此，在所有实验中共转染了包含新霉素抗性基因的Neo载体以在含有遗传霉素(G418)的培养基中进行选择。因此实施例2代表了根据本发明的第三个方面的载体系统。 [0130] 在pDGP-A载体和在对照载体1和2中驱动达依泊汀α的表达的调控遗传元件列于表4。表4也显示了在Neo载体中驱动新霉素抗性基因的表达的调控遗传元件。 [0131] 表4：在pDGP-A载体、对照载体1、对照载体2和Neo载体中包含的遗传调控元件列表[0132] [0133] [0134] 宿主细胞 [0135] 使用和实施例1中相同的细胞系。 [0136] 转染 [0137] 使用和实施例1中相同的转染方法和系统。 [0138] 培养基和G418选择 [0139] 在用于培养哺乳动物细胞的合适培养基中培养细胞(例如CHO K1PD,COS1,CV1,Vero,HeLa,HEK-293,PER C6细胞)，例如当在实验中使用CHO K1PD时使用补充8mM L-谷氨酰胺(Sigma,货号G7513)的内部开发的DM122培养基。 [0140] 在另外补充G418(遗传霉素，Gibco,货号10131-027；终浓度:0.8mg/ml)的相同培养基中进行选择步骤。在转染后2-5天当细胞活力超过60％时将G418加入细胞。G418选择通常需要2-4周。 [0141] 细胞的解冻/冷冻 [0142] 如实施例1中描述的进行细胞的解冻/冷冻。 [0143] 细胞的培养和处理 [0144] 如实施例1中描述的进行细胞的培养和处理。 [0145] 达依泊汀α表达的检测 [0146] 在G418选择步骤以后检测细胞库的稳定达依泊汀α表达。在适当补充的培养基(例如DM122)中进行批量实验以评估mAb的表达。以1.5x105个活细胞/ml的最终密度在125ml摇瓶中接种细胞。总培养体积为25ml。在振荡培养箱中培养细胞(37℃,110rpm,10％CO2)。在第5和9天，取出0.5ml细胞培养上清液样品用于测量达依泊汀α的滴度。通过EPO-特异性ELISA(酶联免疫吸附测定)检测(Epo-ELISA Quantikine试剂盒,R&D Systems,货号:DEP00)测定达依泊汀α的含量。 [0147] 结果 [0148] 表5显示了在第5和9天转染了pDGP-A、对照载体1和对照载体2的细胞批量培养物中的达依泊汀α含量。 [0149] 表5：在第5和9天分别转染了pDGP-A载体、对照载体1和对照载体2的细胞批量培养物中的达依泊汀α含量。 [0150]实验第5天第9天滴度(mg/l) 滴度(mg/l) pDGP-A 1 27.4 76.4 2 26.9 49.1 对照载体1 1 3.7 8.4 2 5.0 8.3 对照载体2 1 1.9 5.5 2 1.7 4.2 [0151] 与转染了对照载体1的细胞相比，在G418选择后，从转染了pDGP-A载体的细胞中得到5至10倍的更高滴度。与转染了对照载体2的细胞相比，pDGP-A载体的使用导致高达14倍更高的达依泊汀α滴度，显示猿猴病毒40增强子和早期启动子区和Hbb内含子II的组合作为调控元件驱动重组蛋白质表达的优势和优越性。 [0152] 结论 [0153] 本发明的表达载体(例如pDGP和pDGP-A)与本领域目前使用的表达载体(例如对照载体)相比提供了以下优势： [0154] ●由于高重现性，作为根据本发明的载体实例，pDGP和pDGP-A的使用将待生成和检测的细胞样品数(即转染的细胞库)显著降低至仅3至5个，因此显著降低了工作量。目前，由于低重现性通常需要生成大量细胞样品(高达50个)以鉴定高产细胞样品。 [0155] ●例如pDGP和pDGP-A的载体的使用在仅1次的G418选择步骤后提供了足够滴度的表达的目的蛋白用于产物表征、临床前和I期研究。在细胞克隆前不需要另外的MTX选择步骤以增加蛋白质(例如抗体)滴度。 [0156] ●当例如使用pDGP或pDGP-A时，由于选择步骤数降低至仅一个G418步骤可大大减少开发细胞系需要的时间。 [0157] 参考文献 [0158] 1 Trill JJ,Shatzman AR,Ganguly S:Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells.Current Opinion in Biotechnology 6,1995:553-560[0159] 2 Xu Z,Mizuguchi H,Ishii-Watabe A,Uchida E,Mayumi T,Hayakawa T:Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.Gene 272,2006:149-156 [0160] 3 Melcher R,Grosch HW,Hasilik A:Plasmid vectors with a 5'-hybrid intron facilitate high-level glycoprotein expression in CHO-cells.Biochimica et Biophysica Acta,1575,2002:49-53 [0161] 4 Kim Y,Kim S,Lee J,Shin,H:Expression vector for mammal comprising murine cytomegalovirus immediate early gene enhancer/promoter and human beta globin intron,cell transformed therewith and method for producing heterologous protein using said cell.Patent:KR 1020000070503-A 224-NOV-2000[0162] 5 Xu Z,Mizuguchi H,Ishii-Watabe A,Uchida E,Mayumi T,Hayakawa T: Strength evaluation of transcriptional regulatory elements for 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